Determinación de variabilidad genética en poblaciones ... - Inafor

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DETERMINACIÓN DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN CINCO POBLACIONES NATURALES DE Cedrela odorata L. UTILIZANDO LA TÉCNICA RAPD La colecta del material vegetal se realizó entre los meses de Julio y Agosto del 2007. Se tomaron los foliolos de hojas de árboles adultos con la ayuda de una tijera telescópica y se colocaron en bolsas plásticas con silica gel debidamente etiquetadas. La distancia entre árboles muestreados fue de 100 m. La media de árboles muestreados por procedencia fue de 18.4 (rango de 14-22). La distancia mínima entre poblaciones fue de 18.3 Km. Se representa en el siguiente mapa los lugares en que se hicieron las colectas. Elaborado por Lic. David Cerda Figura 2. Mapa indicando las poblaciones muestreadas de Cedrela odorata L. de Nicaragua. Las muestras se depositaron en bolsas pláticas (con la ubicación de la población y el número de muestra) para su secado con silica gel de 3 a 5 días. Los foliolos deshidratados se pulverizaron en un mortero y se conservaron a -20 °C mientras se le realizaba la extracción de ADN. 37
DETERMINACIÓN DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN CINCO POBLACIONES NATURALES DE Cedrela odorata L. UTILIZANDO LA TÉCNICA RAPD 4.2. EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO La extracción de ADN, se realizó a partir del procedimiento basado en el protocolo descrito por Möller et al. (1992), adaptado para Cedrela odorata L. en el Laboratorio de Genética Molecular de la UNAN-León, a través del Proyecto Marcadores 2006. 4.2.1. Protocolo 1. En un tubo Eppendorf de 2 ml se depositaron 0.04 g de material vegetal pulverizado para añadir 500 μl de Buffer TES (Tris 100 mM pH= 8.0, EDTA 10 mM, SDS 2%) más 2 μl de β-mercaptoetanol 14.4 M. Mezclar. 2. Incubar a 65° C en baño maría por 30 min, sacar los tubos para añadir 140 μl de NaCl 5 M y 65 μl de CTAB 10 %. Mezclar por inversión y continuar incubando por 10 min más. 3. Añadir 225 μl de acetato de amonio 5 M y dejar por 30 min en hielo. 4. Agregar un volumen de cloroformo alcohol:isoamílico (24:1). Mezclar por inversión. Centrifugar a 12000 rpm por 10 min a 4° C. 5. Transferir la fase superior acuosa a un nuevo tubo y añadir aproximadamente un volumen de cloroformo alcohol:isoamílico (24:1). Mezclar por inversión. Centrifugar a 12000 rpm por 10 min a 4° C. 6. Transferir la fase superior acuosa a un nuevo tubo y añadir un volumen de isopropanol puro frió. Mezclar por inversión. 7. Centrifugar a 12000 rpm por 10 min a 4° C. 8. Lavar dos veces con etanol 70%. Después de la segunda lavada se deja el tubo abierto a temperatura ambiente para secar el sedimento. 9. Disolver el sedimento en una cantidad adecuada de TE (Tris 10 mM y EDTA 1 mM) dependiendo de la cantidad de sedimento. 38
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