04-161 (Regeneración in vitro) - Colegio de Postgraduados

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AGROCIENCIA, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2005 y medios de cultivo (cuatro), o sea ocho tratamientos. La unidad experimental fue un grupo de 20 explantes. Las variables analizadas fueron el porcentaje de explantes que formaron callos embriogénicos, el porcentaje de explantes que regeneraron plantas a las 12 semanas de haber iniciado el cultivo, y el número promedio de plantas producidas por explante a las 16 semanas de haber iniciado el cultivo. Se efectuó un análisis de varianza con las variables explantes que regeneraron plantas y número promedio de plantas producidas por explante, dado que la variable porcentaje de explantes que formaron callos embriogénicos registró un valor del 100% para todos los tratamientos. La variable porcentaje de explantes que regeneraron plantas previamente fue transformada a logaritmo base 10. La comparación de medias se efectuó la prueba de la diferencia mínima significativa (DMS, 0.05), y los promedios se presentan en las unidades originales. Los datos se analizaron con SAS (1999). Transferencia al suelo de las plantas con microbulbos Las plantas que formaron microbulbos in vitro se extrajeron de los frascos y se lavaron con agua corriente con el objeto de eliminar los residuos de medio de cultivo. Luego, las plantas se sumergieron en una solución de Daconil 1% (p/v) durante 2 min y se transfirieron a vasos de unicel de 240 mL conteniendo como sustrato tierra negra de monte, tierra lama y tierra de hoja en proporción equivalente (GARDEN’S, México). Las plantas se cubrieron con una bolsa de polietileno transparente de 0.5 kg de capacidad, donde se hizo 15 a 20 perforaciones con una aguja. Los vasos se mantuvieron dos semanas en una cámara de crecimiento a 26±2 °C con 16 h de iluminación. Después se pasaron a bolsas de 10 kg de capacidad y se llevaron a un invernadero donde se fertilizaron con la mitad de la fórmula 15:30:15 (N, P, K) de Miracle-Gro ® (Scotts Co., EE.UU.) por dos semanas, y después con la dosis completa cada semana, con el fin de que los microbulbos se convirtieran en bulbos. Los bulbos obtenidos a partir de los microbulbos se secaron 30 d a temperatura ambiente para retirar las hojas y la raíz (cura), se sometieron a frío (10 °C) por 30 d más, se pasaron a suelo y se llevaron a una cámara de crecimiento a 22±1 °C, donde emitieron el vástago y las raíces. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los cuatro medios de cultivo (B, C, D y E), permitieron la formación de callos embriogénicos en 100% de los ápices de raíz cultivados para ambas variedades. En el Cuadro 2 se muestran los resultados del análisis de varianza. En el porcentaje de explantes que formaron plantas y el número promedio de plantas producidas por explante hubo diferencias altamente significativas entre variedades; sin embargo, no hubo significancia para medios de cultivo ni para la interacción entre variedades y medios de cultivo. En el Cuadro 3 se presentan los promedios de ambas variables para los factores variedades y medios de cultivo. La variedad Cristal casi duplicó el porcentaje de 650 VOLUMEN 39, NÚMERO 6 to medium F in order to continue their development. The cultures were placed in a chamber of controlled environment at 26±2 °C with photoperiod of 16 h light (lamps of fluorescent cold white light, with luminous (light) intensity of 25 mmol m −2 s −1 ) and 8 h of dark. The regenerated plants were subjected to a cold period (4 °C) for two weeks, condition necessary for the formation of microbulbs, which emerged after an incubation period in a growth chamber at 26±2 °C. The plants that formed microbulbs were transplanted into a greenhouse for the final phase of establishment. Experimental design and statistical analysis A completely randomized experimental design was employed, with three replications in factorial arrangement of two factors: varieties (two) and culture media (four), this is, eight treatments. The experimental unit was a group of 20 explants. The analyzed variables were: percentage of explants forming embryogenic calluses, percentage of explants regenerating plants at 12 weeks after initiating the culture, and the average number of plants produced by explant at 16 weeks after having initiated the culture. An analysis of variance was made with the explant variables that regenerated plants, and the average number of plants produced by explant, since the variable, percentage of explants forming embryogenic calluses, recorded a value of 100% for all the treatments. The variable percentage of explants having regenerated plants previously, was transformed to logarithm base 10. The means comparison was done with the minimum significant difference test (DMS, 0.05), and the means are presented in the original units. The data were analyzed utilizing SAS (1999). Transferring of the plants with microbulbs to soil The plants having formed microbulbs in vitro were extracted from the jars and rinsed under running water with the purpose of eliminating the residues of culture medium. Then the plants were submerged in a 1% (p/v) Daconyl solution during 2 min to be later transferred to 240 mL Styrofoam mugs containing a substratum of black mountain soil, sludge, and forest soil (humus) in equivalent proportion (Garden’s, México). The plants were covered with transparent 0.5 kg polyethylene bags pierced by a needle making 15 -20 holes. The mugs were kept in a growth chamber at 26±2 °C with 16 h light for two weeks. Afterwards, they were put in 10 kg bags and taken to a greenhouse, where they were fertilized with half of the 15:30:15 (N, P, K) formula of Miracle- Gro ® (Scotts Co., U.S.) for two weeks, and later on, every week with the complete dose, to let the microbulbs grow to bulbs. The bulbs obtained from the microbulbs were dried during 30 d at room temperature in order to remove leaves and root (cure), they were subjected to cold (10 °C) for another 30 d, then transplanted to soil and taken to a growth chamber at 22±1 ºC, where they emitted the shoot and the roots. RESULTS AND DISCUSSION The four culture media (B,C,D, and E) allowed the formation of embryogenic calluses in 100% of the root
Cuadro 2. Cuadrados medios para las variables porcentaje de explantes con plantas y número promedio de plantas por explante. Table 2. Mean squares for the variables percentage of explants with plants and average number of plants per explant. Cuadrados medios Factor Grados de de variación libertad Porcentaje de Plantas por explantes con plantas explante Variedades (V) 1 3.129 ** 223.26 ** Medios de cultivo (M) 3 0.364 ns 7.67 ns V×M 3 0.230 ns 3.18 ns Error 16 0.255 16.86 Total 23 CV (%) 14 82 ** = altamente significativo ❖ highly significant. ns = no significativo ❖ non significant. explantes que regeneraron plantas y produjo casi cuatro veces más plantas por explante que la variedad El Toro (Cuadro 3). Esto indica que existen factores genéticos involucrados en la respuesta a dichas variables, por lo que la caracterización y ubicación en el genoma representaría un campo de estudio de gran interés. La presencia de las sales del medio N6, así como de los fitorreguladores, en los medios de cultivo empleados, fue suficiente para inducir callos embriogénicos, lo que concuerda con lo reportado para otras monocotiledóneas como maíz (Zea mays) (Armstrog y Green, 1985) y ajo (Allium sativum L.) (Robledo-Paz et al., 2000). Posiblemente el medio N6 incluye nutrientes factibles de ser usados con éxito en distintas monocotiledóneas (Robledo-Paz et al., 2000), lo que sería corroborado con los resultados del presente trabajo. La respuesta morfogénica de los explantes se inició con un incremento de hasta cinco veces su tamaño después de 30 d de cultivo en el medio de inducción. La proliferación celular se detectó en sitios específicos, concentrándose en las zonas meristemáticas del explante (Figura 1 A). Haque et al. (1997) y Robledo-Paz et al. (2000) también observaron formación de callo sólo en la zona meristemática de la punta de la raíz. Los callos producidos después de ocho semanas fueron de dos tipos, uno de color amarillo claro, compacto y translúcido y otro amarillo intenso, opaco, fácilmente disgregable (friable), o sea, con características similares a los reportados por Van der Valk et al. (1992) y Zheng et al. (1998) en Allium cepa. Además, los callos de la variedad Cristal fueron más friables y de color amarillo más intenso que los de la variedad El Toro; es decir, hubo diferencias entre genotipos lo que concuerda con lo mencionado por Novák et al. (1986), quienes encontraron pigmentación diferencial entre genotipos. REGENERACIÓN in vitro DE PLANTAS DE CEBOLLA (Allium cepa L.) Cuadro 3. Promedios de explantes con plantas y plantas formadas por explante inducidos en variedades de cebolla crecidos en cuatro medios de cultivo. Table 3. Means of explants with plants and plants formed by explant induced to onion varieties grown in four culture media. Medio de cultivo Variedades Cristal El Toro Explantes con plantas (%) tips cultured for both varieties. In Table 2, the results of the analysis of variance are shown. There were highly significant differences between varieties with respect to the percentage of explants developing plants and the average number of plants produced by explants; however, there was no significant difference for culture media, neither for interaction among varieties and culture media. The means of both variables for the factors varieties and culture media are shown in Table 3. Cristal variety nearly doubled the percentage of explants which regenerated plants, and produced almost four times more plants per explant than El Toro variety (Table 3). This indicates that there are genetic factors, involved in the response to said variables, and that is why characterization and location in the genome would be a field of study of great interest. The presence of salts of the N6 medium as well as of the phytoregulators employed in the culture media, was sufficient to induce embryogenic calluses, which agrees with the reports on other monocotyledons, such as corn (Zea mays) (Armstrong and Green, 1985) and garlic (Allium sativum L.) (Robledo-Paz et al., 2000). Possibly, the N6 medium includes nutrients, feasible of being used successfully in different monocotyledons (Robledo-Paz QUINTANA-SIERRA et al. Promedio B 73.3 40.0 56.7 a C 66.7 35.0 50.9 a D 50.0 38.3 44.2 a E 55.0 21.7 38.4 a Promedio 61.3 a 33.8 b 47.6 Plantas por explante B 10.6 2.7 6.6 a C 8.0 1.9 5.0 a D 6.5 1.8 4.2 a E 7.9 1.3 4.6 a Promedio 8.3 a 1.9 b 5.1 Promedios entre variedades o entre medios de cultivo con diferente letra son estadísticamente diferentes (p≤0.05). B, (N6+2, 4-D, 1.0 mg L −1 ); C, (N6+2, 4-D, 0.5 mg L −1 ); D, (N6+2, 4-D, 0.5 mg L −1 y cinetina 0.5 mg L −1 ), y E (N6+2, 4-D, 1.0 mg L −1 y cinetina 1.0 mg L −1 ) ❖ Means among varieties or among culture media with different letter are statistically different (p≤0.05) B, (N6+2, 4-D, 1.0 mg L −1 ); C, (N6+2, 4-D, 0.5 mg L −1 ); D,(N6+2, 4-D, 0.5 mg L −1 and kinetin 0.5 mg L −1 ), and E (N6+2, 4-D, 1.0 mg L −1 and kinetin 1.0 mg L −1 ). 651
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