VARIABILIDAD GENÉTICA Y GRADO DE ENTRECRUZAMIENTO ...

VARIABILIDAD GENÉTICA Y GRADO DE ENTRECRUZAMIENTO ENTRE
POBLACIONES DE MONOS AULLADORES ROJOS (Alouatta seniculus) EN
BOSQUES DEL EJE CAFETERO
INFORME
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS
ALEXANDERvONHUMBOLDT
PROGRAMA CONSERVACIÓN DE BIODIVERSIDAD EN PAISAJES RURALES
CONSULTOR: MARÍA CAROLINA GÓMEZ POSADA
CALI, JULIO DE 2005

INTRODIICCIÓN
Los efectos de las actividades antrópicas en el eje cafetero colomhiano han resultado en un
paisaje fragmentado de cultivos comerciales. pastizales. plantaciones forestales y bosques de
diferentes edades. Históricamente. la mayoría de la población humana del país ha estado
concentrada en la región andina. Sc estima que entre el 70 y el 80 % del área de bosques
premontanos y montanos ha sido alterada en algún grado. la mayor parte de manera severa
(Cavelier 1998). La mayoría de remanentes hoscosos del eje cafetero se encuentran aislados y
algunos aun mantienen poblaciones de primates, l.os n1

condiciones de hacinamiento por altas densidades. vulnerabilidad por escasez de recursos
alimenticios y endogamia por el total aislamiento (Gómez-Posada el al. 2005). Se ha
comentado la posibilidad de manejar estas poblaciones con translocaciones. puentes de dosel.
reintroducciones. y otros (info. Pers. Funcionarios CRQ. CVe. Luis Miguel Renjifo como pers).
Por esta razón. en los dos últimos años se ha realizado un proyecto de evaluación del estado
ecológico de algunas de las poblaciones remanente de aulladores en la región (Górnez-Posada
2004. Gómez-Posada el al. 20051 y se llevó a cabo una primera propuesta rcgional del plan de
conservación y manejo para esta especie (Fundación EcoAndina -Instituto Humboldt). Dadas
las condiciones actuales. es importante que se diseñen escenarios de conservación para
poblaciones de aulladores en la región e imperativo que se determine cómo este primate ha
respondido a la alteración antropogénica de su ambiente natural.
En la actualidad. los planes de conservación se basan en un manejo integrado entre los
aspectos ecológicos y genéticos. La estructura genética dc una población (su variabilidad. nivel
de heterocigosidad. endogamia y flujo génico) es la que ascgura su continua adaptación ante
condiciones tluctuantes del medio. Los factores demográficos y los referentes a la gestión
ecológica son los que le brindan a la población la estructura necesaria para sostenerse. Tallmon
el al. (2002) demuestran como la aplicación de los datos genéticos demográficos son necesarios
al plantear estrategias para mantener las poblaciones de mamíferos en áreas fragmentadas. Una
de las maneras de solucionar el impacto de la fragmentación consiste en establecer áreas de
reserva con suficiente conectividad para que los animales puedan mantener su variabilidad
genética original. Cuando la conectividad entre poblaciones aisladas es efectiva se establece la
migración entre ellas recuperándose la transferencia genética y por ende incrementándose la
eficacia biológica de las poblaciones. Los efectos de bordc pueden ser reducidos. permitiendo el
Informe proyecto variabilidad genética del mono aullador. julio 31 de 2005
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crecimiento de la vegetación a lo largo del borde dcl bosque para incrementar la cobertura
(Kattan & Murcia 2003 l. Así por ejemplo. en planes de conservación de especies animales que
involucren programas de conexión de bosques. la información ecológica y genética es
fundamental.
A partir del ADN de células se puede identificar un individuo y su sexo. así como seguir los
genes en la población. Se pueden responder preguntas acerca de la variación genética dentro y
entre poblaciones. También se pueden establecer genealogías que pueden ayudar a reconstruir
aspectos de historia natural de las poblaciones examinadas. Fl muestrco no invasivo es una
alternativa que permite extraer ADN sin la captura dc animales. Para el caso de los primates. se
ha utilizado el ADN de células epiteliales que se encuentran en las hcces (Garcia & Estrada
www.primatesmx.com/fecaldna.html. Estt' ADN puede ser utilizado entonces como una
herramienta poderosa. por ejemplo para analizar la estructura genética yel estado de
poblaciones animales aisladas en fragmentos. De esta forma. se puede corroborar si la
información genética está acorde con las observaciones ecológicas. el número poblacional y si
la fragmentación ha generado efectos sobre la estructura social.
Este trabajo realizó una caracterización ecogenética de dos poblaciones silvestres de mono
aullador rojo ubicadas cn tragmentos de bosque andino. Se colectaron muestras de heces
(método no invasivo l. A partir de estas muestras se obtu\ o el ADN para los análisis
moleculares que se realizaron con loci de rnicrosatélites desarrollados en otras especies de
Alouatta. Se espera que la información generada permita hacer un diagnostico sobre el efecto
de la fragmentación en la estructura genética de la población.
La información ecológica sobre el estado de las poblaciones de mono aullador en bosques
en el eje cafetero, más información acerca de las condiciones genéticas de estas poblaciones.
Informe provecto variabilidad gelldica del 1110110aullador. julio 31 de 2005

permitirán una completa visión acerca de esta especie y arrojarán bases sólidas y más
confiables, para el diseño de estrategias, monitoreo y manejo de dichas poblaciones.
El trabajo se desarrolló en colaboración con c1laboratorio dc Biología Molecular del
Instituto Humboldt. coordinado por Juan Diego Palacio. I.a fase de campo se realizó con el
ecólogo Jorge Mario Londoño y la fase de laboratorio por la estudiante Angela Mina.
OBJETIVO GENERAL
Determinar el estado de conservación de la variación genética en poblaciones de mono aullador
en el eje cafetero colombiano (en dos localidades como mínimo). a través de la extracción de
ADN de las heces de estos primates.
Objetivos especíñcos
Estandarizar el método de extracción y amplificación en ADN extraído a partir de heces, para
A. seniculus.
Determinar de la variabilidad genética en poblaciones de mono aullador rojo al menos en dos
localidades en el eje cafetero
Indicar si las poblaciones están conectadas por algún tipo de flujo y cuantificar la tasa de
intercambio génico
Estimar la heterocigosidad y endogamia de subpoblaciones y población total.
Informe proyecto variabilidad genética del mono aullador, julio 31 de 2005
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MARCO TEÓRICO
La fragmentación es la división de un hábitat continuo en pedazos pequeños y aislados.
Actividades como la deforestación con fines madereros o para abrir tierras agrícolas y la
construcción de obras civiles, transforman los hábitats naturales que son complejos y diversos,
en hábitats completamente simplificados e inhóspitos para la vida silvestre (Kattan 2002). La
transformación de ecosistemas naturales no siempre es total. Con frecuencia la deforestación de
un área es parcial. resultando en la creación dc paisajes fragmentados. En estos paisajes quedan
algunos parches de vegetación natural. aislados en una matriz dc hábitats antropogénicos
(Kattan & Álvarez-López 1996 j. La disposición particular de los parches de hábitat tiene
importante repercusión para las actividades de los individuos. el crecimiento y la regulación de
las poblaciones y las interacciones entre especies. La translonnación de ecosistemas naturales
resultante de las actividades humanas es una de las principales causas de pérdida de diversidad
biológica (Kattan 1998).
La fragmentación dcl hábitat puede provocar extinción de muchas especies, tanto a nivel
local como regional. Esta extinción puede producirse tund.uueurulmeute por pérdida de hábitats
a escala regional y por aislamiento de las poblaciones en los parches remanentes (Kattan 2002j.
Las especies típicas del bosque quedan aisladas y su supervivencia obedece al tamaño y la
dinámica poblacional a nivel del fragmento (Kattan & Álvarez-López 1996). Un aislamiento
continuo puede resultar en la saturación de los fragmentos de bosque remanente por algunas
especies. lo cual altera las interacciones intraespecificas y causa una sobreexplotación de los
recursos. un incremento en la competencia. depredación y cambios en la tasa de fecundidad.
Informe proyecto variabilidad genética del mono aullador.julio 31 de 200S 6

Esta situación conlleva a una reducción significativa dcl número dc especies e individuos y a un
colapso potencial de las poblaciones remanentes (Estrada & Coates-Estrada 1996).
En una población no aislada la migración puede ocurrir; los individuos pueden dispersarse
a otra población y reproducirse. Así. las poblacioncs sostienen un flujo génico adecuado debido
a que. bajo estas condiciones. se dan los procesos socio biológicos que promueven la
inmigración y emigración de individuos entre unidades sociales: se mantiene la variabilidad
genética (García & Estrada www.primatesmx.com/fecaldna.htm).
En unidades aisladas de bosque. con baja conexión. se pierde la capacidad de mantener
poblaciones viables. debido a que en los fragmentos se altera el microclirna, desaparecen
especies especializadas. se favorece el establecimiento de depredadores oportunistas. se pueden
diseminar parásitos y enfermedades. se alteran los sistemas de polinización. cambian los flujos
de materia. se afectan las interacciones entre especies y hay pérdida de variabilidad genética
(Kattan & Murcia 2003). La pérdida de variabilidad genética en las poblaciones aisladas puede
limitar su capacidad para responder a cambios ambientales en el largo plazo (Primack el al.
200\). El aislamiento impide el flujo de individuos de una unidad social a otra y contribuye a
una mayor tasa de consanguinidad y de extinción. reduciéndose la eficacia biológica individual.
La depresión endogámica permite la expresión de alelos deletéreos en individuos homocigotos
(genes peligrosos que son raros en una población con alta variabilidad. pero son comunes en
poblaciones cuando la variabilidad es baja) (Estrada & Coates-Estrada 1996). Por deriva
genética se pueden perder alelos en una población aislada. llevándolos hacia la monomorfía
(genes homocigotos en la población. se pierden las otras copias j. Las poblaciones aisladas
sujetas a la deriva genética son más susceptibles a una serie de problemas. tales como depresión
endogámica y pérdida de flexibilidad evolutiva; estos factores aumentan la probabilidad de
Informe proyecto variabilidad genética del mono aullador. julio 31 de 2005

extinción. El aislamiento puede también llevar a un incremento de población hasta niveles
inesperados en los cuales parásitos y enfermedades pueden propagarse fácilmente y por
entrecruzamiento, dejar pocos sobrevivientes.
Dependiendo del tipo de matriz y de la forma en que las especies utilizan el hábitat, podrá o
no existir el flujo de individuos entre parches dc bosque (Kattan & Murcia 2003). La
vulnerabilidad de un animal a la fragmentación depende. a escala local. de su posición en la
cadena trófica, de su área de movimiento (diaria y estacional) y de la dispersión espacial y
temporal de sus recursos. Así por ejemplo. las especies de mamíferos sedentarias y herbívoras.
(como los monos aulladores) tienden a ser más tolerantes a la fragmentación. que las especies
insectívoras y móviles (Robinson & Ramírez 1982). A pesar de la flexibilidad de primates
como los aulladores. los problemas creados por la destrucción de habitas pueden causar serias
dificultades. Así por ejemplo, grandes distancias entre poblaciones aisladas de estos primates
resultan en inhabilidad para recolonizar parches de bosques. restricciones en el flujo de genes
entre las poblaciones existentes y grandes infestaciones por parásitos (Crockett 1998. Horwich
1998).
Técnicas no invasivas para análisis genéticos
En algunos casos es difícil obtener muestras de sangre o tejido para ADN. La captura a
menudo causa una considerable cantidad de estrés en los animales. especialmente los arbóreos
como los primates. El muestreo no invasivo es una alternativa que proporciona soluciones para
esos problemas. Con estos métodos de muestreo. el material de ADN puede ser obtenido sin la
captura de animales. El ADN está presente en las raíces del pelo. en las mucosas y en las heces.
El material fecal puede contener ADN porque las células epiteliales del recubrimiento intestinal
Informe proyecto variabilidad genética del mono aullador. julio 31 de 2005

son renovadas regularmente; por tanto. las células viejas son excretadas con las heces. Además
de la información proporcionada por el ADN pueden ser examinados otros elementos de las
heces como hormonas o parásitos.
Diferentes métodos no invasivos han sido utilizados para la amplificación de ruicrosatélites
en diferentes mamíferos. Incluso sc han desarrollado pruebas de efectividad comparándolos con
otros métodos y no se ha encontrado diferencia entre los amplificados desde heces y los
obtenidos por otros tejidos (Wasser el al. 1'1'17). En primates se han desarrollado iniciadores
para la amplificación de microsatélites por medio de la peRo En su mayoría estos iniciadores
han sido desarrollados para primates del viejo mundo. Goncalves el al. (2004) Y Ellsworth &
Hoelzer (19'18) han desarrollado iniciadores específicos para A. helzebul y A. palliutu.
El uso de técnicas no invasivas para extraer ADN ha permitido que primatólogos puedan
llevar a cabo estudios sobre variación genética. !lujo génico y paternidad entre otros. en
poblaciones de primates silvestres. La colecta de material fecal para extraer ADN a partir de las
células epiteliales que aparecen en las heces y la caracterización de microsatélites (marcadores
genéticos) permiten identificar al individuo y su sexo. así como seguir los genes en la
población. Se pueden responder preguntas acerca de la variación genética dentro y entre
poblaciones. divergencia entre especies y preguntas sobre filogenia. Adicionalmente se pueden
hacer estudios de genética forense y huellas moleculares individuales que permiten definir el
territorio de área de actividad. estudios de dispersión y patrones de migración. También se
pueden establecer genealogías que pueden ayudar a reconstruir aspectos de historia natural de
las poblaciones examinadas. Así. estas técnicas han permitido obtener evidencia acerca de las
elecciones reproductivas de individuos. acerca de la estructura de parentesco y acerca de la
Informe proyecto variabilidad genética del mono aullador, julio 31 de 2005 9

genética de poblaciones (variación genética y tlujo gónico) en grupos y poblaciones de primates
(García & Estrada www.primatesmx.com/tecaldna.htm).
Para la colección de esos materiales. el ADN puede ser extraído y analizado, Sin embargo
se pueden presentar desventajas. especialmente cuando se colecta material fecal, la más
importante es la pequeña cantidad de ADN presente en las heces. Además en animales
herbívoros, el compuesto secundario en plantas puede tener un efecto inhibitorio sobre la
calidad del ADN. El ADN puede ser altamente degradado debido al paso a través del tracto
intestinal. Estas desventajas que pueden tener un clecto inhibitorio sobre la calidad del ADN Y
sobre la acción de la polimerasa, se reportan superadas en estudios en los que se ha obtenido
una gran cantidad de amplificados de secuencias mitocondriales. microsatélites y RFLP a
partir de extracciones fecales. Estos resultados fueron reproducibles y se logró remover los
inhibidores y reducir el potencial de contaminación con el estricto seguimiento del protocolo de
preservación en silica o buffer (Wasser el al. 1997), Un número de estudios cada vez mayor
esta haciendo uso de estos métodos. En monos aulladores la extracción a partir de heces se ha
probado con éxito relativo en México \ mejores rcsultadus en Guvana (Ortiz el al. ~003.
Rivadavia 2004). El laboratorio dc los Tuxtlas de la Universidad Autónoma de México ha
desarrollado un protocolo para la toma y preservación de muestras de aulladores (Garcia &
Estrada www.primatesmx.com/tCealdna.hlm j.
Marcadores Moleculares
Los análisis de microsatélites (también llamado Secuencia Simple Repetitiva. son
extensiones de ADN nuclear. las cuales son compuestas por unidades repetitivas en tándem de
2 a 4 pares de bases tales como (C A)n or (CCTT AA)n. Ellas son encontradas en una amplia
lnforme provecto variabilidad gcn0lil':l del mono aullador. julio 31 de 2005 10
1:3 (

variedad de eucariotes y también en el genoma de c1oroplastos de plantas (Jame & Lagoda
I99f». Los microsatélites son secuencias de A[)N no codificante su función exacta es
desconocida, son sujetas a la selección y son altamente polimórficas. Los análisis de pedigrí
han mostrado que son codominantes y heredados de 1'1I"Inamendeliana, Un individuo hereda
alelos de ambos padres. Todos juntos. los microsatélitcs pueden ser usados para resolver
preguntas acerca de diversidad genética dentro y entre poblaciones, identificación de
individuos. distribución y números también como preguntas sobre estructuras de poblaciones
emparentadas. dinámicas de poblaciones y taxonomía (Parker el al. (998). Para hacer los
análisis de microsatélites, es necesario usar cebadores específicos. Éstos se unen al ADN
delimitando al rnicrosatélite para formar una nueva cadena de ADN microsatélite. Asi se puede
sintetizar suficiente ADN para ser visualizado y analizado.
Una vez se ha efectuado la amplificación, las partes de ADN con diferentes pesos
moleculares tendrán que ser separadas unas de otras. Esto se lleva acabo mediante la
clectrotoresis. El ADN amplificado es colocado en un gel. para la separación de los fragmentos
mediante corriente eléctrica. El fragmento de ADN con una bajo peso molecular se moverá más
rápido a través del gel que los fragmentos de ADN con un alto peso molecular. El peso
molecular de las muestras puede ser determinado por la comparación con una muestra de ADN
de tamaño molecular estándar conocido.
Marcadores microsatélites
Los microsatélites, también llamados Short Tandem Repeats (STRs) o Simple Sequence
Repeats (SSRs). son unidades de 2 a 5 pares de bases de ADN. repetidas un número variable de
veces (normalmente de 5 - 50) que puede variar entre individuos y entre los dos alelos de un
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mismo individuo (Bertranpetit 1997). Características como el poseer una herencia codominante
que permite establecer diferencias entre los genotipos homo y heterocigotos de organismos
diploides, el encontrarse ampliamente distribuidos cn cl gcnoma de plantas y animales. ser
altamente polimórficos comparados con otros marcadores como RAPOs y AFLPs, y ser
amplificables vía PCR. hacen de los STRs un marcador muy informativo para estimar la
estructura genética de las poblaciones naturales. Recientemente, los microsatélites han sido
ampliamente usados en análisis de rnapeo genético (Weissenbach el al. 1992). en análisis de
parentesco (Robinson el al. 1996). de paternidad (Queller el al. 1993). probabilidad de
identidad entre individuos (Edwards el al. 1992), estimación del tamaño efectivo de la
población (Allen el al. 1995). entre otros.
Alouatta seniculus
El género Alouatta. perteneciente a la familia Cehidae. comprende seis especies: A.
seniculus. A. belzebul, A. caraya. A. fusca. A. palliatu, yA. pif!,1'O (Emmons & Feer 1999,
Crockett & Eisenberg 1987). Estos primates son conocidos como monos aulladores debido al
característico rugido. que producen gracias al gran desarrollo del aparato hióideo.
El mono aullador rojo A. seniculus es uno de los primates neotropicales de mayor tamaño
corporal (hembras 6.4 Kg Y machos 8,1 Kg). Se distribuye desde el norte de los Andes
colombianos, Venezuela, Trinidad, las Guayanas. y Brasil al norte del Amazonas. y en Ecuador,
Perú, Bolivia y Brasil al occidente del Purus (Emmons & Feer 1999). En Colombia se
encuentra desde O hasta 3200 msnm en un amplio rango de hábitats: bosques secundarios. de
galería, bosques lluviosos tropicales. bosques de sabana. bosques secos y bosques andinos
(Hernández-Camacho & Cooper 1976 l.
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Esta especie se caracteriza por poseer cabeza. hombros. miembros y partes bajas de color
rojo oscuro a rojo púrpura. lomo y lados naranja bri liante a dorado. La cara es negro nacarado
con el mentón cubierto por una larga barba en crecimiento y poseen cola prensil. Presentan
dimorfismo sexual ya que los machos son de mayor talla que las hembras, con gran desarrollo
de la barba y del hueso hiodes (Emrnons & Feer 1999).
Las tropas de aulladores son pequeñas. tluctúan desde 2 a 16 individuos. con un tamaño
promedio de 6 a 9 animales en cada tropa (Detler 2(03). Son grupos sociales. matrilineales. en
donde hay un macho dominante. uno o dos machos subordinados y una a cuatro hembras
adultas con sus crías. Los machos subadultos generalmente se dispersan a otras tropas. aunque
en ocasiones. las hembras también migran (lzawa 19RR.Crockctt & Eiscnberg 1987). El
número de hembras adultas (nunca es más de cuatro por tropa). limita el tamaño del grupo. Al
parecer, las hembras adultas regulan su número expulsando a las hembras jóvenes. a fin de
evitar que otros machos nuevos intenten tomar el dominio del grupo (Crockett 1996). Las
tropas con muchas hembras adultas. atraen en mayor proporción machos solitarios que intentan
ingresar al grupo y derrotar al macho alta. Los cambios de macho alta generalmente conllevan
infanticidio. Tras la muerte de la cría las hembras quedan sexualmente receptivas. disponibles
para aparearse (Crockett & Esienberg 19R7. Crockeu 1996).
La dieta es principalmente folivora - Irugívoru. También consumen flores. peciolos. ramas
tiernas y brotes terminales de lianas jóvenes (I.ondoíio & Gómcz-Posada 2003. Giraldo el al.
2002. Julliot & Sabatier 1993. Braza el al. 19R3. Gaulin & Gaulin 19R2). Esta especie invierte
un alto porcentaje de tiempo descansando mientras que otras actividades como búsqueda de
alimento. movimiento y otras como interacciones sociales. son realizadas en menor proporción
(Detler 2003, Gómez-Posada el al. 2002. Soini 1992. Crockett & Eisenberg 1987). Este patrón
Informe proyecto variabilidad genética del 1110no aullador. julio 31 de 2005 13

de actividad está asociado a un metabolismo lento para la digestión de las hojas que consumen
ya una estrategia de ahorro de energía (minimizadores de viaje) (Milton 1980).
Estos monos presentan un comportamiento social de defecar en grupo. todos a la vez (Defler
2003). Esta actividad es iniciada generalmente por el macho alfa. luego de un descanso
prolongado (relacionado con digestión). Las letrinas son estables a lo largo del tiempo. y
generalmente son ramas altas que no presentan otras ramas debajo. Se considera que escogen
ese tipo de ramas para evitar "ensuciar" las hojas y frutos que potencialmente podrán ser
alimento, siendo una estrategia para evitar parásitos (Gilbcrt 1(97).
Las áreas de actividad son relativamente pequeñas y varían desde 4 hasta 25 ha (Defler
2003) con un caso extremo de 185 ha en la Amazonía oriental colombiana (Palacios &
Rodríguez 200 I j. Esta amplitud en el rango vital de la especie. parece estar relacionado con la
oferta de alimento y la calidad del hábitat así como la competencia con otros animales de
requerimientos similares (Milton 19XO). Las tropas realizan recorridos diarios dentro de sus
áreas de actividad que van desde los 400 hasta 800 m. los cuales pueden depender de la oferta
de alimentos (Gómez-Posada el al 2004. Palacios & Rodríguez 200 l. Crockett & Eisenberg
1987. Gaulin & Gaulin 1982. Neville 1972).
Alouatta seniculus presenta densidades generalmente cercanas a los 25 individuos/Km",
pero pueden variar desde 4 hasta 150 (Defler 2003. Palacios & Rodríguez 2001. Crockett &
Eisenberg 1987). La densidad de esta especie puede variar dependiendo de algunos factores
como las características intrínsecas del hábitat resultado de variaciones regionales en la
productividad de plantas. la presencia de toxinas de compuestos secundarios en los alimentos
de origen vegetal (Crockett 1985) y la heterogeneidad y estacionalidad de los bosques (Peres
1997). También la competencia con otras especies frugivoras grandes puede disminuir su
Informe proyecto variabilidad genérica del mono aullador, julio J I de 2005 14

densidad, así como la interferencia humana, tal como la fragmentación y la caza. y la
protección actual e histórica del área (Palacios & Rodríguez 2001. Schwarzkopf & Rylands
1989, Defler 1981 J. De esta forma. mucha de la variabilidad en las características poblacionales
de los aulladores está relacionada con eventos que ocurrieron en la historia reciente de los
grupos como alteración del hábitat, cacería. caida de la cosecha de frutos o enfermedad
(Chapman & Balcom 1998. Rylands & Keuroghlian 1988. Crockett 1985).
Esta especie puede habitar en pequeños relictos boscosos y bosques de galería debido a que
no requiere de amplias áreas de actividad. Son capaces de vivir cn bosques con muy poca oferta
de frutos y en bosques muy intervenidos. en diferentes estados de sucesión. Las poblaciones
parecen persistir desde que se mantengan algunos de los árboles principales de alimentación
(Defler 2003, Estrada & Coates-Fstrada 1996, Schwarzkopf & Ry lands 1989, Rylands &
Keuroghlian 1988). Sin embargo, los aulladores que existen en pequeños fragmentos aislados,
pueden estar bajo estrés en la dieta (Neves & Rylands 1991 en Crockett 1998) y pueden
presentar grandes infestaciones de parásitos (Crockett 1998). Al parecer. las condiciones de
aislamiento pueden alterar las características de tamaño y composición de grupo, típicas de esta
especie (F. Nassar como pers .. .I. Londoño como pers.: prohablemente por incapacidad de
dispersión de suhadultos (Crockctt 1998). En aulladores negros se ha encontrado un incremento
en las tasas de mortalidad (Horwich 1998 l. Estas situaciones sugieren que a pesar de que los
monos aulladores pueden sobrevivir en hábitats aislados, las poblaciones no son saludables y a
largo plazo pueden llegar a desaparecer. Para el aullador rojo, poco se sahe acerca de las
características poblacionales hajo condiciones de fragmentación; información que es importante
para entender su aparente tolerancia a la pérdida de hábitat.
Infounc proyecto variabi Iidad gí..'tlél ica del mono aullador. jul io 3 I de 2005 15

En bosques de montaña se encuentra muy poca información acerca del estado de las
poblaciones remanentes del mono aullador. Recientemente se evaluaron cuatro fragmentos de
bosque en el valle del Cauca y actualmente se están evaluando cuatro en el eje cafetero
(Gómez-Posada et al. 2005. Górnez-Posada et "l. sin publicar). Los resultados preliminares
arrojan densidades muy altas. superiores en algunos casos a los 200 individuos/Km 2 • al parecer
como resultado del fuerte aislamiento en que se encuentran estos bosques. Por ejemplo, en la
Reserva de Yotoco, un fragmento aislado de bosque premontano (1600 m). se ha estimado una
densidad alrededor de 191 individuos/Km". En la vereda de Montegrande (Caicedonia, Valle).
fueron encontrados 255 individuos/Km" en rodales de guadua (Górnez-Posada el al. 2005). Se
debe tener en cuenta que estos altos valores de densidad pueden reflejar el pequeño tamaño de
los fragmentos de bosque y que la población en el fragmento es muy pequeña (Crockett 19(8).
Por el contrario. bosques con menor grado de aislamiento. como los de la tinca Merenberg en el
Huila (15 individuos/Km", Gaulin & Gaulin 19X2). Santuario Otún-Quimbaya (71
individuos/Km". Gómez-Posada ct al. 20(4) y la cuenca del río Nima (22.6 individuos/Km".
Górnez-Posada et al. 2(05); en estos casos las densidades se asemejan a las normalmente
reportadas para tierras bajas.
Informe proyecto variabilidad genética del mono aullador. julio 3 I de 2005 16

ÁREA DE ESTliDlO
MÉTODOS
El estudio se desarrolló en el norte del departamento del Valle del Cauca. La distribución
altitudinal de los monos aulladores es de O hasta los 3200 msnm (Hernández - Camacho &
Cooper 1976). Actualmente. los fragmentos donde se ha reportado la presencia de esta especie
en el eje cafetero. se distribuyen desde los 900 hasta los 2100 111 de elevación aproximadamente
(Górnez-Posada 2004). abarcando varios tipos de bosques montanos y prernontanos.
Para el presente trabajo. se estudiaron dos fragmentos aislados en el Valle: Vereda de
Montegrande (Caicedonia) y Reserva Natural del Bosque de Yo toco (Yotoco). A continuación
se describen las áreas de estudio.
l. Vereda Montegrande (Caicedonia, Valle):
Esta vereda se encuentra en el Municipio de Caicedonia. noroccidente del departamento del
Valle del Cauca, ubicada en la vertiente occidental de la Cordillera Central (4°22' N - 75 0 48'
W). en los límites con el departamento del Quiudio (rio Barragán) (Figura 1). Los fragmentos
son de propiedad privada. en predios de 3 tincas: Jamaica. Maracaibo y La Arboleda.
Las tincas se localizan entre los 900 m a 1100 m con una temperatura promedio de 23 "C.
El clima se puede clasificar como templado y húmedo (Agudelo & Vela 2001. CVC 2000) con
un régimen hirnodal de precipitación. El promedio anual de precipitación es de 1800 mm (datos
suministrados por CVC estaciones metereológicas La Camelia y Miravalles, desde 1947 y
1969). La humedad relativa está alrededor del 86 'Yo,
Informe proyecto variabilidad genética del mono aullador. julio 3' de 2005 '7
I-ZL/

Mono Aullador
Alouatta senicúlus
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Figura 1, Poblaciones de aulladores rojos evaluadas
t. Vereda Montegrande (Valle) 2. Reserva de Yotoco (Valle).
El bosque original debió ser premontano húmedo (según Holdridge), pero fue casi
totalmente arrasado. especialmente desde los años JOs. para ganadería y agricultura.
Actualmente la cobertura boscosa de toda la zona se reduce al 6 %. compuesto de plantaciones
forestales. bosques secundarios y rodales de guadua «("ve 2000).
Los rodales de las tres tincas estudiadas abarcan 60.4 ha y son pequeños corredores
bosques de galeria que siguen el curso del río Barragán y algunas de sus quebradas afluentes.
cerca de su desembocadura en el río Quindlo (Gémez-Posada el al. 200S). Estos guaduales no
Informe proyecto variabilidad genética del mono aullador. julio 3' de 2005 18
l.."

son continuos, son seis fragmentos inmersos cn una matriz de cultivos de cítricos
principalmente, potreros y algunas producciones de maíz y plátano. Estos rodales de guadua no
tienen una figura de protección reglamentada; son preservados voluntariamente por los
propietarios; principalmente para evitar erosión y caída del talud del río Barragán. Los
guaduales protegen las orillas y además. son usados comercialmente. l.a mayoría presenta
entresaca controlada de guadua. la cual es coordinada por la eve. En estos rodales. es posible
observar además de los aulladores. monos nocturnos Vlo/uslclI1urinu.l) y otras especies de
fauna nativa como barranqueros (Momotus mOI/IiJIa). loros (Aulacorhycha aClI1olopygus).
armadillos (Dasypus sp.), ñeques (Dasyproctu sp). lechuzas. garzas, entre otros.
En esta localidad, fueron estudíados los aulladores rojos en el año 2004 (Górnez et al.
2005). La densidad encontrada es la más alta reportada hasta el momento para la especie. con
254.9 y 31.4 grupos / Km 2 (154 individuos en 19 grupos). Se observaron síntomas incipientes
de hacinamiento; algunas tropas son de gran tamaño y el número de encuentros intragrupales y
agresiones es muy alto. Esta población de monos no presentan amenaza de cacería y la
entresaca controlada de guadua 11

1). Presenta una altura sobre el nivel del mar entre los 1200 y 1700 m. Su área aproximada es
de 559 ha. divididas por la carretera Ruga - Lobogucrrcro. El bosque pertenece a la
Universidad Nacional de Palmira y es administrado por el Comité Insterinstitucional para el
Manejo de la Reserva de Yotoco, CIRNY y la Corporación Regional del Valle del Cauca, CVe.
Fue nombrado reserva en los años 60's para protección de cuencas y se realizan actividades de
turismo. educación e investigación.
La zona presenta una temperatura media de 20 "C y una precipitación promedio de 1500
mm anuales. es de régimen climatológico bimodal. La reserva se encuentra en transición entre
las zonas naturales de vida bosque premontano seco y premontano húmedo según Holdridge
(Orejuela el al. 1979). La mayor parte de la reserva esta cubierta por vegetación de bosque
maduro y secundario. de diferentes edades. debido a la fuerte entresaca anterior a su
establecimiento como área protegida en los años 50' s (Escobar 2001 j. Toda la reserva está
rodeada por pastizales, anteriormente cultivos de cale.
Esta reserva cuenta con una alta diversidad faunistica. probablemente porque su
localización le permite tener influencia tanto de la región pacífica. como del valle geográfico de
río Cauca, Se encuentran tres especies de primates: A. seniculus. Aotus lemurinus (mono
nocturno) y Cebus capuccinus (mico maicero).
Durante el año 2004 se realizó un estudio ecológico sobrc los monos aulladores en este
fragmento. Fue estimada una densidad de 23.5 grupos y de 191 indv/Km 1 (Górnez-Posada el al.
2005). Con estos datos se calculó una abundancia entre 700 a 1500 monos en 96 a 170 grupos.
A pesar de la alta densidad. no se observaron alteraciones de la estructura social en los grupos
residentes, ni síntomas de hacinamiento. Esta reserva está protegida hace 46 años. por lo tanto
no hay presión de cacería. ni extracción de madera. Por el contrario. la eve promueve
lnforme proyecto variabilidad genética del mono aullador. julio 31 de 1005 20

programas de compra de tierras en los alrededores, para aumentar la cobertura boscosa. A pesar
de no tener amenazas directas. el bosque y la población de aulladores se encuentran totalmente
aislados y es probable que lleve así por lo menos llllOS 60 años (Górnez-Posada el al. 2005).
MÉTODO DE COLECTA DE HECES EN CAMI)O:
Para realizar la colecta de heces. primero se acondicionó el úrea de estudio y las tropas de
aulladores. Es decir, luego de recorridos de reconocimiento a lo largo del bosque y de la
ubicación de algunas tropas de aulladores, se empezó con la construcción de caminos y trochas
que permitieran el seguimiento continuo de los monos. Una de las fases más largas y pesadas.
es "amansar" las tropas de aulladores, de tal forma que permitan su observación constante,
identificación del número de individuos en cada grupo e identificación de la edad y sexo de
cada uno (la identificación de edad y sexo se realizó siguiendo las características morfológicas
utilizadas por Soini 1992 y Dcflcr 19XI l. Además. es necesario acostumbrar la tropa a la
presencia del investigador. de tal forma que al defecar estén tranqui los y el observador pueda
ubicar los montículos de cada uno de los individuos (requisito fundamental para los análisis
genéticos). Esta especie, como ya se dijo anteriormente. tiene un comportamiento de defecar en
grupo, lo cual dificulta la recolección individual de heces.
Una vez se ha logrado amansar las tropas y reconocer su estructura y composición (lo cual
puede tomarse hasta dos meses de seguimientos continuos. dependiendo del historial de cacería
de cada bosque), se empiezan a real izar las colectas de heces.
El registro de la colecta se realiza de la siguiente forma:
Colecta N°:
Ficha de colección:
lnforme proyecto variabilidad genética del mono aullador, julio 31 de 2005 21

Identificación:
Colector:
Lugar y fecha:
Número de Muestras:
Medio de preservación:
Código de identificación:
Número del individuo
Posición del individuo en la tropa
i i
r= #: .: ?
Número de colecta JInicial del sexo
Inicialmente para la toma de datos. fueron considerados tres medios de preservación de
ADN: buffer de lisis, sílica y alcohol. Cada vez que un grupo iniciaba un evento de defecación.
se observaba cuidadosamente donde caían los montículos de cada individuo. La mayoría de las
ocasiones. las heces de varios monos caen unas sobre otras. imp\)sibililando la rccolección.
Dado que cada grupo defeca entre dos y tres veces por día. generalmente fue necesario
seguirlos incluso más de los 5 días presupuestados. intentando recolectar muestras de todos los
integrantes de una tropa. lo cual es una tarea difícil y no siempre exitosa.
Una vez defecaban. se colocaba una banderilla sobre cada montículo. en la cual se
identificaba cada individuo. Posteriormente se procedía a la toma de datos. usando guantes
desechables para evitar contaminación. De cada montículo se tomaban tres muestras, para
conservarlas en los tres medios diferentes.
Informe proyecto variabilidad genética del mono aullador, julio 31 de 2005 22

Colecta en hui/á de lisis:
Este medio es líquido. Al campo. se lleva un frasco cargado del buffer. Con una pala de
madera estéril (se usa una pala diferente para cada individuo). se recolecta una cantidad de feca,
similar al tamaño de una almendra. Esta es introducida dentro de frascos estériles. luego se le
agrega el buffer hasta cubrir completamente la muestra. y se sella el frasco. Cada muestra es
marcada con la identificación del grupo e individuo al cual pertenece.
Colecta en Etano:1
Este medio es líquido y por lo tanto la colecta se efectúa de manera idéntica al buffer de
lisis (ver párrafo anterior).
Colecta en silica gel:
Este medio es sólido. Al campo se llevan bolsas sellomatic con 50 g de sílica gel
previamente pesados. Con una pala de madera estéril se recolecta una cantidad de teca similar
al tamaño de una almendra. Esta es introducida dentro de gasas estériles: la muestra se envuelve
totalmente para evitar el contacto directo con la sílica. Luego las gasas son introducidas en las
bolsas sellomatic, procurando sacar el aire contenido en éstas. Cada muestra es marcada con la
identificación del grupo e indi viduo al cual pertenece
FASE DE LABORATORIO
Con el propósito de conocer la estructura genética de las dos poblaciones estudiadas. se
utilizaron loci de microsatélites como marcadores moleculares para medir la diversidad
genética. La evaluación de los cebadores polimórficos se realizó por amplificación vía PCR.
probando diferentes condiciones iniciales (ver informe preliminar para detalles). Los resultados
de la evaluación dependieron de la estandarización de las condiciones de PCR para la
Informe proyecto variabilidad genética del mono aullador. julio 31 de 2005 23
1/8

ampliticación con cada cebador obtenido y de la estandarización del programa de amplificación
para cada cebador. Los productos de arnplificación se separaron electroforéticamentc en geles
de acrilamida y se tiñeron con nitrato de plata. Una vez visualizado el marcador, los geles
fueron fotografiados. Con los datos generados por los amplificados se realizaron los análisis
estadísticos para conocer la estructura genética de los diferentes sitios donde se tomaron las
muestras. El trabajo en laboratorio inicio en enero de 2005. con la búsqueda de rnicrosatélites
para realizar la evaluación. métodos de extracción de ADN ajustables a las condiciones en
laboratorio. Se escogieron un total de IJ microsatélites (Tabla 1): bajo el criterio se haber sido
desarrollados específicamente párale genero Alouatta. Fue evitado el uso de microsatélitcs
heterólogos que estén reportados no solo para géneros. sino también hasta órdenes. a En de dar
la mayor especificidad posible. Los rnicros Ab04 hasta el Ab20 fueron sacados del articulo
Goncalves el al. 2004 en el que se reporta el diseño de los mismos para Alouatta helzehull. Los
micros Ap 68, 74 Y 6 son tomados del articulo de Ellsworth & Hoelser 1998 que fueron
diseñados para Alouatta palliatta.
La fase de laboratorio fue llevada a cabo en laboratorio de biología molecular del IAvH.
Las condiciones de cada ll\lO de los reactivos ulilil.ados Sl\n las que maneja el laboratorio en su
stock. La amplificación por PCR se realizó en termocicladores PTC-I OO. la electroforesis de
agarosa se realizó en cámaras horizontales 11.14 L1FE TECHNOLOGIES, la clectroforesis de
acrilamida al 4% se corrió en cámaras BIO-RAD Sequi-Gcn Cell 38 x 50. Para la extracción
con Kit se utilizó kit Qiagen QIAmp DNA stool Mini Kit Handbook for DNA purification from
stool simples, la extracción de fenol cloroformo se hizo según Ortiz el al. 2003.
Informe proyecto variabilidad genética del mono aullador. julio 31 de 2005 24
1/+

Tabla \. Microsatélites desarrollados para el género Alouatta y empleados en este estudio
Locus
Ab04
Ab06
Ab07
Ab09
Secut!/Ici/l (S '- 3 ')
Forward 5 -AGCGCCTCTCCTGGTTTTT AC-3
Reverse 5 - AAAAATTCCCAAACCCCACC- 3
Forward 5-GTGA 1'1'ATTGTGTGGT ACTTG-3
Reverse 5 - ATGT ATTTTTCTGGTTTT ACC-3
Forward 5-ACCCCCATCTCTTAAAACACAC-3
Reverse 5 -CCTACTGCCTAAGTCTCCCAAC-3
Ab\O Forward 5-1'A1'1'1'1'AAAAAGCCTTCCAGGTGA-3
Reverse 5 -GCAAGACTCCA TCTT AAAAAAAGAAA-3
Abl2
Abl3
Abt6
Forward 5-AATGAAGACAACAAACGAC-3
Reverse 5 -TGAAGAACACACCTGAGG-3
Forward 5-AAATCAAGGCCCACAGGG-3
Reverse 5- CAAAGGCAAGAAAGCAAGAAG-3
Forward 5-CTTCTGGAG(;AAAAAAAAA
Reverse 5 - CCCACCAGGAAGAATACT-3
Forward 5-AGGAGGTTGAGGC AAGAGAA-3
Reverso 5- ACAAACCAGTACAGCCCAGA-3
Abl7 Forward 5-GGAAACAGTGGAAGACAAAAGGAG-3
Reverse 5- AGATGGCCAAAGATAAAGACATGT AAAA-3
Ab20 Forward 5-GTGTGGTGGTGGGTGCGC-3
Reverse 5 - TTGCTTTTCCCCTTTTGTGTTTGC-3
Ap68
Ap74
Ap6
Forward 5-TGTTGGTATAATCTTTCCTA-3'
Reverse 5'- ACATACACCTTTGAGTTTCT-3'
Forward 5-TGCACCTCATCTCTTTCTCTG-3'
Reverse 5'- CATCTTTGTTTTCCTCATAGC-3'
Forward 5- AGTGTTTTATGGTTTGAGAT-3
Reverse 5- GTTTAGCAATAATGTTGATG-3
Genil no.
BV097088
BV097089
BV097090
BV097091
BV097092
BV097093
BV097094
BV097095
BV097096
BV097097
U36399
U36400
U09224
El protocolo de CTAB se realizó según Cullings 1992. pero con modificaciones en el uso de
fenol-cloroformo-isoamilico en lugar de clorotormo-isoamilico. en el uso de dos detergentes y
en la incrementación en los tiempos de lisis. La cuantificación del ADN de las muestras se
realizó por estimación de la intensidad de las bandas con Bromuro vistas en luz UV. Elementos
Informe proyecto variabilidad genética del mono aullador. julio 31 de 200S 2S
¡lb

como rnicropipetas, centrifuga, bario maría, balanzas, autoclave, horno microondas, cámara de
extracción, equipo fotográfico, computadores ultracongeladores, tanque de nitrógeno,
dispensador de hielo, fueron requeridos en este trabajo y fueron suministrados por el IAvH y
en ocasiones por la Unidad de Biotecnologia del CIA T.
Para la comparación de los métodos de extracción se utilizó un diseño de bloques
completamente al azar (DBCAj. Los resultados fueron sometidos a ANDEVA y la comparación
de medias se hizo a través de diferencias mínima significativa (DMS ) con el programa
estadístico IRRISTA T 4.3.
A lo largo del capítulo de resultados, se explicará detalladamente las metodologías
realizadas para esta fase del proyecto, puesto que la estandariazción del método para la
extracción y amplificación de ADN de las heces necesitó de gran número de ensayos y
modi ficaciones.
lnforrne proyecto variabilidad genética del mono aullador. julio 31 de 2005 26
J/c5

FASE DE CAMPO
1. Reserva del Bosque de Yotoco
RESlIL T AnOS y DISCUSIÓN
Para la toma de datos de heces fue necesario acondicionar un sistema de trochas en el
costado sur de la reserva, que permitiera el seguimiento de las tropas de aulladores. Fueron
realizadas dos cuadrículas (de J O ha cada una) con trochas cada J 00 m, para poder hacer un
seguimiento continuo de los aulladores. el cual permitiera la colecta de las heces. Se realizaron
observaciones de dos grupos de monos durante 4 meses. La mayor parte del tiempo se estuvo
tratando de amansar las tropas. para poder reconocer el número. edad y sexo de los individuos.
Las dos tropas fueron seguidas durante 5 días completos/mes por cuatro meses. desde el
amanecer. hasta cuando el grupo ingresó a un dormitorio al atardecer. Durante estos
seguimientos se intentó colectar muestras de todos los individuos de cada grupo.
Las colectas fueron realizadas en enero. marzo. abril y julio. Las muestras de esta población
fueron utilizadas para los ensayos de los métodos de extracción y amplificación de ADN.
Las muestras tomadas corresponden a las dos tropas: La tropa uno (A,,) está conformada
por 9 miembros: 2 machos adultos. 3 hembras adultas. I hembra subadulta y 3 infantes (1
hembras y 2 machos). La tropa dos (Al,) esta conformada por seis miembros: 2 machos
adultos, 3 hembras adultas y J infante. A continuación se muestran los individuos de los cuales
se colectaron heces en este bosque (Tabla 2).
Informe proyecto variabilidad genética del mono aullador. julio 31 de ~005 27

Tabla 2. Datos de las muestras colectadas en el bosque de Yotoco
Datos campo
l. hembra pequeña - subadulta
(Grupo A,J
2. macho a «(j. A,J
3. Hembra P (G. A;,)
4. Macho P (G. A"l
5. Juvenil (Grupo Ao)
6. Infante- Churni (G. Ao)
7. Macho P «(j. Ao)
8. Ana hembra adulta «(j. Ao)
9. Hembra con cría (G. Ao)
10. Sofía hembra subadulta (G. Ao)
2. Vereda Montegrande (Caicedonia-Valle)
ldentificacián en
laboratorio Fecha colecta
I:I:H: p
1:2:M:a
1::1:H: [1
I :4:M: 11
2:1 :.1\
2:2:ln
2:3:M~
2:4:Ha
2:5:11c
2:6:Hs
5-03-05
16-0:1-05
16-0:1-05
16-0:1-05
19-04-05
19-04-05
19-04-05
19-04-05
19-04-05
19-04-05
Para poder penetrar dentro de los rodales de guadua de este fragmento. se invirtió largo
tiempo en la realización de algunos caminos que permitieran el desplazamiento del
investigador. Afortunadamente en esta área. los aulladores no mostraron rechazo al observador
y no se necesito de más de tres semanas para amansar\os. Durante dos meses se siguieron varios
grupos de aulladores. al menos 5 días por mes. Fueron colectadas I 1 muestras de fecales.
pertenecientes a diferentes grupos.
De los 19 grupos presentes en estos bosques. se colectaron heces de 9 (Tabla 3).
Desafortunadamente no se pudieron obtener muestras de varios individuos de un mismo grupo;
a excepción de la tropa E (se cuenta con heces de 3 individuos). Cada grupo de aulladores en
este fragmento estuvieron conformados en promedio por 8.1 individuos.
Informe proyecto variabilidad genética del mono aullador, julio 31 de 2005 28
113

• ••••Il.
I
• •I
•l.
I
• ••
Tabla 3. Datos de las muestras colectadas en la verdea Montegrande
FASE DE LABORATORIO
Métodos de colecta:
ldentificacián Fecha
Datos campo en lahoratorio colecta
A l Macho adulto (Grupo A) 3:9:Ma 7-05-05
E 1 Macho adulto (G. El) 3:5:Ma 7-05-05
E lb Hembra adulta (G. El) 3:4:l1a 7-05-05
E Ic Macho subadulto (G. El) 3:2:Ms 7-05-05
E 2 NN 3 (G. E2) 3:6:NN 7-05-05
E 3 Macho adulto (G. E3 ) 3:8:Ma 7-05-05
G 1 NN I adulto (G. (j 1) 3:10:NN 7-05-05
G 2 Macho adulto (G. (2) 3: II:Ma 7-05-05
G 3 NN 2 adulto (G (3) 3:7:NN2 7-0S-0S
G4 Macho adulto (G. (4) ~:~:t\~a 7-0S-0S
G5 Macho adulto (G. CíS) 3:I:Ma 7-05-05
Fue necesario evaluar además del método de extracción, la eficacia de los métodos de
colecta y preservación de la muestra. Esto con el fin dc sabe-r con cual de ellos se obtiene mejor
calidad del ADN y con cual se tiene una manejo más adecuado en laboratorio. El trabajo con
heces fecales requiere de muchos cuidados en su manejo ya que se trata de material en
descomposición el cual presenta una gran cantidad de microorganismos (hongos y bacterias)
que son agentes contaminantes y transmisores de enfermedades; a su vez los primates pueden
contagiar enfermedades a los humanos.
Informe proyecto variabilidad genérica del mono aullador.julio 31 de ~005 29
IIJ.

Los primeros ensayos antes de obtener la primera evidencia de ADN en las heces, se
presenta en la figura 2. La cantidad de ADN es alta, por encima de 50 ng, pero hubo una fuerte
evidencia de degradación. Este ADN correspondió al total de presente en cada muestra. Es
decir que incluye el ADN de los microorganismos, el del tejido vegetal que este presente y el de
los monos que estará en menor proporción. El ADN visualizado correspondió a las muestras
colectadas en buffer y sílica; las muestras de etanol no presentaron ADN; por 10 que se descartó
este medio para la colecta. Posteriormente, las muestras conservadas en sílica arrojaron
evidencia de fuerte contaminación y fue descartada. Las muestras se colectaron solamente en
buffer.
Figura 2. Extracción de ADN heces colectadas en etanol, sílica y buffer
Estandarización del método de extracción y amplificación de ADN fecal:
El primer paso para poder realizar este trabajo fue obtener ADN a partir de las heces de
aullador. En su mayoría los protocolos de extracción de ácidos nucleicos se conforman de una
serie de pasos que componen tres fases principales: La primera fase corresponde a la lisis
celular, la segunda fase corresponde al aislamiento de los ácidos nucleicos de restos de
proteínas y componentes nucleares. La tercera fase son los pasos requeridos para purificar el
Informe proyecto variabilidad genética del mono aullador, julio 31 de 2005 30
,ji

ADN de impurezas que puedan interferir con la subsiguiente manipulación enzirnática, la cual
es determinante para el uso posterior del ADN (DeSalle 1'/ al. 200 l l. Al utilizar herramientas
como los microsatélites se tiene la ventaja de poder trabajar con pocas cantidades de ADN de
una calidad optima. Por tanto cuando se presentan inconvenientes con la amplificación de las
regiones microsatélites se debe mirar si hay problemas con el protocolo de extracción. Como se
registra más adelante, los resultados en amplificación obtenidos desde muestras fecales de
monos aulladores obligaron la realización de una evaluación de los métodos de extracción para
saber con cual de ellos se tenía un mejor resultado; aunque no se puede hablar de resultados
óptimos.
Con las muestras de heces fecales se ensayaron] protocolos de extracción de ADN.
Inicialmente se uso el método de fenal-cloroformo. posteriormente se utilizó el kit de
extracción de Qiagen y finalmente se utilizó el protocolo de CTAB (Figura ]l. Se evaluó la
efectividad de acuerdo con la cantidad en nanogramos de ADN obtenida por cada método y con
los resultados de amplificación por PCR para cada uno. Se encontró que si había diferencias
significativas entre los métodos de extracción (p

c.
Figura 3. ADN extraído de heces con los diferentes protocolos
a). Fenol cloroformo, b) Kit Qiagen, e) CTAB.
El mayor número de amplificados logrados correspondieron al método de CTAB. Pero esto
es debido a las limitantes que presenta el kit para realizar extracciones repetidas. Estas son
necesarias por el poco volumen de ADN que se logra obtener y la alta cantidad que se requiere
para cada PCR. La eficiencia de la extracción relación con la obtención de amplificados es de
0.07 para CTAB y de 0.025 para el kit.
Para contar con un control positivo para la estandarización de la amplificación de los
micros, fue utilizada sangre de aulladores. Con estas controles, se puede estar seguros de que el
ADN amplificado corresponde a la especie A. seniculus y no a otro organismo como podría
Informe proyecto variabilidad genética del mono aullador, julio 31 de 2005 32

suceder en las muestras de heces. Como control positivo. se lomaron seis muestras de sangre de
individuos de Alouaua seniculus mantenidos en cautividad (Tabla 4). Estas muestras se
obtuvieron en el Zoológico de Santa Fé en Medellin, gracias a la colaboración de Adriana
Ramírez.Juan Diego Palacio y Jorge Caro (zooctenista del Zoológico). Estos aulladores fueron
decomisados en la terminal de transportes de Medellín, se desconoce su procedencia pero se
piensa que en su mayoría son de la costa Norte del país. Las muestras fueron conservadas en
buffer de colecta para vertebrados. La extracción de ADN se realizó con el protocolo de sangre
para vertebrados usado en el laboratorio dellAvH.
Tabla 4. Identificación de las muestras de sangre
de seis individuos de mono aullador rojo en cautiverio
Numero
1
2
3
4
5
6
Descripción
l hembra Juvenil
2 hembra Juvenil
3 Macho juvenil pequeño
4 Macho Adulto tullido
5 Machojuvenil grande
6 Hembra adulta
Estas muestras de sangre (Figura 4) presentaron resultados óptimos para la amplificación,
con una eficacia de 0.83 para los amplificados obtenidos. Estos fueron visualizados tanto en
agarosa como en acrilamida (Figuras 6 y 7).
Informe proyecto variabilidad genética del mono aullador. julio 31 de 2005 33
ID~

Estandarización de las condiciones de PCR:
Figura 4. Extracción de muestras de sangre
El proceso de estandarización de la amplificación de regiones de microsatélites consiste en
hallar las condiciones óptimas para amplificar las regiones de interés. Estas regiones son
posteriormente visualizadas para realizar la asignación alélica e identificar los alelos que
presenta cada individuo de la población. De esta forma se pueden realizar los análisis
poblacionales que son de interés; para este caso la estimación de flujo y variabilidad. Por tanto
si no se logran unas condiciones óptimas en este proceso es imposible obtener resultados del
tipo poblacional a partir de los micro satélites y la obtención de estas condiciones esta ligada
principalmente a dos factores: ADN y Taq polimerasa.
Este proceso fue realizado en tres fases: una inicial con las muestras de heces
correspondientes a una primera colecta, con las que se buscaba verificar si el ADN obtenido era
amplificable. Una segunda fase en la que haciendo uso de las muestras de sangre, se querían
obtener las condiciones para cada uno de los trece micro satélites a utilizar; y una tercera fase en
la que se extrapolaron las condiciones usadas con las muestras de sangre a las muestras de
heces. Las condiciones estandarizadas para las muestras de sangre se presentan en las tablas 3 y
4. Los resultados obtenidos (ejemplo en la figura 4) indican que el lograr amplificados a partir
de muestras de heces presenta inconvenientes que muy seguramente están relacionados con la
Informe proyecto variabilidad genética del mono aullador, julio 31 de 2005 34

calidad del ADN obtenido. Se puede descartar con seguridad inconvenientes de reactivos,
dados los excelentes resultados en las muestras de sangre. Con estas condiciones se
amplificaron ll de los 13 microsatélites utilizados en el estudio. en las muestras de sangre.
Tabla 3. Condiciones de PCR estandarizadas para las muestras de sangre.
Reactivo
Buffer
BSA
MgCh
dNTPs
Primer F
Primer R
Taq
ADN
Concentración final
IX
0.01%
2mM
100flM
72Nm
72nM
3u
15ng
Tabla 4. Protocolo de corrida.
Volumen a usar por
individuo en )ll.
2.5
2.5
2.5
0.5
0.18
0.18
0.084
5
Paso Tiempo
194°C I min
2 94()C 30 seg
345°C 45 seg
472°C 30 seg
5 35 ciclos desde el paso 2
6 72 Oc lO min
En el caso de las muestras de heces se dehe considerar que el ADN que se ohtiene a partir
de estas corresponde a células que ya se encuentran en Ull proccso de deterioro (Avers 1991 l.
Este proceso no se puede revertir. sumado a que en proporción la cantidad de estas células es
mínima en una matriz que contiene microorganismos y tejido vegetal ahundante. De estos
últimos también se extrae su ADN y hace parte del total utilizado para las amplificaciones. No
Informe proyecto variabilidad genética del mono aullador, julio 31 de 2005 35

existe una metodología que permita hacer separación de los ADNs previa a su amplificación.
La selectividad esta dada por dos aspectos: primero los cebadores escogidos fueron
desarrollados para el genero Alouatta. Segundo que los cebadores de las regiones micro satélites
se anclan en el sitio específico que corresponde a su homología, lo cual se hace más astringente
cuando se utilizan temperaturas de apareamiento altas.
Para el micro satélite Ab12, los resultados de la amplificación muestran las bandas del lado
derecho que corresponden a las seis muestras de ADN de sangre (Figura 5). Las del lado
izquierdo a cinco muestras de heces fecales. Solo dos de los individuos de heces presentan
bandas y estas son más tenues que las bandas de los individuos de sangre. Esto indica un menor
amplificado.
Figura 5. Amplificados obtenidos para el microsatélite Ab12.
Dadas estas características de las muestras de heces, parece ser necesario un proceso de
estandarización de tipo individual para cada muestra para poder lograr amplificados. La figura
6 muestra como, bajo unas mismas condiciones de PCR, amplifican algunas muestras. Y bajo
otras condiciones amplifican otras pocas muestras. El grupo de los Tuxtlas en México informó
(comunicación personal) la necesidad de realizar una estandarización individual para mejorar
los resultados. En la figura 6, en la parte superior, aparece amplificado el tercer individuo de
Informe proyecto variabilidad genética del mono aullador, julio 31 de 2005 36

aullador, usando las condiciones estandarizadas con sangre para este microsatélite. En la parte
inferior aparece amplificado el segundo individuo cuando se hizo PCR usando el producto del
PCR de la parte superior.
Figura 6. Amplificados muestras de heces microsatélite Ab09.
El éxito de la asignación alélica a partir de ADN proveniente de muestras de heces fecales
ha sido reportado para primates en varios trabajos como Fernando el al. 2003, Morin el al.
2001, Wasser el al. 1997, Roeder el al. 2004, entre otros. Estos éxitos han sido logrados
utilizando las mismas técnicas y herramientas de las cuales se ha hecho uso en este estudio,
pero en lapsos de tiempos mayores, no inferiores a dos años. Para este estudio solo contamos
con siete meses. Los resultados del grupo de trabajo en los Tuxtlas (México) han advertido la
imposibilidad de realizar un trabajo poblacional a partir de heces fecales en primates en
periodos de tiempo corto.
Han sido reportados errores en la asignación alélica cuando se usan muestras de heces
fecales (Roon el al. 2005, Lathuilliére el al. 2001, Bradley & Vigilant 2002, Broquel & Petit
2004 entre otros). En estos trabajos se demuestran errores dados por la poca reproducibilidad de
Informe proyecto variabilidad genética del mono aullador, julio 31 de 2005 37
/0'1

la técnica y por la dificultad de obtener bandas claras y definidas como las obtenidas con otro
tipo de muestras, pero principalmente por la infestación que hay en las muestras de ADN
correspondiente a otros organismos.
Con las muestras que presentaron amplificados se pasó a la fase tres a fin de caracterizar
cada individuo (Figura 7). En paralelo con las muestras de sangre se ve la dificultad para hacer
la asignación debido a la baja intensidad de las bandas, al bandeo inespecífico y principalmente
a la no reproducibilidad en los resultados. Con esto se logra verificar que los inconvenientes
para obtener amplificados son debido a la calidad del ADN que se encuentra presente en las
muestras y principalmente por el tipo de muestra. Ocurre además que de los pocos amplificados
obtenidos se presentan problemas de reproducibilidad, lo que genera un gran inconveniente si
se tiene en cuenta que una de las ventajas de usar micro satélites es que los resultados son
reproducibles.
a.
b.
Figura 7. Bandas en acrilamida con amplificados del micro Ablü.
a) bandas de muestras de sangre, b) bandas de muestras de heces.
Informe proyecto variabilidad genética del mono aullador, julio 31 de 2005 38

Resumen de las actividades realizadas en el laboratorio, para la estandarización de los
métodos de extracción y amplificación:
Esta fase del proyecto fue la de mayor trabajo y dedicación. La estandarización de esta
metodología es muy complicada y ha necesitado de ajustes continuos en las prácticas de
laboratorio (ver informe preliminar). A continuación se listan las principales actividades
desarrolladas en laboratorio. para establecer la "mejor" forma de realizar el proceso.
Inicialmente mientras se conseguían los rnicrosatélites específicos para el género Alouaua
se trabajó con microsatélites de humanos (donados por el laboratorio de genética Humana de la
Universidad del Valle). Se pueden probar secuencias de humanos dada la alta hornología que
existe entre los primates. Sin embargo no se obtuvo éxito en las amplificaciones, para un total
de 10 ensayos con diferentes secuencias de microsatélites incluidas secuencias de plantas y
RAPDs. Estos primeros ensayos demostraron la necesidad de realizar procesos de limpieza de
ADN adicionando solventes. inhibidores de enzimas y de RNA al protocolo de extracción.
Los siguientes ensayos demostraron serios problemas de degradación del ADN de los
tejidos conservados. Por consiguiente. se congelaron a una temperatura por debajo de los -150
oc.
Con las directrices que arrojaron los primeros ensayos. se realizaron extracciones de dos
formas: fenol cloroformo y kit para vertebrados. Para el primero no fueron obtenidos resultados
positivos. Para el kit se encontraron bandas de ADN.
Los PCR realizados con los microsarélites especiales para este género de monos
presentaron de nuevo ausencia de amplificados. Por consiguiente Iue realizada una prueba para
observar inhibidores. Esta consiste en contaminar una muestra de ADN de un positivo y
lnforme proyecto variabilidad genética del mono aullador. julio 31 de 2005 39

observar si hayo no-amplificación. A la vez permite observar el tipo de ADN que se tiene (si es
vegetal o de otro tipo), usando un micro que este funcionando. Se realizó un PCR para ambas
pruebas con el micro globulata de Espeletia grandi» (Jasen Raucher) con control positivo. El
resultado de esta prueba es que las muestras contaminadas no amplificaron, con lo cual se
demuestra que el ADN que se tenía no era amplificable.
Posteriormente se inició la prueba de microsatélites. l.as condiciones de prueba inicial se
establecieron a partir de lo publicado por Goncalves el al. 2004 y las usadas por los diferentes
investigadores del laboratorio de biología molecular del Instituto von Humboldt. Con estas
condiciones, se obtuvieron las primeras bandas de micros. A partir de este punto fue necesario
estandarizar las condiciones y encontrar las más adecuadas para cada cebador, realizando varias
pruebas. Ya con las condiciones establecidas se realizaron los ensayos de amplificación. Sin
embargo, estos no fueron exitosos debido a factores de contaminación. Se corrieron 14 PCR
hasta evitar la contaminación en la amplificación. Una vez que se eliminó la contaminación, se
realizaron las siguientes consideraciones:
1. Hacer diluciones considerando una primera dilución 1:1. Así: 1:4, 1:3, 1:2, 1:I(original)
2. Correr un PCR para dos individuos de aullador y un negativo para los tres cebadores Ab12,
ab20, Ab06 con estas diluciones pero solo bajo el volumen que venia usando ósea 0.25,.11,para
20¡.t1de reacción.
3. En este PCR (uno por cada micro) sc usaron las Temperaturas de anidamiento (Tm). - Abl2
= 60°C,
- Ab06 = 50°C
- Ab20 = 65°('
Informe proyecto variabilidad genética del mono aullador. julio J 1 de 1005 40
/01

Sin embargo los resultados no fueron satisfactorios y fue necesario cambiar las condiciones de
prueba. Se probó otro micro con las condiciones de un cóctel exitoso. para un micro con
tamaño similar (y así verificar que el ADN era amplificable). Fue probado con las condiciones
del micro üM07 del árbol Roble.
Ya con estas nuevas condiciones. se corrieron las muestras obtenidas de sangre de
aulladores. De nuevo no se obtuvieron resultados exitosos. Por lo tanto se realizaron nuevas
consideraciones y nuevas pruebas:
• Puede haber algún tipo de contaminación por células humanas. dada la alta homologia
que hay entre humanos y monos.
• Se está trabajando a un Tm muy bajo que da muy poca astringencia y por ende se
amplifica cualquier cosa que tenga algo de homología con el cebador. Por esta razón puede
darse el barrido y las múltiples bandas.
• Se deben manejar estas muestras de forma diferente para evitar contaminación. Es
posible que deban tratarse como se hace en los laboratorios dc genética de humanos.
Se deben usar un filtro en las puntas
Usar pipetas diferentes para el peR y para los geles.
Dejar un lugar único para la realización de los PCRs
Servir el control negativo al inicio, a parte y sin haber tocado los ADNs
Servir las muestras de ADN de último y lejos del control negativo
Usar siempre guantes nuevos para cada PCR
No tocar ninguno de los reactivos de ['CR sin guantes.
Informe proyecto variabilidad genética del mono aullador.julio 31 de 2005 41
/00

A partir de este momento se inició de nuevo el proceso de estandarización (ajuste de
temperaturas. magnesio y concentración de A DN) para cada uno de los micros. Se realizaron un
total de 31 PCR hasta llegar a obtener una banda definida en cada uno de los a seis individuos
de sangre. Este resultado se logró para 11 de los 13 microsatélitcs. Dos microsatélites no
amplificaron. Con estos resultados se hizo el paso ha acrilamida que es el que determina la
utilidad de las condiciones de amplificación o no.
La primera corrida en acrilamida mostró que aun eran necesarios más ajustes en todos los
mieras realizados. Estos fueron visualizados nuevamente en acrilamida y se observó que siete
de los II ya se visualizaban adecuadamente. Es decir que se puede hacer una asignación alélica
de acuerdo con lo que se observó. Los otros cuatro micros se continuaron ajustando. Dejando
quietas las condiciones para los siete estandarizados. fueron utilizadas las muestras de ADN de
las heces. Sin embargo, no se obtuvieron amplificados con ellas.
Fue necesario entonces iniciar un nuevo proceso de ajuste de las cantidades y concentración
pero solo del ADN obtenido a partir de heces, para buscar que se lograran amplificados.
Finalmente las muestras de las heces se están corriendo bajo los parámetros establecidos en
estos siete meses de trabajo. tras 110 PCR de ensayo. Con estos parámetros. se obtienen los
resultados menos negativos (para detalles ver informe preliminar).
CONCLUSIONES:
Durante todo este proceso se ha logrado establecer que el tiempo es un factor determinante
en el trabajo. Varias evaluaciones hechas a los ADNs mostraron como rápidamente se van
degradando. También es clave en el trabajo la forma de preservar las muestras ya que varias de
las conservadas a _80°C tenían hongos.
Informe proyecto variabilidad genética del mono aullador. julio 31 de :!OOS 42

Resultados medianamente exitosos solo se obtuvieron para 12 PtR. De los 13
microsatélites, en sangre se lograron resultados ideales para 1(1 (produjeron bandas muy claras).
En heces se amplificaron solamente algunos individuos.
Una de las bondades con las que contaba el planteamiento inicial de este estudio era la de
poder integrar dos áreas del conocimiento biológico como lo son la ccología y la genética, Para
el aporte genético se contó con las herramientas moleculares suficientes para obtener los
mejores resultados. Los microsatélites han sido utilizados en un sin numero de estudios de este
tipo y presentan unas ventajas que permiten obtener la información necesaria para establecer
estructura genética. Aun más importante que el marcador escogido. es el contar con un
excelente laboratorio en cuanto a reactivos, equipos y personal con mucha experiencia en
herramientas moleculares, con muchos años en el proceso de estandarización a partir de
diferentes tipos de muestras y diferentes marcadores. De forma similar este trabajo contó con
un conocimiento existente sobre la ecología de la especie: el cual es un aspecto que muy pocas
investigaciones tienen a su disposición. El contar con un grupo de investigadores que conoce a
profundidad las poblaciones muestreadas y que realiza un gran esfuerzo en la toma de muestras
son en su conjunto componentes de un alto valor a considerar en una investigación. Este trabajo
con más tiempo de muestreo habría podido arrojar resultados mucho más satisfactorios,
Informe proyecto variabilidad genética del mono aullador. julio 31 de 2005 43

LITERA TlIRA CITADA
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