Ver tesis - Universidad de Colima

UNIVERSIDAD DE COLIMA
DOCTORADO EN CIENCIAS: ÁREA BIOTECNOLOGÍA
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS DE PAPA (Solanum tuberosum L.)
CON EL GEN QUE CODIFICA PARA EL INHIBIDOR DE CISTEÍN PROTEINASAS
DE ORIGEN HUMANO; CISTATINA C.
TESIS
PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTOR EN CIENCIAS, ÁREA: BIOTECNOLOGÍA
PRESENTA
M EN C JOSÉ FRANCISCO MORALES DOMÍNGUEZ
ASESORES
DR. RAFAEL GUTIERREZ CAMPOS
DR. OSCAR REBOLLEDO DOMÍNGUEZ
Tecomán, Colima, México Enero del 2006

A:
A mis hijos:
Francisco Emiliano y Luís Hernán.
A mi domadora:
CristY.
A mi papá
Y a Juanita † y Roge † .

AGRADECIMIENTOS
A la Universidad Autónoma de Aguascalientes por el apoyo institucional brindado en
mi superación profesional.
Al Programa de Mejoramiento del Profesorado (PROMEP) por su apoyo con la
beca PROMEP/ 103.5/02/2037 para la realización de mi Doctorado en Ciencias.
Al M en C. Rafael Urzúa Macias Rector de la Universidad Autónoma de
Aguascalientes por su confianza y apoyo incondicional.
Al Dr. Rafael Gutiérrez Campos, por la dirección de esta tesis, asesoría, invaluables
consejos y su gran amistad, mi agradecimiento sincero.
Al Dr. Eugenio Pérez Molphe-Balch, por la asesoría, revisión del escrito, apoyo y su
gran amistad, mil gracias.
Al Dr. Oscar Rebolledo Domínguez, por la asesoría, brindada durante todo este
proceso y por su gran amistad.
Al Dr. Jaime Molina Ochoa, por la asesoría brindada y acertadas sugerencias.
Al Dr. Juan Alberto Osuna Castro y el Dr. Elpidio Peña Beltrán, por las sugerencias
en la parte experimental, en la revisión del escrito y por la confianza brindada.
Al Dr. Sergio Aguilar Espinosa, Dr. Roberto Lezama Gutiérrez, Dr. Alfonso Pescador
Rubio, por su valiosa revisión y sugerencias en durante todo este proceso.
Al M en C Carlos Dávila Figueroa y a la TLQ Martha Pérez Reyes, por su gran apoyo
técnico.
A M en C. Cristina Garcidueñas Piña, por el apoyo, amistad y su gran amor, mil
gracias.
A Elizabeth Lizardi Jáuregui, Mariana Muñoz Vega, Mireya Delgado Gutiérrez,
Sandra Camacho, Bernardo Velásquez, por su amistad y apoyo.
A todos mis compañeros del posgrado en Ciencias por compartir esta aventura y
superación.

Y sin olvidar a mis hermanos y hermanas y a la familia Morales Ruiz, gracias por
todo.
Y otra vez, a todos los mencionados y los que me faltaron, mil gracias.

Índice
Índice de figuras---------------------------------------------------------------------------------------I
Índice de tablas----------------------------------------------------------------------------------------II
Abreviaturas--------------------------------------------------------------------------------------------III
Resumen------------------------------------------------------------------------------------------------IV
Abstract---------------------------------------------------------------------------------------------------V
I INTRODUCCIÓN -----------------------------------------------------------------------------------1
II ANTECEDENTES-----------------------------------------------------------------------------------5
2.1 Origen e historia de la papa.---------------------------------------------------------------5
2.2 Taxonómia y cultivo de la papa.----------------------------------------------------------5
2.3 Producción de papa.-------------------------------------------------------------------------6
2.4 Importancia de la papa----------------------------------------------------------------------8
2.5 Daños en papa. ---------------------------------------------------------------------------9
2.6 Proteasas.-------------------------------------------------------------------------------------12
2.7 Inhibidores de Cisteín proteinasas.-----------------------------------------------------13
2.8 Estudio molecular del gen de la cch.---------------------------------------------------16
2.9 Cultivo de tejidos en papa.----------------------------------------------------------------17
2.10 Microtuberización.--------------------------------------------------------------------------20
2.11 Factores que inducen la microtuberización.-----------------------------------------21
2.12 Transformación genética de plantas de papa mediada por
Agrobacterium tumefaciens. --------------------------------------------------------------23
III MATERIALES Y METODOS --------------------------------------------------------------------25
3.1 Materiales--------------------------------------------------------------------------------------25
3.2 Métodos----------------------------------------------------------------------------------------25
3.2.1 Construcción del plásmido Pcambia:cch.-------------------------------------------25
3.2.2 Aislamiento de DNA plasmídico mediante mini preparaciones por
el método de Birboin.------------------------------------------------------------------------28
3.2.3 Micropropagación de plántulas axénicas de papa mediante cultivo
de tejidos vegetales.-------------------------------------------------------------------------29
3.2.4 Regeneración de papa vía organogénesis.-----------------------------------------29

3.2.5 Microtuberización.-------------------------------------------------------------------------30
3.2.6 Registro y análisis de datos.------------------------------------------------------------31
3.2.7 Germinación de los microtubérculos y aclimatación.-----------------------------32
3.2.8 Transformación genética de plantas de papa mediada por
Agrobacterium tumefaciens.---------------------------------------------------------------32
3.2.9 Análisis histoquímico del gen uidA (gus).-------------------------------------------35
3.2.10 Análisis molecular de las plantas transformadas mediante la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR).-----------------------------------------35
IV RESULTADOS-------------------------------------------------------------------------------------37
4.1 Construcción y análisis molecular del vector Pcambia:cch.----------------------37
4.2 Producción de brotes a partir de tubérculos de la papa.--------------------------40
4.3 Propagación de plántulas de papa. ----------------------------------------------------40
4.4 Regeneración.--------------------------------------------------------------------------------41
4.5 Producción de microtubérculos.---------------------------------------------------------45
4.6 Germinación de microtubérculos.-------------------------------------------------------48
4.7 Transformación de plantas.---------------------------------------------------------------50
V DISCUSIÓN ------------------------------------------------------------------------------------55
VI CONCLUSIONES----------------------------------------------------------------------------68
VII LITERATURA CITADA---------------------------------------------------------------------69

ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Producción mundial de papa -----------------------------------------------------7
Figura 2. Producción nacional de papa ----------------------------------------------------8
Figura 3. Diagrama del uso integral de la papa.-----------------------------------------10
Figura 4. Mecanismo propuesto para la inhibición de cisteín proteasas ---------16
Figura 5. Proceso de tuberización en papa. ---------------------------------------------21
Figura 6. Mapa del vector pKYLX80 -------------------------------------------------------26
Figura 7. Mapa del vector pCAMBIA:2301 -----------------------------------------------27
Figura 8. Análisis de restricción de pUC18:cch -----------------------------------------38
Figura 9. Análisis de restricción de pBSK-:cch. -----------------------------------------38
Figura 10 Análisis de restricción de pCAMBIA:cch -------------------------------------39
Figura 11. Mapa de la construcción pCAMBIA:cch.-------------------------------------39
Figura 12. Micropropagación in vitro de plántulas de papa.--------------------------40
Figura 13. Regeneración de papa a partir de tallos.------------------------------------42
Figura 14. Producción de tejido calloso en explantes de hoja y tallo --------------43
Figura 15. Formación de brotes a partir de tejido calloso.-----------------------------43
Figura 16. Regeneración de papa a partir de callos ------------------------------------44
Figura 17. Enraizamiento de plántulas de papa.-----------------------------------------44
Figura 18. Efectos de la luz continúa en la producción de tubérculos.-------------47
Figura 19. Efectos de la oscuridad en la microtuberización -------------------------47
Figura 20. Efecto de la sacarosa y cinetina sobre la microtuberización.----------48
Figura 21. Germinación de microtubérculos.----------------------------------------------49
Figura 22. Adaptación en suelo de plantas de papa ------------------------------------49
Figura 23. Comparación entre plántulas transformadas y no transformadas. ----52
Figura 24. Verificación de plantas transformadas mediante PCR.-------------------53
Figura 25. Análisis de gus papa transformadas. -----------------------------------------53
Figura 26. Plantas regeneradas de papa con el gen de la cch.-----------------------54
Figura 27. Verificación de plantas transgénicas por PCR y GUS.--------------------54

ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Tratamientos analizados para la regeneración de papa.----------------30
Tabla 2. Tratamientos analizados para la microtuberización.---------------------31
Tabla 3. Primera transformación genética de plantas de papa.------------------34
Tabla 4. Segunda Transformación genética de plantas de papa.----------------34
Tabla 5. Efecto de varias combinaciones de los reguladores de
crecimiento en la regeneración de papa.-------------------------------------------41
Tabla 6. Tratamientos in vitro utilizados para la microtuberización.-------------45
Tabla 7. Análisis de la expresión de GUS en explantes de hoja
y tallo de papa.----------------------------------------------------------------------------51

ABREVIATURAS
Krpm Kilo (mil) revoluciones por minuto.
L
Litros
ml Mililitros
µl Microlitros
Kg. Kilogramos
g
Gramos
mg Miligramos
µg Microgramos
ng Nanogramos
M
Molar
mM Milimolar
µM Micromolar
hr
Hora
min. Minuto
cm Centímetro
pb Pares de bases
RNAasa Ribonucleasa
DNAasa Desoxirribonucleasa
µ Micro
U/µl Unidades por microlitro
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
Npt II Neomicina fosfotransferasa II.
cch Gen de la cistatina C humana
oc-I Gen de oryzacistatina ( cistatina del arroz)
MS Medio de cultivo de Murashige y Skoog
BA Bencil adenina
AIA Ácido indol acético.
Cb Carbenicilina
Km Kanamicina
º C Grados centígrados

RESUMEN
TRANSFORMACION GENÉTICA DE PLANTAS DE PAPA (Solanum tuberosum L.) CON
EL GEN QUE CODIFICA PARA EL INHIBIDOR DE CISTEÍN PROTEINASAS DE ORIGEN
HUMANO; CISTATINA C.
Se optimizó un sistema de regeneración in vitro por organogénesis en Solanum
tuberosum cv. Alfa sin el uso de zeatina. Se utilizaron explantes de hojas y tallos
provenientes de plántulas de 4-5 semanas cultivadas in vitro. La formación de callo
ocurrió después de 4-5 semanas y los brotes aparecieron de 8-10 semanas después
de la formación de los callos en medio MS conteniendo 0.05 mg·L -1 TDZ, 0.1 mg·L -1
BA, 1 mg·L -1 GA 3 y 1 mg·L -1 AIA. Alrededor del 97% de los explantes cultivados
formaron callo, y la regeneración de brotes ocurrió con una frecuencia del 85.7%
relativa al total de callos formados. Por otro lado, se analizaron algunos procesos
para la microtuberización en este mismo material genético de papa. El cultivo de
segmentos nodales con un brote en MS 100% más 2.5 mg·L -1 de cinetina resultó en
un incremento en la formación de microtubérculos bajo condiciones de un
pretratamiento de incubación de 14 días en la oscuridad seguido por un fotoperiodo
de días cortos. Los segmentos nodales produjeron en promedio 7.3±0.3
microtubérculos por explante. Los sistemas de regeneración y microtuberización
optimizados en este trabajo permitirán reducir el tiempo y costos para la propagación
de plantas de papa con características deseables.
Asimismo, se llevó a cabo la transformación de Solanum tuberosum cv. Alfa con
el gen de la cistatina C humana, el cual codifica una proteína pequeña que es un
potente inhibidor de proteasas y a la cual se le ha asignado potencial para protección
de cultivos de interés económico. El transgen estuvo regulado por el promotor del
virus del mosaico de la coliflor potenciado (35S 2 ). La transformación fue realizada
mediante cocultivo con las cepas EHA 105, PVG 2260 y AGL 1226 de A.
tumefaciens. Los análisis moleculares de expresión y presencia del transgen en las
plantas presuntamente transformadas consistieron en análisis histoquímicos de
actividad de GUS y la técnica de PCR con oligos específicos dirigidos a los genes
cch, nptII, uidA y virD1. El transgen pareció mostrar una sobre expresión temprana
ya que las plantas generadas presentaron efectos pleitrópicos fisiológicos tales como
enanismo, decremento en la dominancia apical, hojas pequeñas delgadas y
etioladas, así como una necrosis en el sitio de corte del tallo posiblemente debida a
una apoptosis lenta. La optimización de este sistema de expresión permitirá analizar
el potencial de la cistatina C como agente de protección contra fitopatógenos de
cultivos importantes.
Palabras clave: Solanum tuberosum, cv. alfa, callo, microtubérculo, cinetina.

ABSTRACT
TRANSFORMATION OF Solanum tuberosum, CV. ALPHA, WITH GENE
ENCODING TO CYSTEINE PROTEASE INHIBITORS FROM HUMAN; CYSTATIN
C.
An in vitro organogenesis-based regeneration system was optimized for Solanum
tuberosum cv. Alfa without using zeatin. Leaves and stems from 4-5 week-old in vitro
grown plantlets were used as explant source. Callus formation occurred after 4-5
weeks and shoots appeared 8-10 weeks after callus formation in Murashige & Skoog
(MS) medium containing 0.05 mg·L -1 TDZ, 0.1 mg·L -1 BA, 1 mg·L -1 GA 3 and 1 mg·L -1
AIA. About 97% of the cultivated explants formed calli, and shoot regeneration
occurred at a frequency of 85.7% relative to the total of calli formed. On the other
hand, several processes for the microtuberization of this potato genetic material were
analyzed. Cultivation of nodal segments containing one shoot on 100% MS amended
with 2.5 mg·L -1 of kinetin resulted in increased microtuber formation under conditions
involving an incubation pre-treatment of 14 days in darkness followed by a short-day
photoperiod. Nodal segments produced an average of 7.3±0.3 microtubers per
explant. The regeneration and microtuberization systems optimized in the present
work will permit reductions in time and costs for the propagation of potato plants with
desirable characteristics.
In addition, Solanum tuberosum cv. Alfa was transformed with the human cystatin
C gene, encoding a small protein with a potent protease-inhibiting activity and
potential for protection of crops of economic interest. The transgene was regulated by
a potentiated form of the cauliflower mosaic virus promoter (35S 2 ). Transformation
was carried out by co-culture with A. tumefaciens EHA 105, PVG 2260 and AGL 1226
strains. Molecular analyses for transgene expression and presence in putatively
transformed plants consisted in histochemical analyses for GUS activity and PCR
with specific oligos targeted at the cch, nptII, uidA and virD1 genes. The transgene
seemed to show early overexpression in view that transformed plants presented
physiologic pleiotropic effects such as dwarfism, decreased apical dominance and
small, thin etiolated leaves, as well as necrosis at the stem cut site possibly due to
slow apoptosis. Optimization of this expression system will allow for the analysis of
the potential of cystatin C as a protection agent against phytopathogens of important
crops.
Keywords: Solanum tuberosum, cv. alfa, calli, microtuber, kinetin.

I
INTRODUCCIÓN
Por su gran interés agrícola y económico la papa (Solanum tuberosum L.) es uno
de los principales cultivos de cosecha a nivel mundial, sin embargo, existen grandes
pérdidas debido tanto a factores bióticos como abióticos. Entre los factores bióticos
que más dañan a la papa se encuentran, las plagas y los patógenos (Atkinson et al.,
2001).
La Biología Molecular de plantas, ofrece nuevas alternativas para el control de
plagas y patógenos, así como para la generación de materiales con características
agronómicas ventajosas al lograr transferir material genético exógeno (transgen) que
le confiera alguna de las característica deseadas (Lawrence, 2002).
Existen varios métodos de transformación en plantas, sin embargo una de las vías
posibles para aumentar la eficacia de estos métodos es la optimización de la
capacidad de regeneración in vitro de las plántulasespecies a trabajar (Powell et al.,
1990; Le, 1991; Ly et al., 1996; M´Hamdi et al., 1998). En plantas de papa, es posible
la transformación de diferentes cultivares comerciales, a partir de segmentos de tallo
y hojas desarrolladas in vitro, anteras y de discos de microtubérculos (Gómez et al.,
1997; Rodríguez et al., 2000; Trujillo et al., 2001).
Con formato: Fuente: Cursiva
Entre los genes más estudiados como de defensa en plantas están los que
codifican para inhibidores de proteasas (Boulter, 1993; Urwin et al., 1995; Atkinson et
al., 2001). Los inhibidores de proteasas, son pequeñas proteínas, que generalmente
se encuentran en altas concentraciones (10% del contenido proteíco) en tejidos de
almacenamiento de la planta, pero también se han detectado en las hojas como
respuesta al ataque de insectos y microorganismos patógenos. Tales inhibidores se
unen con alta afinidad pero reversiblemente a enzimas proteolíticas en un sitio
específico de tal modo que inhiben su actividad (Urwin et al., 1997; Koiwa et al.,
2000; De Leo et al., 2002).
1

Los inhibidores de proteasas más estudiados son del tipo cisteín proteinasas o
cistatinas y entre estos se encuentran el oc-I (oryzacistatina de arroz) aislado de
semillas de arroz (Arai et al, 2002), y cch (cistatina c Humano) aislado de suero de
pacientes con enfermedades autoinmunes y esta presente en altas concentraciones
en mucho fluidos biológicos como: el plasma seminal, fluido cerebroespinal y en bajas
concentraciones en otros fluidos como saliva y orina humana (Abrahamson et al.,
1990). En plantas transformadas genéticamente con cistatinas exógenas
principalmente con el oc-I, indican que este tipo de inhibidores juega un papel clave
en la defensa contra diferentes plagas y patógenos (Valueva y Mosolov, 2004). Sin
embargo, no existen estudios reportados donde el gen de la cch se haya expresado
en plantas pero, los estudios más sobresalientes de este gen son en sistemas de
expresión bacterianos donde se obtienen grandes cantidades de esta proteína sin
perder sus propiedades fisicoquímicas (Abrahamson, 1988). Otro punto importante
de esta proteína, se refiere a los efectos que tiene en el auto procesamiento del virus
del ciruelo, ya que este tipo de inhibidor interviene en la proteólisis de la poliproteína
viral producida por el propio virus impidiendo su procesamiento infectivo (García et
al., 1993; Gutiérrez-Campos et al., 1999). La propuesta hecha por Irie et al. (1996)
sobre la función de las cistatinas como inhibidores del auto procesamiento de los
potivirus ha sugerido que la cch puede jugar un papel clave en el reconocimiento e
inhibición de proteasas exógenos o actuar en las enzimas digestivas de los intestinos
de los insectos.
Sin embargo, en plantas de papa de la variedad alfa transformadas genéticamente
con el del gen de la cch podrían mostrar resistencia o tolerancia a plagas y
patógenos.
Pero para que la transformación sea eficiente se requiere de un sistema óptimo de
regeneración. Existen diversos trabajos sobre regeneración en papa donde se
demuestra que hay una gran dependencia del genotipo en la capacidad y eficiencia
de regeneración (Park et al. 1995). Sin embargo, el factor más importante para que la
2

egeneración sea posible es el balance adecuado de reguladores del crecimiento
(Yadav y Sticklen, 1995).
La mayoría de los protocolos de regeneración en papa, se basan en colocar los
explantes en tres diferentes medios en composición: 1) para la inducción de tejido
calloso, 2) para la inducción de brotes y 3) Enraizamiento, provocando que este
sistema sea más laborioso y consuma tiempos más largos (Park, 1995; Hulme et al,
1992; Curry y Cassells, 1999). Sin embargo, también existen protocolos de
regeneración en un sólo paso, que consisten en colocar explantes en el mismo
medio de cultivo con una adecuada combinación de reguladores del crecimiento
hasta la obtención de plántulas (Trujillo et, al. 2001; Rodríguez et al. 2001).
En el caso del cultivo de papa, particularmente en la variedad alfa (la de mayor
producción y consumo en nuestro país), es posible la producción de plantas y
tubérculos libres de enfermedades, germoplasma, conservación y sistemas de
transformación genética, sin embargo estos métodos son lentos, costosos e
ineficientes.
Debido a lo anterior, en el presente trabajo realizamos estudios in vitro con la
planta de papa de la variedad alfa con el fin de establecer metodologías de
propagación, microtuberización, aclimatación de plántulas y microtubérculos, así
como un sistema eficaz de regeneración vía organogénesis en un sólo paso. De la
misma forma se generaron plantas transformadas genéticamente a través del
sistema Agrobacterium tumefaciens con el cDNA del gen de la cistatina C humana
(cch). Dicha proteína fue seleccionada debido a su alta capacidad inhibitoria de
cisteín proteinasas cuando es evaluada in vitro (contra la actividad enzimática de
papaína), demostrando que es mayor que en el caso de la oc-I.
3

hipótesis:
El sistema de regeneración in vitro en un sólo paso es adecuado para la
transformación de plantas de papa mediante Agrobacterium tumefaciens con el gen
de la cch, y las plantas transformadas que se generen tendrán dicho gen.
Objetivo general.
Desarrollar un sistema in vitro de regeneración vía organogénesis de plantas de papa
y transformar explantes de hoja y tallo mediante Agrobacterium tumefaciens con el
gen de la cistatina C humana.
Objetivos específicos
1. Optimizar un sistema de propagación y microtuberización a partir de
segmentos nodales de plántulas de papa crecidas in vitro.
2. Optimizar un sistema de regeneración vía organogénesis a partir de explantes
de hoja y tallo de plántulas crecidas in vitro.
3. Transformar genéticamente plantas de papa a partir de explantes de hoja y
tallo de plántulas crecidas in vitro con el gen de la cistatina C humana (cch)
mediada por Agrobacterium tumefaciens.
4. Verificar la transformación genética mediante tinción histoquímica de GUS y
por PCR para los genes nptII, virD, gus y cch de líneas de papa como posibles
transformantes.
4

II ANTECEDENTES
2.1 Origen e historia de la papa
La palabra papa proviene del vocablo quechua que significa tubérculo, es una
planta tuberífera originaria de América (Hawkes y Lester, 1977). Existen dos centros
de biodiversidad de papa silvestre: uno que está localizado en la región central de
México, y el segundo entre la región central del Perú y el noroeste Argentino.
Algunasde Argentina. Algunas variedades silvestres son originarias de México. Los
incas del Perú han cultivado esta hortaliza desde hace dos mil años, lo que habla de
la tradición de este producto en las culturas indígenas del continente. Fue introducida
a Europa después de la conquista de los españoles, apareciendo gradualmente en
varios países europeos durante los siglos XVII y XVIII. Durante el periodo de 1600 a
1845, la papa se constituyó como la principal fuente de alimentos de Irlanda, siendo
los inmigrantes de este país los que la trajeron a Norteamérica en el año de 1719. Por
sus altos rendimientos por hectárea y sus características alimenticias, diversas
naciones del viejo mundo incorporaron su cultivo con el fin de evitar los rigores de las
hambrunas entre sus pueblos (Hawkes, 1977; Alonso, 1991).
Con formato: Color de fuente:
Automático
2.2 Taxonómia y cultivo de la papa
El cultivo de la papa se ha extendido por todo el mundo a excepción de los países
tropicales. La papa (Solanum tuberosum L.) pertenece a la familia Solanaceaefamilia
Solanaceae; es una planta dicotiledónea herbácea anual, sus raíces son muy
ramificadas, finas y largas, el tallo se origina en las yemas del tubérculo y es grueso,
fuerte y anguloso con una altura que varía entre los 0.5 y 1 metros; por lo general
consta de nueve o mas foliolos cuyo tamaño es mayor cuanto más alejados se
encuentren del nudo de inserción (Hawkes, 1977).
5

El fruto es una baya redonda de color verde, que al madurar se vuelve amarilla. A
la vez que tallos aéreos, la planta tiene tallos subterráneos; los primeros son de color
verde y contienen un alcaloide tóxico llamado solanina, que pueden formarse
también en los tubérculos cuando estos se exponen prolongadamente a luz. Los
tallos subterráneos o estolones, relativamente cortos, en sus extremidades se
convierten en tubérculos. En la superficie de los tubérculos se forman yemas
distribuidos en forma helicoidal, abundando sobre todo en la parte opuesta al punto
de inserción sobre el estolón. Aunque la papa puede multiplicarse por semillas y por
esquejes, en la práctica, la multiplicación es siempre vegetativa, haciéndose por
medio de los tubérculos que producen brotes en las yemas (Alonso, 1991).
En México, la papa se produce tanto en el ciclo otoño-invierno como en el de
primavera-verano, aunque el más importante es este último ya que durante el mismo
se obtienen alrededor del 60 por ciento de la producción. Se cultiva tanto en
condiciones de temporal como de riego destinándose para la primer modalidad
aproximadamente el 50 por ciento del total y el restante para riego (Sagarpa, 2004).
2.3 Producción de papa
La producción mundial de papa se incrementó rápidamente en las últimas tres
décadas, en una mayor proporción que cualquier otro cultivo, exceptuando al trigo,
arroz y maíz. Actualmente se cultiva en todo el mundo y en muchos países es el
alimento básico (Alonso, 2000; Sagarpa; 2004). En Alemania, Rusia y Polonia se
consumen alrededor de 180 kg de papa percápita por año. Por su parte, el promedio
de consumo nacional percápita promedio en México durante el periodo 1992-2001 fue
de 16.5 kilogramos por persona (Sagarpa, 2004). Pese a que la papa es un producto
originario de América, la principal zona productora no está en el continente
americano, si no que está conformada por países asiáticos y europeos. Según datos
de la FAO en el periodo comprendido entre 1992-200, la producción mundial de papa
registró un incremento del 11 por ciento, al pasar de 277 millones de toneladas en
6

1992 a 308 millones en 2001. Casi el 60 por ciento de la producción mundial de papa
se concentra en China, Rusia, Polonia, Estados Unidos, India y Ucrania (Fig. 1)
(Sagarpa, 2004).
600
500
400
Millones de toneladas
300
200
100
0
China Rusia Polonia Estados
Unidos
India Ucrania Alemania Belosrusia Holanda Reino Unido México
País
Figura 1. Producción mundial de papa en el periodo comprendido entre 1992-2001.
En la figura se muestra gráficamente la producción mundial de papa en millones de
toneladas (Y), por país (X) (FAO, 2004).
En nuestro país, la papa ocupa el quinto lugar en importancia, superado
únicamente por los granos básicos (maíz, fríjol, arroz y trigo), entre las hortalizas solo
los cultivos de jitomate y chile verde ocupan una mayor superficie, en cuanto
producción sólo es superado por el jitomate (Sagarpa, 2004). En estos últimos diez
(1992-2002) años, los principales estados productores han sido: Sinaloa, Estado de
México, Nuevo León, Chihuahua, Sonora y Guanajuato (Fig. 2), quienes en conjunto
aportaron el 60 por ciento del total de la producción nacional durante el periodo
analizado (Sagarpa, 2004).
7

Veracruz
4%
Jalisco
4%
Coahuila
5%
Otros
12%
Sinaloa
17%
Mexico
10%
Puebla
7%
Michoacan
7%
Guanajuato
8%
Sonora
8%
Chihuahua
9%
Nuevo León
9%
Figura 2. Producción nacional de papa en el periodo comprendido entre 1992- 2001.
En la figura se muestra gráficamente el porcentaje de producción nacional de
papa por estado (Sagarpa, 2004).
2.4 Importancia de la papa
El destino de la producción de papa en México, está distribuido de la siguiente
manera: el 80% es consumida como alimento fresco, 7% para uso industrial y
alimentos procesados (papas fritas, almidón, alcohol, industria farmacéutica) y el
13% restante, se utiliza como semilla. El 60% de las áreas de cultivo de papa en
México es ocupada por la variedad alfa, seguida por la variedad López con un
25% y el resto lo componen entre las variedades Atlantic, White Rose, Bintje,
Norteña, Rosita, Mexiquense, entre otras.
En términos de nutrición, 100 g de papa suplen cerca del 10% de la dosis diaria
de proteína recomendada para niños, una consideración importante para países
que buscan mejorar la dieta de sus pobladores. Estos 100 g también proporcionan
el equivalente al 10% de los requerimientos de un adulto de tiamina, niacina,
8

vitamina B6 y ácido fólico y cerca del 50% de vitamina C (Dilmer, 2000). Además
de su consumo como producto fresco la papa tiene un gran potencial económico
cuando es procesado para la industria alimentaría, química, agroindustrial,
farmacológica y en otras ramas industriales (Fig. 3).
Además de que, la papa sufre varios procesos para diferentes usos, en la
actualidad se ha emprendido el mejoramiento en su producción mediante
Biotecnología , ya que en el pasado se enfocó en incrementar la producción por
hectáreas sembrada y en desarrollar variedades resistentes a plagas y
enfermedades (Van der Meer, 1994; Wu et al., 1995; Atkinson et al., 1997; Urwin
et al., 1997; Veramendi et al., 1999; Dilmer, 2000; Urwin et al., 2000; Atkinson et
al., 2001; Zeh et al., 2001; Vásquez, 2001; Urwin, 2001; Lauterslager et al., 2001).
2.5 Daños en papa
El cultivo de la papa y su producción, se ve afectado tanto por factores bióticos y
abióticos. Entre los factores bióticos, se encuentran principalmente los patógenos y
plagas, entre los patógenos más importantes se encuentran Los patógenos mayor
considerados están: las bacterias, destacando ; entre las que han causado severos
daños en la producción y sanidad de la papa se incluyen a 2 subespecies
estrechamente relacionadaos de Erwinia carotovora (E. c, Subs. carotora y
astroseptica) que causa la pudrición blanda y es conocida comúnmente como “piedra
negra”, Ralstonia solanacearum (Pseudomas solanacearum) que causa marchitez y
daña a nivel vascular en los tubérculos, daño conocido como “vaquita de la papa” y
Clavibacter michiganenesis sspSubs.. sepedinicum que causa la enfermedad como
pudrición anillada de la papa y marchitez.,
9

Figura 3. Diagrama del uso integral de la papa.
10

En lo que respecta a los en virus, existe una gran lista de los que se han
identificado en el cultivo de la papa a nivel mundial y su distribución geográfica esta
limitada a ciertas regiones lo que puede ser determinado por las condiciones
ambientales, el tipo del suelo, la presencia del vector y transmisión mecánica,. eEntre
los principales virus se encuentran: el virus X de la papa (potexvirus), los virus Y y A
de la papa (potivirus), el virus S de la papa (carla virus) y el virus del enrollamiento de
la hoja (luteovirus) y entre estos, los más importantes son los del tipo potivirus
(Lozoya-Saldaña et al., 2002; Bakker et al., 2003).
Entre los , en hongos patógenos de papa, uno de los más importantes es
Phyphthora infestans que causa la enfermedad conocida como tizón tardío (Lawrence
et al., 2002), fitoplasmas causantes de la punta morada, mientras que en los
nematodos fitoparásitos están los del genero Globodera rostochiensis y Globodera
palliada; nematodos formadores del quiste de la raíz (Urwin et al., 2000) y
Meloidogyne incógnita; nematodo formador de nódulos de la raíz (Hussey y Jenssen,
2002; y en plagas algunos insectos como: coleópteros y hemípteros principalmente
(Ashok et al.,1998; Atkinson et al., 2001; Lawrence et al., 2002).
Tradicionalmente, el control de estas plagas y patógenos requiere de la rotación
de la tierra, resistencia del huésped y de plaguicidas químicos. Las dos primeras
estrategias proveen un control incompleto y los plaguicidas son demasiados tóxicos y
provocan contaminación ambiental (Urwin et al., 1998).
Una alternativa para controlar este tipo de plagas y patógenos, consiste en proveer a
la planta de defensas transfiriendo genes que codifican para inhibidores de proteasas
(Boulter, 1993; Urwin et al., 1998; Atkinson et al., 2001), estas proteínas se unen a
enzimas proteolíticas (proteasas), de tal modo que inhiben su actividad (Ryan, 1990;
Abe et al., 1991; Richardson, 1991).
11

2.6 Proteasas
Las proteasas son un grupo de enzimas que tienen la capacidad de degradar total
o parcialmente las proteínas. El termino proteasa incluye a tanto a endopeptidasas
como a exopeptidasas, mientras que proteinasa es usado para describir solo a
endopeptidasas (Ryan, 1990).
Las primeras funciones asignadas a este tipo de enzimas derivaron de la
implicación en la digestión de las proteínas de la dieta (Turk, 1991). Actualmente, en
animales, su significado biológico se ha ampliado notablemente y se ha reconocido
su papel central y específico en múltiples procesos como la coagulación sanguínea,
la cicatrización de heridas, la ejecución de los programas de apoptosis (Rodríguez-
Fragoso, 2000). Recientemente, se ha estudiado la actividad metabólica de proteasas
principalmente de cisteín proteinasas en los intestinos de diferentes plagas y en
diversos procesos celulares de patógenos que atacan a plantas de interés
agroalimentarios (Arai, 1996; Lilley et al., 1996).
En plantas, las proteasas juegan un papel importante en la degradación de
proteínas, como un proceso esencial para el crecimiento, desarrollo y respuestas a
diferentes factores ambientales. Aunque las plantas pueden sintetizar todos los
aminoácidos de novo, una gran cantidad de nuevas proteínas son derivadas del
reciclado de aminoácidos. Los aminoácidos pueden ser generados de la degradación
de proteínas de reserva en semillas o tejidos vegetativos. Bajo condiciones de estrés,
la degradación de proteínas es acelerada para mantener el suministro adecuado de
aminoácidos. Por lo que la proteólisis en plantas es un proceso muy complejo que
involucra muchas proteasas (Ho et al., 2000).
Con formato: Fuente: Cursiva
Las proteasas, se clasifican en base a su mecanismo de acción y son: serín,
aspartil, cisteín y metalo proteasas (Barret, 1987; Chauhan, 1991; Grant, 1996;
Chinni, 1997; Rodríguez–Fragoso et al., 2000). Entre las proteinasas másmayor
estudiadas se encuentra las del tipo cisteín, debido a que tienen un papel central en
12

diferentes funciones de proteólisis en plantas superiores, desde: el catabolismo de las
proteínas de reserva de semillas y en procesos fisiológicos y de desarrollo comohasta
senescencia y muerte celular programada (Ho et al., 2000; Solomon et al., 1999).
La mayoría de las cisteín proteinasas pertenecen a la familia de la papaína y en
su secuencia de aminoácidos muestran regiones conservadas homólogas entre ellas
y son reguladas intracelularmente (en cuanto a su actividad) por proteínas
denominadas inhibidores de cisteín proteinasas o cistatinas, las cuales se unen de
una manera específica y reversible al sustrato (Barrett, 1987).
2.7 Inhibidores de cisteín proteinasas (cistatinas)
Los inhibidores de proteasas, son pequeñas proteínas, que generalmente se
encuentran en altas concentraciones (10% del contenido total de proteínas) en tejidos
de almacenamiento de la planta, pero también se han detectado en las hojas como
respuesta al ataque de insectos y microorganismos patógenos (Johnson et al., 1989;
Ryan, 1990; Botella et al., 1993; Boulter, 1993; Urwin et al., 1997; Koiwa et al., 2000;
De Leo et al., 2002).
El nombre de cistatina lo utilizó por primera vez Barret en 1981, aplicándolo a una
proteína obtenida de huevo de gallina, que presentó una alta inhibición con varías
cisteín proteasas. Un número considerable de otras proteínas aisladas y
caracterizadas presentan también esta inhibición de proteasas y de acuerdo a la
secuencia de aminoácidos y su comparación con la cistatina de huevo de gallina, se
ha formado una superfamilia (Barret et al., 1987). En base a estos datos, las
cistatinas se han clasificado en una familia de cuatro miembros que son: Las
estéfinas, cistatinas, kininógenos y fitocistatina (Turk y Bode, 1991; De Leo et al.,
2002).
13

Las estefinas son proteínas de una sola cadena polipeptídica y carecen de
puentes de disulfuro, tienen un peso molecular de 11 kDa, así mismo, todas las
proteínas de esta familia contienen la región conservada del pentapéptido Gln-Val-
Val-Ala-Gly.
Las cistatinas, al igual que las estéfinas son proteínas de una sola cadena pero,
presentan dos puentes disulfuro, su peso molecular promedio es de 13 kDa, y
presentan el pentapéptido Gln-Xaa-Val-Xaa-Gly.
Los kininógenos, son reconocidos como precursores de los procesos de la
coagulación de la sangre y de procesos inflamatorios, además de su función como
inhibidor de cisteín proteinasas del tipo de papaina. Son las proteínas de mayor peso
molecular de esta familia con cerca de 120 kDa.
Las fitocistatinas son proteínas que se encuentran ampliamente distribuidas en
diferentes tejidos de la planta. Las principales representantes de este grupo son las
oc-I y oc-II, que fueron las primeras aisladas de semillas de arroz (Arai et al., 2002).
Tienen un peso moléculas entre 12 y 16 kDa, no presentan enlaces disulfuro, están
implicadas en los procesos de germinación, senescencia y en defensa contra plagas
y patógenos (Boris et el., 1998; Botella et al., 1993; De Leo et al., 2002).
En nuestro grupo de investigación estamos enfocados en el grupo 2 de las
cistatinas por su importancia en diversos procesos celulares, fisiológicos y de defensa
en plantas. La familia de las cistatinas generalmente esta compuesta de 115 residuos
de aminoácidos y con un peso molecular promedio a 13 kDa (Turk y Bode, 1991).
Son fuertes inhibidores reversibles de la cisteín proteasa como la papaína que inhibe
desde 1x10 –12 M (Song, 1995; Abraham, 1991). Presentan regiones consenso en
aminoácidos principalmente los conformados por Gln –53-Val-Val-Asp- Glu 57, dando
lugar a un lazo conformado por puente de sulfuro que reacciona con el sitio catalítico
del sustrato, asimismo, también están presentes los residuos glicina – 9 y alanina -10,
estos dos aminoácidos forman dos lazos independientes, que interactúan a través de
puentes de hidrógeno y junto con el amino terminal adoptan una conformación
14

altamente complementaria al sitio activo de la papaína e impidiendo por lo tanto su
acción catalítica sobre el sustrato (Fig. 4) (Abe; 1987 a , Fanos, 1999; Solomon, 1999).
El inhibidor de proteasas más estudiado es la cistatina C humanao (cch), aislado
de suero de pacientes con enfermedades autoinmunes y está presentes en altas
concentraciones en mucho fluidos biológicos tales como:: plasma seminal, fluido
cerebroespinal y en bajas concentraciones en otros fluidos como saliva y orina
humana (Abrahamson et al., 1990). La cistatina de huevo de gallina también es uno
de los más estudiados y es usado como modelo acción de los inhibidores de
proteasas sobre su sustrato (Bode, 1990). El mecanismo de acción propuesto se
describe en la Figura 4.
La actividad de las cistatinas como inhibidores de proteasas se ha demostrado
tanto in vitro como en plantas transgénicas. Por ejemplo, Pernas et al., (2000),
demostraron la actividad antifúngica de cistatinas extraídas del castaño que inhibió el
crecimiento de B. Cinerea, asimismo, se demostró esta actividad de cistatinas
extraídas de semillas del mijo (Valueva, 2004).
En plantas transformadas genéticamente con cistatinas exógenas, se ha visto que
este tipo de inhibidores brindan protección contra diferentes plagas y patógenos
debido a que estas enzimas suprimen la actividad metabólica de cisteín proteinasas.
En lo referente a la protección contra virus en plantas transgénicas de tomate, se
demostró que la expresión de oryzacistatina I y II, inhiben la replicación de virus de la
familia picornavirus (Valueva, 2004). Por otro lado, en plantas de tabaco transgénicas
con el gen de la ocI, mostraron resistencia contra el virus del jaspeado del tabaco y el
virus Y de la papa; ambos virus pertenecientes a los potyvirus que utilizan cisteín
proteinasas para el proceso de su genoma (Gutiérrez-Campos et al.,1999; Valueva y
Mosolov, 2004). En la resistencia contra nematodos fitopatógenos Urwin et al .,
(1998, 2000) generaron plantas de papa con el gen de la oc-I, demostrando
resistencia a Globodera pallida y Meleoidogine incognita, asimismo Atkinson et al.
(2004) demostraron resistencia a Radopholus similis en plátano transgénico con un
el gen sintético de la ocI (OcI∆D86). En insectos, se analizó la actividad inhibitoria de
15

oc-I in vitro sobre la actividad biológica de cisteín proteinasas de coleopteros,
observado una completa inhibición. Varias plantas transgénicas con genes de
inhibidores de proteasas se han generado y se ha demostrado la resistencia contra
diferentes plagas de insectos (Lawrence, 2002).
2.8 Estudio molecular del gen de la cch
Los estudios sobre la expresión de la cch en humanos son escasos sin embargo,
se han podido aislar cDNAs y verificar su expresión en diferentes tejidos humanos
como hígado, cerebro, páncreas, intestino, estómago, vesículas seminales y pulmón
(Fanos, 1999).Las evidencias más notorias fueron detectadas en RNA mensajeros de
vesículas seminales, lo que pone de manifiesto que en la mayoría de los fluidos
biológicos y en el plasma seminal se presenta la mayor expresión de la cch
(Abrahamson, 1990). Sin embargo, los estudios más sobresalientes de la cch han
sido en sistemas de expresión bacterianos donde se ha logrado obtener grandes
cantidades de esta proteína exhibiendo las propiedades fisicoquímicas similares a las
nativas (Abrahamson, 1988).
Figura 4. Mecanismo propuesto para la inhibición de cisteín proteasas por medio
de Cistatinas (Bode, 1990).
16

Otra característica importante de esta proteína se refiere a los efectos que tiene
en el auto procesamiento del virus del ciruelo, ya que este tipo de inhibidores
interviene en la proteólisis de la poliproteína viral producida por el virus impidiendo su
procesamiento infectivo (García et al., 1993; Gutiérrez-Campos et al., 1999). La
propuesta hecha por Irie et al. (1996) sobre la función de las cistatinas como
inhibidores del autoprocesamiento de los potivirus han sugerido que la cch puede
jugar un papel clave en el reconocimiento e inhibición de proteasas exógenos a tales
enzimas digestivas en los intestinos de los insectos.
2.9 Cultivo de tejidos en papa
El cultivo de tejidos vegetales (CTV), es el conjunto de técnicas que permite el
establecimiento, mantenimiento y desarrollo de cualquier parte de la planta, desde
una célula hasta un organismo completo, bajo condiciones artificiales y axénicas. Así
mismo, es una herramienta de gran valor para la resolución de problemas básicos y
aplicados en la Biología Molecular y Biotecnología vegetal, ya que brinda la
oportunidad de diseñar modelos ideales para el estudio de la fisiología, bioquímica,
genética, clonación, conservación, manipulación in vitro y en la obtención de plantas
genéticamente modificadas (Ross y O´Neill, 2000).
El desarrollo de cualquier tejido vegetal es un proceso bastante complejo en el cual
intervienen una serie de factores tanto internos como externos. Entre los factores
internos que controlan el desarrollo de los diferentes tejidos vegetales destacan las
fitohormonas u hormonas vegetales o también conocidos como reguladores del
crecimiento vegetal (RCV).
Los RCV se clasifican en 5 grupos básicos dependiendo de su estructura química
y su efecto fisiológico y son: Las auxinas son compuestos derivados comúnmente del
triptofano, y generalmente son sintetizados en los ápices y están implicados en varios
eventos relacionados con el crecimiento y desarrollo celular de la planta. participan en
la regulación de algunos procesos como el crecimiento celular, la acidificación de la
17

pared celular, el inicio de la división celular, la formación de tejido calloso, la
diferenciación del tejido vascular y la formación de órganos. La auxina de origen
natural más importante es el ácido indolacético (AIA) y entre los sintéticos se
encuentran el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), ácido naftalen acético (ANA) y el
ácido 4-amino-3, 5, 6-tricloropiridin-2-carboxílico (picloram) (Pérez-Molphe, 1999).
Las Citocininas, Generalmente son derivados de la adenina y son sintetizados
en tejidos jóvenes y raíces. Se le han atribuido dos propiedades fundamentales para
CTV: 1) estimulan la división celular y 2) rompen la latencia de las yemas axilares
haciéndolas brotar. En las plantas completas, tiene la función de promover la
brotación de yemas axilares, estimula la expansión de las hojas y retardan la
senescencia. Las citocininas naturales más comunes son la zeatina, Isopentiladenina
(2iP) y el ribósido de zeatina, y entre las sintéticas están la benciladenina (BA), la
cinetina (CIN) y el N-fenil-N´-1,2,3-tidiazolil-5-urea (TDZ ó Tidiazuron) (Martínez-
Garcia et al., 2002).
El Ácido giberélico, puede utilizarse en algunos casos para la elongación de
estructuras como brotes, y la aceleración de brotes en ciertos tipos de yemas y
meristemos. Ácido abscísico, es utilizado en algunos casos para inhibir la
germinación de embriones maduros o para completar el proceso de los mismos.
Una de las vías posibles para aumentar la eficacia de los métodos de
transformación genética mediante Agrobacterium tumefaciens es la optimización de la
capacidad de regeneración in vitro de las plántulasespecies a trabajar. Aunque las
células vegetales son totipotenciales y poseen la capacidad de diferenciarse, algunos
tejidos son más fáciles de ser inducidos para formar nuevas plantas. Las condiciones
necesarias para la regeneración eficiente varían entre células de la planta y tejidos
así como de la especie (Powell et al., 1990; Le, 1991; Ly et al., 1996; M´Hamdi et al.,
1998)
18

En lo referente a la plantaespecie de interés, ha sido posible la regeneración de
plantas completas de diversos cultivares comerciales, a partir de diferentes explantes;
segmentos de tallo y hojas desarrolladas in vitro (Visser et al., 1989; Visser, 1991;
Hulm et al., 1992; Yadav y Sticklen, 1995; Gómez et al., 1997; Rodríguez et al.,
2000; Trujillo et al., 2001), anteras, (De Block, 1988) y plantas enteras partiendo de
discos de tubérculos (Marchetti et al., 2000). Esto con el fin de producir cultivos
transgénicos resistentes a diferentes tipos de plagas, producción de vacunas orales
contra diferentes enfermedades y en aumentar la calidad nutricional de la papa (Van
der Meer, 1994; Wu et al., 1995; Beaujean et al., 1998; Veramendi et al., 1999;
Dilmer, 2000; Urwin et al., 2000; Zeh, 2001; Vásquez et al., 2001; Urwin, 2001;
Lauterslager et al., 2001).
Con formato: Fuente: Cursiva
A pesar de que a nivel mundial se han realizado numerosos trabajos en papa en
regeneración y transformación, se ha demostrado que existe una gran dependencia
del genotipo en la capacidad y eficiencia de regeneración (Park et al. 1995). Sin
embargo, el factor más importante para que la regeneración sea posible es el balance
adecuado de reguladores del crecimiento, tales como auxinas y citocininas. Entre las
auxinas mejormás empleadas para la brotación están el ácido indolacético (AIA) y la
bencilaminopurina (BAP) (Park, 1995) y el uso de citocininas como la zeatina pueden
mejor la eficiencia de la regeneración (Yadav y Sticklen, 1995).
La mayoría de los protocolos de regeneración en papa, se basan en colocar los
explantes en diferentes medios de cultivo. pPrimeramente en uno diseñado, para la
inducción de tejido calloso, y luego en otro para la inducción de brotes y por último en
un medio de Eenraizamiento. Este proceso de regeneración, lo que en esta especie
hace que sea más laboriosa y consuma tiempos más largos (Park, 1995; Hulme et al,
1992; Curry y Cassells, 1999). Sin embargo, también existen protocolos de
regeneración en un solo paso, y el cual consisten en colocar explantes en el mismo
medio de cultivo hasta la obtención de plántulas (Trujillo et, al. 2001; Rodríguez et al.
2001).
19

2.10 Microtuberización
La propagación in vitro de papa mediante brotes axilares ha sido reportado por un
gran numero de investigadores y ha llegado ser un sistema efectivo para una rápida
multiplicación de nuevos cultivos o existentes libres de enfermedades (Alisdair y
Willmitzer, 2001). Como alternativa del producto final de la micropropagación de papa
son los pequeños tubérculos o microtubérculos. Los microtubérculos se usan
convenientemente para almacenar o transportar germoplasma y también pueden ser
adaptados para una producción a gran escala (Hussey y Stacey, 1981; Estrada et al.,
1986; Ortiz y Lozoya 1987; Banfalvi et al., 1997; Eugichi, 2000).
Con formato: Fuente: Cursiva
El tubérculo de la papa no se forma en la raíz como común se piensa, si no que se
desarrolla en un tallo subterráneo llamado estolón. En condiciones que no son
favorables para la formación del tubérculo como por ejemplo. dDías largos (LD; por
sus siglas en inglés), los estolones frecuentemente emergen fuera del suelo y
producen un nuevo brote, sin embargo en condiciones favorables como días cortos
(SD: por sus siglas en inglés), los estolones siguen creciendo hasta el hinchamiento
de la punta para formar el tubérculo. Este hinchamiento es debido a que el estolón
deja de crecer y las células de la punta y del cortex se alargan y se dividen
transversalmente. Más tarde las células en la región perimedular se extienden y se
dividen en orientaciones al azar para formar el tubérculo maduro (Fig. 5). (Vecchio et
al., 1994; Alisdair y Willmitzer, 2001).
20

Figura 5. Proceso de tuberización en papa. La figura muestra las diferentes etapas
de formación del tubérculo de papa en la punta de los estolones (Viola et al. 2001).
Los procesos de desarrollo del tubérculo, son difíciles de estudiar en campo o en
plantas crecidas en tierra, debido al bajo nivel de sincronía de los procesos de
tuberización en esas condiciones. Para evitar estos problemas, se han desarrollado
métodos in vitro, que conducen a una sincronización de la tuberización, así como a
una alta frecuencia de producción (Villafranca et al., 1998; Alisdair y Willmitzer, 2001;
Coleman et al.; 2001).
2.11 Factores que inducen la microtuberización
La inducción de la microtuberización es debido tanto a factores ambientales como
endógenos, haciendo que esta sea favorecida por: foto períodos principalmente de
días cortos (SD), principalmente; temperatura relativamente bajas (20-24 °C), alta
concentración de sacarosa (8-10%) al medio de cultivo, intensidad de luz alta, baja
cantidad de nitrógeno y la adición de reguladores del crecimiento como citocininas
(Hussey y stacey, 1984; Suttle, 1998; Jackson, 1999; Alisdair y Willmitzer, 2001;
Martínez-García et al., 2002).
a) Efecto de la sacarosa sobre la tuberización.
Xu et al. (1998), mencionan que la microtuberización es altamente dependiente de
la concentración de sacarosa, y que a su vez este carbohidrato es un inductor de
21

varios genes en el tubérculo, tales como Llos de la patatina (proteína de reserva),
inhibidor de proteinasas II (regulador de proteasas) y ADP-Glc pirofosforilasa. Sobre
la concentración de sacarosa, los mismos autores reportan, que existen altos niveles
de GA en la punta de los estolones (puesto que GA, es un inhibidor de la
microtuberización) cuando se agrega al medio una concentración del 1% de sacarosa
y disminuyen cuando se incrementa la cantidad de sacarosa en un 8%, sugiriendo
que la sacarosa puede modular los niveles de GA en los estolones y desarrollar
mayor cantidad de estos para la inducción de los tubérculos. La prueba principal de
estos datos se basa en la producción de plantas transgénicas de papa con el gen en
antisentido de la ADP-Glc pirofosforilasa, donde se observó que los tubérculos tienen
una baja actividad de esta enzima y por lo tanto niveles bajos de almidón, así mismo,
se observó que el único cambio fue un incremento en el número de tubérculos
producidos y un decremento de tamaño (Muller-Rober et al., 1992; Xu et al., 1998).
Aunque algunos investigadores han propuesto que no es necesario la adición de
sacarosa al medio para la microtuberización ya que, esta se puede dar bajo otras
condiciones externas como temperatura y fotoperiodos de días cortos (Garner y
Blake, 1989). Sin embargo, existe un mayor número de investigadores que aseguran
que las altas concentraciones de sacarosa promueve la microtuberización y que
posiblemente esta se dé sin sacarosa dependiendo del genotipo que se estudie
(Jackson, 1999).
b) Efectos del fotoperiodo sobre la tuberización
Algunas especies de papa tales como: S. dDemissum, y S. Ttuberosum son
plantas de días corto que requieren de 12 horas luz o menos para el proceso de la
microtuberización. El fotoperiodo tiene un efecto importante sobre los niveles de GA
en muchas especies de papa, puesto que existe un incremento de GA en plantas
puestas sobre LD que en SD. Por ejemplo, se ha visto que los niveles en la actividad
de GA decrecen en hojas de plantas de S. tuberosum ssp. Andigena, cuando son
transferidas de LD a SD (Dobranzki y Mandi, 1993; Seabrook et al., 1993; Jackson;
1999; Dobranzki, 2001).
22

En otros estudios se ha comprobado el efecto que tiene el fotoperiodo sobre la
ruta metabólica del GA; en espinaca y chícharo, donde existe baja actividad de las
enzimas GA 20-oxidasa y de la GA12-aldehído involucradas en la síntesis de GA y
por ende menos actividad de GA. Asimismo, estos estudios sobre los efectos del
fotoperiodo ha sido bien documentado por varios investigadores sobre una amplia
gama de variedades de papa obteniendo mayor cantidad de microtubérculos (Gopal
et al., 1998).
c) Efectos de la temperatura.
Las altas temperaturas (28° C o más) son inhibitori as para la microtuberización ya
sea en SD o LD, aunque los efectos inhibitorios se han visto más en SD.
Las altas temperaturas afectan la partición de los asimilados de carbono,
decreciendo la cantidad de estos hacia los microtubérculos e incrementando la
cantidad a otra parte de la planta. Este efecto se estableció mediante la variación de
temperatura en diferentes partes de la planta (30 °C – 35 °C alta y 17-26 °C bajas)
donde se observó que las altas temperaturas dan origen a plántulas con brotes
laterales y e inhibiendo parcialmente la microtuberización, bloqueando el desarrollo
de los estolones (Jackson, 1999).
2.12 Transformación genética de plantas de papa mediada
por Agrobacterium tumefaciens
La transformación genética de diferentes variedades de papa mediada por A.
tumefaciens, ha sido mundialmente utilizada para la introducción de genes foráneos
(De Block 1988; Visser et al. 1989; Dymocket al., 1991; Mitten et al. 1990; Escudero
et al., 1995; Pfitzner, 1998; Chong y Langridge, 2000). Sin embargo, muchos de
estos métodos son poco eficientes, debido principalmente a una baja producción de
brotes en el medio utilizado para la regeneración. A pesar de esto, se ha tenido éxito
en la transformación de diferentes variedades de papa para producir cultivos:
resistentes a varios tipos de plagas; con vacunas orales contra diferentes
enfermedades; y con mayor calidad nutricional (Van der Meer, 1994; Wu et al., 1995;
Urwin et al., 1995; Constabel, 1999; Veramendi et al., 1999; Kumar et al., 1995;
23

Bendalman et al., 2000; Dilmer, 2000; Urwin et al., 2000; Urwin et al., 2001; et al.,
2001; Vásquez, 2001; Lauterslager et al., 2001).
En algunos casos ha sido necesario optimizar métodos de transformación para
variedades específicas de papa. Como Beaujean et al., (1998) quienes trabajaron
con Bintje, Desirée y Kaptah Vande; y de Trujillo et al., (2001) trabajando con Diacol
Capiro (DC) y Parda Pastusa (PP). Sin embargo, Y een la mayoría de los casos se
han utilizado sistemas de regeneración ya establecidos para la misma o diferente
variedad, con el fin de verificar la expresión y funcionalidad del gen de interés. Por
ejemplo en la transformación de la variedad Desirée mediada por A. tumefaciens,
Lecardonnel et al., (1999) utilizaron los genes marcadores nptII y uidA y observaron
que la expresión en las hojas provoca rechazo alimenticio a larvas de Leptinotarsa
decemlineata S (escarabajo dorado de la papa); Zeh et al., (2001), expresaron el gen
en antisentido de la treonina sintasa con el fin de verificar el punto de divergencia
entre la síntesis de los aminoácidos treonina y metionina, como consecuencia de
esto se obtuvo una alta acumulación de metionina en las plantas transgénicas, lo que
hizo que estas tuvieran un gran valor nutricional; y Narváez y Ryan (2002) trabajando
con la misma variedad, pero con el gen precursor de la sistemina, transformaron
segmentos de tallo y secciones de microtubérculos donde se generaron plantas con
características resistentes a heridas y patógenos. En variedades Europeas como la
116/86, se utilizaron diferentes medios de regeneración, tal es el caso de
Moravcíkova et al., (2004) quienes transformaron con los genes fusionados de la
quitinasa III y de la glucanasa I, donde las plantas transformadas mostraron
inhibición del crecimiento del hongo Rhizoctonia solan, al estar en contacto con
estas; Chakraborty et al., (2000) trabajaron con la misma línea pero con el gen AmA1
de Amaranthus hypochondriacus, que codifica para una proteína rica en aminoácidos
esenciales donde se logró obtener tubérculos con un alto valor nutricional para los
humanos. En algunas otras se obtuvieron plantas con características resistentes a
nematodos utilizando el gen de oryzacistatina I (Urwin et el., 1998; Cowgill et al.,
2002; Urwin et al., 2000; Urwin et al., 2003; Hussey et al., 2002; Williamson y
Hussey, 1996).
Comentario [EPMB1]: Estos son genes
marcadores, no pueden conferir resistencia
por si mismos
Comentario [EPMB2]: Sistemina?
24

III
MATERIALES Y METODOS
3.1 Materiales
Material vegetal de tubérculo de papa variedad alfa, donado por el Ing. Roberto
Garcidueñas del Comité Estatal de Sanidad Vegetal del Estado de Guanajuato
(CESAVEG).
Cepas bacterianas
Agrobacterium tumefaciens para la transformación de las cepas EHA 105,
PGV 2260 y AGL1226.
Escherichia coli: cepa DH5α, para la transformación bacteriana en el diseño de las
construcciones utilizadas.
3.2 Métodos
3.2.1 Construcción del plásmido pCAMBIA:cch
El gen de la cistatina C humana , se encontraba inicialmente clonado en el vector
pUC18 en los sitios de restricción Eco RI. Con el fin de generar nuevos sitios de
restricción en el gen de la cch y clonarlo en el vector de expresión de plantas
pCAMBIA 2301, primeramente se liberó el gen de la cch del vector pUC18 mediante
restricción con la enzima Eco RI, siguiendo el protocolo descrito por Sambrook et. al.,
(1989) este fragmento posteriormente se subclonó en el vector pBSK- y luego en el
vector pKYLX80 (Fig. 6).
Comentario [EPMB3]: ¿dónde se
obtuvo?
Como se puede apreciar en la Figura 7, el vector pCAMBIA carece del promotor
que dirija la expresión del transgen de la cch y así como de la secuencia de
terminación. Para que el gen de la cch tuviera el promotor y el terminador, se fusionó
el promotor del virus del mosaico de la coliflor potenciado (35S 2 ) y el terminador de la
ribulosa bifosfato carboxilasa (rbcS 3´), en el sitio de clonación múltiple del vector
25

pCAMBIA, ambos fragmentos fueron cortados mediante restricción del vector
pKYLX80. El promotor se liberó con las enzimas Eco RI y Bam HI y el terminador de
la rbcS 3´, con Bam HI y Cla I (Fig. 7B).
La construcción pCAMBIA:cch, fue incorporada mediante transformación genética
bacteriana en la cepa curada DH5α de E. coli por choque térmico y la verificación de
la transformación se realizó mediante el aislamiento de DNA plasmídico de las
colonias como presuntas positivas; así como por análisis de restricción.
A
B
Eco RI
Promotor
35S 2
rbcS3’
Hind III-BamHI-XhoI-PstI-SacI-XbaI
Km
Eco RI BamHI ClaI
Figura 6. Mapa del vector pKYLX80 y fragmento linearizado del promotor, sitio
múltiple de clonación y el terminador.
Organización del vector de expresión en plantas, que se utilizó para liberar el
promotor potenciado del virus del mosaico de la coliflor (35S2) y el terminador
de la ribulosa bifosfato carboxilasa (rbcS3´). B) fragmento linearizado del
vector pKYLX80 donde se muestra el sitio de restricción Eco RI del promotor,
sitio múltiple de clonación, y el de rbcS3´.
26

A
Sitio multiple de clonación
B
Borde izq.
35s
Poly A
Gen de
selección
de plantas
35S Lac Z 35S Gus Nos
Poly A
Borde Der.
EcoRI-BamHI
Figura 7. Mapa del vector pCAMBIA:2301 y linearización del cassette de
expresión.
Organización del vector binario de expresión en plantas pCAMBIA:2301. El vector
presenta el cassette de expresión limitado por los bordes izquierdo y derecho (tborder:
left and right), donde esta presente el gen de selección a kamanicina, el
gen reportero gus y el sitio múltiple de clonación. B) linearización del cassette de
expresión donde se muestra los sitios de restricción Eco RI-Bam HI dentro del sitio
múltiple de clonación, este sitio fue utilizado para insertar el gen de la cch con su
promotor y secuencia de terminación.
27

3.2.2 Aislamiento de DNA plasmídico mediante mini
preparaciones (minipreps) por el método de Birboin
Se inoculó una colonia aislada de las posibles transformantes en 3 ml de medio
LB (Sambrook y Maniatis, 1989) líquido con el antibiótico carbenicilna (Cb), y se
incubó a 37 °C con agitación constante durante toda la noche. Al día siguiente se
tomó 1.5 ml de cultivo y se transfirió a un tubo para microcentrígufa y se centrífugó a
12000g por 2 min. El sobrenadante se desechó y la pastilla se resuspendió en 100
µL de solución I (glucosa 50 mM, Tris-HCl 25 mM, EDTA 10 mM) y se dejó a
temperatura ambiente durante 5 min. Transcurrido este tiempo se agregaron 200 µL
de la solución II (NaOH 0.2N, SDS 1%) y se mezcló por inversión por 5 min.
Enseguida, se adicionaron 150 µL solución III (acetato de potasio 5M, ácido glacial
acético 1N) y se dejó precipitar en hielo por 5 min. Las muestras se centrifugaron a
12000g a 4 °C durante 5 min. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se le
agregó 2 µL de RNAasa y se dejó incubar a 37°C por 30 min. Pasado ese tiempo, se
realizaron extracciones con fenol-cloroformo 1:1 (V:V), y cloroformo-alcoholisoamílico
24:1 (V:V). En ambos casos, se recuperó la fase acuosa y los ácidos nucleicos se
precipitaron con 2.5 volúmenes de etanol absoluto frío, mezclando vigorosamente por
inversión e incubando después a -70°C por 30 min. La pastilla con el DNA se
recuperó centrifugando a 12000g a 4°C por 5 min. y se lavó con etanol frío al 70%,
secando luego bajo vacío.
La integridad de la molécula de DNA plasmídico, se analizó mediante
electroforesis en gel de agarosa al 1% en buffer de corrida de TPE (Sambrook y
Maniatis,1989) 1X, el gel fue teñido con bromuro de etidio y visualizado bajo luz
ultravioleta.
28

3.2.3 Micropropagación de plántulas axénicas de papa
mediante cultivo de tejidos vegetales
Tubérculos de papa de la variedad alfa fueron lavados suavemente con abundante
agua y Extran al 5% y posteriormente fueron secados y puestos sobre una capa de
algodón húmedo e incubados a temperatura ambiente y en oscuridad durante 4-5
semanas. Los brotes generados después de ese tiempo, fueron lavados con Extran
al 5% por 5 min, y desinfectados dos veces con una mezcla de blanqueador
comercial (cloralex) al 1% y etanol 10% durante 10 min, finalmente se enjuagaron
dos veces con agua destilada estéril.
Los brotes se cortaron en segmentos de aproximadamente 1 cm de longitud y
fueron colocados horizontalmente en medio basal MS propuesto por Murashige y
Skoog (1962) al 50% con sacarosa al 3% y 8 g·L -1 de agar e incubados bajo
condiciones de luz continua a 25 °C.
Las plántulas obtenidas mediante micropropagación fueron cortadas por
segmentos nodales y propagados en el mismo medio y bajo las mismas condiciones
experimentales antes mencionadas. El material vegetal obtenido mediante este
proceso se utilizó como fuente de explantes para los experimentos de regeneración
de papa por organogénesis y microtuberización.
3.2.4 Regeneración de papa por organogénesis
Se utilizaron explantes de hoja y tallos de plántulas de 4 semanas crecidas in
vitro. Los explantes de hoja fueron cortados de su base y se colocaron con el haz en
contacto con el medio, mientras que los tallos fueron de regiones internódales de
aproximadamente 0.5 cm de longitud y colocados horizontalmente en el medio.
29

Como medio basal se utilizó el MS al 50% suplementado con caseína hidrolizada
0.05%, ácido ascórbico 40 mg·L -1 y sacarosa 3%.
Los explantes se sometieron a cinco tratamientos diferentes con reguladores del
crecimiento como se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1. Tratamientos analizados para la regeneración de papa.
TRATAMIENTO
(medio MS)
Concentración de reguladores del
Crecimiento en mg/l.
GA 3 AIA TDZ BA 2IP Zeatina
MSR1 1 1 0 0.5 0 0
MSR2 1 1 0.1 0 0 0
MSR3 1 1 0.05 0.1 0 0
MSR4 1 1 0 0 3 0
MSR5 1 1 0 0 0 3
Se usaron 40 explantes de tallos y 40 de hoja por tratamiento y el experimento
completo se realizó cuatro veces de forma independiente. Los explantes fueron
incubados en la oscuridad durante 4-5 semanas hasta la aparición de tejido calloso y
posteriormente bajo lámparas de luz fluorescente (54 µmol/m 2 s) en ciclos de 8/16 h
luz/oscuridad a 25 °C durante 4-5 semanas, para la inducción de brotes. El número
de brotes por explante se cuantificó a los 60 días de iniciado el experimento.
3.2.5 Microtuberización
Se cortaron segmentos nodales de plántulas axénicas in vitro y se colocaron en
forma vertical en el medio de cultivo. Como medio basal se utilizó el MS al 50%,
probándose ocho diferentes condiciones diseñadas para favorecer la
30

microtuberización (Tabla 2). Se utilizaron 10 explantes por cada tratamiento y el
número de microtubérculos se registró a los 28 días de iniciado el experimento.
Tabla 2. Tratamientos analizados para la microtuberización.
tratamiento Condiciones del medio Condiciones de incubación
MST1 Sólido con 3% sac. 16 hr Luz /8 h osc.
MST2 Sólido con 8% sac. 8 h Luz/16 h osc.
MST3 Sólido con 8% sac. Preincubación por 14 días en
osc. 8 h Luz /16 h osc.
MST4 Sólido con 3% Sac. Preincubación por 14 días en
osc. 8 h Luz /16 h osc.
MST5 Líquido con 8% sac. Luz continua.
MST6 Liquido con 3% sac. Luz continua.
MST7
MST 8
Sólido, 3% sac. y
2.5 mg.L -1 cinetina.
Sólido, 8% sac.y
2,5 mg.L -1 cinetina.
8 h Luz /16 h osc.
Preincubación por 14 días en
osc. 8 h Luz /16 h osc.
Donde sac; sacarosa, osc; oscuridad.
3.2.6 Registro y análisis de datos
La toma de datos se realizó de acuerdo a lo especificado para cada medio en la
regeneración de plantas, donde se tomaron los datos para la respuesta de inducción
de brotes .Se determinó si existió diferencia significativa entre los 5 tratamientos
empleados con los explantes de tallo y hoja para cada uno. Para ello se empleó la
prueba para el análisis de varianza (anova) no paramétrico, para un diseño
completamente al azar, propuesta por Kruskal-Wallis, asimismo se realizó la prueba
de las medias de los rangos múltiples estandarizados de Tukey-Kramer con la
31

finalidad de seleccionar el mejor tratamiento. El software estadístico utilizado para
esta prueba fue el INSTAT 2.
3.2.7 Germinación de los microtubérculos y aclimatación de
las plantas generadas
Los microtubérculos obtenidos fueron sometidos a dos tratamientos con el fin de
inducir su germinación in vitro. En ambos tratamientos se utilizó como medio basal
MS 50%. El primer tratamiento fue libre de hormonas mientras que para el segundo
fue adicionado con 2,5 mg⋅L -1 de cinetina. Ambos se incubaron bajo luz continua
durante 2 semanas. Adicionalmente, se intentó la germinación ex vitro, para lo cual se
colocaron los microtubérculos sobre una capa de algodón húmedo hasta su
germinación. Los microtubérculos con brotes adventicios y raíces fueron transferidos
a suelo y aclimatados en el laboratorio y posteriormente bajo condiciones de
invernadero.
3.2.8 Transformación genética de plantas de papa mediada por
Agrobacterium tumefaciens
Con el fin de establecer las condiciones de transformación genética de papa de la
variedad alfa utilizando la cepa EHA 105 de Agrobacterium tumefaciens, se
analizaron varios protocolos de transformación para diferentes variedades de papa
como se muestra en la tabla 2. A esta primera fase de análisis donde se utilizó la
cepa EHA 105, se le denominó como primera transformación y la segunda
transformación fue aquella donde se trabajó con las cepas PGV 2260, AGL 1226 y
EHA 105, donde se utilizó como medio de regeneración MS3, tal como se muestra en
la Tabla 3.
32

El protocolo en general para la transformación fue el siguiente: Colonias aisladas
de Agrobacterium fueron incubadas en medio YEB a 28 °C por 24 hrs. con agitación
continua. La obtención de la concentración de la bacteria se hizo mediante
espectrofotometría a una absorbancia de 650 nm, y se diluyó en medio fresco YEB a
una concentración de 1x10 8 bacterias por ml. Como explantes se utilizaron regiones
internódales de tallo y hojas de 4 semanas de crecida in vitro. Antes de la infección,
los explantes, fueron incubados en medio MS para la primera transformación y para la
segunda en MS3 durante 24 hrs. Pasado este tiempo, los explantes fueron incubados
en 20 ml de medio MS líquido el cual contenía la bacteria y se incubaron en oscuridad
a 28°C y en agitación constante. Después de la infe cción, los explantes fueron
secados en papel filtro y colocados en medio de cocultivo MS3 durante 48 hr.
Después del cocultivo, los explantes fueron lavados en medio MS líquido adicionado
con 10 ml ּ◌L -1 de antibiótico PPM. Los explantes fueron lavados varias veces hasta
quitar el exceso de bacteria y fueron secados sobre papal filtro estéril e incubados en
medio de selección hasta la obtención de brotes.
Para la primera transformación los medios de regeneración y de selección fueron
los siguientes:
MS(A): ANA 200 mg ּ◌L -1 , GA 3 20 mg ּ◌L -1 , 2-ip 2 mg ּ◌L -1 , Cb 250 mg ּ◌L -1 y Km 50 mg ּ◌L -1 .
MS (B): zeatina 0.8 mg ּ◌L -1 , 2,4-D 500 mg ּ◌L -1 , Claforam 500 mg ּ◌L -1 y Km 50.
MS(C): ANA 0.2 mg ּ◌L -1 , zeatina 2 mg ּ◌L -1 , PPM 20 mg ּ◌L -1 y Km 50 mg ּ◌L -1 .
MS (D): zeatina 3 mg ּ◌L -1 , GA 3 mg ּ◌L -1 , AIA 1 mg ּ◌L -1 , Km 150 mg ּ◌L -1 y Cb 500 mg ּ◌L -1 .
MS1 (E): GA 3 mg ּ◌L -1 l, BA 0.5 mg ּ◌L -1 , AIA 1 mg ּ◌L -1 . PPM 10-20 ml/l, Km 50-150 mg ּ◌L -1 .
MS3 (F): GA 3 1 mg ּ◌L -1 l, AIA 1 mg ּ◌L -1 , TDZ 0.05 mg ּ◌L -1 , BA 0.1 mg ּ◌L -1 , PPM 10-20 ml/l, Km
50-150 mg/l. MS (G): PPM 20 ml/l y Km 50 mg/l.
Nota: el medio de selección en todos los casos fue el mismo que el de regeneración
sólo que con la adición de antibiótico.
33

Tabla 3. Primera transformación genética de plantas de papa.
P r im e r a tr a n s fo r m a c ió n
C e p a d e
A g ro b a c te riu m
E H A R 1 0 5
T ip o d e
e x p la n te y
c a n tid a d
T a llo 4 0
H o ja 4 0
P re
tra ta m ie n to
D il d e b a c te ria y
tie m p o d e
in c u b a c ió n (m in )
M e d io
R e f e re n c ia
N O 1 5 m in . M S (A ) T a k a h a T . e t
a l., (1 9 9 8 )
T a llo 4 0
(s e c c io n a d o s
lo n g itu d in a l)
H o ja 4 0
M S
2 4 h rs .
1 :1 0
3 0 m in .
M S (B )
B e a u je a n e t
a l., (1 9 9 8 )
T a llo 4 0
H o ja 4 0
M S
2 4 h rs .
1 :1 0 -1 :5 0
1 5 -3 0 m in .
M S (C )
M ´h a m d i M . e t
a l., (1 9 9 8 )
T a llo 4 0
H o ja 4 0
M S
2 4 h rs .
1 :1 0 , 1 :5 0 ,
1 :1 0 0
1 0 -3 0 m in .
M S (D )
T ru jillo C . e t
a l., (2 0 0 1 )
T a llo 4 0
H o ja 4 0
T a llo 4 0
H o ja 4 0
M S
2 4 h rs .
M S
2 4 h rs .
1 :5 0 , 1 :1 0 0
1 0 -3 0 m in
1 :1 0
1 0 m in .
M S 1 (E )
M S 3 (F )
F ra n c is c o
M o ra le s
P ro p u e s to
p a ra e s ta te s is .
S e c c io n e s d e
m ic ro tu b é rc u lo s
1 :1 0 0
1 0 m in .
M S (G )
Tabla 4. Segunda Transformación genética de plantas de papa.
S e g u n d a transfo rm ac ió n
C e pa de A .
tu m efa cien s
E H A 105:
pC A M B IA :C C H
D il.
B a ct.
N o. D e
tallo s
N o.
h oja
La va do s con
A ntib iótico
90 80 P P M 10 m l/L
24 h rs.
M ed io d e
S e lección
M S 3
P P M 10 m l/L
K m 25 m g/L
E H A 105:
C A M B IA :C C H
A gl:C A M B IA :C C H
90 80 P P M 10 m l/L
4 hrs.
90 7 0 P P M 10 m l/L
4 h rs.
P P M 1 0 m l/L
K m 25 m g/L
P P M 1 0 m l/L
K m 25 m g/L
pG V:C A M B IA :C C H
90 8 0 P P M 10 m l/L
4 h rs.
P P M 1 0 m l/L
K m 25 m g/L
34

3.2.9 Análisis histoquímico del gen uidA
Los explantes y plántulas que crecieron en medio de selección, se analizaron para
comprobar transformación mediante la tinción histoquímica del gen reportero uidA
que codifica para la β-glucuronidasa (GUS).
El protocolo que se utilizó fue el propuesto por Jefferson (1987). Para monitorear
la expresión de GUS en los explantes, sSe tomaron 3 de tallo y 3 de hoja al azar a los
7, 15 y 21 días después de la transformación y para las plántulas hasta la aparición
de brotes axilares. Los explantes se colocaron en un tubo para microcentrífuga de 1.5
ml y se cubrieron completamente con el reactivo para la detección histoquímica dede
GUS. Posteriormente se incubaron a 37 °C en oscurid ad durante 24 hr, enseguida se
eliminó la clorofila de los explantes mediante lavados consecutivos con etanol al 70%,
hasta que los explantes quedaran transparentes y se pudiera observar la tinción azul.
3.2.10 Análisis molecular de las plantas transformadas mediante
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Para analizar molecularmente las plantas como presuntas transformantes, fue
necesario extraer el DNA genómico y posteriormente la amplificación enzimática in
vitro de los transgenes de la cch, gus y nptII y así como descartar la presencia de
Aagrobacterium con la amplificación de los genes vir, por medio de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) (Vollenhofer et al., 1999).
El protocolo para la extracción de DNA fue el de CTAB (Porebsky, 1997), con
algunas modificaciones hechas en el laboratorio para tejidos de papa. Se pesaron 30
mg de tejido vegetal y se congelaron con nitrógeno líquido y se pulverizo con la ayuda
del mortero. El tejido pulverizado, se pasó un tubo para micro centrífuga de 1.5 ml y
se homogenizó con 3 volúmenes de buffer de extracción (apéndice), se mezcló por
35

inversión durante 5 min., y se dejó Incubar a 60 °C durante 20 min con agitación
constante. Las muestras se centrifugaron a 12 rpm durante 5 min y el sobrenadante
se paso a un nuevo tubo. Enseguida se hicieron extracciones con un volumen (1:1)
de fenol:cloroformo-alcoholisoamilico y una más con cloroformo: alcoholisoamílico
(24:1). El sobrenadante de las extracciones se paso a un nuevo tubo y los ácidos
nucleicos se precipitaron con un volumen de isopropanol e incubando a –20 °C por 20
min. La pastilla de DNA se recuperó centrifugando a 12 rpm por 5 min y se lavó dos
veces con 200 µl de etanol 70% para quitar el exceso de sal. Al final la pastilla se
resuspendió en 50 µl de agua desionizada estéril.
La integración de la molécula de DNA se visualizó mediante electrofóresis en gel
de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio y bajo luz ultravioleta.
La amplificación de los genes de cch, nptII, gus y vir, se realizó acorde al protocolo
del kit comercial PCR Super Mix de Gibbco. La concentración del templete de DNA
fue de 0.2 µg y de oligos de 0.1 µg. La mezcla de reacción, se llevo a cabo en un tubo
para PCR de 0.5 ml durante 30 ciclos con las condiciones siguientes:
desnaturalización 94˚ C por 1 min., alineamiento, 55 °C, 1 min y reacción de la
polimerasa a 72 °C por 1.30 min., la amplificación de las muestras se llevó a cabo en
el termociclador de Perkin Elmer 480.
36

IV
RESULTADOS
Comentario [SIP4]: En página aparte
4.1 Construcción y análisis molecular del vector pCAMBIA:cch
El gen clona de la cch, estaba inicialmente clonado en el vector pUC18. El gen
fue liberado del vector mediante análisis de restricción con la enzima Eco RI. La
muestra de la digestión fue corrida por electroforesis, donde se observó claramente
el fragmento liberado de un peso de 772 pb (Fig. 8). Con el fin de tener un sitio de
restricción que permitiera la inserción del gen de la cch en el vector de expresión de
plantas el pCAMBIA, se utilizó como generador de nuevos sitios de restricción el
plásmido pBSK-, que fue digerido con la enzima Eco RI (Fig. 9). Posteriormente,
tanto el gen de la cch como el vector pBSK-:fueron corridos por electroforesis y
purificados del gel de agarosa, siguiendo el protocolo de un kit comercial (Gibco), y
se procedió con la ligación de ambos. La orientación de la construcción pBSK-:cch,
se verificó mediante análisis de restricción con las enzimas Xho y Sac I; sitios que
fueron adicionados al gen de la cch y donde se muestra un aumento de 91pb
quedando a 863 pb. (Fig. 10). Una vez obtenido esta construcción se volvió a liberar
el fragmento y se clonó en los vectores pKYLX80 y pCAMBIA. Con la construcción
pCAMBIA:cch (Fig. 11), se procedió a realizar la transformación de Agrobacterium
tumefacienes cepa EHA105 mediante la técnica de cruza triparental y la verificación
fue mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
37

1 2 3 4 5 6
pUC18
2.69 Kb.
pBSSK-
2.96 Kb.
gen cch
Aprox. 772 pb.
Figura 8. Análisis de restricción de pUC18:cch con Eco RI y
linearización del vector pBSK-.
En los carriles1, 2 y 4 se observa el corte enzimático de la
construcción puc18:CCH, donde el 2.69 kb corresponde al vector y el
fragmento de 772 a la CCH. Carril 3 MPM 1Kb. Carriles 5 y
6,corresponden al vector pBSK- linearizado con la enzima Eco RI. El
gel fue teñido con bromuro de etidio y visualizado bajo luz ultravioleta.
Comentario [EPMB5]: Marcadores?
gen cch
Aprox. 863 pb.
Figura 9. Análisis de restricción de pBSK-:cch. Carriles 1 y 2,
muestras de DNA plasmídico digerido donde se observa el plásmido
de 2.96 kpb., y el fragmento de cch de 863 pb. Carril 3, DNA
plasmídico falso positivo, y carril 4, MPM 1 kb.
38

1 2 3 4 5
Cch, 863 pb
Figura 10. Análisis de restricción de pCAMBIA:cch con Xho y Sac.
Carriles 1 al 4 muestras de la digestión, donde se observa una banda
de alto peso molecular que corresponde al vector y otra de
aproximadamente 863 perteneciente al peso molecular de la cch.
Borde
izq.
CaMV35
Poly
A
Gen de
selección
de
plantas
35S
35S 2
pKYLX80
cch
Lac
rbcs 3´ Z
pKYLX80
35S Gus Nos Poly
A
Borde
Der.
Figura 11. Mapa de la construcción pCAMBIA:cch.
El gen de la cch fue insertado dentro del sitio múltiple de clonación del vector
dirigido por el promotor potenciado del virus del mosaico de la coliflor (35S2)
y la secuencia de terminación de la ribulosa 5 fosfato (rbcs3´). El gen de
selección nptII, se encuentra cerca del borde izquierdo bajo el promotor 35S
y el gen uidA cerca del borde derecho con el promotor 35S.
39

4.2 Producción de brotes a partir de tubérculos de la papa
Se trabajó con tubérculos de papa esterilizadosdesinfectados, que fueron
incubados para la germinación de brotes. Después de tres semanas de incubación los
tubérculos produjeron brotes de 3 cm de longitud. Estos brotes se cortaron en
segmentos de 1 cm de longitud con una yema axilar y de nueva cuenta fueron
desinfectados y colocados verticalmente en medio de propagación (Fig. 12A), donde
crecieron sanamente hasta la formación de plántulas completas y posteriormente
fueron utilizados para propagación y regeneración (Fig. 12B).
Comentario [SIP6]: ¿Estos ya no
fueron desinfectados, solo el tubérculo?
4.3 Propagación de plántulas
Los brotes del tubérculo de la papa a las 4 semanas de ser incubados en medio
de propagación, produjeron plántulas de 10 cm de longitud con apariencia sana,
vigorosas y raíces. Durante la primera semana de incubación, se observó que todos
los segmentos nodales formaron plántulas entre 4-5 cm de longitud, a la segunda
semana tenían abundantes raíces y en la cuarta semana ya se tenía plántulas de
aproximadamente 10-12 cm de longitud (Fig. 12B).
Comentario [SIP7]: Homogeneizar
justificación
A
B
Figura 12. Micropropagación in vitro de plántulas de papa.
A) Segmentos nodales colocados en medio para propagación
provenientes de brotes del tubérculo. B) propagación de plántulas a las
4 semanas de ser incubadas. Las condiciones de propagación son:
25°C, bajo luz continúa.
40

4.4 Regeneración
Para verificar que el sistema de regeneración fuera eficiente se propuso un tiempo
máximo de 5 semanas para la inducción de tejido calloso y de 6 semanas para la
brotación a partir de tejido calloso. La aparición de tejido calloso en los extremos de
los tallos y en los bordes de las hojas se observó a las dos semanas de iniciado el
experimento (Fig. 13A y B), a partir de la quinta semana la formación de tejido calloso
fue en todo el explante (Fig. 13C y D). La formación de tejido calloso ocurrió
principalmente en los tratamientos con TDZ 0.05 mg·L -1 y con 0.1 BA mg·L -1 (MS3),
BA 0.5 mg·L -1 (MS1) y 2iP 3 mg·L -1 (MS4). Con respecto a los medios tratados con
TDZ 0.1 mg·L -1 y zeatina 3 mg·L -1 , no se observó inducción de tejido calloso y mucho
menos la aparición de brotes.
Tabla 5. Efecto de varias combinaciones de los reguladores de crecimiento en la
regeneración de papa.
Tratamiento Tipo de
explante
Explante con
Callo (%) z
Brotes por
explante y
MSR1 Hoja 67.5 6.1 ± 0.1 b
Tallo 71.3 6.5 ± 0.1 b
MSR2 Hoja 6.3 0.5 ± 0.1 c
bencil adenina (BA), thidiazuron (TDZ), ácido indolacético (AIA), ácido
giberélico
(GA 3 ), Isopentiladenina (2ip) y zeatina. En la formación de tejido calloso y la
proliferación de brotes adventicios en papa variedad alfa.
Z los valores se refieren al porcentaje de explantes que producen tejido calloso.
Y
significa el número de brotes por explante. X análisis de comparación múltiple
Tukey Kramer (P≤0.01)
Tallo 7.5 0.8 ± .02 c
MSR3 Hoja 81.3 10 ± 0.2ª
Tallo 91.3 10 ± 0.2 a
MSR4 Hoja 92.5 0
Tallo 95.0 0
MSR5 Hoja 0 0
Tallo 0 0
41

En lo que respecta al tejido calloso producido con 2iP, no mostraronó inducción de
brotes durante el tiempo establecido, pero si se observó la producción de tejido
calloso tanto para hoja como en tallo (Fig. 14A y B).
A partir de las cinco semanas, los explantes con tejido calloso tanto de hoja como
de tallo colocados en medio con TDZ 0. mg·L- 1 más 0.1 BA mg·L- 1 , y BA 0.5 mg·L- 1 ,
empezaron a producir brotes (Fig. 15A y B) y a las diez semanas el tejido calloso
tenia tanto brotes adventicios como raíces (Fig. 16A y B). Las plántulas obtenidas a
partir de tejido calloso en estos dos medios fueron puestas ens a medio MS 50% para
su enraizamiento y propagación (Fig. 17).
A
B
C
D
Figura 13. Regeneración de papa a partir de tallos.
A; Inducción de tejido calloso en tallo a las 2 semanas y B; Inducción de
tejido calloso en hoja a las 2 semanas tejido calloso de tallo a las 5 semanas,
C y D tejido calloso de tallo y hoja a las 5 semanas. Los explantes fueron
puestos en medio MS adicionado con TDZ 0.05 mg/L y BA 0.1 mg/L.
42

A
B
Figura 14. Producción de tejido calloso en explantes de hoja y tallo con
2i-P. Formación de tejido calloso en los extremos del tallo a las 2
semanas de ser incubado. B) Formación de tejido calloso en los bordes
de las hojas a las 2 semanas de ser incubado.
A
B
Figura 15. Formación de brotes a partir de tejido calloso.
Explantes de tallos y hoja puestos en medio MS adicionado
con TDZ 0.05 mg/L y BA 0.1 mg/L. A y B formación de
brotes a partir de tejido calloso proveniente de hojas.
43

A
B
Figura 16. Regeneración de papa a partir de callos de explante de hoja
y tallo. A) regeneración a partir de explante de tallo en medio MSR1, B)
regeneración a partir de hoja.
Figura 17. Enraizamiento de plántulas de papa.
Plántulas de papa provenientes de tejido calloso fueron
puestas en medio MS al 50%, bajo las condiciones de
luz continua y a 25° C para su enraizamiento.
44

4.5 Producción de microtubérculos
Todos los tratamientos empleados en este experimento inducen la formación de
microtubérculos, aunque, la producción de estos varío conforme al medio y las
condiciones en que fueron incubados como se puede apreciar en la tabla 5.
Para comprobar el efecto del fotoperíiodo en la microtuberización, realizamos
experimentos de SD, luz continua y oscuridad continua. Los resultados en los
tratamientos que no fueron expuestos a fotoperiodos como MST5 y MST6, se observó
que los explantes crecieron de una forma lenta y con hojas y tallos fuertes pero con
escasa producción de raíces y microtubérculos (Fig. 18) aunque, la concentración de
sacarosa fue diferente de un medio a otro 3% y 8% esta no influyó demasiado en la
producción de microtubérculo.
Tabla 6. Tratamientos in vitro utilizados para la microtuberización.
Tratamiento
Producción
de microtubéerculo.
Por frasco
Numero de
microtubérculo
Por explante
Numero de ojos
microtubérculo.
MST1 5 1 4
MST2 10 4 5
MST3 10 6 5
MST4 7 4 4
MST5 3 1 1
MST6 12 1 1
MST7 18 4 5
MST 8 25 8 6
En la Tabla 6, se muestra los diferentes tratamientos utilizados con el fin de
determinar los efectos de estos sobre la formación de microtubérculos. Estos
45

tratamientos fueron seleccionados conforme a experimentos previos en el laboratorio
y en la literatura citada.
En otra serie de experimentos se analizó los efectos de la oscuridad. Para
verificar esto, se procedió a realizar un pretratamiento en oscuridad por dos semanas,
en medios MST3, MST4 y MST8, seguidos de SD. Durante el tiempo de
pretratamiento, se observó una mayor cantidad de estolones por explante con
algunas pequeñas hojas con apariencia etiolada, y la aparición de microtubérculos.
Una vez puesto bajo SD los explantes tomaron apariencia normal y se indujo más la
producción de microtubérculos principalmente en el medio MST4, (Fig. 19).
Para analizar los efectos de la sacarosa sobre la microtuberización, se realizó una
serie de experimentos en diferentes medios con concentraciones del 3 y 8%. Sobre
este punto, los resultados en los medios MST1 (Fig. 20), MST2 y MST4, que
contienen 3% de sacarosa, mostraron variabilidad en la producción de
microtubérculos (tabla 5) mientras que en MST4 tuvo mayor producción de
microtubérculos. Así mismo, los tratamientos con 8% de sacarosa como MST3 y bajo
las mismas condiciones que MST4, mostraron mayor producción de microtubérculos.
Por otro lado, se ha demostrado que la promoción de la microtuberización es
eficaz mediante una combinación de citocininas, sacarosa; SD y bajas temperaturas.
Los resultados sobre la adición de cinetina al medio, mostraron un incremento en la
producción de microtubérculos en los medios a una concentración de 2.5 mg·L -1 y 8%
sacarosa (MST8), después de los 60 días de tratamiento, en comparación con
aquellos que no tienen esta hormona o con combinados con esta y con
concentraciones bajas de sacarosa (MST7).
46

A
B
Figura 18. Efectos de la luz continúa en la producción de tubérculos.
Explantes nodales de plántulas de papa incubados en MS con
8% sacarosa para la microtuberización. B) Explantes nodales de
plántulas de papa incubados en MS con 3% sacarosa. En
ambos casos se observa poca producción de microtubérculos.
los explantes estuvieron a 25° C.
Figura 19. Efectos de la oscuridad en la microtuberización en MST4.
Los explantes fueron inoculados en medio MS con 8% de
sacarosa, bajo un fotoperiodo de incubación de 8 hrs/16
hrs Luz/oscuridad.
47

A
B
Figura 20. Efecto de la sacarosa y cinetina sobre la microtuberización.
A) Microtuberización en MS adicionado con 8% sacarosa y 2.5
mg/L de cinetina, bajo un pretratamiento de 14 días en oscuridad
y seguido de un fotoperiodo de 8hrs/16 hrs. Luz/oscuridad. B)
Microtuberización en medio MS con 3% de sacarosa, bajo un
fotoperiodo de 8/16 hrs. Luz/oscuridad.
4.6 Germinación de microtubérculos
La germinación de los microtubérculos fue más rápida en aquellos que estuvieron
en tratamiento con cinetina, ya que en la primera semana de incubación se observo
la aparición de brotes, estolones y raíces (Fig. 21B). En este caso el 100% de los
microtubérculos germinaron satisfactoriamente. En el medio libre de reguladores del
crecimiento también se observó germinación (100%) de los microtubérculos (Fig.
21A), pero fue más lenta (3 semanas).
Los microtubérculos que se pusieron a germinar in vitro y ex vitro fueron
aclimatados y transferidos a tierra bajo condiciones de invernadero (Fig. 22A y B).
48

Finalmente, el 80% de las plántulas obtenidas a partir de microtubérculos fueron
capaces de sobrevivir en suelo (Fig. 22 C).
A
B
Figura 21. Germinación de microtubérculos.
A) Microtubérculos germinados en medio MS 50% sin
reguladores de crecimiento a las tres semanas de ser
incubados. B) Microtubérculos germinados en medio MS 50%
con 2.5 mg/L de cinetina a la segunda semana de incubación.
A
B
C
Figura 22. Adaptación en suelo de plantas de papa generadas
in vitro. Plántulas de papa adaptadas a suelo provenientes
tanto de plántulas como de microtubérculos. A) Planta de
49

papa proveniente de tejido calloso adaptada a tierra. B) Planta
de papa micro propagada adaptada a tierra y C) planta de
papa proveniente de microtubérculo adaptada a tierra.
4.7 Transformación de plantas
Explantes de hoja y tallo de plántulas crecidas in vitro de 4 semanas fueron
cocultivadas con Agrobacterium tumefaciens cepa EHA 105, PGV2260 y AGL 1226
conteniendo el gen cch:35S. Los explantes como posibles transformantes fueron
seleccionados en medio selectivo con kanamicina y regenerados hasta la obtención
de plantas.
La transformación, se realizó en dos etapas: 1) primera transformación donde
sólo se empleo la cepa EHA 105 y de esta se obtuvieron 6 plantas como posibles
transformantes. Del total de las plantas como putativas transformantes, solo dos
sobrevivieron en medio selectivo con 50 mg/l de km. Durante 4 meses de estar en
este medio las dos plantas mostraron un crecimiento anormal comparadas con el
control es decir, no llegaron a desarrollarse completamente ya que presentaban
hojas pequeñas y etioladas, y el tallo muy frágil y etiolado y sin la generación de
raíces, así como una necrosis en la parte del tallo que estaba en contacto con el
medio (Fig. 23B).
Para verificar la incorporación del DNA exógeno en estas plantas, se extrajo DNA
total y posteriormente la amplificación mediante PCR de los genes de la neomicin
fosofotransferasa II (NPTII), β-glucoronidasa (gus), de la cistatina C humana (CCH) y
de los genes virD con el fin de verificar que los fragmento amplificados no fueran de
la bacteria. Estas dos líneas, dieron positivos para: NPT II con un fragmento cercano
a 700, para gus de 1200 pb (Fig. 24A) y para cch con 500 pb , mientras que para los
genes vir no se detecto amplificación en el DNA provenientes de la planta, pero sí, en
el DNA plasmídico de A. tTumefaciens (Fig. 24B).
Para la segunda transformación se utilizaron a parte de la capa EHA 105 las
cepas Pgv2260 y Agl 1226. Todos los explantes después de la transformación fueron
50

puestos en medio de selección con 50 mg de kanamicina. El análisis de gus se
realizó a los 7, 15 y 21 días tomando al azar 3 explantes tanto de hoja como de tallo
en las tres cepas utilizadas (Tabla 6). Como control positivo se utilizó segmentos de
hoja de limón transformadas y en todos los casos fue positivo a gus (Fig. 25A1, B1,
C1) mientras como control negativo se utilizaron segmentos de papa sin transformar
siendo los resultados negativos para gus (Fig. 25A2, B2, C2). En todos los explantes
analizados a los 7 y 15 días después de la transformación fueron negativos a gus
mientras que a los 21, se observó en un segmento de tallo positivo a gus procedente
de la cepa EHA 105 (Fig. 25B4 y C4). Cconforme transcurría el tiempo, los explantes
tanto de hoja como de tallo en todas las cepas utilizadas sufrieron contaminación por
la bacteria y en la mayoría de aquellos que no presentaba esta contaminación no
crecieron en el medio de selección. Sin embargo, 5 explantes de tallo de la cepa
EHA 105, 8 de ALG1226 y 7 de PGV2260 sobrevivieron en medio de selección con
Km a 50 mg.
Tabla 7. Análisis de la expresión de GUS en explantes de hoja y tallo de papa.
Cepa GUS (+) Observaciones
Tallo Hoja callo C+ C-
EHA105 40/1 30/0 0 + - El resto de los explantes
No creció en medio selectivo.
AGL1226 40/0 26/0 0 + - El resto de los explantes
No creció en medio selectivo.
PGV2260 40/0 33/0 0 El resto de los explantes
No creció en medio selectivo.
En la presente tabla, se muestra la cantidad total de explantes analizados
para verificar la expresión de gus. C+; control positivo explante de limón
transgénico, C- control negativo explante de papa sin transformar.
Después de un mes de ser incubados en medio de selección, dos explantes
procedentes de la cepa EHA 105 lograron sobrevivir y estos presentaban el
crecimiento de un brote el cual se dejo crecer y posteriormente fue aislado y
transferido a medio fresco de selección. A los 5 días, uno de ellos presento hojas
etioladas, seguida por marchites y necrosis y a las 8 días la planta murió (Fig. 26A).
51

En lo que respecta a la otra planta que sobrevivió en el medio de selección, esta
presentó un crecimiento muy parecido a las plantas de la primera transformación es
decir: crecimiento lento, hojas pequeñas, tallo delgado y frágil así como necrosis en
la parte del tallo en contacto con el medio (Fig. 26B). Después de un mes, se
observo un crecimiento retardado por lo que se decidió verificar la presencia del DNA
exógeno. Para este fin, se extrajo DNA total de la planta y se amplificó mediante
PCR para los genes nptII y cch, donde se observó una banda de aproximadamente
700 pb para npt II y una de aprox. de 500 para CCH (Fig. 27A). Así mismo, se tomo
un pequeño fragmento de hojas de la planta para verificar la presencia del gen gus y
el cual fue positivo (Fig. 27B).
En lo que respecta a los explantes con las dos cepa PGV2260 y AGL1226, la
mayoría de estos murieron por necrosis u oxidación y los que aun sobreviven en el
medio de selección han generado pobremente tejido calloso aunque este presenta
oxidación.
Figura 23. Comparación entre plántulas transformadas y no
transformadas. plántulas de papa en Medio MS 50% para su
enraizamiento provenientes de tejido calloso no transformado y B)
plántulas de papa transformada con el gen de la CCH. Nota: ambas
plantas fueron crecidas al mismo tiempo.
52

A) 1 2 3 4 5
B) 1 2 3 4 5 6
GUS
NPT II
CCH
Vir D
Figura 24. Verificación de plantas transformadas mediante PCR.
A: 1) control negativo, 2) DNA genómico de papa, 3) MPM 1kb., 4)
NPTII y 5) gen GUS. B: 1) MPM. 2, 3, 4) vir plasmídico de A.
tumefaciens, 5) cch, 6 y 7) amplificación para Vir en plantas de
papa transformadas.
A
1 2 3 4
B
1 2 3
4
53

C
1 2 3 4
Figura 25. Análisis de gus papa transformadas. En la figura B4 y C4 se
muestra la expresión de gus para un explante de tallo a los 21 de ser
transformado con la cepa EHA 105, y en A, B, y C (1): control positivo de
hojas de limón transformadas.
A
a
B
C
b
a
Figura 26. Plantas regeneradas de papa con el gen de la cch.
A) plántulas transformantes con el gen de la cch en medio MS
con Km 50. B) Planta de papa en medio MS con Km 50 después
a los 40
días después de la Transformación y C) Planta control a los 15
días.
54

1 2 3 4 5 6 7
A
B
Figura 27. Verificación de plantas transgénicas por PCR y GUS.
A: Carril 1) MPM 1kb, 2) control negativo; papa sin transformar, 3) cch
de papa, 4) control positivo, 5) control negativo, 6) NPT II papa, 7)
control positivo. B) Análisis histoquímico de gus.
V DISCUSION
Los primeros experimentos que se hicieron en este trabajo estaban dirigidos a la
obtención de brotes a partir de tubérculos de la papa, los cuales posteriormente
fueron propagados mediante segmentos nodales (Fig. 12). En los explantes
propagados se observó que a las cuatro semanas regeneraron plántulas con una
longitud entre 10 y 12 cm y con raíces. Sobre estos resultados, observamos que la
variedad alfa, al igual que otras variedades es fácil de propagar mediante segmentos
nodales con un brote adventicio. De esta manera de propagación, Khuri y Moorby,
(1996), al trabajar con las variedades Estima, Cultra y Costella, comprobaron que los
explantes con un brote adventicio tiene la facilidad de ser efectiva la propagación, ya
que estos contienen una gran cantidad de ácido giberélico que es esencial para el
crecimiento apical, asimismo, nuestros resultados fueron similares a los reportados
por Hussey and Stacey (1981), Garner and Blake (1989), Khuri and Moorby (1996),
los cuales utilizaron segmentos nodales para la propagación de papa de diferentes
variedades, tanto Europeas como Americanas.
55

El sistema de regeneración a partir de explantes de hoja y tallo de algunas
variedades de Solanum tuberosum L. ha sido bien documentado sin embargo, no
existen protocolos publicados para la regeneración in vitro por organogénesis en la
variedad alfa con o sin el uso de zeatina. La mayoría de los protocolos de
regeneración en papa, y otras plantas, se basan en colocar los explantes en 3
diferentes medios: 1) para la inducción de tejido calloso, 2) para la inducción de
brotes y 3) para enraizamiento. Este proceso hace que la regeneración sea más
laboriosa y tome tiempos más largos (Hulme et al., 1992; Park et al., 1995; Beaujean,
1998).
Rodríguez et al. (2000) y Trujillo et al. (2001), quienes trabajaron con explantes de
hoja de las variedades sudamericanas Diacol Capiro (DC) y Parda Pastusa (PP),
diseñaron un sistema de regeneración en un sólo paso el cual consiste, en colocar los
explantes en el mismo medio hasta la obtención de plántulas. Sobre estos datos nos
propusimos a optimizar un protocolo eficiente de regeneración para la variedad alfa,
el cual estuvo enfocado en la adición de GA 3 y AIA y con diferentes concentraciones
de BA, TDZ, 2ip y Zeatina (Tabla 1). Para verificar la eficiencia de regeneración nos
propusimos en este experimento un tiempo máximo de 4-5 semanas para la inducción
de tejido calloso y de 6 semanas para la brotación a partir de tejido calloso, esto en
base al protocolo en un solo paso propuesto por Rodríguez et al. (2000).
La aparición de tejido calloso en los bordes de las hojas y en los extremos de los
tallos se observó a las dos semanas de iniciado el experimento en varios de los
tratamientos probados (Tabla 1) y (Fig.13A y B). Los tratamientos probados con TDZ
0.05 mg·L -1 más BA 0.1 mg·L -1 (MSR3), BA 0.5 mg·L -1 (MSR1) y 2iP 3 mg·L -1
(MSR4), produjeron el tejido calloso más abundante (Fig. 14A y B), mientras que los
tratamientos con 0.1 mg·L -1 TDZ y zeatina no produjeron tejido calloso en el tiempo
propuesto. A partir de las seis semanas, los explantes con tejido calloso tanto de hoja
como de tallo mantenidos en los tratamientos con TDZ 0.05 mg·L- 1 más 0.1 BA mg·L-
1 (MS3) y BA 0.5 mg·L- 1 (MS1) (Fig. 15A y B), empezaron a producir brotes, y a las
56

10 semanas, el tejido calloso tenía tanto brotes adventicios como raíces (Fig. 16A y B,
Fig. 17).
El mejor tratamiento para la generación de brotes fue MS3, en donde el 81.3% de
los explantes de hoja con callo generaron brotes, con un promedio de 10 ± 0.4 y los
de hoja con 10±0.5. En los explantes tanto de hoja como de tallo con 2iP, se mostró
una producción de tejido calloso de 91.4% para hoja y en tallo del 91.3% (Fig. 14),
pero este no tuvo la capacidad de generar brotes durante el tiempo en que fue
observado.
Sobre el índice de brotación nuestros resultados difieren con lo reportado por
Rodríguez et al. (2000) y Trujillo et al. (2001) quienes trabajando con explantes de
hoja de la variedad Diacol Capiro (DC) y Parda Pastusa (PP) generaron tejido calloso
con la adición de zeatina y también con los resultados de M´hamdi et al. (1998) quien
trabajo con las variedades Nagore, Desieree y Superior. Sin embargo, nuestros
resultados coinciden con los de Gómez et al. (1997) quien logró regenerar plántulas
sin la adición de zeatina, al trabajar con las variedades DC y PP.
La eficiencia de regeneración de nuestro sistema es superior al de M´hamdi, quien
obtuvo el promedio más alto de 6.8 brotes por explantes de hoja en la variedad
Desireé y menor a los de Trujillo et al. (2001) y Rodríguez et al. (2000), quienes
lograron obtener un alto índice de brotación en las variedades PP y DC, en ambos
casos con la adición de zeatina. En lo referente a los medios con 2i-p, que sólo se
generó tejido calloso, lo ideal sería trabajar con otro tipo de reguladores del
crecimiento para inducir la brotación en este mismo medio.
En nuestro sistema de regeneración, al igual que los desarrollados por Trujillo y
Rodríguez, se requiere de un solo medio de cultivo, lo cual lo hace más sencillo y
rápido. Si bien la eficiencia del sistema reportado por nosotros para la variedad alfa
no es del 100%, se tiene la ventaja de no requerir zeatina. La zeatina es la citocinina
57

ecomendada en muchos de los protocolos existentes para la regeneración de papa
(De Block, 1998; Park et al., 1995; Rodríguez et al., 2000; Trujillo et al. 2001), sin
embargo su alto precio hace que los sistemas de regeneración que la requieren sean
menos atractivos y más difíciles de utilizar a gran escala.
Microtuberización
El sistema de regeneración reportado en este trabajo para la variedad alfa tiene
las ventajas de utilizar un mismo medio para la generación del callo y la posterior
generación de brotes, así como utilizar citocininas de más bajo precio en lugar de
zeatina y abre las posibilidades de obtener a partir de éstas, plantas transgénicas
utilizando sistemas de transformación por diferentes métodos.
Xu et al. (1998), menciona que es posible regenerar y transformar planta de papa
a partir de segmentos de microtubérculos, por lo que, se propuso como parte
adicional la inducción de microtubérculos estas estructuras, analizando para ello
diferentes protocolos para tal propósito y que fueran utilizados para la transformación.
Esta bien documentado que varios factores tanto endógenos como ambiéntales
influyen en la microtuberización y entre estos se encuentra la concentración de
sacarosa, temperatura, adición de reguladores de crecimiento y fotoperiodo ya sea
noches largas o fotoperiodos cortos (SD) o días largos (LD) (Jackson, 1999; Alisdair,
2001).
Todos los tratamientos empleados en este experimento inducen la formación de
microtubérculos, aunque, la producción de estos varióío conforme al medio y las
condiciones en que fueron incubados como se puede apreciar en la Tabla 6.
Para comprobar el efecto del fotoperiodo en la variedad alfa, realizamos
experimentos de días cortos (SD, 8 hr luz/ 16 hr oscuridad), luz continua y oscuridad
58

continua. Sobre estos efectos nuestros resultados en los tratamientos que no fueron
expuestos a fotoperiodos como MST5 y MST6, se observó que los explantes
crecieron de una forma lenta y con hojas y tallos fuertes pero con escasa producción
de raíces y microtubérculos, como se observa en la Figura 18 A donde, los explantes
mostraron un engrosamiento en los tallos y la escasa producción de hojas y en la
figura 18B, se aprecia el comportamiento de los explantes como plántulas
micropropagadas y una escasa producción de microtubérculos debido en parte a la
acción de la luz continua y a la senectud de los explantes en el medio. Con estos
datos se comprobó que uno de los factores principales para la inducción de la
microtuberización es el fotoperiodo, puesto que Hussey y Stacey; (1984), Jackson
(1999) y Alisdair (2001) analizaron y comprobaron que la acción de la luz continua
induce la producción de ácido giberélico el cual es esencial para la producción de
brotes y no de microtubérculos.
En otra serie de experimentos analizamos los efectos de la oscuridad sobre la
microtuberización, ya que Gopal et al., (1998), reportan que la microtuberización se
realiza de una manera más rápida en la oscuridad que en tratamientos con luz,
aunque menciona que existe una disminución considerable en la producción de ojos
por microtubérculo comparada bajo condiciones de luz –oscuridad. Para verificar
estos efectos, procedimos primeramente a incubar explantes en medio MST8, los
cuales fueron puestos a oscuridad continua durante 60 días y como control explantes
incubados en este mismo medio bajo SD. En los tratamientos que fueron puestos
bajo oscuridad continua se observó un incremento y alargamiento en la producción de
estolones y a las dos semanas se observó la inducción de microtubérculos, a las seis
semanas hubo un incremento la cantidad de estolones así como de microtubérculos y
al final del experimento, se observó mayor inducción de microtubérculos con un
tamaño de aproximadamente 2mm, en tanto que los controles, se observó que no
existe una diferencia significativa en el numero de microtubérculos producidos a los
60 días pero, si existe una disminución casi total en la producciónmoción de
microtubérculos. Sobre estos datos, observamos que los explantes inducidos para
microtuberización concuerdan con los de Gopal (1998), aunque, para nuestro caso lo
59

conveniente sería alargar el tiempo del experimento para observar si existe una
mayor producción de microtubérculos.
Tomando en cuenta los efectos de la oscuridad en el experimento anterior,
procedimos a realizar un pretratamiento en oscuridad estas condiciones por dos
semanas, en medios MST3, MST4 y MST8, seguidos de SD (Fig. 20). Durante el
tiempo de pretratamiento, se observo una mayor cantidad de estolones por explante
con algunas pequeñas hojas con apariencia etiolada, y la aparición de
microtubérculos. Una vez puesto bajo SD los explantes tomaron apariencia normal y
se indujo más la producción de microtubérculos principalmente en el medio MST8.
Sobre estos resultados, comprobamos que la microtuberización en la variedad alfa,
es optima bajo SD concordando con los datos obtenidos por: Wang and Hu (1982),
Hussey and Stacey (1984), Garner and Blake (1989) y Gopal et al. (1998), quienes
también encontraron que la mejor inducción para microtuberización es cuando los
explantes son incubados bajo condiciones de días cortos. Sin embargo, en nuestros
experimentos fue necesario un pretratamiento de 14 días en oscuridad para una
mayor producción de microtubérculos. Así mismo, también existe una
microtuberización deseable cuando los explantes son sometidos bajo oscuridad
aunque lo conveniente sería tomar en cuenta tiempo más largos.
Para analizar los efectos de la sacarosa sobre la microtuberización, se realizó una
serie de experimentos en diferentes medios con concentraciones del 3 y 8%, ya que,
Xu et al. (1998), demostraron que la tuberización in vitro es altamente dependiente
de la concentración de sacarosa y así mismo, demostró que en los medios con
cantidades pequeñas de sacarosa 1%, existen altos niveles de GA (inhibidor de la
microtuberización) en las puntas de los estolones donde se forman los
microtubérculos y en comparación con cantidades altas de sacarosa 8% el efecto es
opuesto y por lo tanto la inducción de microtubérculos. Sobre este punto, nuestros
resultados en los medios MST1 y MST4, que contienen 3% de sacarosa, mostraron
variabilidad en la producción de microtubérculos (Tabla 6), aunque lo importante en
60

este punto es la combinación de sacarosa y fotoperiodo lo cual fue motivo importante
para la inducción de microtubérculos, como es el caso de MST4 que tuvo mayor
producción de microtubérculos. Asimismo, los tratamientos 8% de sacarosa como
MST2 y MST3 mostraron mayor producción de microtubérculos que los generados al
3% demostrando la importancia de la sacarosa en la microtuberización y
concordando también con los resultados de Xu et al., (1998); Garner and Blake,
1989; Ranalli et al, 1994 y Gopal et al, 1998, quienes reportaron que la promoción de
la microtuberización se puede realizar con bajas y altas concentraciones de
sacarosa, fotoperiodos de SD y bajas temperaturas.
Por otro lado se ha demostrado que la promoción de la microtuberización se
incrementa mediante una combinación de citocininas, sacarosa,; SD y bajas
temperaturas, Palmer y Smith (1969) Wang y Hu, 1982; Hussey y Stacey 1984; Gopal
et al, 1998). Nuestros resultados muestran un incremento en la producción de
microtubérculos en los medios suplementados con cinetina a 2.5 mg·L - 1 y sacarosa al
8% (MST8) después de los 60 días de tratamiento, en comparación con aquellos que
no tienen esta hormona o con combinados con esta y con concentraciones bajas de
sacarosa (MST7) (Fig. 20), teniendo efectos similares por los reportados con (Hussey
y Stacey; 1984. Alisdair; 2001). quienes adicionaron citocininas al medio al trabajar
con las variedades Europeas. Con estos resultados podemos decir que el mejor
tratamiento para la microtuberización de la variedad alfa es el MST8 bajo las
condiciones de SD y temperatura de 24-25 °C así com o un pretratamiento de
oscuridad por 14 días.
Germinación de microtubérculos
Los microtubérculos obtenidos fueron sometidos a dos tratamientos con el fin de
inducir su germinación in vitro. En el primer tratamiento se utilizó como medio basal
MS 50% más sacarosa al 3% libre de hormonas y otro medio adicionado con cinetina
al 2.5 mg·L -1 . Adicionalmente, se intentó la germinación ex vitro, para lo cual se
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61

colocaron los microtubérculos sobre una capa de algodón húmedo hasta su
germinación.
La germinación de los microtubérculos fue más rápida en aquellos que estuvieron
en tratamiento con cinetina, ya que en la primera semana de incubación se observó la
aparición de brotes, estolones y raíces (Fig. 21B), en este caso el 100% de los
microtubérculos germinaron satisfactoriamente. En el medio libre de reguladores del
crecimiento también se observó germinación (100%) de los microtubérculos (Fig.
21A) pero fue más lenta (3 semanas), mientras que los germinados ex vitro tardaron
cerca de un mes.
Sobre este punto, los resultados mostraron claramente que la inducción de brotes
en microtubérculos en medio MS es más rápido que la desecación. Estos resultados
concuerdan en parte con los realizados por Khuri y Moorby (1996) quienes indujeron
la brotación a partir de microtubérculos con la variedad Estima, Cultra y Costella,
reportando que la inducción se lleva a cabo en medio MS con 3%. Finalmente, lLos
microtubérculos germinados in vitro fueron aclimatados en tierra suelo y a las tres
semanas mostraron crecimiento normal, tanto en el desarrollo de tallo, hojas, raíces y
estolones (Fig. 22C) donde el 80% de las plántulas obtenidas a partir de
microtubérculos fueron capaces de sobrevivir en suelo. En cambio los germinados ex
vitro al ser pasados a tierra y durante la aclimatación mostraron crecimiento normal
igual que los crecidos in vitro pero, a las tres semanas la mayoría mostró sequía
deshidratación en los tallos y murieron. Sobre esto podemos decir que el tratamiento
que mejor resultados dio para la propagación de la papa a partir de microtubérculo es
el MS adicionado con CN ya que dio una mayor inducción de brotes y una mayor
aclimatación al ser transferidos a suelo.
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Análisis molecular de plantas transgénicas con el gen de la cch.
62

Una alternativa muy interesante para el control de enfermedades, ataque de
plagas y patógenos en plantas es a través de técnicas de ingeniería genética,
específicamente mediante el uso de inhibidores de proteinasas. Entre los inhibidores
de proteinasas más estudiados se encuentran los del tipo cisteín proteinasas o
cistatinas, ya que están involucradas en diversos procesos biológicos tanto en plantas
como en animales (Abrhamson et al., 1986). Las cistatinas se localizan a altas
concentraciones en fluidos biológicos de animales tales como: plasma seminal,
liquido cerebro espinal y en menores concentraciones en plasma sanguíneo, saliva,
orina y retina; los principales representantes de esta familia son la cistatina C humana
y la cistatina de gallina (Abrhamson et al., 1986), en plantas el mejor estudiado es la
cistatina procedente del arroz; orizacistatina-I (oc-I) (Abe et al., 1987; Arai et al.,
1987).
En los últimos años, varias cistatinas de plantas se han identificado, clonado y
expresado en diferentes plantas donde se ha visto que juegan un papel importante en
actividades biológicas como la movilización de proteínas de reserva durante la
embriogenésis, germinación de la semilla, desarrollo vegetal y en los mecanismos de
defensa contra la invasión de patógenas y plagas que tienen gran actividad
metabólica de proteasas en los procesos digestivos (Atkinson, 2004) y mas
recientemente en la actividad de la muerte celular programada o apoptosis (Belenghi
et al., 2003; Solomon et al., 1999; Urwin 1998; Gutiérrez campos et al., 1999.
La estrategia en este estudio es generar plantas de papa con un gen codificante
para un inhibidor de cisteín proteinasas denominado la cistatina C humana (cch).
El gen de la cch fue clonado en el vector pCAMBIA e incorporado en las cepas de
EHA-105, PGV 2260, y AGL 1226 de Agrobacterium tumefaciens, donde dicho vector
fue utilizado para regenerar plantas de papa de la variedad alfa.
El procedimiento de transformación se realizó en dos etapas, donde en la primera
transformación se utilizó únicamente la cepa EHA 105 (Tabla 3) y en la segunda
transformación además de la EHA 105, PVG 2260 y AGL 1226 (Tabla 4).
63

De la primera transformación, se generaron seis plantas como posibles
transformantes sin embargo, al pasarlas al medio de selección sólo dos de ellas
sobrevivieron. Esta baja eficiencia de transformación radica principalmente en dos
factores: uno, a la hipersensibilidad del explante a esta cepa y al grado de virulencia
que esta presenta y dos, a los efectos de sobre expresión del gen. Después de tres
meses de mantener las plantas en medio con km 50, se observó que presentaban
efectos pleiotrópicos tales como: disminución en el desarrollo, clorosis en las hojas y
necrosis en el tallo que esta en contacto con el medio (Fig. 23B). Gutiérrez-Campos
et al., (2001), observaron efectos contrarios en plantas de tabaco transformadas con
el gen de la cistatina oc-I, donde la expresión de este gen modifico el ciclo normal de
la planta afectando características como: desarrollo, mayor numero de hojas y
disminución en el tiempo de floración, todo lo cual lo consideran como características
agronómicas de interés agronómico. Sin embargo estudios recientes del mismo autor
en plantas de tabaco que expresan el gen de la cch, demuestran efectos pleiotrópicos
indeseables que van desde el enanismo, enrollamiento foliar hasta la muerte en
plántulas a nivel de estadío de octava hoja (en prensa).
Para verificar la presencia del transgen en la planta, se procedió a realizar un
análisis molecular en la amplificación mediante PCR contra los genes de la cch, npt II,
y para los genes virD con el fin de descartar una amplificación bacteriana.
El resultado del PCR reveló la presencia de la amplificación de los genes nptII de
aproximadamente 500 pb y para gus de 1200 pb (Fig. 24A), y para cch de 450
aproximadamente, asimismo la amplificación de los genes vir fue negativa y sólo se
presentó en el DNA procedentes de Agrobacterium (Fig. 24B), estos datos confirman
que la planta contenía el transgen de la cch y que posiblemente su expresión alteraba
la fisiología de la planta. Sobre este punto, Reed (2000), menciona que las cistatinas
constituyen el último paso en el control de las cisteín proteasas las cuales se
encuentran involucradas en diferentes procesos metabólicos esenciales. En animales
parece ser que las cistatinas también inhiben otro tipo de proteasas tales como las del
tipo serín e incluso, la expresión de una cistatina de origen animal en plantas puede
64

tener efectos en eventos metabólicos muy variados en el proceso fisiológico de la
planta y que de alguna manera no pueden ser controlados (Baron et al., 1999)
Con los resultados de la segunda transformación, se fue monitoreando la
expresión del gen gus de los explantes que fueron colocados en medio de selección
con el fin de observar desde el principio la incorporación del transgen. De todas las
plantas analizadas solo un explante de tallo procedente de la cepa EHA 105 fue
positivo (Fig. 25B4 y C4), lo cual indica que el evento de transformación se lleva
adecuadamente con esta cepa aunque en un porcentaje demasiado bajo. Conforme
transcurría el tiempo, los explantes tanto de hoja como de tallo en todas las cepas
utilizadas sufrieron contaminación por la bacteria y en la mayoría de aquellos que no
presentaba esta contaminación no crecieron en el medio de selección.
En lo que respecta a los explantes con las dos cepas PGV2260 y AGL1226, la
mayoría de estos murieron por necrosis u oxidación y los que aun sobreviven en el
medio de selección han generado pobremente tejido calloso aunque este presenta
oxidación, sin embargo, 5 explantes de tallo de la cepa EHA105, 8 de ALG y 7 de
PGV sobrevivieron en medio con Km a 50 mg. Después de un mes dos explantes
procedentes de la cepa EHA105 lograron sobrevivir y formar tejido calloso además de
presentar un brote por explante, estos se dejaron crecer y posteriormente fueron
transferidos a medio fresco de enraizamiento con km. A los 5 días, uno de ellos
presentó hojas etioladas, seguida por marchitezs y necrosis, y a las 8 días murió lo
que indicó que posiblemente era un escape (Fig. 26A), mientras la planta que
sobrevivió, ésta presentó un crecimiento muy parecido a las plantas de la primera
transformación es decir: crecimiento lento, hojas pequeñas, tallo delgado y frágil así
como necrosis en la parte del tallo en contacto con el medio (Fig. 26B). Después de
un mes, se observó que el crecimiento de esta planta era retardado por lo que se
decidió verificar la presencia del DNA exógeno mediante PCR y análisis histoquímico
de GUS.
65

Los análisis moleculares mediante PCR, revelaron la presencia de los genes nptII
y cch, donde se observó una banda de aproximadamente 700 pb para npt II y una de
paros de 450 para cch (Fig. 27A), y en lo referente al análisis histoquímico de GUS,
este fue positivo, confirmando la integración del transgen en la planta (Fig. 27B).
Con los resultados de esta segunda transformación verificamos que posiblemente
la expresión de la cch tiene efectos dramáticos en el desarrollo normal de la planta.
Como se mencionó anteriormente, las cistatinas juegan un papel importante en
actividades biológicas como: la movilización de proteínas de reserva durante la
embriogénesis, germinación de la semilla, desarrollo y en los mecanismos de
defensa para proteger a la planta de la invasión de patógenos quienes utilizan las
proteasas durante la división celular o del ataque de plagas que tienen gran actividad
metabólica de proteasas en los procesos digestivos (Solomon et al., 1999; Lawrence,
2002) y mas recientemente se ha visto que están involucradas en la actividad de la
muerte celular programada o apoptosis (Solomon et al., 1999; Belenghi et al., 2003).
Uno de los principales papeles de las proteasas en plantas es la degradación de
proteínas que es esencial para su crecimiento, desarrollo y como respuestas a
diferentes condiciones ambientales. Entre los aspectos más importantes de la
proteólisis se encuentra el inicio y el reciclado de nitrógeno y de esta manera
mantener la homeostasis celular y el crecimiento, por otro lado, la acumulación de
proteínas que al no ser degradadas provocan daños tóxicos a la célula como por
ejemplo: durante la división celular se requiere de una rápida degradación de
proteínas o en cloroplasto durante el flujo de electrones. Entre estas enzimas
proteinasas, se encuentran las del tipo de cisteín proteasas que son reguladas
específicamente por inhibidores de cisteín proteinasas (cistatinas).
Asimismo, la inhibición constitutiva de estas rutas provoca daños esenciales en la
planta ya que además existen rutas ligadas a estas que se disparan en cascada y
que requieren de proteólisis tal es el caso del control de las ciclinas durante el ciclo
celular o en los procesos de degradación del fitocromo y su función durante la
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fotomorfogénesis, sobre este punto se tiene evidencias de la acción de la cch en la
retina de mamíferos influye en la degradación de las proteínas fotorreceptoras y que
de alguna manera la expresión de la cch en las plantas tenga inferencia en la
degradación de los fotorreceptores (Wasselius et al., 2001). La muerte celular
programada es un proceso básico biológico que funciona en muchos aspectos del
desarrollo tanto en animales como en plantas y en respuesta a diferentes tipos de
estrés (Greenberg, 1996; Schmid et al. 1999), el mecanismo de acción de este
evento es muy similar en estos dos sistemas (Levine, 1996) y específicamente los
eventos morfológicos incluyen malformación celular, condensación nuclear y
distorsión membranal, mientras que los eventos bioquímicos involucrados son el flujo
de calcio, activación de proteasas especificas y fragmentación del DNA (Solomon,
1999).
La activación de cisteín proteasas constituye un punto crítico en los procesos de
apoptosis de células de animales y plantas (Solomon, 1999). Interesantemente
Minami y Fokuda (1995), realizaron estudios con Zinni elegans, donde observaron
que la apoptosis puede ser bloqueada por inhibidores específicos de cisteín
proteasas, asimismo se encontraron los mismos efectos en Arabidopsis thaliana
(Belenghi et al., 2003). Resultados similares fueron obtenidos por Solomon (1999)
trabajando con células de soya transformadas con la cistatina Sbcys, las cuales
fueron tratadas con H 2 O 2 para inducir la apoptosis. En estos estudios observaron que
la sobreexpresión de sbcys bloquea ligeramente la actividad basal proteolítica pero
existe una gran actividad de proteasas relacionadas con la apoptosis debido a la
respuesta de la inhibición de la actividad basal por algún mecanismo de regulación
proteica diferente aun desconocido.
En nuestros resultados posiblemente ocurra algo similar a los obtenidos por
Mazal en relación a la apoptosis debido a la sobreexpresión de la cch, ya que este
gen esta bajo el control del promotor constitutivo 35S potenciado. Estos, resultados
pueden ser parcialmente explicados ya que por una parte dicha expresión puede
producir apoptosis temprana, el enrollamiento foliar ha sido comprobado que es
67

debido a una sobre división celular de los meristemos laterales con respecto a la los
meristemos apicales (Gutiérrez-Campos et al, en prensa). En las plantas que se
generaron de papa se observó que en la zona de corte presentaban una necrosis
lenta donde tal vez sucedía la apoptosis, ya que en las plantas control este efecto no
se observó y puede descartarse que se trate de la simple cicatrización de los tejidos
por la incisión.
En resumen, nuestros resultados muestran que la integración de la cistatina C
humana bajo el control del promotor constitutivo 35S potenciado tiene efectos
pleiotrópicos negativos en el desarrollo normal de la planta. Cabe resaltar que en
estudios previos (Gutiérrez- Campos et al., en prensa) encontró que solo una
proporción (40%) de plantas de tabaco transformadas con el gen de la cch
mostraron un aspecto aberrante y el resto mostraban un fenotipo normal. Así pues
son necesarios subsecuentes experimentos para analizar en que grado los efectos
pleitrópicos nocivos se manifiestan en plantas de papa que expresan el inhibidor de
cisteín proteasas referido.
VI CONCLUSIONES
Se optimizó un sistema de regeneración in vitro en un sólo paso por
organogénesis de papa en la variedad alfa.
Se estableció un sistemas de microtuberización en esta misma variedad
mediante el cultivo de segmentos nodales.
Se estableció un sistema de germinación tanto in vitro con ex vitro a partir
de microtubérculos.
Se generaron plantas transgénicas de papa con el gen de la cistatina C
humano.
68

Se demostró la presencia y la expresión del gen de la cistatina C humano
en las plantas transgénicas.
VII
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