Determinación de variabilidad genética en poblaciones ... - Inafor

DETERMINACIÓN DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA EN CINCO POBLACIONES NATURALES DE Cedrela odorata L. UTILIZANDO LA
TÉCNICA RAPD
10. Añadir 1 μl de ARNasa por cada 10 μl de muestra de ADN obtenida de la
extracción. Incubar por 1 h a 37° C en baño maría.
11. Conservar el ADN a -20 ° C.
4.2.2. Chequeo y cuantificación del ADN extraído
Para verificar la presencia del ADN extraído se realizó un chequeo cualitativo
mediante electroforesis en un minigel de agarosa al 0.8 % usando tampón TAE 1X (0.04
M Tris-acetato, 0.001 M EDTA) y una velocidad de migración electroforética de 5 V/cm.
La muestra de ADN se colocó en los pocillos del gel con la ayuda de un tampón de
carga (EDTA 10 mM, glicerol 20% y azul de bromofenol 0.25%). Después de la
migración de aproximadamente 30 min, se verifica la presencia de ADN visualizándolo
bajo luz ultravioleta a 260 nm, después de ser tiñendo el gel de 15 a 20 min en una
solución de bromuro de etidio a 0.5 μg/ml.
Si los resultados son positivos las muestras se cuantifican preparando un factor
de dilución de 200 (5 μl de la muestra y 995 μl de agua destilada) que se depositan en
cubetas de cuarzo para determinar la concentración de ADN en un espectrofotómetro
Lambda EZ201 (UV vis Spectophotometer) a una absorbancia (A) de 260 nm. La
concentración se calcula en μg/μl con la fórmula:
Donde:
A260= Absorbancia de la muestra a 260 nm
50= Factor que indica que una absorbancia de 1.0 se tienen 50 μg/ml
1000= Factor de conversión de ml a μl
Conocida la concentración del ADN extraído se diluye a 5 ng/ μl y se conservan a –20°
C.
A260xfactor de diluciónx50
1000
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