dennis ariel cisterna aguila valdivia – chile 2011 - Tesis Electrónicas ...

3.2.3.2 Reacción de polimerasa inversa acoplada a reacción de polimerasa en
cadena.
A partir de las criptas obtenidas, se procedió a aislar el RNA total utilizando la
extracción con TRIZOL (Invitrogen, USA). La reacción de polimerasa inversa se realizó
a partir de 3 µg de RNA total utilizando el Kit SuperScript II system (Invitrogen, USA),
utilizando partidores hexaméricos al azar y oligo dT bajo las condiciones establecidas
por el fabricante. Los partidores utilizados fueron para transcritos de las familias mClCA
(Tabla III), Vmd (Tabla IV), TMEM16 (Tabla V). La mezcla de reacción contiene,
alícuota de templado, 0,2 µM de cada partidor, 2.5 unidades de DNA Taq polimerasa
(Promega), 2mM dNTPs, y 1,5 mM MgCl2 en un volumen total de reacción de 25 µl. Se
fijaron los siguientes parámetros como sigue: Una denaturación inicial a 95 ºC por 2
minutos, 30 ciclos a 95 ºC por 30 segundos, alineamiento a 58 ºC por 30 segundos,
elongación a 74 ºC por 30 segundos, y un paso final de 5 minutos a 74 ºC.
Transcurrida la reacción, 10 µl del volumen total (25 µl) son cargados en un gel de
agarosa al 1% de con tampón de corrida TAE 1X para verificar amplificación.
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