04-161 (Regeneración in vitro) - Colegio de Postgraduados

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AGROCIENCIA, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2005 10 mm Figura 1. Regeneración in vitro de plantas de cebolla (Allium cepa L.). A: ápices de raíz después de cuatro semanas en el medio de inducción B. B: callo embriogénico después de ocho semanas de cultivo en el medio B. C: plantas regeneradas después de 16 semanas de iniciar el cultivo. D: formación de microbulbos en las plantas regeneradas in vitro. E: bulbo después de 12 semanas de estar creciendo en invernadero. F: plantas obtenidas a partir de bulbos obtenidos en el invernadero. Figure 1. In vitro regeneration of onion plants (Allium cepa L.), A: root tips after four weeks in induction medium B. B: embryogenic callus after eight weeks of culture in medium B. C: regenerated plants after 16 weeks of initiating the culture. D: microbulb formation in plants regenerated in vitro. E: bulb after 12 weeks growing in greenhouse. F: plants obtained from bulbs produced in greenhouse. Se obtuvieron callos embriogénicos (Figura 1B) tanto en presencia únicamente de 2, 4-D y en combinación con cinetina. Sin embargo, la formación de plantas a partir de estos callos fue numéricamente menor cuando los callos embriogénicos fueron inducidos en los medios que contenían 2, 4-D y cinetina (Cuadro 3). Estos resultados contrastan con lo reportado por Robledo-Paz et al. (2000) y Van der Valk et al. (1992) para tejidos de ajo y cebolla, pero concuerdan con lo observado en cultivos embriogénicos de cacahuate (Arachis hypogaea L.) (Baker y Wetzstein, 1994) y chile (Capsicum annuum L.) (Steinitz et al., 2003). La poca influencia de la cinetina en la regeneración de plantas de cebolla podría deberse a que los niveles usados de este fitorregulador fueron mayores o menores que las concentraciones requeridas para 652 VOLUMEN 39, NÚMERO 6 A B C 1 mm E 1 mm 10 cm et al., 2000),which would be corroborated by the results of the present study. The morphogenic response of the explants began with an increment of up to five times their size after 30 d of culture in the medium of induction. Cellular proliferation was detected at specific sites, being concentrated in meristematic zones of the explant (Figure 1A). Haque et al. (1997) and Robledo-Paz et al. (2000) also observed callus formation only in the meristematic zone of the root tip. The calluses, produced after eight weeks, were of two types, one, light yellow, compact, and translucent, and the other, of intense yellow color, opaque, easily being disintegrated (friable); in other words, with characteristics similar to those reported by Van der Valk et al. (1992) and Zheng et al. (1998) for Allium cepa. Furthermore, F 10 mm 5 mm D
establecer el nivel hormonal endógeno adecuado que influyera positivamente en las células de los ápices de raíz en su capacidad para regenerar plantas. Lo anterior obedece a que la respuesta del explante está en función de los niveles hormonales endógenos de éste durante el cultivo in vitro (Fehér et al., 2003). La función inductora del 2, 4-D en la embriogénesis somática ha sido observado por otros autores (Van der Valk et al., 1992; Zeng et al., 1998; Myers y Simon, 1998), y se confirma con los resultados del presente trabajo. Se ha demostrado que el 2, 4-D estimula la síntesis de otras auxinas como el ácido indol acético (AIA) en células de zanahoria (Daucus carota L.) (Michalczuk et al., 1992). Asimismo, se ha propuesto que el 2, 4-D podría actuar no sólo como una auxina, sino también como un herbicida, el cual induce respuestas a estrés (Grossmann, 2000). Lo anterior se fundamenta en el hecho de que la presencia del 2, 4-D en el medio de cultivo induce la expresión de varios genes relacionados con el estrés en células de alfalfa (Medicago sativa) (Györgyey et al., 1991; Davletova et al., 2001). Tres semanas después de que los callos se transfirieron al medio F (libre de reguladores del crecimiento) triplicaron su tamaño, advirtiéndose la presencia de algunos embriones de los cuales emergían el vástago y la raíz para convertirse en plantas. El estudio anatómico, que permitirá corroborar la ontogenia y bipolaridad de los embriones, está en proceso. El mantener las plantas en los medios G (1 mg L −1 de BA), H (0.5 mg L −1 de BA) y F promovió su crecimiento hasta un tamaño en el cual pudieron someterse a un tratamiento que indujera la formación de microbulbos. Las plantas regeneradas in vitro que se mantuvieron a 4 °C por 15 d, formaron microbulbos en su base dos semanas después de retiradas de esta condición. Los microbulbos continuaron su crecimiento hasta convertirse en bulbos que alcanzaron un tamaño de 3 cm de diámetro después de 32 semanas de haber iniciado el cultivo de ápices (Figura 1E), y a las 52 semanas de tal inicio, las plantas de cebolla obtenidas de estos bulbos aún continuaban su crecimiento en el invernadero (Figura 1F). Aunque Dunstan y Short (1978) emplearon ápices de raíces para regenerar plantas de algunas variedades de cebolla (Giant Zittau e Inai Early Yellow), era necesario establecer las condiciones de cultivo in vitro que indujeran la mejor respuesta en variedades de interés para México como Cristal y El Toro. Asimismo, aunque se ha reportado la regeneración de plantas de cebolla a partir de otros explantes (Van der Valk et al., 1992; Mohamed- Yasseen y Splittstoesser, 1992; Saker 1997; Zheng et al., 1998), la mayoría de estos protocolos sólo contemplan la fase in vitro, por lo que no proporcionan información acerca de el tiempo requerido para el establecimiento de las plantas en suelo, ni se ha dado seguimiento al desarrollo de la REGENERACIÓN in vitro DE PLANTAS DE CEBOLLA (Allium cepa L.) calluses of the Cristal variety were more friable and more intensely yellow than those of El Toro variety, this means, there were differences among genotypes, which agrees with Novák et al. (1986), who found differential pigmentation among genotypes. Embryogenic calluses (Figure 1B) were developed in presence of 2,4-D alone, as well as in combination with kinetin. However, plants produced by these calluses were less numerous when embryogenic calluses were induced to media containing 2, 4-D and kinetin (Table 3). These results contrast with those reported by Robledo- Paz et al. (2000) and Van der Valk et al.(1992) for garlic and onion tissues, but agree with what was observed in embryogenic cultures of peanut (Arachis hypogaea L.) (Baker and Wetzstein, 1994) and pepper (Capsicum annuum L.) (Steinitz et al., 2003). The insignificant influence of kinetin on onion plant regeneration might be due to the fact that the utilized levels of this phytoregulator were higher or lower than the concentrations, required to establish an adequate endogenous hormone level, that could have a positive effect on the cells of the root tips in their capacity of regenerating plants. The previous is due to the fact that the response of the explant is a function of its endogenous hormone levels during in vitro culture (Fehér et al., 2003). The inductive function of 2, 4-D in somatic embryogenesis has been observed by other authors (Van der Valk et al., 1992; Zheng et al., 1998; Myers and Simon, 1998) and is confirmed by the results of the present paper. It has been demonstrated that 2, 4-D stimulates the synthesis of other auxins, like indoleacetic acid (AIA) in carrot (Daucus carota L.) cells (Michalczuk et al., 1992). Likewise, it has been suggested that 2, 4-D might act not only as an auxin, but also as herbicide, which generates responses to stress (Grossmann, 2000). The aforesaid is based on the fact that 2, 4-D presence in the culture medium originates the expression of several genes related to stress in cells of alfalfa (Medicago sativa) (Györgyey et al., 1991; Davletova et al., 2001). Three weeks after the calluses had been transferred to medium F (without growth regulators), they tripled their size, and the presence of some embryos was perceived, whose shoot and root emerged to become plants. The anatomic study, which will permit to corroborate ontogeny and bipolarity of the embryos, is being conducted. Keeping the plants in media G (1mg L −1 of BA), H (0.5 mg L −1 of BA), and F, promoted their growth until reaching a size where they could be subjected to a treatment, which would induce microbulb formation. Plants regenerated in vitro, being maintained at 4 °C for 15 days, formed microbulbs at their base, two weeks after being removed from this condition. The microbulbs continued their growth until they turned to bulbs, reaching a diameter of 3 cm after 32 weeks of initiating the culture QUINTANA-SIERRA et al. 653
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