Estudio de susceptibilidad in vitro

Estudio de
Susceptibilidad
Antifúngica
ngica in vitro
Prof. Dr. Victor Silva V.
(T.M., MSc., PhD.)
victor.silva@umayor.cl
Facultad de Medicina - Universidad Mayor
Santiago - Chile.
1

¿Cuál l es la real utilidad del antifungigrama?
• Tamizaje de nuevas moléculas
• Espectro de acción n de un nuevo
antimicótico tico y de asociaciones
Predicción n de eficacia terapéutica
Adaptación n al tratamiento
Limitar el riesgo de falla terapéutica
Vigilancia de resistencia
2

Desarrollo de Moléculas Antifúngicas
ngicas
Anfotericina B
Flucitosina
Ketoconazol
Fluconazol
Itraconazol
Caspofungina
Voriconazol
Anidulafungina
Posaconazol
Ravuconazol
Albaconazol
1950 1960
1970 1980 1990
2000
Formulaciones
Lipídicas de la
Anfotericina B
2005
Micafungina
Aminofungina
3

La Falla Terapéutica es Multifactorial
Hospedero
Estado inmune
Patología a asociada
Sitio de infección
Material extraño
Actividad
Posología
Toxicidad
Farmacocinética
Interacción
Droga
R
Hongo
Tamaño o inóculo
Especie
Resistencia microbiológica
Biopelícula
Factores del hospedero son frecuentemente los más m s relevantes para definir R
Espinel-Ingroff et al. Rev. Iberoam. Micol. 38: 293-304,2000
4

• La mayoría a de los relatos de cepas resistentes, es frente a
fluconazol, en cepas aisladas de pacientes con SIDA
– Resistencia secundaria; C. albicans 4 a 6%
• 1ra. Cepa R a Fluconazol de paciente no-VIH (1996),
presentó co-resistencia a:
– Clotrimazol, ketoconazol e itraconazol
• Este fenómeno se observa principalmente en:
– C. glabrata y C. krusei
• De 29 cepas R a fluconazol (33 C. albicans y 26 C. krusei)
– 28 (97%) fueron sensibles a voriconazol
Espinel-Ingroff Med. Mycol. 38: 293-103, 2000; Sobel et al. J. Infect. Dis. 183: 286-93,2001
Lee et al. Int J Antimicrob Agents 16: 205-9, 2000
5

¿Cuándo determinar la Susceptibilidad?
Levaduras
• Candidiasis y tricosporonosis invasora
– Para guiar el tratamiento inicial y en caso de falla terapéutica.
• Criptococosis
– En caso de falla terapéutica.
• Candidiasis superficial
– Solo en caso de resistencia clínica (no para el tratamiento inicial!!)
• Para anfotericina B cuando hay problema terapéutico
– Otros casos discutirlo con el microbiólogo !!!
6

¿Cuándo determinar la Susceptibilidad?
• Aspergilosis u otros filamentosos
– En caso de resistencia clínica después s de tratamientos
prolongados
Identificación
de
Especie
Apoya elección
de conducta
terapéutica
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Preguntas frecuentes
• ¿Cuál l es la real utilidad del antifungigrama?
• ¿Cuándo determinar la susceptibilidad
antifúngica?
ngica?
• ¿Qué método puedo utilizar?
• ¿Cuál l es el patrón n de susceptibilidad de los
hongos en nuestro medio?
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Necesidades de Técnicas T
In Vitro
• Debe ser reproducible intra e inter-laboratorio.
• Debe ser capaz de distinguir entre CIM bajas y altas.
– Para un determinado antifúngico ngico y especie.
– CIM altas asociadas a falla clínica
define umbral.
• NCCLS (CLSI); > 15 años a
de trabajo colaborativo
– Técnica reproducible
– Capaz de detectar RESISTENCIA
– Genera resultados con pertinencia clínica.
– Parámetros que influyen en la CIM
• Medio de cultivo, pH, tiempo de incubación, n, método m
de lectura,
criterio de lectura (inhibición n total o parcial?).
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Técnicas Disponibles
Método
Principio
Ventaja
Desventaja
CLSI
Microdilu.
Met. Referencia
Laborioso
EUCAST
en caldo
Control calidad
No comercial
E-test
Difusión
Simple
Costo?
en agar
Validado
Comercial
ATM fungus
Tabletas
Variable
Simple
No validados
Otros
Comercial
(excep. Sensititre)
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Métodos de Referencia Americano / Europeo
Formato
Medio
CLSI / M27-A2
Levaduras 2002
Macrodilución
Microdilución
RPMI
EUCAST / E.Dis 7.1
Levaduras 2003
Microdilución
RPMI + 2% glucosa
CLSI / M38-A
Filamentosos
Microdilución
RPMI
Inóculo
0,5
Incubación
0,5 – 2,5 x 10 3
UFC/ml
48h Candida spp
72h Cryptococcus
Lectura Visual (0,1,3,4)
0,5 – 2,5 x 10 5 UFC/ml 0,4 – 5 x 10 4 UFC/ml
24h Candida spp
24h Rhizopus spp.
48h Aspergillus spp y
Fusarium spp.
72h Scedosporium spp,
Espectrofotométrica
trica Visual (0,1,3,4)
CIM /
Inhibición
Azoles y 5FC: 50%
Anfotericina B: 100%
Azoles y 5FC: 50%
Anfotericina B: 100%
Azoles y 5FC: 50%
11
Anfotericina B: 100%

CLSI (NCCLS); Documento M 27-A2
Micrométodo en placa, 2002
Concentraciones decrecientes del antifúngico
INÓCULOS
CIM
Control de
esterilidad
del medio
Técnica reproducible para
detectar resistencia in vitro.
Inóculo cepa
ATCC
Control de
crecimiento de
inóculos
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Métodos de Referencia CLSI / EUCAST
Inhibición n Parcial
Inhibición n Total
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Definición n de Puntos de Cortes
Criterios generados para Candida spp por CLSI
Criterios
Fluconazol
(µg / ml)
Itraconazol
(µg / ml)
Flucitosina
Sensible < 8 < 0,125 < 4
SDD 16 a 32 0,25 a 0,5
Intermedio 8 a 16
Resistente > 64 > 1 > 32
• SDD: Sensibilidad Dosis Dependiente
• Basado en candidiasis superficial (Flu e itra), invasoras (Flu), datos históricos
e infección n animal (5FC)
• Detecta resistencia y ayuda a determinar falla clínica
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Porcentaje acumulado de sensibilidad in vitro (ug/ml) de
5.346 cepas de Candida spp aisladas de cuadros invasivos
Excelente espectro y potencia !!
Droga / CIM 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8
Anidulafungi 72.6 82.0 83.4 84.7 88.7 98.8 99.9 100
Capofungina 79.6 84.0 91.9 98.1 99.7 99.9 99.9 100
Micafungina 81.9 83.3 85.0 88.5 97.0 100
• 98.8 a 100% de cepas con sensibilidad (

Definición n del Punto de Corte para
Equinocandinas
Criterios generados para Candida spp por CLSI - 2007
Sensible: < 2 ug/ml
• Considerando la distribución n de CIM en estudios de vigilancia.
• Mecanismo de acción n y de resistencia conocidos (gen FKS1)
• Farmaconinética y farmacodinamia
• Eficacia Clínica de cepas con su CIM relacionada.
• Este punto de corte orienta a más m s del 99% de todos los aislados
de Candida testeados y discrimina la susceptibilidad de cepas
nativas de aquellas con mutaciones (resistentes)
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Meeting CLSI 2007, Perlin, Drug Resist Updat 2007; Pfaller & Diekman, Clin Microbiol Rev 2007; Pfaller et al., J Clin Microbiol 2007.

Correlación n Método M
EUCAST con CLSI
Fármaco
% de Concordancia
Anfotericina B 93 – 95
Flucitosina 100
Fluconazol 81 – 98
Itraconazol 67 – 94
Voriconazol 83 – 100
Posaconazol 79 – 100
Caspofungina 96
Técnica EUCAST para filamentosos en etapa de validación
Cuenca-Estrella, et al Antim. Agent Chemother. 46: 3644-7, 2002; Chryssanthou et al., J. Clin.
Microbiol. 40; 3841-4, 4, 2002; Espinel-Ingrof et al., J. Clin. Microbiol. 43: 2884-9, 2005.
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Métodos Comerciales
• Ideal
– Reproducible
– Fácil
– Económico
– Pocos equipos
– Rápido
– Definición n clara de
puntos de corte
– Elevada correlación
• Difusión n en agar
– E-test (AB Biodisk)
– Neosensitab (Rosco)
– Discos (Bio- Rad)
• Paneles colorimétricos
– Fungifast (International Microbio)
– Fungitest (Bio-Rad)
– ATB Fungus (BioMérieux)
– Asty (Kyokuto Ph. Ind.)
– Sensitive yeast one panel (Trek Dg.
System)
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– Cinta con gradiente de droga
E - TEST
– Concordancia CLSI > 94-98%
98%
• Anfo B, Fluco, Vori, Caspo.
– Para Levaduras y Filamentosos
– Mejor desempeño
• En R a anfotericina B
• En R a Caspofungina
– Aplicable en rutina
– A veces difícil de leer (Trailing)
– Menor desempeño o (por pH)
• Flucitosina y C. neoformans
Espinel-Ingrof et al. JCM 34: 848-52, 1996
Dannaoui et al., EJCMID 16: 228-32, 1997
Clancy et al., AAC 43: 1289-90, 1999
Pfaller et al., JCM 41: 1440-6, 2003

E – TEST en Levaduras
Resistencia adquirida a
la Caspofungina
detectada por E-Test
Baixench, TIMM - 2005
Cepas con trailing
Lectura a 24h
20

C. albicans C. neoformans
Fluconazol
21

C. krusei
E – TEST en Levaduras
>256 ug/ml
> 1,5 ug/ml
22

E – TEST en Filamentosos
23

E – TEST y Caspofungina
0,016
24

E – TEST y Microdilución n vs
Caspofungina
MEC
Concentración
Mínima Efectiva
25

Tabletas
• Neosensitab, Bio-Rad, BioMIC
– Tableta / Discos
– Cualitativo
– Concordancia variable
– Aplicable en rutina
• Requiere más m s estudios
– Corroborar R e I con CIM
325 Lev Anfo-B Itra Keto Fluco
% S 100 97,2 91,4 90,2
Quindos et al. RIM 16: 97-100, 1999
Meis et al. DMID 36:215-223, 2000
26

C. krusei ATCC 6258
Anfotericina B (1,5ug/ml), Sensible
Fluconazol (96ug/ml), Resistente
Voriconazol (0,125ug/ml, Sensible
Caspofungina (0,250ug/ml), Sensible
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C. parapsilosis ATCC 22019
Anfotericina B (0,19ug/ml), Sensible
Fluconazol (0,50ug/ml), Sensible
Voriconazol (0,23ug/ml), Sensible
Caspofungina (1,5ug/ml), Sensible
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Paneles Colorimétricos I
• Fungifast I, Fungitest y
ATB Fungus
– Panel
• Pocas concentraciones
• ¡ Cualitativo !
– Limitación n de antimicóticos
ticos
– Buena correlación n con CLSI
en Candida spp sensibles
– Limitaciones para detectar R
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• Asty y Sensitive yeasts one panel
– Facilitan lectura de CIM
Paneles Colorimétricos II
– Reduce tiempo de incubación
– Estrecha correlación n con CLSI
• Excepto para Anfotericina B
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IFI in Chile: a multicenter study of fungal prevalence and susceptibility during a 1 year period.
Species (No.)
C. albicans (59) Amphotericin B
Fluconazole
Itraconazole
C. famata (6) Amphotericin B
Fluconazole
Itraconazole
C. glabrata (6) Amphotericin B
Fluconazole
Itraconazole
C. parapsilosis (23) Amphotericin B
Fluconazole
Itraconazole
C. tropicalis (15) Amphotericin B
Fluconazole
Itraconazole
C. neoformans (11) Amphotericin B
Fluconazole
Itraconazole
All yeasts* (125)
Antifungal agents MIC (µg/ml)(
Range 50% 90%
Amphotericin B
Fluconazole
Itraconazole
0.03-1
0.25-16
0.03-0.5
0.5
0.03-0.13
0.13
8-16
0.5-1
0.06-1
0.25-128
0.03-16
0.03-1
0.25-128
0.03-0.25
0.25
0.03-1
0.25-128
0.03-0.5
0.5
0.13-0.5
0.5
0.5-16
0.03-0.5
0.5
0.03-1
0.25-128
0.03-16
Cepas aisladas entre 2000 y 2001 (RED IFI en Chile)
0.06
0.25
0.03
0.03
8
0.5
0.5
8
0.5
0.13
1
0.03
0.06
0.5
0.06
0.25
2
0.13
0.13
0.5
0.03
1
1
0.06
0.13
16
1
1
128
16
0.25
4
0.13
1
128
0.5
0.5
8
0.25
1
16
0.5
% S - R
100 – 0
97 – 0
98 – 0
100 – 0
50 – 0
0 – 33
100 – 0
50 – 33
33 – 50
100 – 0
96 – 4
96 – 0
100 – 0
87 – 7
80 – 0
100 – 0
91 – 0
73 – 0
100 – 0
89 – 6
84 – 4
31
Silva et al., Med. Mycol. 42: 333-9, 2004

Programa IFI 2006-2008. 2008. Sensibilidad en 366 cepas de Levaduras
Anfotericina B Fluconazol Voriconazol Caspofungina
N° Especie S SDD R S SDD R S SDD R S SDD R
176 Candida albicans 176 174 1 1 173 1 163
30 Candida glabrata 30 28 2 29 24
6 Candida guillermondii 6 6 6 4 1
9 Candida krusei 9 9 7 7
8 Candida lusitaniae 8 8 8 7
43 Candida parapsilosis 43 43 42 35 1 2
33 Candida tropicalis 33 33 31 30
3 Candida peliculosa 2 1 1 2 2
1 Candida kefyr
1 Candida rugosa 1 1 1 1
1 Candida norvegensis 1 1 1 1
51 Cryptococcus neoformans 51 51 51
3 Saccharomyces cerevisiae 3 1 2 3 3
1 Rhodotorula glutinis 1 1 1 1
366 Total Levaduras 363 317 34 12 354 1 277 1 3
Porcentaje 100 87,3 9,4 3,3 99,7 0,3 98,6 0,4 1,1
* Método M
de difusión n en agar por Tabletas y E-TestE
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Programa IFI 2006-2008. 2008. Susceptibilidad Antifúngica ngica en filamentosos
Anfotericina B Voriconazol Caspofungina
N° Especies S SDD R S SDD R S SDD R
17 Aspergillus fumigatus 15 9 9
6 Aspergillus flavus 6 3 3
1 Aspergillus terreus
1 Eurotium amstelodami
1 Emiricella nidulans 1
2 Fusarium solani 1 1 1
3 Fusarium verticillioides 3 2 2
5 Rhizopus oryzae 1 4 3 3
2 Scedosporium apiospermium 1 1 1
1 Exophiala jeanselmei
1 Paecilomyces marquandii 1 1 1
1 Paecilomyces lilacinus 1
41 Total Filamentosos 25 9 15 5 13 7
Porcentaje 73,5 25,5 75 25 65 35
* Método M
de difusión n en agar por E-Test. E
No todos los filamentosos han sido evaluados
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Susceptibilidad antifúngica ngica frente a Anidulafungina
Anfotericina B Fluconazol Voriconazol Anidulafungina
CIM
N° Especie S R S SDD R S SDD R Rango S
27 Candida albicans 27 26 1 27

Vitoco
Coral
Claudia
Ceidy
María a Ignacia