Protocolos del Laboratorio - UNAM

PROTOCOLOS DEL LABORATORIO
MATERIALES PARA EXTRACCIÓN Y AMPLIFICACIÓN DE ADN
Tejido fresco
Tijeras
Mortero y pistilo
Micropipetas
Matraz
Tubos eppendorf
Pipetas
Probeta
Tubos para PCR
Puntas para micropipetas
Masking tape
Plumón
Cronometro
Termociclador
Centrifuga refrigerada
Microcentrifuga
Baño maría
Charola para electroforesis
Fuente de poder
Transiluminador
EQUIPO
Buffer de extracción CTAB 2X
REACTIVOS
BUFFER DE EXTRACCION
Tris-HCl 100 mM pH 8
NaCl 1.4 M
EDTA 20 mM pH8
CTAB 2%
b-mercaptoetanol 0.3% (no agregar este reactivo hasta el momento de usar
el buffer)
Buffer de extracción CTAB
Tris-HCl 100 mM pH8
NaCl 1.5 M
EDTA 20 mM pH8
CTAB 4%
PVP40 4%
Ac. ascórbico 0.1%
DIECA 0.1%

-mercaptoetanol 0.3% (no agregar este reactivo hasta el momento de usar
el buffer)
Buffer de extracción STE
Tris-HCl 100 mM pH8
EDTA 50 mM pH8
NaCl 100mM
b-mercaptoetanol 0.3% (no agregar este reactivo hasta el momento de usar
el buffer)
PROTOCOLO DE EXTRACCION ADN
1.- Moler alrededor de 0.5 g de tejido con nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino.
2.- Agregar 260 µl de buffer de extracción CTAB y 975 µl de buffer STE, seguir
moliendo hasta eliminar los grumos. Recuperar en un tubo eppendorf de 1.5 ml.
3.- Centrifugar a 1200 rpm durante 8 minutos.
4.- Eliminar el sobrenadante y resuspender con 250 µl de CTAB Y 750 µl de STE, y
vortexear.
5.- Centrifugar a 1200 rpm durante 8 minutos.
6.- Eliminar el sobrenadante y resuspender con 600 µl de CTAB 2X.
7.- Agregar 4 µl de RNasa (7000u/ml), incubar 20 minutos a 37ºC.
8.- Agregar 25 µl de proteinasa-K (20mg/ml), incubar a 65ºC durante 30 minutos.
9.- Incubar en hielo durante 15 minutos.
10.- Agregar a cada tubo 600 µl de cloroformo:octanol 24:1 agitar, hasta homogenizar.
11.- Centrifugar a 9000 rpm durante 12 minutos.
12.- Trasladar el sobrenadante a un tubo nuevo con ayuda de una micropipeta.
13.- Precipitar el ADN con 600 µl de isopropanol frío.
14.- Dejar reposar 12 horas a -20ºC.
15.- Centrifugar a 12500 rpm durante 7 minutos. Eliminar el sobrenadante.
16.- Limpiar el ADN agregando 1 ml. De etanol al 70% frío, agitando suavemente
durante 5 minutos.
17.- Eliminar el sobrenadante, secar el pellet y resuspender con 100 µl de agua
ultrapura.
1.- Rotular tubos para PCR.
AMPLIFICACION DE ADN
2.- Poner los siguientes reactivos en el tubo para PCR:
Buffer PCR 10X 2.5 µl
MgCl2 1.5 µl
BSA 1.0 µl
dNTP’S 0.2 µl
Primer F 2.5 µl
Primer R 2.5 µl
ADN 2.5 µl

H2O 12.1 µl
Taq. 0.2 µl
3.- Se centrifugan los tubos de PCR para mezclar bien los componentes y eliminar las
burbujas de aire.
4.- Se meten los tubos al termociclador y se carga el programa correspondiente.
ELECTROFORESIS
1.- Preparar charola para llevar a cabo la electroforesis.
2.- Preparar gel de agarosa al 3 %, disolver la agarosa en buffer TAE 1X, hervir y dejar
reposar hasta que la temperatura baje a 60ºC, agregar 0.3 µl. de bromuro de etidio
(extremar cuidados el bromuro de etidio es cancerígeno), mezclar y depositar el gel en
la charola y dejar solidificar.
3.- Preparar las muestras que se cargaran al gel, poniendo en cada pocillo 3 µl. de el
buffer de carga y 5 µl. del amplificado (PCR) y en un pocillo aparte poner 3 µl. de el
buffer de carga y 3 µl. de la escalera (Low DNA Mass Ladder)
4.- Se cargan en cada pocillo del gel 5 µl de cada una de las muestras y 5 µl de la
escalera, se pone el buffer TAE 1X y se conecta a la fuente de poder para llevar a cabo
la electroforesis. Se deja correr las muestras por aproximadamente 15 minutos.
5.- Se pasa el gel al transiluminador para observar las bandas en el gel, si es que las hay.
REFERENCIAS
Falcón I. L. y Valera A. 2007. Extracción de ácidos nucleicos. En: Ecología Molecular
(Eguiarte L. E., Souza V. y Aguirre X., compiladores) SEMARNAT-INE-UNAM-
CONABIO, México, DF, pp. 499-515.