04-161 (Regeneración in vitro) - Colegio de Postgraduados

MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal y medios de cultivo
Se utilizaron semillas de Allium cepa L. de las variedades Cristal
White Wax y El Toro (envasada al vacío) de la marca WESTAR Seed
International Inc., proveniente de El Centro, California, EE.UU.
La composición de los medios de cultivo usados en la presente investigación
se describe en el Cuadro 1. El pH de los medios se ajustó a
5.8±0.1 y éstos se esterilizaron en una autoclave a 1.05 kg cm−2 y 121 °C
durante 15 min. En todos los medios se agregó 0.7% (p/v) de agar-agar,
purificado y exento de inhibidores (Merck, Darmstadt, Alemania).
Inducción de callos embriogénicos
Las semillas se colocaron en una solución que contenía 1 g L −1
de Fungimycin 100 [18.1% (p/v) estreptomicina y 2.0% (p/v)
oxitetraciclina], y 1 g L−1 de Daconil [75% (p/v) Clorotalonil tetracloro
isotalonitrilo] (Química Industrial Agrícola, S. A., México) durante
15 h. Las semillas se transfirieron a una solución de 1.8% de cloro
activo (v/v) (Cloralex ® , México), a la cual se adicionaron 4 mL L −1 de
Tween 20 (SIGMA Chemical, USA). En esta solución las semillas
permanecieron 20 min; después se enjuagaron tres veces con agua
destilada estéril.
Las semillas se colocaron en frascos de 100 mL con 25 mL del
medio A, y se incubaron en un cuarto de crecimiento a 26±2 °C en
obscuridad. Después de 2 d, los ápices de las raíces que medían 3 mm
de longitud aproximadamente, se cortaron con un bisturí y se colocaron
en cajas Petri con 30 mL de cuatro medios de inducción (B, C, D
y E), los que se incubaron en oscuridad durante ocho semanas, cambiándolos
a un medio fresco cada cuatro semanas.
Desarrollo de los embriones y formación de microbulbos
Los explantes con callo se transfirieron a un medio libre de reguladores
(F) donde permanecieron tres semanas. Se cultivaron en frascos
de 100 mL con 25 mL de medio G (1.0 mg L−1 BA) durante tres
semanas, se transfirieron al medio H (0.5 mg L−1 BA) por dos semanas
más y las plantas diferenciadas se regresaron al medio F para
continuar su desarrollo. Los cultivos se colocaron en una cámara de
ambiente controlado a 26±2 °C con fotoperíodo de 16 h luz (lámparas
de luz blanca fría fluorescente, con intensidad lumínica de 25 µmol
m −2 s −1 ) y 8 h de oscuridad.
Las plantas regeneradas se sometieron a un período de frío (4 °C)
por dos semanas, condición necesaria para la formación de
microbulbos, cuya presencia se logró después de un periodo de
incubación en una cámara de crecimiento a 26±2 °C. Las plantas que
formaron microbulbos se transplantaron a invernadero para la fase
final de establecimiento.
Diseño experimental y análisis estadístico
Se empleó un diseño experimental completamente al azar con
tres repeticiones en arreglo factorial, de dos factores: variedades (dos)
REGENERACIÓN in vitro DE PLANTAS DE CEBOLLA (Allium cepa L.)
The composition of the culture media used in the present research
is described in Table 1. The pH of the media was fitted to 5.8±0.1, and
these were sterilized in autoclave at 1.05 kg cm−2 and 121 °C during
15 minutes. To all the media, 0.7% (p/v) of purified agar-agar, free
from inhibitors, was added (Merck, Darmstadt, Germany).
Induction of embryogenic calluses
The seeds were put in a solution containing 1 g L−1 of Fungimycin
100 [18.1% (p/v) streptomycin and 2.0% (p/v) oxytetracycline], and
1 g L−1 of Daconyl [75% (p/v) Chlorothallonyl tetrachloride
isothallonitrile] (Química Industrial Agrícola, S.A. México) during
15 h. The seeds were transferred to a solution of 1.8% of active chlorine
(v/v) (Cloralex ® , México), to which 4 mL L −1 of Tween 20 (Sigma
Chemical, USA) were added. In this solution the seeds remained for
20 min; then they were rinsed three times with sterile distilled water.
The seeds were put in 100 mL jars with 25 mL of A culture medium
and incubated in a growth room at 26±2 °C in the dark. After 2 days,
the root tips, which were approximately 3 mm long, were cut with a
scalpel and placed in Petri dishes with 30 mL of four induction media
(B, C, D, and E), which were incubated in the dark during eight weeks,
changing them to a fresh medium every four weeks.
Development of embryos and microbulb formation
The explants with callus were transferred to a medium without
regulators (F), where they remained during three weeks. They were
cultured in 100 mL jars with 25 mL of G medium (1.0 mg L−1 BA)
during three weeks, then transferred to the H medium (0.5 mg L−1 BA) for another two weeks, and the differentiated plants were returned
Cuadro 1. Composición de los medios de cultivo utilizados para la
regeneración de plantas de las variedades Cristal y El
Toro, a partir de explantes de ápices de raíces obtenidas
de plántulas de 2 d de edad.
Table 1. Composition of the culture media utilized for regeneration
of plants of the varieties Cristal and El Toro, from explants
of root tips obtained from 2-day-old seedlings.
Reguladores del
Medio
Sales
Vitaminas
Sacarosa
inorgánicas (%)
crecimiento
(mg L−1 )
A 50% MS 50% MS 1.5
B N6 MS 2.0 2, 4-D, 1.0
C N6 MS 2.0 2, 4-D, 0.5
D N6 MS 2.0 2, 4-D, 0.5
cinetina, 0.5
E N6 MS 2.0 2, 4-D, 1.0
cinetina, 1.0
F MS MS 3.0
G MS MS 3.0 BA, 1.0
H MS MS 3.0 BA, 0.5
MS, Murashige y Skoog (1962); N6, Chu et al. (1975); 2, 4-D, ácido
2, 4-diclorofenoxiacético; cinetina, 6-furfurilaminopurina; BA, N 6 -
benciladenina ❖ MS, Murashige and Skoog (1962); N6, Chu et al.
(1975); 2,4-D, 2,4- dichlorophenoxyacetic acid; kinetin, 6furfurylaminopurine;
BA, N 6 - benzyladenine.
QUINTANA-SIERRA et al.
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