Diagnóstico bacteriano de las ITS

Programa de Microbiología, ICBM
Facultad de Medicina-Universidad de Chile
Diagnóstico
bacteriano de las ITS
María A. Martínez Tagle MSc, Ph.D

ITS bacterianas
Peeling et al. Nature Reviews Microbiology 2006; 4, S7–S19

Síndromes ITS con participación n de C.
Síndrome
trachomatis y N. gonorrhoeae
Patologías as asociadas
Etiologías
Descarga
uretral
Descarga
vaginal
Dolor
abdominal bajo
Uretritis
Epididimitis
Vulvovaginitis
Vaginosis microbiana
Cervicitis
E.I.P.
Neisseria gonorrhoeae
Chlamydia trachomatis
Mycoplasma genitalium
Ureaplasma spp.
Candida spp.
Trichomonas vaginalis
Etiología a polimicrobiana
Chlamydia trachomatis
Neisseria gonorrhoeae
Chlamydia trachomatis
Neisseria gonorrhoeae

Chlamydia trachomatis
Bacteria gramnegativa
Intracelular estricta
Polimorfismo Omp1
(20 Serotipos)
Serotipos (20)
- A, B, Ba, C
- D, Da, E, F, G, Ga, , H, I, Ia, , J, Ja, K
- L1, L2a, L2b, L3
Proteína Omp1

Hombres
Mujeres
Adultos
ambos
géneros
Neonatos
Manifestaciones clínicas de la
infección n por C. trachomatis
Uretritis
Epididimitis
Cervicitis
Conjuntivitis
Faringitis
Proctitis
Sd. de Reiter
Conjuntivitis
Neumonía
Infección n cervical
(70-80% asintomática)
tica)
40% ascendente
meses
años
Enfermedad inflamatoria
pélvica (E.I.P)
Consecuencias
-Infertilidad
-Embarazos ectópicos
-Algias pelvianas crónicas
Ovalle A, Martínez MA. Infecciones genitales. E. Guzmán (Ed).
Selección de temas en Ginecoobstetricia. 2008, p. 875-923.

Rate (per 100,000 population)
600
Men
Women
480
Total
Chlamydia — Rates by Sex:
United States, 1987–2006
Program expansion
527.5*
515.8
↓
360
240
120
CT screening demonstration
project (Region X)
183.0*
173.0
↓
0
1987 89 91 93 95 97 99 2001 03 05
Notifiable
All 50 report
Total cases reported in 2006: 1,030,911
1,073,699*
* 2007 data are preliminary (as of February 16, 2008).

Chlamydia — Age- and Sex-specific
Rates: United States, 2006
Men Rate (per 100,000 population) Women
3000 2400 1800 1200 600 0 Age 0 600 1200 1800 2400 3000
11.6 10-14
121.5
545.1 15-19
2862.7
856.9 20-24
2797.0
480.8 25-29
1141.2
222.2 30-34
415.7
120.8 35-39
174.2
65.1 40-44 69.0
27.8 45-54 25.6
9.1 55-64 6.8
2.8 65+ 2.2
173.4 Total
517.0

Número de casos notificados por el sistema de
Vigilancia centinela de las ITS en Chile. Año 2006
Normas de Manejo y tratamiento ITS, Chile. 2008. Rev Chil Infectol 2009; 26: 174-90

Prevalencia de infección n cervical por C.trachomatis
por edad.
RM, Abril de 2003-Junio de 2005*
Centro
Centro
privado
Hospital
San José
CEMERA
TOTAL
Nºmuestras
analizadas
268
100
35
403
Nº(%)
muestras
positivas
14 (5,2)
2 (2)
3 (8,6)
19 (4,7)
I n fe c c i ó n c e r v i c a l (% )
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
8.3
7.3
4.4
3.5
3.1
2.7
15-20 21-26 27-32 33-38 39-44 >45
*P >0.05
Edad (años)
Rev Med Chile 2008; 136: 1294-300.

Porqué efectuar tamizaje
de C. trachomatis
El manejo del Síndrome S
de descarga uretral ha sido bien
evaluado (6-19% hombres con infección n uretral por C.
trachomatis son asintomáticos)
ticos) Int J STD &AIDS 2008; 19: 155-8
El manejo del Síndrome S
de descarga vaginal tiene
importantes limitaciones
La presencia de flujo vaginal es un buen indicador de
infección n vaginal
La búsqueda b
de factores de riesgo para infección
cervical por C. trachomatis no tiene buen valor predictivo
La infección n cervical es mayoritariamente asintomática
tica
El Síndrome S
de dolor abdominal bajo tiene buen
rendimiento para E.I.P. por N. gonorrhoeae. C. trachomatis
causa E.I.P. subclínica
Clin Microbiol Infect 2009; 15: 4-10

Toma de muestras
MMWR 2002/51 (RR15): 1-27.
Tipo de
infección
Cervical
Muestras clínicas
Hisopado endocervical
Técnica
apropiada
Todo procedimiento
Hisopado vaginal ú orina 1er chorro
TAAN
Uretral
Hisopado endouretral
Todo procedimiento
Orina 1er chorro
TAAN
Faríngea/rectal
Conjuntivitis
Neumonía a neonatal
Abuso sexual
Hisopado faríngeo/rectal
Hisopado conjuntival
Aspirado nasofaríngeo
ngeo
Hisopado vaginal
Cultivo, IFD (Omp1)
Cultivo, IFD (Omp1)
Cultivo (TAAN)

Toma de muestras genitales para
diagnóstico de C. trachomatis
La toma de muestras para detección n de Antígenos
y TAAN debe respetar las recomendaciones del
fabricante
Esto asegura la eficiencia diagnóstica del ensayo
En general se recomienda:
MMWR 2002/51 (RR15): 1-27.

Toma de muestra endocervical
Retirar secreción n cervical
purulenta
Tomar primero muestras
para diagnóstico de N.
gonorrhoeae ó PAP
Introducir tórula t
1-21
cm en
canal endocervical, rotar
tórula presionando sobre
pared del canal 10-30
30’’
Depositar la muestra en el
Medio de transporte ó aplicar
a frotis IFD
MMWR 2002/51 (RR15): 1-27.

Toma de muestra uretral
Al menos 1 hora sin orinar
Insertar tórula t
delgada 2-42
cm en el canal uretral
Rotar suavemente (1 giro)
Dejar 2-32
seg
Retirar y disponer en el
medio de transporte ó
efectuar un frotis para IFD
Una vuelta
MMWR 2002/51 (RR15): 1-27.

Toma y transporte de muestras para PCR no
comerciales (“in(
in-house”)
Transporte de fluidos en recipientes
con tapa rosca y en la cantidad
indicada por el laboratorio
Ej. 15 – 20 ml de orina 1er chorro
Transporte hisopados en el medio de
transporte proporcionado por el
laboratorio
Existen diferencias en la capacidad
de elusión n microbiana de las tórulas t
Algunos materiales de tórula t
pueden
ser inhibitorios de la PCR (alginato)
Transporte en hielo mientras el
laboratorio no demuestre que sea
innecesario
(J Clin Microbiol 2002; 40: 3838-40)
(J Clin Microbiol 2006; 44: 2265-67)
Medio de transporte
Fibras cortas de nylon con superficie hidrofílica
(flocked)

Efecto del tipo de tórulas t
en eficiencia
sistemas comerciales de amplificación
J Clin Microbiol 2006; 44: 1084-6
Cantidad de DNA
blanco obtenido del
sitio de infección ó
fluido
KS: kit swab
FS: flocked swab

Medios de transporte para PCR no
comerciales
El medio de transporte estabiliza y preserva el
ácido nucleico blanco de amplificación
2SP (2 sacarosa fosfato; suplementado con suero
bovino y antibióticos)
ticos)
Universalmente empleado para diagnóstico de
Mycoplasma y Chlamydiae
Hanks (suplementado con suero bovino y
antibióticos)
ticos)
Universalmente empleado para diagnóstico viral

Técnica
Cultivo
IFD
EIA
TAAN
Utilidad de las técnicas t
diagnóstico
Ventajas
Especificidad
- Automatización
- Especificidad
C. trachomatis
-Disponibilidad
-Evalúa a calidad de muestras
-Bajo costo
Sensibilidad: > 95%
Especificidad: 99%
Útil en muestras No invasoras
Limitaciones
-Requiere transporte
de muestras complejo
-Sensibilidad: 70-75%
75%
Sensibilidad: 70-75 75 %
Sensibilidad: 70-75%
75%
Complejidad
Costo

Requerimientos de los procedimientos
de amplificación n de ácidos nucleicos
Protocolización n estricta de los procedimientos
Toma y transporte de muestras y su conservación
Procedimientos de extracción n de los ácidos nucleicos
Protocolos de amplificación
Controles de calidad
De la PCR: control positivo y negativo
De la calidad de la muestra
Controles de calidad externos (Centro de referencia,
inter-laboratorios)
Vigilancia epidemiológica de las cepas circulantes
(Centro de referencia)

Procedimientos de extracción n de los
ácidos nucleicos
En la actualidad son el factor más m s crítico de las TAAN
Las TAAN tienen el potencial de amplificar 1 copia de genoma por
muestra
Si se combinan con métodos m
de extracción n adecuados, el resultado
es un procedimiento muy sensible
Características deseables métodos m
de extracción:
Concentrar DNA blanco
Eliminar sustancias inhibitorias
Apropiados para procesar todo tipo de muestras
Simple ó al menos semiautomatizado
Diseñado para prevenir contaminación n cruzada

Procedimientos antiguos de
extracción n de los ácidos nucleicos
Método de extracción n con fenol-cloroformo
Procedimiento eficiente
Diseñado para un bajo número n
de muestras
Económico
Tóxico-laborioso-residuos residuos fenol inactivan Taq
DNApol
Procedimientos “en crudo” por ebullición n de
muestras no se emplean con fines de diagnóstico

Procedimientos comerciales de
extracción n de los ácidos nucleicos
Emplean reactivos estandarizados de calidad y pueden
ser manuales ó automatizados
Métodos manuales se basan en el empleo de columnas
con partículas de sílice s
que capturan los ácidos nucleicos
y son apropiados para un pequeño o nº n de muestras
Métodos automatizados se basan en la adsorción ó
filtración n de ácidos nucleicos en micro placas ó en su
captura a partículas metálicas en tubo. Se adaptan a
robot. Permiten trabajar con grandes volúmenes de
muestras con mínimo m
de manipulación.
n.
(J Clin Microbiol 2002; 40: 4211-7)
(J Clin Microbiol 2003; 41: 4440-3)
J Clin Pathol 2001; 54:86-90)

Calidad de las muestras genitales para la
detección n de C. trachomatis por PCR (n=407
muestras)
Muestras con escaso contenido de ADN celular
C. trachomatis es intracelular y la presencia de
células afecta todos los ensayos diagnósticos
Muestras endocervicales: 6.7%
Muestras uretrales: 18.8%
Muestras con inhibidores: 5.9%
Muestras endocervicales: 0/311 (0%)
Muestras uretrales: 23/96 (24%)
J Clin Microbiol 2000; 38: 2512-5

Confirmación n resultados TAAN
El CDC recomienda confirmar resultados positivos en
poblaciones con VPP

Neisseria gonorrhoeae
Normas de Manejo y tratamiento ITS, Chile.
2008.
Rev Chil Infectol 2009; 26: 174-90

Manifestaciones clínicas
Neisseria
gonorrhoeae
Hombres
• Uretritis
Mujeres
- Cervicitis
- Infección asintomática
20%
Conj. neonatal
E.I.P.
Adultos
Ambos géneros: conjuntivitis, proctitis, faringitis
Inf. gonocócica diseminada:

Cultivo
N. gonorrhoeae
Técnica de referencia
para el diagnóstico
Especificidad
Estandarización
Costo
Permite colectar cepas
para vigilancia
epidemiológica
Tipo de
infección
Uretritis
(gonorrea)
Infección uretral
asintomática
Infección
cervical
Infección rectal
Infección
faríngea
Infección de
sitios estériles
Conjuntivitis
adultosneonatal
Muestra clínica
Secreción uretral
Hisopado
endouretral
Hisopado
endocervical
Hisopado rectal
Hisopado faríngeo
De acuerdo al tipo
de infección
Hisopado
conjuntival

Situaciones y muestras apropiadas para
diagnóstico de N. gonorrhoeae mediante
TAAN
•Cuando no se dispone de cultivo ó
• El transporte no asegura la eficiencia del cultivo
Sospecha abuso
sexual niñitas
Muestra vaginal
TAAN confirmado
Infección uretral
masculina
Secreción
endouretral ú orina
de 1er chorro
Infección
endocervical
Hisopado
endocervical

Toma y transporte de muestras
clínicas
Las tórulas t
de algodón n son
inhibitorias
Los medios de transporte con
carbón n activado son superiores,
excepción n AMIES (Copan)
Los medios comerciales garantizan
95% de sobrevida de N. gonorrhoeae
a las 24 h
Control de calidad de sistemas de
transporte casero con cepas de
referencia

Examen Directo (Gram)
• Diagnóstico presuntivo en hombres
S.:90-95%
Esp.:95-100%

Cultivo de N. gonorrhoeae
24-48 h
35-36ºC
3-5% CO2
Muestra clínica
Medio selectivo y no selectivo
Diplococos Gram negativos
Agar Thayer-Martin
Colonias características
Oxidasa + Catalasa +, superoxol +
Diagnóstico presuntivo

Identificación Neisseria
gonorrhoeae
Diagnóstico
confirmatorio
• Pruebas de utilización de azúcares
• Métodos fenotípicos comerciales
• Técnicas inmunológicas
• Técnicas moleculares
Envío de cepas al ISP

Comparación n de los sistemas de
identificación n de N. gonorrhoeae
J Med Microbiol 2005; 54: 827-31

Técnicas de amplificación n para
diagnóstico de N. gonorrhoeae
Se dispone de numerosos procedimientos comerciales-
“in-house”
Sus resultados son considerados presuntivos (CDC)
Problemas histórico de especificidad que no está
actualmente superado
Blancos de amplificación n presentes en Neisserias
comensales
Homología a en regiones de los genes 16S rRNA y cppB
Causado por el intercambio genético horizontal en el
género
Neisseria
Solo se recomienda TAAN para muestras
endocervicales, endouretrales y orina de hombres

P
r
e
Indicaciones
laboratorio
Paciente
Entrega
Informe
P
o
s
t
A
n
a
l
í
t
I
c
o
Toma muestra
Transporte
Conservación
Análisis
Redacción
informe
Interpretación
resultados
A
n
a
l
í
t
I
c
o

Muchas gracias