comparación entre marcadores microbianos - Inia
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La determinación de la síntesis de proteína microbiana<br />
en el rumen: comparación <strong>entre</strong> <strong>marcadores</strong> <strong>microbianos</strong> (Revisión)<br />
M.D. Carro<br />
Dpto. de Producción Animal I, Universidad de León, 24071 León<br />
dp1mct@unileon.es<br />
RESUMEN<br />
La cuantificación de la síntesis de proteína microbiana y de la degradación de la proteína del alimento en el<br />
rumen son dos puntos clave en todos los sistemas de valoración nutritiva para los animales rumiantes. La determinación<br />
de la síntesis microbiana se realiza mediante la utilización de <strong>marcadores</strong> <strong>microbianos</strong>, los cuales se<br />
clasifican en internos (constituyentes de los microorganismos ruminales) y externos (sustancias administradas a<br />
los animales que son incorporadas por los microorganismos). Sin embargo, ninguno de los <strong>marcadores</strong> utilizados<br />
hasta el momento cumple todos los requisitos exigidos a un «marcador ideal». En esta revisión se analizan<br />
las ventajas y los inconvenientes de los principales <strong>marcadores</strong> <strong>microbianos</strong> internos (ácidos nucleicos, bases<br />
púricas, ácido diaminopimélico, D-alanina, ácido aminoetilfosfónico, perfiles de aminoácidos y ATP) y externos<br />
( 15 N, 35 Sy 32 P), y se discuten los resultados obtenidos en algunos estudios en los que se han utilizado varios<br />
<strong>marcadores</strong>.<br />
PALABRAS CLAVE:<br />
Proteína microbiana<br />
Rumen<br />
Marcadores <strong>microbianos</strong><br />
Purinas, 15 N<br />
INTRODUCCIÓN<br />
La posesión del retículo-rumen, y de la población microbiana que alberga, permite a<br />
los animales rumiantes transformar las complejas estructuras de la pared celular de los vegetales<br />
en elementos nutritivos que pueden ser utilizados, una vez absorbidos, para su<br />
mantenimiento y funciones productivas. Sin embargo, el hecho de que los alimentos sean<br />
fermentados en el retículo-rumen antes de la digestión gástrica dificulta el conocimiento<br />
de los nutrientes aportados en la ración que son utilizables por el animal. En lo referente a<br />
Recibido: 5-5-00<br />
Aceptado para su publicación: 16-3-01<br />
Invest. Agr.: Prod. Sanid. Anim. Vol. 16 (1), 2001
6 M.D. CARRO<br />
la proteína, los aminoácidos que llegan al duodeno pueden tener tres orígenes diferentes:<br />
la proteína microbiana sintetizada en el rumen, la proteína del alimento que no ha sido degradada<br />
y la proteína endógena (descamaciones celulares, jugos digestivos, etc.). La proteína<br />
microbiana constituye, generalmente, una proporción considerable del flujo duodenal<br />
de nitrógeno (N) aminoacídico en los animales rumiantes. Así, se calcula que cuando<br />
los animales reciben raciones convencionales, la proteína microbiana representa <strong>entre</strong> el<br />
40 y el 90 % de los aminoácidos que llegan al intestino delgado (Schniffen y Robinson,<br />
1987), aunque en ocasiones puede alcanzar el 100 % (AFRC, 1992; Stern et al., 1994).<br />
Debido al papel que juegan los microorganismos ruminales en la digestión de las estructuras<br />
de la pared celular de los vegetales y a que la proteína microbiana tiene una gran calidad,<br />
las raciones de los rumiantes deben ser formuladas para permitir el crecimiento óptimo<br />
de estos microorganismos.<br />
La cuantificación de la síntesis de proteína microbiana y la determinación de la degradación<br />
de la proteína de los alimentos en el rumen son dos puntos críticos en todos los<br />
sistemas de valoración nutritiva para los animales rumiantes (Clark et al., 1992), y cobran<br />
especial relevancia en el caso de los animales que presentan altos niveles de producción,<br />
ya que un aporte insuficiente de aminoácidos puede limitar la misma (Nocek y Russel,<br />
1988). Uno de los mayores impedimentos para obtener información fiable sobre estos dos<br />
aspectos es la falta de un método simple y preciso para determinar la síntesis de proteína<br />
microbiana. La cuantificación del crecimiento microbiano en el rumen se puede llevar a<br />
cabo únicamente mediante la utilización de <strong>marcadores</strong> <strong>microbianos</strong> (Schönhusen et al.,<br />
1995). Generalmente se utilizan animales provistos de cánulas en el rumen y el duodeno,<br />
y se determina el flujo duodenal de N no amoniacal (NNA). Posteriormente, es necesario<br />
diferenciar el origen del N (microbiano, alimenticio y endógeno), y para ello se determina<br />
la relación marcador/N en la digesta duodenal y en una muestra de microorganismos aislados<br />
del rumen o del duodeno de los animales. La relación <strong>entre</strong> ambos valores (marcador/N<br />
en la digesta duodenal / marcador/N en los microorganismos) representa la fracción<br />
nitrogenada de la digesta duodenal que es de origen microbiano. El resto del N que llega<br />
al duodeno corresponde a la fracción proteica del alimento no degradada en el rumen y a<br />
las secreciones y descamaciones endógenas. Este procedimiento in vivo es el más ampliamente<br />
aceptado, pero presenta tres puntos conflictivos. El primero de ellos es la cuantificación<br />
de la digesta duodenal. Esta cuantificación puede realizarse mediante una colección<br />
total de la digesta en animales provistos de cánulas reentrantes, ya que éstas permiten<br />
recoger la digesta, muestrearla y volverla a introducir en el duodeno. Sin embargo, este<br />
tipo de cánulas no es muy utilizado, debido a que su implantación exige un doble corte en<br />
la pared del duodeno, lo que afecta a la inervación del intestino y a su motilidad (Wenham<br />
y Whyburn, 1980). Por ello es más frecuente el uso de cánulas simples o en T. Estas cánulas<br />
únicamente permiten el muestreo de la digesta duodenal en momentos puntuales, y<br />
para cuantificar el total de la digesta es necesario utilizar <strong>marcadores</strong> de flujo, lo que añade<br />
nuevas imprecisiones al proceso. Cada marcador presenta una serie de ventajas e inconvenientes<br />
(Warner, 1981), pero el método más utilizado actualmente es la técnica del<br />
doble marcador propuesta por Faichney (1975), que combina un marcador de la fase sólida<br />
y otro de la líquida.<br />
Un segundo punto conflictivo es el aislamiento de una fracción microbiana representativa<br />
de toda la población ruminal. En la mayoría de los estudios en los que se ha determinado<br />
la síntesis de proteína microbiana in vivo, la muestra de microorganismos que se<br />
toma como referencia se ha aislado de la fase líquida del rumen, debido a que éste es el
SÍNTESIS DE PROTEÍNA MICROBIANA Y MARCADORES MICROBIANOS 7<br />
procedimiento más sencillo, aunque en algunos estudios se ha aislado también a partir del<br />
contenido duodenal (Siddons et al., 1982; Kennedy et al., 1984; Schönhusen et al., 1995).<br />
Sin embargo, prácticamente en todos los estudios en los que se han aislado bacterias asociadas<br />
a la fase sólida (BAS) y a la fase líquida (BAL) del rumen se ha observado que<br />
ambas difieren en su composición química (Merry y McAllan, 1983; Legay-Carmier y<br />
Bauchart, 1989), y que ésta a su vez difiere de la de los protozoos (Martin et al., 1994).<br />
En cuanto a los hongos ruminales, en el momento actual no existen datos definitivos sobre<br />
su composición química y su contribución a la proteína microbiana.<br />
El tercer punto conflictivo es la utilización de un marcador microbiano adecuado. Según<br />
Broderick y Merchen (1992) un marcador microbiano «ideal» debería cumplir los siguientes<br />
requisitos: (1) ser fácil de determinar y cuantificar, (2) no formar parte de los alimentos<br />
que reciben los animales, (3) distribuirse de manera uniforme en todas las especies<br />
microbianas ruminales y (4) ser biológicamente estable. Dehority (1995) añade otros<br />
3 requisitos: (5) no ser absorbido en el tracto digestivo, (6) estar en una proporción constante<br />
en los microorganismos ruminales en todas las fases de su crecimiento y (7) que todas<br />
sus formas (p.e. libre o formando parte de células intactas de microorganismos ruminales<br />
o de alguna de sus partes) presenten el mismo ritmo de tránsito a través del tracto<br />
digestivo. Sin embargo, ninguno de los <strong>marcadores</strong> que se utilizan hasta el momento cumple<br />
todos los requisitos señalados anteriormente (Broderick y Merchen, 1992; Obispo y<br />
Dehority, 1999), por lo que la elección de uno u otro para realizar estudios sobre la síntesis<br />
de proteína microbiana en el rumen resulta especialmente complicada. El objetivo de<br />
este trabajo es revisar la información disponible sobre los diferentes <strong>marcadores</strong> <strong>microbianos</strong>,<br />
haciendo especial hincapié en los más utilizados, y comparar los resultados obtenidos<br />
en aquellos estudios en los que se ha utilizado más de uno de ellos.<br />
Los <strong>marcadores</strong> <strong>microbianos</strong> se clasifican en dos grandes grupos: <strong>marcadores</strong> internos<br />
y externos. La principal característica de los <strong>marcadores</strong> internos es que son constituyentes<br />
de las células microbianas y por ello no necesitan ser administrados a los animales<br />
experimentales. Por el contrario, los <strong>marcadores</strong> externos deben ser administrados a los<br />
animales experimentales para que sean incorporados por los microorganismos ruminales<br />
y formen parte de sus estructuras.<br />
MARCADORES MICROBIANOS INTERNOS<br />
Los principales <strong>marcadores</strong> internos son: los ácidos nucleicos (ácido ribonucleico<br />
(ARN) y ácido desoxirribonucleico (ADN)), las bases púricas (purinas), el ácido diaminopimélico<br />
(DAPA), la D-alanina, el ácido aminoetilfosfónico (AEPA), los perfiles de aminoácidos<br />
y el ATP.<br />
Ácidos nucleicos (ARN y ADN) y purinas<br />
La utilización de estas sustancias como <strong>marcadores</strong> <strong>microbianos</strong> se basa en las altas<br />
concentraciones de ADN y, especialmente, de ARN presentes en los organismos unicelulares<br />
(Broderick y Merchen, 1982). Su utilización como <strong>marcadores</strong> <strong>microbianos</strong> se remonta<br />
a la década de los sesenta, en la que diversos autores observaron que la síntesis de<br />
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8 M.D. CARRO<br />
proteína microbiana en el rumen estaba relacionada con el flujo total de polinucleótidos<br />
(Ellis y Pfander, 1965) y con la excreción urinaria de derivados púricos (Topps y Elliot,<br />
1965). Posteriormente se han utilizado como <strong>marcadores</strong> <strong>microbianos</strong> el total de ácidos<br />
nucleicos (Zinn y Owens, 1980; Ushida et al., 1985), el ADN (Arambel et al., 1982) y el<br />
ARN (Ling y Buttery, 1978; Merry y McAllan, 1983; Schönhusen et al., 1995), aunque<br />
en los últimos años la utilización de las purinas ha adquirido un mayor protagonismo (Pérez<br />
et al., 1996a, 1997b; Calsamiglia et al., 1996; Carro y Miller, 1999a).<br />
El análisis de purinas (Zinn y Owens, 1986) es simple, rápido y más barato que la<br />
mayoría de los otros procedimientos utilizados para estimar la síntesis microbiana en el<br />
rumen. Sin embargo, la utilización de las purinas como marcador microbiano presenta<br />
también algunos inconvenientes. En primer lugar, los ingredientes que forman parte de las<br />
raciones de los animales contienen, en mayor o menor cantidad, purinas. Algunos alimentos<br />
presentan contenidos muy inferiores a los existentes en los microorganismos ruminales,<br />
pero otros (p.e. harina de pescado) presentan valores ligeramente menores a los encontrados<br />
por algunos autores en estos microorganismos (Titgemeyer et al., 1989; Pérez<br />
et al., 1996b; Carro y Miller, 2001). McAllan y Smith (1973a) observaron que cuando se<br />
introducían ácidos nucleicos libres (ARN y ADN) en el rumen, éstos eran degradados rápidamente<br />
a nucleósidos y bases, las cuales eran posteriormente catabolizadas (McAllan y<br />
Smith, 1973b). Sin embargo, la situación puede ser diferente en el caso de los ácidos nucleicos<br />
de los alimentos, ya que en este caso se encuentran protegidos por las estructuras<br />
de la pared celular (McAllan, 1982). La degradabilidad de las purinas de origen alimenticio<br />
se ha determinado en algunos estudios, pero los resultados obtenidos son contradictorios.<br />
Algunos autores (McAllan y Smith, 1973a; Schelling y Byers, 1984) concluyen que<br />
el flujo duodenal de purinas de origen alimenticio es insignificante, a pesar de que otros<br />
estudios, en los que se marcaron los ácidos nucleicos <strong>microbianos</strong> con 32 P (Smith et al.,<br />
1978) o con 15 N (Pérez et al., 1997a), señalan que, dependiendo de la ración ingerida por<br />
los animales, hasta un 30 % del flujo duodenal de purinas puede ser de origen alimenticio,<br />
lo que provocaría una sobreestimación de la síntesis de proteína microbiana cuando se utilizan<br />
las purinas como marcador. Pérez et al. (1996b) determinaron la degradación aparente<br />
y verdadera de las purinas de nueve alimentos (heno de alfalfa, harinas de pescado y<br />
carne, gluten feed, cebada, maíz, tortas de soja y girasol, y paja de cebada) tras su incubación<br />
en bolsas de nylon en el rumen de ovejas. Los valores de degradación verdadera de<br />
las purinas de estos alimentos tras 24 horas de incubación (valor correspondiente a un ritmo<br />
de paso a través del rumen de 0,042 h –1 ) oscilaron <strong>entre</strong> 80 y 99 % (excepto la paja de<br />
cebada que presentó un valor del 50 %). Por otra parte, Calsamiglia et al. (1996) determinaron<br />
la degradación de las purinas de ocho raciones diferentes en fermentadores continuos,<br />
y señalaron que la degradación microbiana del N púrico de origen alimenticio osciló<br />
<strong>entre</strong> 81 y 110 %.<br />
Un segundo inconveniente de las purinas como marcador microbiano es que la relación<br />
purinas/N no es la misma en las bacterias y protozoos, e incluso varía en las diferentes<br />
especies bacterianas. Arambel et al. (1982) analizaron las relaciones ARN/N y<br />
ADN/N en diecisiete especies bacterianas ruminales y observaron que éstas oscilaban <strong>entre</strong><br />
8,0 y 102 y <strong>entre</strong> 0,2 y 39, respectivamente. Cuando las bacterias se agruparon según<br />
las características de su pared celular, observaron que los valores medios de la relación<br />
ARN/N eran de 37 y 62 para las bacterias gram-positivas y gram-negativas, respectivamente,<br />
y de 8,8 y 19 para la relación ADN/N. Estas diferencias <strong>entre</strong> bacterias se han observado<br />
también en la relación purinas/N, tal como puede observarse en la Tabla 1. En la
SÍNTESIS DE PROTEÍNA MICROBIANA Y MARCADORES MICROBIANOS 9<br />
mayoría de los trabajos en los que se han comparado distintos extractos <strong>microbianos</strong>, se<br />
ha observado que las BAS presentan un menor contenido en purinas (o en ARN y ADN)<br />
y una menor relación purinas/N, tanto en estudios in vivo (Merry y McAllan, 1983; Legay-Carmier<br />
y Bauchart, 1989; Pérez et al., 1996b, 1997b, 1998a; Martín-Orúe et al.,<br />
1998), como in vitro (Carro y Miller, 2001). Estas diferencias en el contenido en purinas<br />
parecen deberse a las características intrínsecas de las diferentes especies que integran<br />
cada fracción bacteriana y al menor ritmo de crecimiento de las BAS en comparación con<br />
las BAL (Bates et al., 1985; Legay-Carmier et al., 1989).<br />
En la casi totalidad de los estudios en los que se ha determinado la síntesis de proteína<br />
microbiana utilizando las purinas como marcador, las BAL se han tomado como muestra<br />
de referencia, lo que provoca una subestimación de la síntesis de proteína microbiana,<br />
tal y como se ha observado en los escasos estudios en los que se han comparado los resultados<br />
obtenidos con BAL y BAS (Pérez et al., 1998a; Carro y Miller, 2001). En el trabajo<br />
de Carro y Miller (2001) las raciones estaban constituidas por pared celular (fibra neutro-detergente)<br />
y la cantidad de proteína microbiana sintetizada fue una media de un 38 %<br />
mayor cuando se utilizaron las BAS como extracto microbiano de referencia que cuando<br />
se utilizaron las BAL. En general, el error cometido en la determinación de la cuantía de<br />
la síntesis microbiana dependerá de la proporción de BAS presente en el rumen. Esta proporción<br />
depende del tipo de ración que reciben los animales, pero puede llegar a ser de un<br />
90 % en animales que reciben raciones constituidas únicamente por forrajes (Merry y<br />
McAllan, 1983). Una solución válida para paliar este problema sería obtener extractos<br />
bacterianos representativos de todas las bacterias ruminales, que incluyeran tanto las BAL<br />
como las BAS. A pesar de que existen diversos procedimientos para aislar las BAS, su<br />
eficacia suele ser pequeña debido a que estas bacterias se encuentran firmemente adheridas<br />
a las partículas de alimento. La mayoría de los métodos comúnmente utilizados para<br />
desligar las BAS de las partículas de alimento permiten liberar <strong>entre</strong> un 30 y un 60 % de<br />
las mismas (Merry y McAllan, 1983; Legay-Carmier y Bauchart, 1989; Martín-Orúe et<br />
al., 1998), aunque otros autores (Whitehouse et al., 1994; Ranilla et al., 2001) han utilizado<br />
procedimientos que permiten desligar aproximadamente un 80 % de las BAS. Sin embargo,<br />
algunos de estos tratamientos pueden afectar a la integridad de las bacterias y ocasionar<br />
pérdidas celulares que modifican relación purinas/N, tal y como han observado<br />
Martín-Orúe et al. (1998) y Carro y Miller (2001). Por otra parte, incluso cuando se han<br />
aplicado tratamientos que permiten un alto porcentaje de desligamiento de las BAS, la recuperación<br />
final de éstas en el pellet bacteriano es inferior al 60 % (Ranilla et al., 2001).<br />
Son muy pocos los estudios en los que se ha intentado aislar un extracto bacteriano<br />
«representativo». Carro y Miller (2001) aislaron un extracto bacteriano que incluía bacterias<br />
asociadas a la fase sólida y líquida de la digesta obtenida de un fermentador semicontinuo<br />
(RUSITEC), y observaron que la relación purinas/N de dicho extracto presentó un<br />
valor intermedio <strong>entre</strong> los encontrados en las BAL y las BAS (ver Tabla 1). Cecava et al.<br />
(1990) observaron que la relación purinas/N de un extracto microbiano «mixto» aislado<br />
de terneros fue similar a la encontrada en las BAS aisladas de los mismos animales (ver<br />
Tabla 1).<br />
Por otra parte, los protozoos que pasan al abomaso y duodeno contribuyen también al<br />
flujo duodenal de purinas. Estos microorganismos suelen presentar valores para la relación<br />
purinas/N en torno al 50 % de los que presentan las bacterias (ver Tabla 1; Ling y<br />
Buttery, 1978; Firkins et al., 1987; Robinson et al., 1996), por lo que la síntesis de proteína<br />
microbiana se subestima de nuevo cuando se utilizan extractos bacterianos como<br />
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Tabla 1<br />
Contenido en purinas y relación purinas/nitrógeno (valores <strong>entre</strong> paréntesis) de muestras de bacterias (BAL:<br />
bacterias asociadas a la fase líquida; BAS: bacterias asociadas a la fase sólida) y protozoos aislados del rumen<br />
Referencia<br />
Origen de los microorganismos<br />
Ración BAL BAS<br />
Bacterias<br />
mixtas<br />
Protozoos<br />
Firkins et al. (1987) 1 Rumen (vacuno) Forraje: concentrado (70:30) 51,4 (0,80) 57,5 (0,78) – 27,8 (0,44)<br />
Cecava et al. (1990) 3 Rumen (vacuno) Forraje: concentrado (34:66) 153 (1,56) 125 (1,33) 123 (1,30) –<br />
Pérez et al. (1996b) 2 Rumen (ovino) Heno: concentrado (67:33) 59,5 (0,86) 42,2 (0,60) – –<br />
Robinson et al. (1996) 3 Rumen (vacuno) Ensilado: concentrado (56:44) – – 84,6 (0,93) 40,1 (0,62)<br />
Pérez et al. (1997b) 2 Rumen (ovino)<br />
Paja: concentrado (82:18) 126 (1,90) 93,4 (1,58) – –<br />
Paja: concentrado (40:60) 138 (1,95) 99,1 (1,51) – –<br />
Pérez et al. (1998) 2 Rumen (ovino)<br />
Paja 111 (2,12) 93,3 (1,55) – –<br />
Paja: cebada grano (50:50) 112 (1,91) 106 (1,71) – –<br />
Martín-Orúe et al. (1998) 2 Rumen (ovino)<br />
Paja: cebada grano (80:20) 93,7 (1,57) 77,9 (1,36) – –<br />
Paja: cebada grano (20:80) 147 (1,89) 89,1 (1,28) – –<br />
Carro y Miller (2001) 2 In vitro (RUSITEC) Pared celular de forrajes<br />
(Fibra neutrodetergente)<br />
64,7 (0,83) 38,6 (0,60) 48,1 (0,72) –<br />
1 mg (equivalente a ARN de levaduras)/g materia seca.<br />
2 mol/g materia seca.<br />
3 mg (equivalente a ARN de levaduras)/g materia orgánica.
SÍNTESIS DE PROTEÍNA MICROBIANA Y MARCADORES MICROBIANOS 11<br />
muestra de referencia. Sin embargo, la cuantificación de la proteína protozoaria presenta<br />
una gran dificultad, ya que los protozoos suelen sufrir una retención selectiva en el rumen<br />
debido a su adhesión a las partículas de alimento (Broderick y Merchen, 1992), y son escasos<br />
los estudios en los que se ha determinado su contribución al flujo de N duodenal<br />
(Ling y Buttery, 1978; Robinson et al., 1996).<br />
Otro inconveniente de la utilización de las purinas como marcador microbiano es que<br />
la relación purinas/N en las bacterias cambia tras la administración de alimento a los animales<br />
(Craig et al., 1987; Cecava et al., 1990). Craig et al. (1987) observaron que los valores<br />
de la relación purinas/N en las bacterias ruminales (BAS y BAL) eran mínimos inmediatamente<br />
antes de la administración de alimento y aumentaban hasta presentar valores<br />
máximos (<strong>entre</strong> 33 y 44 % superiores a los registrados anteriormente) <strong>entre</strong> 7y9<br />
horas tras la administración de alimento. Sin embargo, este problema puede paliarse realizando<br />
muestreos seriados del contenido ruminal, de tal forma que se abarquen todas las<br />
fases del ciclo alimenticio (Cecava et al., 1990).<br />
Como se ha comentado anteriormente, una de las principales ventajas de las purinas<br />
como marcador microbiano es que su análisis por el método de Zinn y Owens (1986) es<br />
simple, rápido y barato. El método consiste en hidrolizar las purinas mediante su tratamiento<br />
con una solución de ácido perclórico, seguido por la precipitación de las mismas<br />
con nitrato de plata y su cuantificación mediante espectrofotometría. Sin embargo, Makkar<br />
y Becker (1999) observaron que la recuperación de purinas de extractos bacterianos<br />
ruminales que habían sido añadidos a celulosa, almidón y fibra neutro-detergente era solamente<br />
del 50 % cuando se usaba este método, y propusieron la utilización de la técnica<br />
descrita por Balcells et al. (1992) para obtener una recuperación de las purinas cercana al<br />
100 %. Dicha técnica utiliza la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), por lo<br />
que para llevar a cabo los análisis de purinas se necesita disponer de un equipo de HPLC.<br />
Si bien es cierto que no todos los centros de investigación de nuestro país disponen de dicho<br />
equipo, existen laboratorios que realizan los análisis de purinas mediante esta técnica<br />
a un precio asequible (aproximadamente 2.000 pesetas por análisis).<br />
A pesar de todos los inconvenientes anteriormente descritos, las purinas son recomendadas<br />
como uno de los métodos de elección para determinar la síntesis de proteína microbiana<br />
(Broderick y Merchen, 1992; Brodiscou y Jouany, 1995).<br />
Las purinas que llegan al duodeno pueden ser absorbidas y posteriormente reutilizadas<br />
por el animal o metabolizadas y excretadas en la orina en forma de alantoína y otros<br />
metabolitos (McAllan, 1982). Debido a ello se ha propuesto que la excreción urinaria de<br />
derivados púricos (DP) puede constituir un parámetro válido para estimar el flujo duodenal<br />
de proteína microbiana. A pesar de que los primeros estudios que mostraron la existencia<br />
de una estrecha relación <strong>entre</strong> la excreción urinaria de DP y la concentración de<br />
ácidos nucleicos en el rumen se llevaron a cabo hace más de treinta años (Topps y Elliot,<br />
1965), ha sido en la última década cuando se han realizado numerosos trabajos sobre este<br />
tema. Las purinas de los microorganismos ruminales que llegan al duodeno son absorbidas<br />
rápidamente a través de la mucosa intestinal, en forma de nucleósidos o como bases<br />
libres, si bien en el ganado vacuno sufren una cierta degradación a ácido úrico en su paso<br />
por la mucosa (Stangassinger et al., 1995). Las purinas absorbidas se transportan hasta el<br />
hígado, donde tiene lugar su utilización y degradación. Tras su metabolismo, las purinas<br />
se excretan en la orina en forma de alantoína, ácido úrico, xantina e hipoxantina, aunque<br />
en el ganado vacuno las cantidades de estos dos últimos compuestos son insignificantes<br />
(Verbic et al., 1990). Otras vías de excreción son la saliva y la leche, pero cuantitativa-<br />
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mente representan una pequeña proporción (Chen et al., 1990a). La estrecha relación<br />
existente <strong>entre</strong> la excreción urinaria de DP y el flujo duodenal de células microbianas se<br />
ha puesto de manifiesto en numerosos trabajos (Sibanda et al., 1982; Balcells et al., 1991;<br />
Chen et al., 1990b; 1991), y ha permitido el desarrollo de ecuaciones que permiten predecir<br />
el flujo duodenal de N microbiano a partir de la excreción urinaria de DP en el ganado<br />
vacuno (Verbic et al., 1990) y ovino (Chen et al., 1990b; Balcells et al., 1991), aunque<br />
hasta el momento no se dispone de ninguna ecuación para el ganado caprino.<br />
La utilización de la excreción urinaria de DP para estimar el flujo duodenal de N microbiano<br />
presenta varias ventajas respecto a otros métodos. La ventaja principal es que se<br />
trata de una técnica no invasiva, con lo cual los posibles trastornos en el comportamiento<br />
alimentario de los animales o en su motilidad digestiva (producidos por la implantación<br />
de cánulas) quedan descartados. Por otra parte, esta técnica es relativamente fácil de llevar<br />
a cabo en la mayoría de las circunstancias, ya que únicamente se necesita realizar la<br />
recogida de la orina de los animales. En algunos estudios (Lebzien et al., 1993; Giesecke<br />
et al., 1994) se ha puesto de manifiesto la relación existente <strong>entre</strong> la excreción de alantoína<br />
en leche y el flujo duodenal de N microbiano, hecho que abre nuevas posibilidades a<br />
esta técnica. La posibilidad de estimar el flujo duodenal de N microbiano a partir de la<br />
concentración de alantoína en la leche [se ha observado que el ácido úrico excretado en la<br />
leche procede en su mayoría del metabolismo de la glándula mamaria (Giesecke et al.,<br />
1994)] es especialmente interesante, ya que en las vacas lecheras interesa lograr un alto<br />
ritmo de síntesis de proteína microbiana debido a la repercusión que tiene la nutrición<br />
proteica no sólo en la producción de leche, sino también en la función reproductora (Ferguson<br />
y Chalupa, 1989). Si bien los resultados obtenidos son sólo aproximados, esta técnica<br />
resulta muy útil en aquellos casos en los que no se puede predecir la síntesis de proteína<br />
microbiana porque no se conoce la energía ingerida por los animales (p.e. cuando<br />
los animales reciben forrajes), y no resulta complicado llevarla a cabo, ya que el muestreo<br />
de la leche durante el ordeño es una práctica habitual (Stangassinger et al., 1995).<br />
La excreción urinaria de DP es una técnica prometedora, pero existen ciertos aspectos<br />
que deben ser clarificados para su mejor utilización. Uno de ellos es la cuantificación de<br />
la excreción de DP de origen endógeno. A pesar de que diferentes grupos de trabajo<br />
(Chen et al., 1990b; Balcells et al., 1991) han determinado valores similares para la excreción<br />
urinaria endógena de DP en el ganado ovino, no se conoce bien como se ve afectada<br />
esta excreción cuando los animales reciben raciones de diferente calidad y/o a diferentes<br />
niveles de ingestión. Chen et al. (1992) señalaron que la excreción urinaria de DP<br />
de origen endógeno disminuía a medida que el animal disponía de purinas de origen exógeno.<br />
Sin embargo, en un estudio más reciente, Pérez et al. (1998b) observaron que la excreción<br />
endógena de DP aumentaba al hacerlo la cantidad de concentrado ingerida por los<br />
animales, y aumentar por ello el flujo duodenal de purinas. Aunque la contribución de las<br />
purinas de origen endógeno a la excreción urinaria de DP es proporcionalmente pequeña<br />
(Chen et al., 1992), una cuantificación precisa de su contribución bajo diferentes circunstancias<br />
alimenticias permitiría obtener estimaciones más exactas del flujo duodenal de N<br />
microbiano (Stangassinger et al., 1995).<br />
Otro aspecto conflictivo es que en el cálculo del flujo duodenal de N microbiano a<br />
partir de la excreción urinaria de DP se asume que los microorganismos ruminales presentan<br />
una relación purinas/N constante, ya que ésta no es determinada en cada experimento.<br />
Sin embargo, esta relación varía con los factores que se han comentado anteriormente, e<br />
incluso se ve afectada por las características de la ración, como son la cantidad de proteí-
SÍNTESIS DE PROTEÍNA MICROBIANA Y MARCADORES MICROBIANOS 13<br />
na de la misma y su relación forraje:concentrado (Clark et al., 1992). Por otra parte, se ha<br />
observado que existen diferencias en el metabolismo de las purinas <strong>entre</strong> las diferentes especies<br />
animales, y también <strong>entre</strong> animales jóvenes y adultos (Stangassinger et al., 1995).<br />
La identificación de estas diferencias permitiría desarrollar modelos que pudieran aplicarse<br />
a todo tipo de animales, así como extrapolar los datos de una especie a otra.<br />
Por último, hay que tener en cuenta que la excreción urinaria de DP es un parámetro<br />
que refleja posibles cambios en la eficiencia de digestión y absorción de los microorganismos,<br />
es decir, es un parámetro que refleja la biodisponibilidad del N microbiano, mientras<br />
que el flujo duodenal de N microbiano determinado directamente mediante el uso de <strong>marcadores</strong><br />
es independiente de estos procesos (Stangassinger et al., 1995). Asimismo, hay<br />
que considerar que las estimaciones del flujo duodenal de N microbiano obtenidas a partir<br />
de la excreción urinaria de DP no son valores exactos (Broderick y Merchen, 1982; Chen<br />
et al., 1992; Stangassinger et al., 1995), ya que se obtienen aceptando determinados supuestos<br />
que pueden no ser ciertos en todos los casos (p.e. una relación constante purinas/N<br />
en los microorganismos ruminales), pero se acepta su validez a efectos comparativos.<br />
Una posible alternativa para el futuro sería analizar la excreción urinaria de DP en todos<br />
aquellos experimentos en los que se determine la síntesis de proteína microbiana<br />
mediante la utilización de otros <strong>marcadores</strong>, de tal forma que se pudieran llegar a clarificar<br />
los aspectos mencionados anteriormente. Por otra parte, el análisis de la relación purinas/N<br />
en los microorganismos ruminales de animales que reciban raciones de diferente<br />
calidad y administradas a diferentes niveles de ingestión permitiría obtener un rango de<br />
valores, de tal forma que en trabajos posteriores se dispusiera de los valores más apropiados<br />
para utilizar en cada caso.<br />
Ácido diaminopimélico (DAPA)<br />
El DAPA es un aminoácido que forma parte de la pared celular de numerosas bacterias<br />
ruminales, pero que no se encuentra en los protozoos (Ling y Buttery, 1978). Su posible<br />
utilización como marcador microbiano se planteó en los años cincuenta y desde entonces<br />
se ha utilizado en multitud de estudios, a pesar de que presenta numerosos inconvenientes.<br />
El hecho de que el DAPA se encu<strong>entre</strong> únicamente en la pared celular de las<br />
bacterias hace que la relación DAPA/N en las mismas varíe con aquellas condiciones que<br />
alteran el tamaño celular. Las condiciones que favorecen el crecimiento de las bacterias<br />
de mayor tamaño provocan una disminución de la relación DAPA/N, ya que la relación<br />
pared celular/protoplasma será proporcionalmente menor cuanto mayor sea el tamaño de<br />
las bacterias (Broderick y Merchen, 1992). Por el contrario, las bacterias de menor tamaño<br />
presentan una proporción DAPA/N comparativamente mayor. Además, en algunas<br />
bacterias como los cocos gram-positivos no existe DAPA en su pared celular (Merry y<br />
McAllan, 1983). Debido a estas diferencias <strong>entre</strong> bacterias no resulta extraño que en varios<br />
estudios (Merry y McAllan, 1983; Olubobokun y Craig, 1990) se haya observado que<br />
el contenido en DAPA y la relación DAPA/N es significativamente menor en las BAS<br />
que en las BAL (ver Tabla 2).<br />
Por otra parte, en algunos estudios (Ling y Buttery, 1978; Olubobokum y Craig,<br />
1990) se ha observado que la cantidad de DAPA en los microorganismos ruminales varía<br />
en función del tiempo transcurrido desde la ingestión de alimento. Dufva et al. (1982)<br />
señalaron que la relación DAPA/N era menor en las BAL aisladas de animales que<br />
Invest. Agr.: Prod. Sanid. Anim. Vol. 16 (1), 2001
14 M.D. CARRO<br />
Tabla 2<br />
Contenido en ácido diaminopimélico (DAPA) y relaciones (valores <strong>entre</strong> paréntesis) DAPA/N y ácido<br />
aminoetilfosfónico-N (AEPA-N)/N de muestras de bacterias (BAL: bacterias asociadas a la fase líquida; BAS:<br />
bacterias asociadas a la fase sólida) y protozoos aislados del rumen<br />
Marcador microbiano y referencia<br />
Origen de los<br />
microorganismos<br />
Ración BAL BAS<br />
Bacterias<br />
mixtas<br />
Protozoos<br />
Ácido diamimopimélico<br />
Merry y McAllan (1983) 1 Rumen (vacuno) Cebada: paja cebada: urea<br />
(45:48:3) 3,81 (0,047) 2,20 (0,031) – –<br />
Rhanema y Theurer (1986) 1 Rumen (vacuno) Sorgo grano: melazas: forraje<br />
(84:6:10) – – 3,28 (0,049) 1,02 (0,017)<br />
Legay-Carmier y Bauchart (1989) 1 Rumen (vacuno) Heno: concentrado (50:50) 2,23 (0,034) 1,39 (0,024) – –<br />
Olubobokum y Craig (1990) 1 Rumen (vacuno) Heno: concentrado (94:6) 1,90 (0,021) 1,58 (0,022) – –<br />
Martin et al. (1994) 2 Rumen (vacuno) Heno: cebada (65:35) 2,52 (0,028) 1,10 (0,013) – –<br />
Robinson et al. (1996) 2 Rumen (vacuno) Ensilado: concentrado (56:44) 7,05 (0,078) – – 2,03 (0,031)<br />
Ácido diaminoetilfosfónico<br />
Ling y Buttery (1978) Rumen (ovino) Cebada grano: paja: melazas: torta<br />
de soja (58:16:10:16) – – –(0,64) –(2,26)<br />
Cebada grano: paja: melazas: urea<br />
(72:16:10:2) – – –(0,22) –(1,72)<br />
1 mg de DAPA/g materia seca.<br />
2 mg de DAPA/g materia orgánica.
SÍNTESIS DE PROTEÍNA MICROBIANA Y MARCADORES MICROBIANOS 15<br />
recibían raciones forrajeras que en las aisladas de animales que recibían raciones con altas<br />
proporciones de concentrado, si bien Robinson et al. (1996) no observaron efectos significativos<br />
de la ración en la relación DAPA/N de bacterias y protozoos aislados de novillos<br />
que recibían raciones compuestas por ensilado y concentrado.<br />
Otro problema grave es la ausencia de DAPA en los protozoos ruminales (Ling y<br />
Buttery, 1978). A pesar de ello, las preparaciones de protozoos aislados del rumen presentan<br />
ciertas cantidades de DAPA, bien por su contaminación con bacterias durante el aislamiento<br />
o, principalmente, debido a la presencia de restos de bacterias no digeridas en el<br />
interior de los mismos (Coleman y Sandford, 1979). Sin embargo, la relación DAPA/N en<br />
los protozoos es muy inferior (<strong>entre</strong> 3y8veces menor) a la de las bacterias (ver Tabla 2;<br />
Czerkawski, 1974; Rahnema y Theurer, 1986; Robinson et al., 1986), por lo que no considerar<br />
este hecho produce una subestimación de la producción de N microbiano. Estos hechos<br />
hacen que el DAPA no cumpla la premisa de encontrarse distribuido de forma uniforme<br />
en todos los microorganismos ruminales.<br />
La lisis microbiana que tiene lugar en el rumen y abomaso provoca una pérdida del<br />
contenido celular, de tal forma que muchos restos de paredes celulares de bacterias pasan<br />
al duodeno (Gómez et al., 1991). Dado que el DAPA solamente se encuentra en la<br />
pared celular de las bacterias, este hecho hace que la digesta duodenal presente una relación<br />
DAPA/N anormalmente alta, y por ello se sobreestima la producción de N microbiano.<br />
A lo largo de varios experimentos realizados con ovejas, Masson et al. (1991)<br />
observaron que del total de DAPA presente en la digesta duodenal sólo un 69 % formaba<br />
parte de células bacterianas intactas cuando las muestras se obtenían una hora antes<br />
de la ingestión de alimento, y esta cifra se reducía al 29 % si las muestras se obtenían<br />
varias horas después de la ingestión. Estos datos indican que, a menudo, más de la mitad<br />
del DAPA que llega al duodeno puede encontrarse en forma libre o en restos de paredes<br />
celulares, de tal forma que en algunos estudios se han obtenido proporciones de N<br />
microbiano en la digesta duodenal superiores al 100 % (Nikolic y Jovanovic, 1973). En<br />
otros estudios se ha observado que el uso del DAPA provocó una sobreestimación de la<br />
producción de N microbiano en comparación con otros <strong>marcadores</strong>, como el 35 S (Siddons<br />
et al., 1982; Whitelaw et al., 1984), el 15 N (Siddons et al., 1982; Schönhusen et al.,<br />
1995), el perfil de aminoácidos (Siddons et al., 1982; Schönhusen et al., 1995) y las purinas<br />
(Illg y Stern, 1994). Por el contrario, Ling y Buttery (1978) y Walker y Nader<br />
(1975) obtuvieron menores valores de síntesis de proteína microbiana con DAPA que<br />
con 35 S. Parte de estas diferencias pueden deberse al método analítico usado para determinar<br />
las concentraciones de DAPA. Este análisis (Czerkawski, 1974) utiliza técnicas<br />
de cromatografía de intercambio iónico y de colorimetría, y aunque es el método utilizado<br />
en la mayoría de los laboratorios, muchos de ellos han introducido modificaciones en<br />
el mismo. En cualquier caso, el análisis del DAPA implica numerosos pasos y es una<br />
técnica larga y laboriosa.<br />
Algunos autores (Czerkawski, 1974; Rahnema y Theurer, 1986) han encontrado<br />
DAPA en algunos alimentos de uso habitual en las raciones de los animales rumiantes.<br />
Rahnema y Theurer (1986) señalaron que los valores de la relación DAPA/N en diferentes<br />
alimentos oscilaban <strong>entre</strong> 18 y 40 % de los encontrados en las bacterias ruminales. Sin<br />
embargo, otros estudios (Czerkawski, 1974) han determinado valores de DAPA mucho<br />
menores (inferiores a la mitad) en alimentos de características similares, y se han atribuido<br />
los altos valores encontrados por Rahnema y Theurer (1986) a imprecisiones del método<br />
analítico utilizado por estos autores (Broderick y Merchen, 1992).<br />
Invest. Agr.: Prod. Sanid. Anim. Vol. 16 (1), 2001
16 M.D. CARRO<br />
Debido a los inconvenientes comentados, principalmente al hecho de que gran parte<br />
del DAPA presente en la digesta duodenal no está asociado con células bacterianas intactas,<br />
actualmente no se recomienda su uso como marcador microbiano (Masson et al.,<br />
1991; Broderick y Merchen, 1992; Illg y Stern, 1994), a pesar de que ha sido muy empleado<br />
en las últimas décadas.<br />
D-alanina y ácido aminoetilfosfónico (AEPA)<br />
La D-alanina es un aminoácido que forma parte de la pared celular de numerosas bacterias<br />
ruminales, pero que no se encuentra en los protozoos (Ling y Buttery, 1978) ni en<br />
los alimentos utilizados en las raciones de los rumiantes (Garrett et al., 1986). Sin embargo,<br />
la D-alanina ha sido utilizada en muy pocos estudios, y en alguno de ellos se han obtenido<br />
proporciones de N microbiano en la digesta duodenal superiores al 100 % (Quigley y<br />
Schwat, 1988), lo que teóricamente resulta imposible. Por estas razones la D-alanina no<br />
suele utilizarse como marcador microbiano.<br />
Horiguchi y Kandtsu (1959) aislaron un aminoácido, el ácido aminoetilfosfónico<br />
(AEPA), que formaba parte de los protozoos ciliados del rumen, pero que no estaba presente<br />
en la mayoría de los alimentos usados comúnmente en las raciones de los animales,<br />
por lo que se propuso su utilización como marcador protozoario. Sin embargo, en estudios<br />
más recientes (Ling y Buttery, 1978; Horigani y Horiguchi, 1990) se ha observado la presencia<br />
de AEPA en las bacterias ruminales (ver Tabla 2) y en algunos alimentos. Horigani<br />
y Horiguchi (1990) señalan que las bacterias ruminales pueden incorporar AEPA y las<br />
plantas pueden tomarlo de los microorganismos existentes en el suelo. Debido a estos hechos<br />
se desaconseja el uso de AEPA como marcador de la síntesis microbiana de origen<br />
protozoario (Horigani y Horiguchi, 1990).<br />
Perfiles de aminoácidos<br />
Este método, propuesto por Evans et al. (1975), se basa en estimar la cantidad de N<br />
microbiano, N de origen alimenticio y N de origen endógeno a partir de las diferencias<br />
existentes en el contenido en los distintos aminoácidos de estas tres fracciones. Esta técnica<br />
acepta varias premisas que no son totalmente ciertas. En primer lugar, se asume que la<br />
proteína endógena presenta una composición aminoacídica constante, y por ello se suele<br />
tomar como patrón el pepsinógeno bovino, sin considerar la composición de otras proteínas<br />
que pueden formar parte de la misma (Siddons et al., 1982). Por otra parte, se admite<br />
que la proteína de origen alimenticio no degradada en el rumen tiene la misma composición<br />
en aminoácidos que la proteína del alimento, sin considerar que la composición aminoacídica<br />
de la fracción proteica rápidamente degradable es diferente de la de aquellas<br />
fracciones que se degradan más lentamente (Nikolic y Jovanovic, 1972; Siddons et al.,<br />
1982). En cuanto a los microorganismos ruminales, se suele aislar una muestra de los<br />
mismos o se asume una composición constante (Stern y Hoover, 1979). A pesar de que en<br />
algunos trabajos se ha señalado que los microorganismos ruminales presentan una composición<br />
aminoacídica constante, Clark et al. (1992) revisaron los principales estudios en los<br />
que se determinó la composición aminoacídica de extractos bacterianos (441 muestras correspondientes<br />
a animales que ingirieron 61 raciones diferentes) y observaron una amplia
SÍNTESIS DE PROTEÍNA MICROBIANA Y MARCADORES MICROBIANOS 17<br />
variabilidad en el contenido en todos los aminoácidos, con coeficientes de variación que<br />
oscilaron <strong>entre</strong> 4,8 y 25,6 % (valores para el ácido aspártico y la metionina, respectivamente).<br />
Además, la composición aminoacídica de los microorganismos ruminales cambia<br />
tras la administración de alimento (Clark et al., 1992), por lo que el aislamiento de una<br />
fracción microbiana representativa resulta especialmente difícil.<br />
Evans et al. (1975) compararon los resultados de este método con los obtenidos con<br />
DAPA y observaron que los valores eran similares, pero inferiores a los obtenidos utilizando<br />
ARN como marcador. De forma similar, Siddons et al. (1982) y Schönhusen et al.<br />
(1995) obtuvieron valores de síntesis de proteína microbiana mucho menores con los perfiles<br />
de aminoácidos que con otros <strong>marcadores</strong> (DAPA, ARN, 15 Ny 35 S). Debido a que las<br />
premisas en las que se basa esta técnica no son válidas y a los resultados erráticos obtenidos<br />
en varios estudios, este método no suele utilizarse para cuantificar la síntesis de proteína<br />
microbiana.<br />
ATP<br />
Forsberg y Lam (1977) utilizaron el ATP como marcador microbiano para cuantificar<br />
las proporciones de BAL y BAS en el rumen, y para ello aceptaron las siguientes premisas:<br />
a) que el ATP está presente en todas las células vivas, pero no forma parte de las células<br />
muertas; b) que la concentración de ATP es similar en todos los microorganismos<br />
ruminales y c) que la extracción y posterior análisis de la concentración de ATP en las células<br />
son relativamente simples y baratos (Stern y Hoover, 1979). Sin embargo, estos mismos<br />
autores observaron que existían diferencias en la concentración de ATP <strong>entre</strong> los diferentes<br />
microorganismos ruminales, y que, dependiendo del método utilizado, había una<br />
gran variabilidad en la eficiencia de la extracción de ATP de las células. Posteriormente,<br />
Wallace y West (1982) también observaron diferencias en el contenido en ATP <strong>entre</strong> bacterias<br />
y protozoos. Estos autores señalan que la concentración de ATP refleja el nivel de<br />
actividad de los microorganismos ruminales más que la cantidad total de los mismos, por<br />
lo que no debe ser usado como marcador microbiano.<br />
MARCADORES MICROBIANOS EXTERNOS<br />
Los <strong>marcadores</strong> <strong>microbianos</strong> externos deben administrarse a los animales para que<br />
sean incorporados por los microorganismos ruminales y formen parte de sus estructuras.<br />
El procedimiento más empleado consiste en realizar una infusión continua del marcador<br />
en el rumen de los animales durante el período experimental hasta que se alcanzan condiciones<br />
de equilibrio («steady state»). Los principales <strong>marcadores</strong> externos son 15 N, 35 Sy<br />
32<br />
P, aunque en algunos estudios se ha determinado la incorporación de compuestos marcados<br />
con 3 Hy 14 C (Chikunya y Miller, 1997; Lambert et al., 1998).<br />
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18 M.D. CARRO<br />
15<br />
N<br />
El 15 N se administra a los animales experimentales en forma de sales amónicas<br />
( 15 NH 4 Cl, ( 15 NH 4 ) 2 SO 4 ) o de urea. Estas sustancias se disuelven fácilmente en agua, y tras<br />
un período de infusión de 3-4 días se consigue un enriquecimiento constante de los microorganismos<br />
ruminales (Firkins et al., 1987; Beckers et al., 1995). El 15 N es uno de los<br />
<strong>marcadores</strong> externos más utilizados, tanto en estudios in vivo (Carro et al., 1992a; Lebzien<br />
et al., 1993; Pérez et al., 1996a, 1996b) como in vitro (Carro et al., 1992b; Blümmel<br />
et al., 1997; Carro y Miller, 1999b). Este hecho es debido a algunas de las ventajas que<br />
presenta: 1) es un isótopo no radioactivo, por lo que puede ser utilizado en cualquier ocasión<br />
sin riesgos de contaminación medioambiental; 2) los alimentos de los animales no<br />
suelen presentar enriquecimientos en 15 N superiores a la abundancia natural (0,3663), y la<br />
infusión de 15 N únicamente enriquece a los microorganismos; 3) el 15 N infundido se incorpora<br />
a todos los microorganismos, ya que las bacterias incorporan el 15 NH 3 y los protozoos<br />
lo incorporan indirectamente cuando engullen y digieren a las bacterias, aunque el<br />
grado de enriquecimiento de las diferentes fracciones de microorganismos suele ser diferente.<br />
Otra ventaja del 15 N es que marca directamente el N microbiano, es decir, el material<br />
cuya cuantía se desea determinar. Sin embargo, lo que realmente se determina con este<br />
método es la incorporación de 15 NH 3 por los microorganismos, y no se tiene en cuenta la<br />
incorporación directa de aminoácidos y péptidos. Este hecho cobra una especial importancia<br />
si se tiene en cuenta que las diferentes especies bacterianas ruminales difieren en la<br />
utilización de amoniaco y N aminoacídico para su síntesis proteica (Russell et al., 1992).<br />
En varios estudios (Komisarczuk et al., 1987; Carro y Miller, 1999b; Ranilla et al., 2000)<br />
se ha observado que las BAS incorporan una menor proporción de amoníaco que las<br />
BAL, por lo que resulta lógico que presenten habitualmente un menor enriquecimiento en<br />
15<br />
N (ver Tabla 3). Este hecho se ha observado tanto en condiciones in vivo (Martin et al.,<br />
1994; Beckers et al., 1995; Pérez et al., 1996b), como in vitro (Komisarczuk et al., 1987;<br />
Carro y Miller, 1999b; Ranilla et al., 2000). Por ello, cuando se utilizan las BAL como<br />
extracto microbiano de referencia se subestima la síntesis de proteína microbiana. Carro y<br />
Miller (1998) observaron que la síntesis microbiana en fermentadores semicontinuos<br />
(RUSITEC), al que se administraban cuatro raciones diferentes, era una media de un<br />
22 % menor cuando se usaban las BAL como extracto de referencia que cuando se usaban<br />
las BAS. Tal y como se ha comentado para otros <strong>marcadores</strong> <strong>microbianos</strong>, este problema<br />
podría solucionarse mediante el aislamiento de una fracción microbiana «representativa».<br />
La precisión y exactitud del análisis de 15 N por espectrometría de masas son excelentes<br />
(se pueden detectar enriquecimientos del 0,001 % por encima del enriquecimiento natural),<br />
pero la preparación de las muestras para el análisis es laboriosa, ya que a menudo<br />
es necesario un procesado previo de las mismas. Este procesado suele consistir en un análisis<br />
kjeldahl, seguido de una destilación y evaporación del destilado. En caso de ser necesario<br />
este procesado, el manejo de las muestras debe ser muy cuidadoso para evitar la<br />
contaminación de las mismas durante la destilación (Firkins et al., 1992). Por otra parte,<br />
los espectrómetros de masas son equipos muy caros y presentan un manejo complicado,<br />
por lo que no están al alcance de la mayoría de los laboratorios, y esto representa uno de<br />
los principales puntos limitantes de esta técnica. Sin embargo, en nuestro país existen centros<br />
que realizan análisis de 15 N a un precio aproximado de 2.500 pesetas por muestra.<br />
Una posible alternativa es el análisis de 15 N mediante espectrometría de emisión, técnica
SÍNTESIS DE PROTEÍNA MICROBIANA Y MARCADORES MICROBIANOS 19<br />
Tabla 3<br />
Valores de la relación 15 N/N (%) y 35 S/N en muestras de bacterias (BAL: bacterias asociadas a la fase líquida; BAS:<br />
bacterias asociadas a la fase sólida) y protozoos aislados del rumen<br />
Marcador microbiano y<br />
referencia<br />
Origen de los microorganismos<br />
Ración BAL BAS<br />
Bacterias<br />
mixtas<br />
Protozoos<br />
Firkins et al. (1987) Rumen (vacuno) Forraje: concentrado (70:30) 0,748 0,749 – 0,631<br />
Komisarczuk et al. (1987) 1 In vitro Paja: pulpa de remolacha: manioca (50:29:21) 0,932 0,611 – –<br />
(RUSITEC)<br />
Martin et al. (1994) 1 Rumen (vacuno)<br />
Heno 0,525 0,479 – 0,456<br />
Heno: cebada grano (65:35) 0,536 0,476 – 0,464<br />
Pérez et al. (1996b) 1 Rumen (ovino) Heno: concentrado (67:33) 0,563 0,521 – –<br />
Pérez et al. (1997b) Rumen (ovino) Paja cebada: concentrado (40:60) 0,480 0,478 – –<br />
Martín-Orúe et al. (1998) 1 Rumen (ovino)<br />
Paja: cebada grano (80:20) 0,649 0,629 – –<br />
Paja: cebada grano (20:80) 0,611 0,538 – –<br />
Chikunya y Miller (1999) 1 Rumen (ovino) Paja: pulpa de remolacha (70:30) 0,423 0,420 – –<br />
0,668 0,572 0,600 –<br />
Carro y Miller (1999b) 1 In vitro<br />
(RUSITEC)<br />
Ranilla et al. (2000)<br />
1 In vitro<br />
(botellas de cultivo)<br />
Pared celular de forrajes<br />
(Fibra neutro-detergente)<br />
Pared celular de forrajes<br />
(Fibra neutro-detergente)<br />
0,751 0,626 0,702 –<br />
Merry y McAllan (1983) Rumen (vacuno) Cebada: paja cebada: urea (45:48:3) 2,11 2,04 – –<br />
Chikunya y Miller (1999) Rumen (ovino) Paja: pulpa de remolacha (70:30) 3,16 3,63 – –<br />
1 Las diferencias <strong>entre</strong> las BAL y las BAS en la relación 15 N/N son estadísticamente significativas (P < 0,05).<br />
Invest. Agr.: Prod. Sanid. Anim. Vol. 16 (1), 2001
20 M.D. CARRO<br />
que presenta una menor precisión, pero que requiere un equipo menos costoso y más fácil<br />
de manejar (Proksch, 1972). Otro inconveniente del 15 N es el alto precio del isótopo, el<br />
cual varía en función del enriquecimiento de la fuente. Por ejemplo, 1 g de 15 NH 4 Cl (Sigma-Alldrich<br />
Química, S.A.) con un enriquecimiento del 98 y del 10 % cuesta aproximadamente<br />
40.000 y 1.800 pesetas, respectivamente. La cantidad mínima necesaria para<br />
marcar los microorganismos ruminales suele ser de 80 mg de 15 N por cada 100 g de N en<br />
la ración, por lo que el uso del 15 N en estudios in vivo se ve limitado en muchos casos por<br />
razones económicas. Sin embargo, estas razones no limitan su uso en estudios in vitro, en<br />
los que la cantidad necesaria es mucho menor (1 g de 15 NH 4 Cl con un enriquecimiento<br />
del 98 % permite realizar varios experimentos in vitro, dependiendo del número de tratamientos<br />
y de réplicas). En cualquier caso, el 15 N es uno de los métodos más seguros y fiables,<br />
y es recomendado como uno de los métodos de elección para determinar la síntesis<br />
de proteína microbiana (Broderick y Merchen, 1992).<br />
Los resultados obtenidos en los diferentes estudios en los que se han comparado el 15 N<br />
y las purinas son contradictorios. Pérez et al. (1996a) observaron que los valores de síntesis<br />
microbiana en ovejas que recibían heno de alfalfa suplementado con diferentes cantidades<br />
de cebada (0, 220, 400 y 550 g/día) eran <strong>entre</strong> un 14 y un 22 % menores cuando se utilizaban<br />
las purinas como marcador que cuando se utilizaba 15 N. De acuerdo con estos resultados,<br />
Calsamiglia et al. (1996) observaron que las purinas subestimaban la síntesis microbiana<br />
<strong>entre</strong> un 1yun18%,encomparación con el 15 N, en fermentadores continuos que recibían<br />
una ración basal suplementada con diferentes concentrados proteicos. Por el contrario,<br />
Carro y Miller (1999a) obtuvieron valores <strong>entre</strong> un 15 y un 17 % mayores con purinas que<br />
con 15 N al determinar la síntesis microbiana en un fermentador semicontinuo al que se le<br />
administraba una ración basal con un contenido mínimo de purinas (pared celular suplementada<br />
con cuatro fuentes nitrogenadas diferentes). De forma similar, Tejido et al. (2001)<br />
observaron que las purinas sobreestimaban la síntesis microbiana <strong>entre</strong> un 19 y un 47 %<br />
comparadas con el 15 N cuando ambos <strong>marcadores</strong> se utilizaron para cuantificar el crecimiento<br />
microbiano in vitro sobre sustratos que no contenían purinas (almidón y celulosa).<br />
Carro y Miller (1999a) y Tejido et al. (2001) atribuyeron los mayores valores obtenidos con<br />
las purinas a una pérdida de purinas en el proceso de aislamiento de los extractos bacterianos,<br />
tal y como ya ha sido comentado anteriormente. Otros autores (Cecava et al., 1991)<br />
han observado también una sobreestimación de la sínteis microbiana con las bases púricas<br />
en estudios in vivo, y la han atribuido al efecto de las purinas del alimento que no son degradadas<br />
en el rumen. A pesar de las diferencias obtenidas en los valores absolutos de síntesis<br />
microbiana en los diferentes estudios, en los trabajos de Pérez et al. (1996a) y Carro y<br />
Miller (1999a) se observó una correlación significativa <strong>entre</strong> los valores obtenidos para<br />
cada ración con los dos <strong>marcadores</strong>, si bien esta relación no fue significativa en los trabajos<br />
de Calsamiglia et al. (1996) y Tejido et al. (2001).<br />
35<br />
S<br />
De forma similar a la descrita para el 15 N, el 35 S se infunde en el rumen en forma de<br />
sales (principalmente Na 2<br />
35<br />
SO 4 ) y es incorporado a la proteína de los microorganismos a<br />
través de la síntesis de novo de aminoácidos azufrados (cistina y metionina), aunque también<br />
puede incorporarse a otros compuestos azufrados como la coenzima A (Broderick y<br />
Merchen, 1992). Los protozoos son marcados indirectamente cuando engullen y digieren
SÍNTESIS DE PROTEÍNA MICROBIANA Y MARCADORES MICROBIANOS 21<br />
a las bacterias ruminales. El método requiere el aislamiento de una fracción microbiana<br />
representativa y la determinación de la relación 35 S/N en la misma y en la digesta duodenal.<br />
En los primeros estudios realizados era necesario determinar la actividad específica<br />
del 35 S en la cistina, la metionina o en el total de aminoácidos azufrados (Beever et al.,<br />
1974), lo que complicaba la parte analítica de la determinación de la síntesis microbiana.<br />
Sin embargo, Mathers y Miller (1980) propusieron una modificación del método que reduce<br />
el número de análisis y aumenta su precisión (Siddons et al., 1982), y que ha sido<br />
usada en numerosos estudios (Kennedy et al., 1984; Chikunya y Miller, 1998, 1999).<br />
Una limitación del 35 S como marcador microbiano es el error introducido debido a<br />
que una cantidad considerable de S microbiano puede proceder de la incorporación directa<br />
de péptidos y/o aminoácidos azufrados a la proteína microbiana. Por otra parte, el 35 Ses<br />
un isótopo radiactivo, aunque su radiación es débil y su vida media es relativamente<br />
corta (noventa días). Sin embargo, la utilización de este isótopo exige disponer de instalaciones<br />
y laboratorios aptos para trabajar con material radiactivo, así como de personal<br />
cualificado para ello.<br />
Kennedy et al. (1984) realizaron un experimento para comparar el 15 Nyel 35 S como<br />
<strong>marcadores</strong> <strong>microbianos</strong> y observaron que el 15 N produjo valores un 24 % menores que el<br />
35<br />
S. Por el contrario, Siddons et al. (1982) señalaron que la síntesis de proteína microbiana<br />
en ovejas alimentadas con ensilado o con heno de hierba fue hasta un 25 % menor con<br />
el 35 S que con el 15 N. De forma similar, Chikunya y Miller (1999) observaron que el 35 S<br />
produjo valores un 12 % inferiores a los obtenidos con el 15 N cuando ambos se utilizaron<br />
para determinar la síntesis de proteína microbiana en ovejas alimentadas con una ración<br />
compuesta por paja y pulpa de remolacha (70:30). Dado que las diferencias obtenidas en<br />
los distintos estudios comparativos no son consistentes, se piensa que las condiciones alimenticias<br />
pueden afectar de forma diferente a las estimaciones de la síntesis de proteína<br />
microbiana realizadas con estos dos <strong>marcadores</strong> (Siddons et al., 1982).<br />
32<br />
P<br />
Bucholtz y Bergen (1973) observaron que la captación de fósforo y su incorporación<br />
a los fosfolípidos <strong>microbianos</strong> presentaban una estrecha correlación con la síntesis de proteína<br />
microbiana en el rumen, por lo que propusieron el uso de 32 P como marcador. Posteriormente,<br />
Smith et al. (1978) propusieron una técnica basada en la incorporación de 32 Pa<br />
los ácidos nucleicos <strong>microbianos</strong>. Estos autores observaron que los valores obtenidos con<br />
32<br />
P eran aproximadamente un 85 % de los estimados utilizando ARN como marcador, y<br />
atribuyeron esta diferencia a que el ARN sobreestimaba la síntesis microbiana debido a la<br />
presencia de pequeñas cantidades de ARN de origen alimenticio. A pesar de estos resultados,<br />
la alta energía de este isótopo hace que su manejo sea peligroso y por ello se ha utilizado<br />
mayoritariamente en estudios in vitro (Van Nevel y Demeyer, 1977; Merry et al.,<br />
1990). Por otra parte, su vida media es corta (catorce días) y esto hace que se disponga de<br />
un tiempo limitado para analizar las muestras de digesta y extractos <strong>microbianos</strong>.<br />
Invest. Agr.: Prod. Sanid. Anim. Vol. 16 (1), 2001
22 M.D. CARRO<br />
CONCLUSIONES<br />
En el momento actual los dos <strong>marcadores</strong> <strong>microbianos</strong> más utilizados son las purinas<br />
yel 15 N, y ambos han sido propuestos como <strong>marcadores</strong> de elección por varios autores<br />
(Broderick y Merchen, 1982; Broudiscou y Jouany, 1995). A pesar de que son pocos los<br />
estudios en los que se han comparado estos dos <strong>marcadores</strong>, en algunos de ellos se ha observado<br />
una correlación significativa <strong>entre</strong> los resultados obtenidos por los dos métodos.<br />
Las purinas presentan la ventaja de ser constituyentes de los microorganismos, hecho que<br />
evita la necesidad de realizar infusiones en el rumen para administrar el marcador, pero<br />
un inconveniente es que también forman parte de los alimentos que reciben los animales.<br />
El 15 N presenta principalmente problemas económicos, dado el alto precio del isótopo y<br />
de la analítica que conlleva la técnica. Un problema grave que presentan ambos <strong>marcadores</strong><br />
es el aislamiento de una fracción bacteriana representativa, ya que las relaciones purinas/N<br />
y 15 N/N difieren en las diferentes poblaciones microbianas (BAS, BAL y protozoos).<br />
En la medida de lo posible sería recomendable la utilización conjunta de purinas y<br />
15<br />
N como <strong>marcadores</strong> en los estudios en los que se determine la síntesis de proteína microbiana.<br />
Además, sería deseable recoger la orina producida por los animales y analizar<br />
su concentración en DP, lo que probablemente permitiría validar de forma definitiva la<br />
excreción urinaria de DP como indicador del flujo duodenal de N microbiano.<br />
AGRADECIMIENTOS<br />
Este trabajo forma parte de los Proyectos LE 29/98 y LE 38/01 financiados por la Junta de Castilla y León.<br />
Deseo manifestar mi agradecimiento al Dr. Balcells por las interesantes conversaciones que hemos mantenido<br />
sobre la utilización de las bases púricas y el 15 N como <strong>marcadores</strong> <strong>microbianos</strong>.<br />
SUMMARY<br />
Determination of microbial protein synthesis in the rumen: a comparison of<br />
microbial markers (Review)<br />
Measurement of microbial protein synthesis and protein degradation in the rumen is critical in all the protein<br />
evaluation systems for ruminants. Microbial protein synthesis is determined by means of microbial markers,<br />
which are classified as internal (inherently present in rumen microorganisms) and external (compounds added to<br />
the rumen to label the microorganisms) markers. However, no marker has proven to be completely satisfactory.<br />
This review examines the advantages and disadvantages of the internal (nucleic acids, purine bases,<br />
diaminopimelic acid, D-alanine, aminoethyl-phosphonic acid, amino acid profiles and ATP) and external ( 15 N,<br />
35 S and 32 P) microbial markers and presents the results obtained from studies in which several microbial markers<br />
were compared.<br />
KEY WORDS:<br />
Microbial protein<br />
Rumen<br />
Microbial markers<br />
Purines<br />
15 N
SÍNTESIS DE PROTEÍNA MICROBIANA Y MARCADORES MICROBIANOS 23<br />
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