Protocolos del Laboratorio - UNAM

-mercaptoetanol 0.3% (no agregar este reactivo hasta el momento de usar
el buffer)
Buffer de extracción STE
Tris-HCl 100 mM pH8
EDTA 50 mM pH8
NaCl 100mM
b-mercaptoetanol 0.3% (no agregar este reactivo hasta el momento de usar
el buffer)
PROTOCOLO DE EXTRACCION ADN
1.- Moler alrededor de 0.5 g de tejido con nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino.
2.- Agregar 260 µl de buffer de extracción CTAB y 975 µl de buffer STE, seguir
moliendo hasta eliminar los grumos. Recuperar en un tubo eppendorf de 1.5 ml.
3.- Centrifugar a 1200 rpm durante 8 minutos.
4.- Eliminar el sobrenadante y resuspender con 250 µl de CTAB Y 750 µl de STE, y
vortexear.
5.- Centrifugar a 1200 rpm durante 8 minutos.
6.- Eliminar el sobrenadante y resuspender con 600 µl de CTAB 2X.
7.- Agregar 4 µl de RNasa (7000u/ml), incubar 20 minutos a 37ºC.
8.- Agregar 25 µl de proteinasa-K (20mg/ml), incubar a 65ºC durante 30 minutos.
9.- Incubar en hielo durante 15 minutos.
10.- Agregar a cada tubo 600 µl de cloroformo:octanol 24:1 agitar, hasta homogenizar.
11.- Centrifugar a 9000 rpm durante 12 minutos.
12.- Trasladar el sobrenadante a un tubo nuevo con ayuda de una micropipeta.
13.- Precipitar el ADN con 600 µl de isopropanol frío.
14.- Dejar reposar 12 horas a -20ºC.
15.- Centrifugar a 12500 rpm durante 7 minutos. Eliminar el sobrenadante.
16.- Limpiar el ADN agregando 1 ml. De etanol al 70% frío, agitando suavemente
durante 5 minutos.
17.- Eliminar el sobrenadante, secar el pellet y resuspender con 100 µl de agua
ultrapura.
1.- Rotular tubos para PCR.
AMPLIFICACION DE ADN
2.- Poner los siguientes reactivos en el tubo para PCR:
Buffer PCR 10X 2.5 µl
MgCl2 1.5 µl
BSA 1.0 µl
dNTP’S 0.2 µl
Primer F 2.5 µl
Primer R 2.5 µl
ADN 2.5 µl