04-161 (Regeneración in vitro) - Colegio de Postgraduados

AGROCIENCIA, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2005
y medios de cultivo (cuatro), o sea ocho tratamientos. La unidad experimental
fue un grupo de 20 explantes. Las variables analizadas
fueron el porcentaje de explantes que formaron callos embriogénicos,
el porcentaje de explantes que regeneraron plantas a las 12 semanas
de haber iniciado el cultivo, y el número promedio de plantas producidas
por explante a las 16 semanas de haber iniciado el cultivo. Se
efectuó un análisis de varianza con las variables explantes que regeneraron
plantas y número promedio de plantas producidas por explante,
dado que la variable porcentaje de explantes que formaron callos
embriogénicos registró un valor del 100% para todos los tratamientos.
La variable porcentaje de explantes que regeneraron plantas previamente
fue transformada a logaritmo base 10. La comparación de
medias se efectuó la prueba de la diferencia mínima significativa
(DMS, 0.05), y los promedios se presentan en las unidades originales.
Los datos se analizaron con SAS (1999).
Transferencia al suelo de las plantas con microbulbos
Las plantas que formaron microbulbos in vitro se extrajeron de
los frascos y se lavaron con agua corriente con el objeto de eliminar
los residuos de medio de cultivo. Luego, las plantas se sumergieron
en una solución de Daconil 1% (p/v) durante 2 min y se transfirieron
a vasos de unicel de 240 mL conteniendo como sustrato tierra negra
de monte, tierra lama y tierra de hoja en proporción equivalente
(GARDEN’S, México). Las plantas se cubrieron con una bolsa de
polietileno transparente de 0.5 kg de capacidad, donde se hizo 15 a
20 perforaciones con una aguja. Los vasos se mantuvieron dos semanas
en una cámara de crecimiento a 26±2 °C con 16 h de iluminación.
Después se pasaron a bolsas de 10 kg de capacidad y se llevaron a un
invernadero donde se fertilizaron con la mitad de la fórmula 15:30:15
(N, P, K) de Miracle-Gro ® (Scotts Co., EE.UU.) por dos semanas, y
después con la dosis completa cada semana, con el fin de que los
microbulbos se convirtieran en bulbos.
Los bulbos obtenidos a partir de los microbulbos se secaron 30 d
a temperatura ambiente para retirar las hojas y la raíz (cura), se sometieron
a frío (10 °C) por 30 d más, se pasaron a suelo y se llevaron a
una cámara de crecimiento a 22±1 °C, donde emitieron el vástago y
las raíces.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los cuatro medios de cultivo (B, C, D y E), permitieron
la formación de callos embriogénicos en 100% de
los ápices de raíz cultivados para ambas variedades. En
el Cuadro 2 se muestran los resultados del análisis de
varianza. En el porcentaje de explantes que formaron
plantas y el número promedio de plantas producidas por
explante hubo diferencias altamente significativas entre
variedades; sin embargo, no hubo significancia para
medios de cultivo ni para la interacción entre variedades
y medios de cultivo.
En el Cuadro 3 se presentan los promedios de ambas
variables para los factores variedades y medios de cultivo.
La variedad Cristal casi duplicó el porcentaje de
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to medium F in order to continue their development. The cultures
were placed in a chamber of controlled environment at 26±2 °C with
photoperiod of 16 h light (lamps of fluorescent cold white light, with
luminous (light) intensity of 25 mmol m −2 s −1 ) and 8 h of dark.
The regenerated plants were subjected to a cold period (4 °C) for
two weeks, condition necessary for the formation of microbulbs, which
emerged after an incubation period in a growth chamber at 26±2 °C.
The plants that formed microbulbs were transplanted into a greenhouse
for the final phase of establishment.
Experimental design and statistical analysis
A completely randomized experimental design was employed,
with three replications in factorial arrangement of two factors: varieties
(two) and culture media (four), this is, eight treatments. The
experimental unit was a group of 20 explants. The analyzed variables
were: percentage of explants forming embryogenic calluses, percentage
of explants regenerating plants at 12 weeks after initiating the culture,
and the average number of plants produced by explant at 16 weeks
after having initiated the culture. An analysis of variance was made
with the explant variables that regenerated plants, and the average
number of plants produced by explant, since the variable, percentage
of explants forming embryogenic calluses, recorded a value of 100%
for all the treatments. The variable percentage of explants having
regenerated plants previously, was transformed to logarithm base 10.
The means comparison was done with the minimum significant
difference test (DMS, 0.05), and the means are presented in the original
units. The data were analyzed utilizing SAS (1999).
Transferring of the plants with microbulbs to soil
The plants having formed microbulbs in vitro were extracted from
the jars and rinsed under running water with the purpose of eliminating
the residues of culture medium. Then the plants were submerged in a
1% (p/v) Daconyl solution during 2 min to be later transferred to
240 mL Styrofoam mugs containing a substratum of black mountain
soil, sludge, and forest soil (humus) in equivalent proportion (Garden’s,
México). The plants were covered with transparent 0.5 kg polyethylene
bags pierced by a needle making 15 -20 holes. The mugs were kept in
a growth chamber at 26±2 °C with 16 h light for two weeks. Afterwards,
they were put in 10 kg bags and taken to a greenhouse, where they
were fertilized with half of the 15:30:15 (N, P, K) formula of Miracle-
Gro ® (Scotts Co., U.S.) for two weeks, and later on, every week with
the complete dose, to let the microbulbs grow to bulbs.
The bulbs obtained from the microbulbs were dried during 30 d
at room temperature in order to remove leaves and root (cure), they
were subjected to cold (10 °C) for another 30 d, then transplanted to
soil and taken to a growth chamber at 22±1 ºC, where they emitted
the shoot and the roots.
RESULTS AND DISCUSSION
The four culture media (B,C,D, and E) allowed the
formation of embryogenic calluses in 100% of the root