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Justificación y Objetivos 1. Conseguir resultados fiables y reproducibles, optimizando todos y cada uno de los diferentes parámetros que intervienen en la reacción RAPD. 2. Desarrollar un sistema “in vitro” sensible y versátil, que permita valorar a priori el carácter genotóxico de compuestos químicos y muestras ambientales. 32
Planteamiento y resultados. 3. PLANTEAMIENTO Y RESULTADOS El desarrollo metodológico ha ido dirigido a conseguir un sistema sensible y cuyos resultados “in vitro” sean capaces de predecir los resultados “in vivo”. Como las variaciones, incluso muy pequeñas, en el patrón de bandas de células control y células expuestas son asumidas como resultado de la acción del tóxico sobre el ADN, es imprescindible que dicho patrón sea específico y altamente reproducible. Por tanto, este trabajo se ha estructurado de la siguiente manera: 1. OPTIMIZACIÓN DE LA TÉCNICA (Reproducibilidad y Especificidad) 2. CAPACIDAD PARA LA DETECCIÓN DE DAÑO AL ADN (Sensibilidad) 3. CAPACIDAD PARA PREDECIR EL DAÑO “IN VIVO” 3.1 OPTIMIZACIÓN DE LA TÉCNICA. (Reproducibilidad y Especificidad) (Anexos 2.1 y 2.4) Como ya se ha mencionado, uno de los aspectos mas criticados a la técnica de RAPD, ha sido la falta de reproducibilidad de sus resultados, dando lugar a patrones de bandas variables. Los factores que intervienen en esta falta de reproducibilidad se pueden agrupar en: 33
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Bibliografía Drosophila carrying t
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Bibliografía Experimental Cell Res
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Bibliografía Walton D.G., Acton A.
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II. ANEXOS
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Protocolo del ensayo 93 - Cloruro p
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Protocolo del ensayo 107 d) Para ev
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108 ANEXO 2.1 CHARACTERIZATION OF R
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Because of their great simplicity,
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TABLE 1 OD260/OD280 Index Values in
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electrophoresis or partial destruct
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FIG. 7. Amplification of DNA from d
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120 ANEXO 2.2 DETECTION OF MITOMYCI
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C.Becerril et al. Hadrys,H., Balick
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ANEXO 2.4 DETECTION BY RAPD OF GENE
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ABSTRACT The technique of random am
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modifications in the genetic divers
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was added and the cells were left t
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densitometry (Gelworks 1D; UVP). Th
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Differences in profiles such as var
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involves extracting the DNA from a
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331-335 10. Atienzar, F., Conradi,
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RAPD fingerprint patterns. Res. Mic
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FIGURES LEGENDS Fig. 1. Fingerprint
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ANEXO 3 PUBLICACIONES (en proceso d
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IN VITRO ASSESSMENT OF DNA DAMAGE A
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INTRODUCTION. Persistent and ubiqui
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In previous works we have proved bo
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When cells reached confluence (afte
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RESULTS Both the quantitative analy
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strict control of the experimental
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Similar results were also observed
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REFERENCE. 1. Krane D.E., Sternberg
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15. Theodorakis, C.W., Bickman, J.M
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nonaqueous phase liquids. Environme
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Table I: Quantitative analysis of e
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FIGURE LEGENDS Figure 1.- Pattern f
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IN VITRO DETECTION OF ALTERATIONS I
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1. INTRODUCTION. Ecosystems result
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This technique doesn’t require an
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2. MATERIAL AND METHODS The RTG-2 c
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template DNA, and a molecular weigh
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concentrations greater than 0.05 µ
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the genetic material (Kubota et al.
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This study shows that the RAPD tech
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Atienzar, F., Conradi, M., Avenden,
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Jeffreys, A.J. (1987). Highly varia
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Theodorakis, C.W. and Shugart, L.R.
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Table II: Qualitative analysis. Ban
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ANEXO 4 PUBLICACIONES ( en preparac
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DETECCIÓN DE ALTERACIONES GENETICA
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duración. Las truchas, obtenidas d
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El análisis estadístico de los re
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hasta el final del estudio, confirm
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Ferrero, M., Castaño, A., Gonzalez
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Tabla 1. Análisis cuantitativo: pr
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