HTLV-1/2 - Revista EXPERIENCIA MÉDICA

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Ø±°Ð®·ªïóîððèò¯¨¼ ðîñðéñîððè ïîæëç ÐZ¹·²¿ ê Experiencia Médica - Vol. 26 - Nº 1 - 2008 Introducción El virus HTLV-1 ha sido identificado como el agente causante de la leucemia/linfoma a células Tdel adulto y de la paraparesia espástica tropical (TSP/ HAM) (1, 2). Además, ha sido demostrado que el virus HTLV-1 está relacionado con otras enfermedades inflamatorias incluyendo varias enfermedades autoimmunes, como artropatía inflamatoria crónica y síndrome de Sjögrens. El virus HTLV-1 se asocia también a polimiositis, uveítis, alveolitis y dermatitis infecciosa (3). El virus HTLV- 2 ha sido relacionado con neoplasias de células Ty casos de enfermedad neurodegenerativa (4). La transmisión de los virus HTLV-1/2 podría ocurrir por transfusión de sangre, por vía sexual, de la madre infectada al niño por vía vertical y por el uso drogas endovenosas. El contacto de célula-célula es necesario para una transmisión eficiente del virus HTLV-1 (5) y la transmisión requiere contactos frecuentes entre individuos. Fue demostrado que el riesgo de la infección aumenta con los periodos más prolongados de amamantamiento (> 6 meses) (6, 7) y que el riesgo de transmisión sexual se incrementa en relación con un mayor número de parejas sexuales (8, 9). La infección con HTLV-1/2 ha sido ampliamente documentada en el mundo en zonas endémicas en el sur de Japón, el Caribe, África sub- sahariana y países de Sud América incluyendo Brasil, Colombia, Argentina, Perú, Guayana Francesa y Chile (10, 11, 12, 13,14). El HTLV-2 es endémico entre los amerindios de América del norte, centro y sud América y está diseminado entre consumidores de drogas intravenosas (15, 16). El diagnóstico de las infecciones por HTLV-1/2 se realiza por la detección de anticuerpos específicos en suero o plasma usando ensayos de screening: inmunoensayo ligado a enzimas (enzime linked immunoassay, ELISA) o aglutinación de partícula (AP). Todas las muestras repetidamente reactivas por las pruebas Correspondencia: Dr. Marcos Balangero Juan Ramirez de Velazco 760 Córdoba. Argentina TE: 0351-4732723 E-mail:marcosbalangero@yahoo.com.ar Recibido: 4 de enero de 2008 Aceptado: 14 de febrero de 2008 de screening requieren la confirmación de la presencia de anticuerpos específicos para HTLV-1/2 por otras metodologías. El Western blot (Wb) es la técnica de referencia para la confirmación de la infección y es la que define un resultado positivo o negativo para los anticuerpos anti-HTLV-1/2. Sin embargo, una proporción importante de ELISAs reactivos para HTLV-1/2 resulta en un patrón de bandas insuficiente por Wb (17, 18, 19). Los individuos que presentan estos resultados son categorizados serológicamente como indeterminados para HTLV-1/2. Estos perfiles indeterminados por Wb han sido descritos en todo el mundo siendo más frecuentes en áreas tropicales (18, 19, 20). El agente o los agentes causales y la trascendencia médica del estado de indeterminado para HTLV-1/2 están en la actualidad poco claros. Varias explicaciones potenciales han sido sugeridas, incluyendo (I) la reactividad cruzada con otros agentes infecciosos (por ejemplo., Plasmodium sp.) (21) (II) infección con partículas de HTLV-1 defectivas (22, 23), (III) infección con retrovirus nuevos que tienen alta homología con HTLV-1 (24), (IV) e infección con HTLV-1 en individuos que presentan cargas virales que están debajo del alcance de los métodos que se utilizan para la detección. Diferentes secuencias de genes de HTLV-1 pueden ser amplificadas por PCR en los linfomonocitos de sangre periférica (PBMCs) de casi todos los individuos infectados con HTLV-1. Se ha publicado que la mayoría de los individuos indeterminados para HTLV-1/2 son negativos por PCR para las secuencias de genes del virus (18, 19, 25). El objetivo de esta investigación es evaluar la utilidad de una Inmunofluorescencia indirecta (IFI) como una prueba confirmatoria adicional para el diagnóstico rápido de la infección con HTLV-1/2 en individuos con perfiles de Wb indeterminados. Materiales y métodos Fueron analizadas un total de 181 muestras de sangre periférica correspondientes a personas de diferentes regiones de la Argentina (Buenos Aires, Córdoba, Jujuy). Los pacientes firmaron un consentimiento informado previo a la toma de muestra de sangre. Setenta y una muestras eran positivas para anticuerpos contra los virus HTLV1/2 (66 HTLV-1 y 5 HTLV-2), 63 muestras eran negativas para HTLV1/2 y 47 eran reactivas por el ensayo de 8
Ø±°Ð®·ªïóîððèò¯¨¼ ðîñðéñîððè ïîæëç ÐZ¹·²¿ é PROPUESTA DE ALGORITMO DIAGNÓSTICO DE HTLV-1/2 screening e indeterminadas por Wb para estos virus. Todas las muestras fueron ensayadas por ELISA (Vironostika HTLV- 1/2 Organon Teknika), Aglutinación de Partículas de Gelatina (Serodia HTLV-1 Fujirebo Inc., Tokio, Japón) y posteriormente confirmadas por Western blot (HTLVBlot 2.4, Genelabs, Singapur). Todos los ensayos fueron realizados siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados de los ensayos de Wb fueron interpretados según los estrictos criterios de Genelabs Diagnostics. El Wb fue considerado positivo para HTLV-1 solo si la banda para las proteínas gag (p19 y/o p24) y dos proteínas env (GD 21 y rgp 46 I) estaban presentes. Una muestra fue considerada positiva para HTLV- 2 cuando estaban presentes las bandas para las proteínas gag (p24 y/o p19) y dos proteínas env (GD21 y rgp 46 II). El test fue considerado indeterminado si bandas específicas para HTLVestaban presentes pero no cumplían con el criterio suficiente de positividad. Las muestras fueron consideradas negativas cuando no presentaban ninguna banda específica para proteínas de HTLV-1/2. Inmunofluorescencia Indirecta Todas las muestras de suero fueron probadas por medio de una Inmunofluorescencia Indirecta "in house". Los vidrios fueron preparados utilizando linfocitos T humanos trasformados (MT-2 y Mo-T) e infectados con los virus HTLV-1 y HTLV-2, respectivamente. Estas células expresan antígenos virales en su superficie y en su citoplasma. La línea celular no infectada Molt-3 fue incluida en los vidrios como control de inespecificidad. La IFI fue realizada siguiendo el procedimiento descrito previamente por Gallego et al (26). Brevemente, se colocan 10-20 ul (dilución 1:4) de las muestra de suero y de los sueros control en los pocillos que contienen las células infectadas y las células no infectadas. Las muestras son incubadas por 30 minutos a 37 ºC en cámara húmeda. Luego el vidrio es lavado tres veces con PBS y posteriormente secado, 10ul de una dilución 1:100 de FITC-conjugado anti IgG humana (Kallestad TM fluorescein conjugated antiserum/Sanofi Diagnostics Pasteur) fue posteriormente agregado a cada pocillo e incubado a 37 ºC en cámara húmeda por 30 minutos. Luego del último lavado una solución de buffer glicerol (pH:8) fue utilizada para el montaje de los vidrios. Los sueros fueron considerados positivos para anticuerpos anti HTLV-1/2 cuando presentaban la fluorescencia característica en el citoplasma de las células infectadas y ausencia de fluorescencia en las células no infectadas. Nested-PCR. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) fueron separadas de muestras de sangre entera por Ficoll-Hypaque. Las células de la interfase fueron recolectadas y lavadas con buffer fosfato (PBS). Las alícuotas conteniendo 1x10 6 células fueron resuspendidas en 100 ul de buffer de lisis conteniendo 5 mM Tris CLH, 0,5% Twen 20, 0,5% Triton y 80 ug/ml de proteinasa K (Fungal 100mg, Gibco). Se hizo la digestión con proteinasa K por 1 h a 60º C y luego la enzima se inactivó por 10 min. a 95º C. Los lisados fueron mantenidos a 20º C hasta ser utilizados. Una secuencia de -actina fue amplificada como control de calidad del DNAextraído en las muestras (27). Apartir de los PBMCs de todas las muestras extraídas se realizó una Nested-PCR para la amplificación de secuencias del provirus de HTLV-1 y HTLV-2. Una secuencia de la región tax/rex, una secuencia genérica del gen tax y una secuencia del gen pol fueron amplificadas en ensayos de Nested-PCR diferentes. Una muestra fue considerada positiva para HTLV- 1 o HTLV-2 cuando se amplificaron al menos dos secuencias de genes. Resultados Fueron estudiadas por IFI y PCR un total de 47 muestras de sangre con patrones indeterminados por Wb, 71 muestras confirmadas positivas para HTLV-1/2 por Wb y 63 muestras negativas para HTLV-1/2. Las 71 muestras positivas y las 63 negativas fueron positivas y negativas para anticuerpos anti HTLV-1/2 por IFI, respectivamente, existiendo una completa concordancia entre los resultados de la IFI y el Wb. Por IFI fueron negativas 33/47 (70,2%) de las muestras indeterminadas por Wb, y 14/47 (29,8%) de las muestras indeterminadas por Wb pero positivas por IFI presentaron bajos títulos de anticuerpos por esta ultima técnica (rango 1:4 a 1:64). Se obtuvieron los PBMCs a partir de 181 muestras de sangre entera y la presencia del provirus de HTLV1/2 fue investigada en ellas. Los resultados se muestran en la Tabla 1. Todas las 71 muestras positivas fueron positivas para HTLV-1/2 por PCR. Así, fueron amplificadas en estas muestras secuencias de 128 pb del gen tax/rex, 219 pb del gen tax (secuencia genérica) y 198 pb o 132 pb del gen pol. Las 63 muestras negativas fueron negativas para todas las 9
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