Emilie Heidet - EPHE

MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE
ET DE LA RECHERCHE
ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
Sciences de la Vie et de la Terre
MEMOIRE
Présenté par
Emilie HEIDET
Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes
CARACTERISATION D’UN NOUVEAU GENE
IMPLIQUE DANS LE
PHENOTYPE ODONTOBLASTIQUE
Soutenu le 23 janvier 2003 devant le jury suivant :
Pr Jean-Marie EXBRAYAT – Président
Dr Claire BELLATON – Rapporteur
Dr Françoise BLEICHER – Examinateur
Pr Henry MAGLOIRE – Examinateur
Dr Patricia Rousselle - Examinateur
EPHE Banque de Monographies SVT 1

ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES - SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE
CARACTERISATION D’UN NOUVEAU GENE
IMPLIQUE DANS LE PHENOTYPE ODONTOBLASTIQUE
Emilie Heidet
Les odontoblastes, cellules post-mitotiques, synthétisent les composants de la prédentine-dentine
comprenant des collagènes, des glycoprotéines, des sialoprotéines, des phosprotéines et des
facteurs de croissance. De nombreuses protéines exprimées par les odontoblastes le sont aussi
par différentes cellules de l’organisme en particulier les ostéoblastes. Actuellement, seules deux
protéines sont connues pour être plus spécifiquement exprimées et sécrétées par les
odontoblastes : la phosphoprotéine dentinaire (DPP) et la sialoprotéine dentinaire (DSP), codées
par un gène unique. Le transcrit de ce gène donne naissance à une protéine précurseur : la
sialophosphoprotéine dentinaire (DSPP), qui va être clivée par la suite. Récemment, le transcrit de
la dspp a également été observé dans les cellules du tissu osseux et l’oreille interne de souris
mais à l’état de trace. Ces deux protéines restent pour le moment les deux seuls marqueurs de la
différenciation odontoblastique.
Ceci démontre que le phénotype odontoblastique est encore mal connu. L’étude de ces cellules in
vivo n’est pas évidente. Leur localisation (corps cellulaire en périphérie et prolongement séquestré
dans la dentine) et leur degré de différenciation posent des difficultés techniques pour obtenir des
cellules pures. Pour contourner ces barrières, le laboratoire a développé un système de culture
favorisant la différenciation des odontoblastes à partir de cellules pulpaires précurseurs. Les ARNs
totaux issus de ces deux types cellulaires ont servi à la construction d’une banque d’ADNc,
enrichie en gène spécifiques des odontoblastes grâce à la technique SSH-PCR. Après validation
de la banque, les gènes clonés ont été analysés. Cette recherche a montré qu’une cinquantaine
d’entre eux correspondaient à des gènes inconnus.
Notre choix s’est tourné vers le clone 114, exprimé plus spécifiquement dans les odontoblastes
que les cellules pulpaires précurseurs. L’hybridation in situ a montré que celui-ci était exprimé
spécifiquement dans les cellules odontoblastiques dans la pulpe dentaire humaine. Dans la
mâchoire de rat, cette étude a permis de mettre en évidence un gradient d’expression croissant
pour ce clone, lors de la différenciation des odontoblastes. Par RT-PCR, l’expression des transcrits
correspondants a été détectée dans les cellules du cerveau, des reins, des poumons, du foie et
dans les cellules MG63 (cellules d’ostéosarcome).
Les parties flanquant la séquence clonée ont ensuite été acquises en utilisant successivement les
techniques de RACE-PCR, alignement informatique et RT-PCR. Deux fragments ont été obtenus :
l’un de 2200 pb du côté 5’ du messager, l’autre de 1500 pb du côté 3’ du messager. Après
séquençage il a été possible de superposer la partie commune des deux fragments.
L’analyse de la séquence nucléotidique a permis de détecter un cadre de lecture ouvert de 2742
pb codant pour une protéine de 914 acides aminés. L’alignement de notre séquence protéique
avec les séquences des bases de données montre que celle-ci est très conservée chez la souris
et la drosophile. De plus, cette protéine présenterait des domaines transmembranaires et des
motifs TPR impliqués dans les intéractions protéine-protéine. Prochainement, un anticorps dirigé
contre la protéine sera synthétisé afin de la localiser précisément. A plus long terme, la réalisation
de souris knock-out pourra être envisagée pour étudier la fonction de cette protéine.
Mots clés : gène inconnu, phénotype odontoblastique, spécificité tissulaire, schéma d’expression,
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domaines transmembranaires, motifs TPR.
Titres et Travaux
Liste des Tableaux et Figures
Abréviations
TABLES DES MATIERES
INTRODUCTION 1
SITUATION DU SUJET 2
I –Formation de l’ébauche dentaire 2
I – 1 Origine embryonnaire des tissus dentaires 2
I – 2 Phase d’initiation 2
I – 3 Phase de morphogenèse 3
II – Différenciation terminale des odontoblastes 5
II – 1 Cytodifférenciation des préodontoblastes en odontoblastes fonctionnels 5
II – 2 Régulation de la différenciation odontoblastique 6
II – 2 – 1 Importance de la membrane basale 7
II – 2 – 2 Changement de composition de la membrane basale 8
II – 2 – 3 Activité biologique des constituants matriciels 9
II – 3 Rôle des odontoblastes : la dentinogenèse 10
II – 3 – 1 La prédentine 11
II – 3 – 2 La dentine 11
II – 3 – 3 La dentine réactionnelle 12
II – 3 – 4 La dentine réparatrice 12
II – 4 Protéines dentinaires sécrétées par les odontoblastes 13
II – 4 – 1 Les collagènes 13
II – 4 – 2 Protéines non collagéniques exprimées par les odontoblastes
et les cellules de divers tissus 13
a. L’ostéonectine 13
b. L’ostéopontine 14
c. Les protéoglycanes 14
d. La phosphatase alcaline 15
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II – 4 – 3 Protéines exprimées par les odontoblastes
et les cellules des tissus minéralisés 15
a. L’ostéocalcine 15
b. La protéine de la matrice dentinaire (DMP1 ou AG1) 15
c. La sialoprotéine osseuse (BSP) 15
II – 4 – 4 Protéines spécifiques des odontoblastes 16
a. La phosphoprotéine dentinaire (DPP) ou phosphoryne 17
b. La sialoprotéine dentinaire (DSP) 17
III – Etude des odontoblastes 18
III – 1 Difficultés d’étude de ce type cellulaire 18
III – 2 Méthodes utilisées pour contourner les difficultés 18
III – 2 – 1 Cultures de papilles dentaires 18
III – 2 – 2 Cultures de tranches de dent 19
III – 2 – 3 Cultures de cellules pulpaires 20
III – 2 – 4 Microdissection à capture laser 21
III – 3 Techniques mises en œuvre dans notre laboratoire 21
III – 3 – 1 Culture cellulaire 21
III – 3 – 2 Construction d’une banque spécifique des odontoblastes 22
MATERIELS ET METHODES 24
I – Cultures cellulaires 24
II – Extractions des ARNs totaux des cellules en culture
24
III – Extraction des plasmides 25
IV – Mesures spectrophotométriques 26
V – Reverse northern dot-blotting 27
V – 1 Synthèse et marquage de sonde 27
V – 1 – 1 Marquage au 32 P et synthèse de la sonde 27
V – 1 – 2 Calcul de la radioactivité incorporée dans la sonde 27
V – 1 – 3 Purification de la sonde 29
V – 2 Hybridation 29
VI – RT-PCR 30
VI – 1 Rétrotranscription et amplification dans un même tube 31
VI – 2 Rétrotranscription et amplification dans deux tubes séparés 31
VI – 2 – 1 Transcription inverse par le système RT-PCR
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« SuperScript TM II First-Strand Synthesis » (Invitrogen, CA, USA) 31
VI – 2 – 2 Amplification par le système PCR
« Expand High Fidelity » (Roche, Mannheim, Germany) 32
VI – 3 RT-PCR semi-quantitative 32
VII – Hybridation in situ 33
VII – 1 Préparation des coupes 33
VII – 2 Synthèse et marquage au 33 P de la sonde 34
VII – 3 Hybridation 35
VIII – RACE-PCR 5’ 36
36
39
VIII – 1 Utilisation du kit GeneRacer TM (Invitrogen, CA,USA)
VIII – 2 Utilisation du kit 5’/3’ Race (Roche, Mannheim, Germany)
IX – Purification d’acides nucléiques 41
IX – 1 Electroélution 41
IX – 2 Purification avec le kit Maestro Gelex (Eurobio, Les ulis France) 41
X – Séquençage 42
XI – Analyse informatique 43
XI – 1 Recherche d’amorces 43
XI – 2 Analyse de la séquence nucléique 43
XI – 3 Analyse de la séquence protéique 44
XI – 4 Recherche de séquences antigéniques 44
RESULTATS 45
I – Comparaison des clones de la banque soustractive avec
les séquences contenues dans les banques de données 45
II – Choix du clone à étudier parmi les gènes inconnus
45
II – 1 Etude de l’expression différentielle des clones inconnus
par reverse northern dot-blotting 45
II – 2 Etude de l’expression de différents clones
par RT-PCR semi-quantitative 46
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III – Etude du clone 114 47
III – 1 Schéma d’expression du clone 114 47
III – 1 – 1 Au niveau la dent humaine 47
III – 1 – 2 Au niveau de la mâchoire de rat 47
III – 2 Spécificité d’expression du clone 114 48
III – 3 Recherche de la séquence complète de l’ADNc correspondant au clone 114 49
III – 3 – 1 Etape de RACE-PCR 49
a. Utilisation du kit GeneRacer TM (Invitrogen) 49
b. Utilisation du kit RACE5’/3’ (Roche) 49
III – 3 – 1 Alignement de la séquence AK023165 et choix d’amorces 51
III – 3 – 2 Amplification du transcrit 114 par RT-PCR 51
III – 4 Séquençage 52
III – 5 Analyse informatique de la séquence d’ADNc correspondant
au transcrit du clone 114 52
III – 5 – 1 Alignement de la séquence avec les entrées des banques 52
III – 5 – 2 Recherche de la séquence protéique codée par notre gène 52
III – 5 – 3 Alignement de notre séquence avec le gène virtuel 52
III – 5 – 4 Analyse de la séquence protéique 52
III – 5 – 5 Analyse de la séquence sur le site Ensembl 53
III – 5 – 6 Prédictions sur la destination finale
de la protéine codée par le clone 114 53
III – 5 – 7 Recherche de peptides antigéniques 54
DISCUSSION 55
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 61
BIBLIOGRAPHIE 62
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ABREVIATIONS
[X] Concentration µl Microlitre
ADN Acide désoxyribonucléique ml Millitre
ADNc Acide désoxyribonucléique complémentaire °C Degrè Celsius
ARN Acide ribonucléique
ARNm Acide ribonucléique messager
ARNt Acide ribonucléique de transfert
BSP Sialoprotéine osseuse
CCN Cellules de la crête neurale
Ci Curie
CIP Phosphatase intestinale de veau
DEPC diéthyl pyrophosphate
DMP1 Protéine de la matrice dentinaire 1
DPP Phosphoprotéine dentinaire
DSP Sialoprotéine dentinaire
Dspp Sialophosphoprotéine dentinaire
DO Densité optique
DTT Dithiothreitol
EDTA Acide éthylène diamine tétracétique
GAPDH Glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase
MB Membrane basale
MEC Matrice extracellulaire
32 P Phosphore 32
33 P Phosphore 33
Pb Paire de base
PBS Tampon phosphate
Rpm rotation par minute
RT-PCR Retrotranscription-polymérisation en chaine
SDS Sodium dodécyl sulfate
SSC Citrate de sodium salin
SSPE phosphate de sodium salin-EDTA
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SVF Sérum de veau foetal
TAP Pyrophosphatase acide du tabac
TBE Tris-Borate-EDTA
TCA Trichloroacétate
U Unité
SVF Sérum de veau fœtal
βGP β-glycérophosphate
INTRODUCTION
Le développement des tissus dentaires est caractérisé par l’histomorphogenèse et la
cytodifférenciation d’un mésenchyme et d’un épithélium, ayant la capacité de donner naissance
respectivement aux cellules odontoblastiques et aux cellules améloblastiques. Les premières sont
responsables de la synthèse et la sécrétion des composants organiques de la prédentine/dentine
et les secondes à l’origine des composants de l’émail (Figure 1).
La mise en place des odontoblastes, à la périphérie de la pulpe, fait intervenir une succession
d’événements comprenant la migration et la distribution des cellules de la crête neurale (CCN)
dans la mâchoire en voie de formation, l’acquisition d’un potentiel odontogène par ces cellules,
leur spécification et enfin la différenciation terminale des préodontoblastes compétents en
odontoblastes fonctionnels. Les gènes impliqués dans le développement précoce des tissus
dentaires ont été largement étudiés et les mécanismes moléculaires intervenant dans la
différenciation terminale des odontoblastes commencent à être éclaircis.
En revanche, il existe peu d’informations sur les gènes cibles responsables du phénotype
odontoblastique. Actuellement, seules la sialoprotéine dentinaire (DSP) et la phosphoprotéine
dentinaire (DPP) sont connues pour être surexprimées par les odontoblastes. Afin d’approfondir
les connaissances sur ces cellules, nous avons choisi d’étudier un nouveau gène impliqué dans le
phénotype odontoblastique.
Pour répondre à cet objectif, le laboratoire a developpé un système de culture induisant la
différenciation de cellules pulpaires précurseurs humaines en odontoblastes. L’approche in vitro de
ces cellules est plus évidente que l’approche in vivo. Les odontoblastes sont des cellules postmitotiques
organisées en monocouche à la périphérie de la pulpe, avec leur prolongement
enchassé dans la prédentine-dentine. L’obtention de cellules pures en quantité importante est
donc difficile.
Notre modèle de cultures a ainsi permis l’extraction d’ARNm en quantité suffisante à partir des
cellules pulpaires précurseurs et des odontoblastes, pour pouvoir utiliser des techniques de
biologie moléculaire. Les transcrits ont ensuite servi à la construction d’une banque enrichie en
gènes spécifiques des odontoblastes par la technique PCR d’hybridation soustractive suppressive
(PCR SSH). Après avoir validé la banque, les gènes ont été alignés avec ceux contenus dans les
banques de données grâce au logiciel BLAST. Ceci a permis de classer les gènes dans trois
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catégories : les gènes déjà identifiés dans les odontoblastes, les gènes identifiés dans d’autres
types cellulaires et les gènes inconnus. La forte proportion de cette dernière classe laisse penser
que tout reste à faire sur les gènes exprimés par les odontoblastes.
I – Formation de l’ébauche dentaire
SITUATION DU SUJET
Le développement dentaire résulte d’une suite d’interactions épithélio-mésenchymateuses (pour
revue Thesleff et Sharpe, 1997 ; Slavkin, 1974 ; Thesleff and Hurmerinka, 1981 ; Ruch, 1987)
entre un épithélium dérivé de l’ectoderme et un mésenchyme dérivé des cellules de la crête
neurale (CCN).
La transmission des signaux entre les deux tissus passe par l’expression de nombreux gènes de
types homéogènes, facteurs de croissances et gènes du développement. Ces interactions
réciproques et continues contrôlent la morphogenèse de l’épithélium et du mésenchyme dentaires,
ainsi que la cytodifférenciation des odontoblastes et des améloblastes.
I – 1 Origine embryonnaire des tissus dentaires
Des travaux d’ablations et de transplantations chez des embryons d’amphibiens ont révélés que le
mésenchyme dentaire, incluant les odontoblastes, dérivait de la crête neurale céphalique (Ruch,
1995 ; Maas et Bei, 1997 ; Graveson et al., 1997). En marquant les cellules de la crête neurale au
Dil, Imai et al. (1996) ont montré que celles-ci proviennent du mésencéphale postérieur et
rhombencéphale antérieur (essentiellement les rhombomères 1 et 2) (figure 2a).
Ces cellules vont se séparer du bord de la gouttière neurale au moment de sa fermeture et
entamer leur migration, pour aller coloniser le premier arc pharyngien (figure 2b), à l’origine de la
mandibule et du maxillaire.
Conjointement à leur migration, les CCN se transforment en cellules mésenchymateuses. Une fois
leur destination finale atteinte, certaines d’entre elles se différencieront en odontoblastes sous
l’influence de territoires spécifiques de l’épithélium oral (figure 2c).
I – 2 Phase d’initiation
La première manifestation morphologique du développement dentaire au niveau mandibulaire et
maxillaire apparaît, chez la souris , au jour embryonnaire 11 (E11). L’épithélium buccal s’épaissit
conduisant à la formation de la « lame dentaire » dans des régions spécifiques : c’est la phase
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d’initiation (Figure 3A). Celle-ci détermine le site de développement de la dent au niveau de la
mâchoire (Tucker et Sharpe, 1999), par conséquent elle détermine aussi son identité.
Au départ, le pouvoir odontogène (capacité à induire la formation d’une dent) est détenu par
l’épithélium oral. Il va jouer son rôle en exprimant un certain nombre de gènes tels que Pitx2
(Amand et al., 2000) ainsi que les gènes codant de nombreux facteurs de croissance tels les
BMPs (bone morphogenetic protéine), FGFs (fibroblast growth factor), et des gènes du
développement comme shh (sonic hedgehog) et Wnt (Wint) (Figure 4) (Jernvall et Thesleff, 2000 ;
Chen et al., 1996).
Lorsque l’épithélium a joué son rôle initiateur, l’ectomésenchyme prend un rôle dominant dans les
relations épithélio-mésenchymateuses.
Il va agir sur l’épithélium en exprimant à son tour différents facteurs de transcription codés par les
homéogènes Msx1,-2 (Mackensie et al., 1991 ; 1992 ; Tureckova et al., 1995); Dlx1,-2 (Dolle et
al., 1992 ; Robinson et Mahon, 1994 ; Qiu et al., 1995 ; Weiss et al., 1998 ; Ferguson et al., 2000)
; Barx 1 (Tissier-Seta et al., 1995) ; Pax 9 (Peter et Balling, 1999); Gli1,-2,-3 (Hardcastle et al.,
1998) ; Lhx6,-7 (Grigoriou et al., 1998) ainsi que les facteurs de croissance BMP2 et BMP4 (Figure
4).
I – 3 Phase de morphogenèse
A ce stade, l’ectomésenchyme a un rôle dominant dans les relations épithélio-mésenchymateuses
(Kollar et Baird, 1970a ; 1970b). Son influence va induire la formation de l’invagination épithéliale,
qui va acquérir progressivement une morphologie spécifique de chaque dent. Cette phase est
subdivisée en 3 stades :
- Stade du bourgeon
- Stade de la cupule
- Stade de la cloche.
Stade du bourgeon :
A ce stade (jour embryonnaire 13,5), les cellules de chaque lame prolifèrent et donnent naissance
à un renflement épithéliale : le bourgeon dentaire. En regard de cette structure, les cellules de
l’ectomésenchyme se condensent (Figure 3B)
Pitx2 est toujours exprimé par les cellules de la lame dentaire. Dans la zone centrale du bourgeon,
un sous-ensemble de cellules expriment de manière intense les facteurs de croissance de quatre
familles (BMP, FGF, Hh, Wnt) dont BMP4 et FGF8 ainsi que d’autres d’autres gènes tels que p21,
Msx2 et Lef1 (Jernvall et Thesleff, 2000).
EPHE Banque de Monographies SVT 10

Les cellules mésenchymateuses expriment un certain nombre d’homéogènes de la famille Lhx,
Msx, Dlx, Gli et d’autres encore. Elles relarguent également, en réponse à BMP4 et FGF8
épithéliaux, les facteurs de croissance BMP4 et Activine βA (Figure 4).
Stade de la cupule (ou stade capuchon) :
Au jour embryonnaire 14,5 ; la partie antérieure du bourgeon se différencie en organe de l’émail
(ou organe dentaire épithélial), qui sera responsable de la formation de l’émail (Thesleff et Sharpe,
1997). Celui-ci, composé de différentes couches cellulaires, comprend l’épithélium dentaire
interne, l’épithélium dentaire externe, le réticulum stellaire et le stratum intermedium.
Au cours de ce stade, une structure transitoire se met en place au centre de l’épithélium dentaire
interne : le nœud de l’émail primaire, caractérisé par un arrangement concentrique de cellules
apoptotiques et de cellules vivantes de remplacement. Dans le mésenchyme, un territoire
particulier apparaît : la papille mésenchymateuse, qui va former de la dentine et de la pulpe
(Figure 3C).
Au niveau moléculaire, l’organe de l’émail exprime les facteurs de transcription Msx2 et Lef1, la
protéine P21 et sécrète également les facteurs de croissance des quatre familles (BMP, FGF, Hh,
Wnt).
Le mésenchyme n’exprime plus Msx2 et commence à exprimer Lef1 et Cbfa1. Les facteurs de
croissance des familles BMP et FGF ainsi que l’activine βA sont sécrétés par ces cellules (Figure
4).
Stade de la cloche :
C’est un stade d’histo-morpho-différenciation, qui débute au jour 16,5 du développement
embryonnaire (chez la souris). Les patrons cuspidiens spécifiques à chaque dent se mettent en
place, il devient alors possible de reconnaître la future forme de la couronne dentaire. Si la phase
d’initiation est l’étape déterminant l’identité de la dent, le stade de la cloche peut être considéré
comme l’étape déterminant la forme de la dent (Tucker et Sharpe, 1999) (Figure 3D).
Dans les dents pluricuspidées comme la molaire, le nœud de l’émail primaire disparaît et laisse
place aux nœuds de l’émail secondaires, qui apparaissent au sommet de chaque cuspide (Jernvall
et al., 1994). Ces structures secondaires expriment et sécrètent les mêmes facteurs que le nœud
de l’émail primaire. Cependant, contrairement à celui-ci, ils n’interviennent pas sur la prolifération
mais sur la différenciation cellulaire.
Dans les cellules de la papille mésenchymateuse, l’expression des facteurs de transcription
observée au stade précédent est maintenue et complétée par celle de Dlx5. Des Facteurs de
croissance des familles BMP, FGF et Wnt sont également produites par ces cellules (Figure 4).
II – Différenciation terminale des odontoblastes
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Sous l’influence de l’épithélium dentaire interne, les odontoblastes vont se différencier. Une série
de changements cytologiques et fonctionnels intervient alors au niveau de ces cellules. Le
phénomène de différenciation est initié dans chaque cuspide (Ruch, 1985) et s’effectue selon un
schéma temporo-spatial spécifique. Chez la souris, les premiers odontoblastes différenciés
apparaissent au jour 18 du développement embryonnaire, dans la première molaire inférieure au
sommet de la cuspide principale. Le processus de différenciation de nouveaux odontoblastes
s’étend ensuite progressivement en direction de la base des cuspides et conduit à la formation de
gradients de différenciation (Ruch et coll, 1995) (Figure 5A). Afin de mieux comprendre ce
phénomène, les différentes étapes de la différenciation vont être décrites dans les paragraphes
suivants, ainsi que les activités de synthèses assumées par les odontoblastes fonctionnels.
II – 1 Cytodifférenciation des préodontoblastes en odontoblastes fonctionnels
Les préodontoblastes, situés à proximité de la membrane basale (MB), effectuent un nombre
déterminé de division avant de sortir du cycle cellulaire. Chez la souris, les cellules de la lignée
odontoblastique subissent 14 à 15 mitoses (ceci n’a pas encore été décrit chez l’homme).
La dernière division est particulière car le fuseau mitotique, habituellement orienté parallèlement à
la MB, va s’orienter de manière perpendiculaire (Osman et Ruch, 1976 ; Ruch, 1987) (Figure 5B).
A l’issue de l’ultime mitose, seules les cellules filles au contact de la MB s’engagent dans le
processus de différenciation odontoblastique, tandis que les cellules filles plus internes et donc à
distance de la membrane basale deviennent des cellules de la couche de Höhle. (Piette et
Goldberg, 2001 la Dent p56). La différenciation odontoblastique commence par la polarisation et
l’allongement des cellules, impliquant des changements cytologiques importants (Figure 5A et 5C).
Alors que la cellule s’allonge, le noyau adopte une position basale excentrée, les citernes du
réticulum endoplasmique rugueux et l’appareil de Golgi se développent, s’étendent et s’orientent
de manière parallèle au grand axe de la cellule (Garant et Cho, 1985 ; Takuma et Nagai, 1971)
(Figure 5C). Cet axe est matérialisé par le prolongement cellulaire consécutif à l’allongement de la
cellule. L’odontoblaste sécréteur complètement différencié atteint une longueur de 50 à 60 µm
(Garant et al., 1968 ; Takuma et Nagai, 1971).
Au cours de la polarisation et de l’élongation des odontoblastes, les microtubules, les filaments
intermédiaires et les microfilaments sont réorganisés. L’actine, l’a-actinine, la vinculine et la
vimentine (protéines constitutives des éléments du cytosquelette) s’accumulent dans la partie
apicale du corps cellulaire (Kubler et al., 1988). L’administration de colchicine, vincristine ou de
vinblastine, agents qui perturbent l’assemblage des microtubules, bloquent la translocation des
granules de sécrétion et altèrent la forme des odontoblastes. Ainsi, pour permettre la
différenciation des odontoblastes, l’intégrité structurale et fonctionnelle du cytosquelette sont
indispensables. La polarisation des organites et la réorganisation des éléments du cytosquelette
vont permettre à l’odontoblaste d’orienter et d’acheminer les sécrétions dans le prolongement
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cytoplasmique.
D’autres phénomènes peuvent être associés à la différenciation terminale des odontoblastes. En
effet, des modifications de la membrane cellulaire, comme l’augmentation de l’activité de
l’adénylate cyclase (Osman et al., 1981) et l’accumulation/redistribution apicale des récepteurs de
la concanavaline A et de la fibronectine ont été observées (Meyer et al., 1981 b ; Lesot et coll,
1988)
Les odontoblastes fonctionnels sont reliés entre eux par de nombreuses jonctions intercellulaires.
Parmi elles, on trouve des jonctions communicantes assurant le transport rapide des ions et des
petites molécules entre les cellules. Ces jonctions sont localisées le long des surfaces latérales et
à la base des odontoblastes où elles permettent le contact avec les cellules de la couche sous
odontoblastique (Sasaki et al., 1982a). D’autres, de type desmosomes assurent une forte
cohésion mécanique entre les odontoblastes. Elles sont situées à la base du prolongement
cellulaire (Kagayama et al., 1995 ; Ushiyama et al., 1989 ; Callé, 1985 ; Callé et al., 1985)
II – 2 Régulation de la différenciation odontoblastique
Précédemment, il a été décrit que seules les cellules mésenchymateuses au contact de la
membrane basale se différenciaient en odontoblastes (§ II –1). La différenciation odontoblastique
est régulée par des interactions moléculaires réciproques entre l’épithélium dentaire interne et le
mésenchyme. Nous allons voir que ces interactions font intervenir la matrice extracellulaire (dont
la membrane basale) qui peut agir en tant que sustrat spécifique ou en tant que réservoir de
facteurs paracrines ou autocrines.
II – 2 – 1 Importance de la membrane basale
La membrane basale (MB) est une matrice extracellulaire (MEC) formée de la lame basale
(constituée de la lamina lucida et de la lamina densa) et de la lamina fibroreticularis (Merker,
1994). Les molécules qui la constituent, sont situées à la jonction épithélio-mésenchymateuse.
Son importance dans le développement dentaire a été étudiée par dissociation et réassociation de
pulpe et d’organe de l’émail aux mêmes stades (recombinaisons isochrones) et à des stades
différents (recombinaisons hétérochrones). La dissociation de la pulpe et de l’organe de l’émail
peut-être induite par deux procédés différents. L’utilisation de trypsine entraine la dégradation
complète de la MB tandis que l’EDTA sépare les deux tissus en laissant la MB en contact avec la
pulpe. Ces deux techniques ont été utilisées pour montrer l’importance de la MB lors de la
différenciation odontoblastique.
Osman et Ruch (1981), ont mis en culture pendant 24 heures des pulpes de stade E18, dissociés
par la trypsine ou par l’EDTA :
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- aucun odontoblaste n'apparaît dans les cultures de pulpes dissociées à la trypsine (c'est-à-dire
sans MB associée) (Figure 6A).
- Les pulpes dissociées à l'EDTA restent recouvertes par la MB durant 15 à 18 heures. Durant
cette période, des odontoblastes fonctionnels apparaissent au sommet des cuspides principales,
sans progression occlusale (Figure 6A).
Des expériences chez la souris, ont permis de corréler la reconstitution de la MB et la
cytodifférenciation des odontoblastes, par recombinaisons iso- ou hétérochrones entre pulpe et
organe de l'émail (Karcher-Djuricic et al., 1979) :
- Lorsque des pulpes d'embryons de 18 jours (stade où les premiers odontoblastes polarisent au
sommet des cuspides principales) sont recombinées avec des organes de l'émail du même stade,
il y a reconstitution de la MB et 24 heures après la restauration, les cellules odontoblastiques
polarisées évoluent vers le stade fonctionnel (Figure 6B).
- Si des pulpes de stade 18 jours sont recombinées avec des organes de l'émail du stade 16
jours, la MB est reconstituée après 24 heures mais les odontoblastes fonctionnels n'apparaissent
qu'après 4 jours. Les cellules utilisent ce laps de temps pour se rediviser avant de redevenir postmitotique
(Figure 6B).
- Inversement, le réappariement de pulpes du stade 16 jours avec des organes de l'émail du
stade 18 jours ne permet pas d'anticiper la différenciation des odontoblastes (Figure 6B).
Ainsi, seule une MB temporo-spatiale spécifique est capable d'induire la différenciation des
odontoblastes et les préodontoblastes ne peuvent répondre aux signaux épigénétiques qu'après
avoir effectué un nombre déterminé de cycles cellulaires
De plus, les résultats concernant les pulpes dissociées à l’EDTA indiquent que la MB ne doit pas
rester figée. Elle doit subir des modifications induite par l’épithélium dentaire interne. Ces
changements sont fondamentaux pour la régulation du développement dentaire.
L’évolution de la composition de la MB accompagne donc la différenciation des odontoblastes.
II – 2 – 2 Changement de composition de la membrane basale
Les constituants principaux de la MB sont le collagène IV et III, la fibronectine, la laminine (Lesot
et al., 1981 ; Thesleff et al., 1981), le nidogène (Kubler et al., 1988), la ténascine (Chiquet-
Ehrismann, 1990 ; Erickson, 1989), l’acide hyaluronique et des protéoglycanes à héparane sulfate
(Thesleff et al., 1981). Ceux-ci sont présents bien avant et pendant la différenciation des
odontoblastes.
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La polarisation des odontoblastes s’accompagne de la disparition progressive du collagène de type
III (Lesot et al., 1981) à la jonction épithélio-mésenchymateuse. La fibronectine qui entoure les
préodontoblastes va se concentrer au pôle apicale des odontoblastes polarisés (Lesot et al.,
1981 ; Meyer et al., 1989 ; Thesleff et al., 1981), le collagène de type I, la décorine et le biglycane
présents dans la MEC, s'accumulent également au pôle sécréteur des cellules allongées (Lesot et
al., 1994).
Au cours de la différenciation, il a été montré que le chondroïtine-4-sulfate évoluait de façon
identique à celle de la fibronectine (Mark et al., 1992a). Toutefois, les chondroïtines sulfates ne
semblent pas intervenir dans le contrôle de la différenciation des odontoblastes (Mark et al.,
1992b).
Des études ont également montré des modifications du profil de distribution des
glycosaminoglycanes (Lau et al., 1983 ; Lau et Ruch, 1983) et des polysaccharides (Meyer et al.,
1981). La tenascine associée à la MB augmente au cours de la différenciation terminale des
odontoblastes (Thesleff et al., 1987).
L’ensemble de ces observations illustre certains aspects de l’évolution de la composition de la MB
au cours de la différenciation des odontoblastes.
II – 2 – 3 Activité biologique des constituants matriciels
Les molécules de la MEC interviennent également dans le processus de différenciation
odontoblastique, par l’intermédiaire de récepteur. Une protéine a été largement étudiée à ce sujet :
la fibronectine.
Au cours de la différenciation, celle-ci subit une redistribution au niveau de la MEC. La mise en
présence de préparations membranaires de cellules du mésenchyme dentaire avec la fibronectine
a montré que celle-ci interagissait avec trois protéines de haut poids moléculaire : 145, 165 et 185
kDa (Lesot et al., 1985).
Une approche immunologique a permis d’étudier la protéine de 165 kDa (appelée P165). Deux
anticorps monoclonaux dirigés contre elle ont été utilisés pour définir sa localisation et sa fonction.
Cette protéine et la fibronectine s’accumulent transitoirement au pôle apical des odontoblastes en
cours de polarisation (Figure 7) (Lesot et al., 1990 ; 1992). Un anticorps monoclonal reconnaissant
spécifiquement un épitope extracellulaire de la protéine 165 kDa interfère avec l’organisation des
microfilaments et bloque l’élongation et la polarisation des odontoblastes sans affecter les
microtubules. Le mécanisme moléculaire utilisé par la P165 , dans la réorganisation des
microfilaments pendant la polarisation n’a pas encore été élucidé. Aucune interaction entre la P165
et l’a-actinine, la vinculine ou la taline n’a été mise en évidence dans les conditions expérimentales
utilisées (Fausser et al., 1993a, 1993b).
Des recherches complémentaires indiquent que la P165 n’est pas un membre de la famille des
intégrines. En effet, la P165 est un monomère et son interaction avec la fibronectine est calciumindépendante.
Elle interagit avec un fragment protéolytique de 62 kDa de la fibronectine
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comprenant le domaine de liaison au collagène et le premier motif de type III or aucune intégrine
n’interagit avec cette région (Lesot et al., 1988 ; 1990 ; 1992 ; 1993).
D'autre part, la P165 ne se lie pas au fragment C-terminal de la fibronectine qui comprend la
séquence d'attachement cellulaire RGD (domaine de liaison de nombreuses intégrines). Cette
observation est confirmée par le fait que le peptide de synthèse GRGDS, compétiteur de la
séquence RGD, n'inhibe pas la différenciation de l'odontoblaste.
Concernant les facteurs de croissance et leur(s) récepteurs, de nombreuses expériences
d’immunolocalisation et d’hybridation in situ, suggèrent l’intervention de certaines protéines dans la
différenciation terminale des odontoblastes.
La distribution de la GH (Growth Hormone), de la protéine de liaison à la GH et du récepteur de la
GH a été étudiée par Zhang et al. (1997) Les immunomarquages réalisés sur des germes
dentaires de rat à différents stades de gestation, montrent que les trois molécules semblent être
exprimées dans les cellules odontogéniques subissant la cytodifférenciation. Ces données
suggèrent que la GH joue un rôle paracrine et/ou autocrine dans le développement dentaire.
L’immunohistochimie de IGF-I (de la famille des IGF : Insulin Growth Factor) et de son récepteur a
montré que ces molécules étaient synthétisées localement par les cellules de la dent en formation.
D’autre part, une forte immunoréactivité a été observée pour IGF-I au niveau des odontoblastes
en cours de différenciation. Ces résultats semblent indiquer que lGF-I puisse jouer également un
rôle paracrine et/ou autocrine (Joseph et al., 1993 ; 1996).
Dans la superfamille des TGFβs (transforming growth factor), le TGFβ1, -2, -3 (Cam et al., 1990 ;
D’Souza et al., 1990 ; Thesleff et Vaahtokari, 1992 ; Heikinheimo et al., 1993a) et le BMP2, -4, -6
(Bone morphogenetic protein) (Lyons et al., 1990 ; Heikinheimo, 1993b, 1994 ; Vainio et al., 1993)
jouent également un rôle dans la polarisation et la différenciation. L’analyse du schéma
d’expression de ces facteurs de croissance a permis de mettre en évidence leur transcrits dans les
cellules de l’épithélium dentaire interne, en face des cellules odontoblastiques.
Le rôle de ces facteurs a été testé in vitro. Des pulpes dentaires ne renfermant que des
préodontoblastes, cultivées en présence de TGFb1 ou de BMP2 et de l’héparine, permettent la
différenciation fonctionnelle d’odontoblastes (Bègue-Kirn et coll, 1994). En effet, les facteurs de
croissance ont besoin d’être immobilisés pour exercer leur action.
In vivo, ils interagissent avec des composants extracellulaires, associés à la membrane basale et
à des protéines membranaires. Les TGFbs se lient en particulier au b-glycan, au biglan, à la
décorine (Cam et al., 1997) et aux récepteurs à sérine-thréonine kinase de type I ou de type II
(Wang et al., 1995).
II – 3 Rôle des odontoblastes : la dentinogenèse
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Les cellules de la lignée odontoblastique passent par plusieurs états de différenciation.
Successivement les cellules se différencient en odontoblastes polarisés, en odontoblastes
sécréteurs puis en odontoblastes matures. La différenciation entraîne aussi bien des changements
cytologiques que des changements transcriptionnels et traductionnels.
Dès l’étape de polarisation, les odontoblastes commencent à synthétiser les constituants de la
prédentine/dentine.
II – 3 – 1 La prédentine
La prédentine est composée de 97% de collagène de type I (dont 10-15% de trimère) et de 3% de
type V [α1(V) et α3(V)]. Des phospholipides, de l’albumine et des protéoglycanes ont également
été identifiés ainsi que de très petites quantités de phosphoprotéines (tableau 1). La prédentine
contient du calcium (0,4%) et du phosphore (0,37%) à l’état de trace, contrairement à la dentine
qui a une haute teneur en ions minérales (voir paragraphe suivant).
Les odontoblastes sont responsables de la synthèse et de la sécrétion de la dentine mais
également de sa dégradation. Pour cela, les odontoblastes sont capables de produire différentes
enzymes catalytiques et métalloprotéases, qui vont dégrader la MEC de la prédentine/dentine. Les
molécules libérées sont ensuite capturées par les vésicules d’endocytoses des odontoblastes.
Elles convoient les résidus en direction des lysosomes distaux des corps cellulaires, où
l’élimination se poursuit, tout en délivrant des messages informatifs ou stimulant la cellule (Piette
et Goldberg, 2001). Les produits de dégradation de la matrice extracellulaire sont probablement
générés lors de la conversion de la prédentine non-minéralisé en dentine minéralisé.
II – 3 – 2 La dentine
La dentine est composée de différents types de collagène tels que le collagène de type I, trimère
de type I, type V et type VI, mais également de protéines non collagéniques (PNC) comme les
protéoglycanes, les glycoprotéines, les phosphoprotéines et autres molécules que l’on peut trouver
résumées dans le tableau 1. Parmi ces molécules, seules la DSP et la DPP sont connues pour
être plus spécifiques des tissus dentaires.
Cependant, les constituants principaux sont ceux de la phase minérale qui représente 70% de la
dentine. Cette phase est composée d’hydroxyapatite carbonée et de magnésie. Ce sont les
protéines non collagéniques, sécrétées à l’extrémité du prolongement, qui vont permettre la
transformation de la prédentine en dentine, en initiant et en régulant la minéralisation de la MEC.
La zone où s’effectue ce processus est appelé « front de minéralisation » (Butler, 1995 ; 1998).
La dentinogenèse est un processus continu, qui persiste tout au long de la vie, cependant le
vieillissement conduit les odontoblastes à des cellules peu sécrétrices (Couve, 1985), il y a donc
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un ralentissement net entre les phases de formation initiale où l’activité sécrétrice est intense et
les phases matures où ces processus sont ralentis.
Au fur et à mesure de l’apposition de la dentine, les odontoblastes reculent en même temps que la
pulpe. Le corps cellulaire reste à la périphérie du tissu mésenchymateux, tandis que le
prolongement se retrouve séquestré dans la prédentine, dans des structures appelées canalicules.
Malgré de nombreuses études, il n’a pas été possible pour le moment de déterminer la longueur
occupée par les prolongements dans les canalicules. Certains résultats suggèrent qu’il ne s’étend
pas au-delà de la moitié de la dentine (Brannstrom et Garberoglio, 1972 ; Frank et Voegel, 1980 ;
Thomas et Payne, 1983), et d’autres que le prolongement se termine à proximité de la jonction
amélodentinaire (Yamada et al., 1983), Tandis qu’une étude récente (Yoshiba et al., 2002),
indique qu’il ne dépasserait pas la moitié ou le tiers interne de la dentine.
II – 3 – 3 La dentine réactionnelle
Bien que la synthèse de la dentine soit nettement diminuée chez l’adulte, l’activité métabolique des
odontoblastes peut être augmentée en réponse à des stimuli comme le développement de caries
ou des dommages tissulaires (Franck et Nalbandian, 1989). Selon Smith et al. (1995 ; 1998), les
membres de la famille du TGFb présents dans la dentine pourraient être solubilisés par la plaque
bactérienne acide. Ainsi, ces molécules seraient responsables des effets stimulateurs des voies
métaboliques des odontoblastes. Les composants organiques sécrétés en réponse aux agressions
donnent naissance à la dentine dite « réactionnelle ».
II – 3 – 4 La dentinogenèse réparatrice.
Parfois, les dommages causés par différents facteurs sont tels que les odontoblastes primaires,
issus du développement normal, sont détruits. La dentine réactionnelle ne peut donc plus être
synthétisée. Le tissu pulpaire a alors la possibilité de réagir, par la mise en place d’une barrière
dentinaire : la dentine réparatrice (Lesot et al., 1993 ; Smith et al., 1994 ; Magloire et al., 1992 ;
Farges et al., 1993). Celle-ci est produite par des cellules issues de la région sousodontoblastique,
qui se divisent et qui migrent au contact de la zone de nécrose et se différencient
en odontoblastes secondaires. Ces cellules sont morphologiquement et fonctionnellement
semblables aux odontoblastes de première génération (Magloire et al., 1988; 1992 ; Lesot et al.,
1993 ; 1994 ; Bègue-Kirn et al., 1994). Ils présentent toutefois des caractéristiques fonctionnelles
différentes comme la synthèse de collagène de type III et de fibronectine.
II – 4 Protéines dentinaires sécrétées par les odontoblastes
II – 4 – 1 Les collagènes
La matrice organique est constituée à 90% de collagènes et essentiellement de collagène de type
I. Celui-ci est formé par l’association de deux chaines α1 et α2. On trouve également du collagène
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sous forme de trimère de type I (10 à 15%), composé de trois chaines a1. La prédentine/dentine
comprend également du collagène de type V, qui régule le diamètre des fibres de collagène de
type I. Les molécules de collagène s’organisent en un réseau tridimensionnelle de fibres de gros
diamètre. Ce motif architectural est spécialement adapté pour la minéralisation. Cependant, le
collagène de type I n’est pas directement responsable de la nucléation de l’hydroxyapatite. Il
permettrait plutôt la fixation des phosphoprotéines. Ces dernières conditionneraient alors le dépôt
du minéral dans les espaces libres de la fibre de collagène.
II – 4 – 2 Protéines non collagéniques exprimées par les odontoblastes et les cellules de
divers tissus
a. L’ostéonectine
Cette protéine est présente dans l’os, le cartilage hypertrophique, la dent et dans d’autres tissus
conjonctifs pendant certains stades du développement (Bianco et al., 1988 ; Lane et Sage, 1994 ;
Malaval et al., 1991 ; Reichert et al., 1992). Elle contient de nombreux résidus acides aspartiques,
acides glutamiques, glycine et sérine. Elle se lie fortement au calcium et au collagène de type I. In
vitro, elle se comporte comme inhibiteur des cristaux d’apatites. Sa synthèse est stimulée par le
TGFβ1. L’ostéonectine pourrait jouer un rôle dans la forme et l’adhésion cellulaire et dans la
progression du cycle cellulaire (Gilmour et al., 1998 ; Lane et Sage, 1994 ; Tremble et al., 1993).
b. L’ostéopontine
C’est une protéine phosphorylée, qui porte une séquence poly-Asp pour la fixation du calcium et
plusieurs sites de phosphorylations potentiels pour les caséïnes kinases (Butler, 1989 ; Denhardt
et Guo, 1993). Elle possède également une séquence RGD (Gehron-Robey, 1996 ; Kohri et al.,
1993), reconnue par les intégrines. Sa synthèse est stimulée par la vitamine D et par le TGFβ1. Sa
fonction dans les tissus minéralisés serait de réguler la croissance des cristaux d’hydroxyapatite et
assurer la cohésion entre le minéral et la MEC. Elle est exprimée par les préostéoblastes, les
ostéoblastes, les jeunes ostéocytes et les chondrocytes (Butler, 1989). Les immunomarquages
sont discrêts pour les odontoblastes jeunes et la prédentine, plus marqués pour les odontoblastes
matures.
c. Les protéoglycanes
Les protéoglycanes (PG) sont formés de protéines associées à des glycosaminoglycanes sulfatés
de type chondroïtine-sulfate, dermatane-sulfate et kératane-sulfate. Des études
immunocytochimiques ont montré que les chondroïtine-4-sulfates étaient présentes dans la
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prédentine et la dentine tandis que les chondroïtine-6-sulfates ne sont présentes que dans la
prédentine (Takagi et al., 1990).
Parmi les protéoglycanes présents dans la prédentine/dentine, on compte la décorine et le
biglycane (Yoshiba et al., 1996), la fibromoduline, le lumican (Chen et al., 1996 ; Hall et al., 1997)
et le versican (Takagi et al., 1990), l’asporine (Henry et al., 2001 ; Lorenzo et al., 2001), le
kératocane (Corpuz et al., 1996) et l’ostéoadhérine (Buchaille et al., 2000 ; Petersson et al., 2003).
Le rôle des protéoglycanes dans les phénomènes de biominéralisation est mal défini. Il a été
suggéré que la décorine, le lumican et l’ostéoadhérine puissent avoir un rôle dans la mise en place
du réseau des fibres de collagène. L’ostéoadhérine aurait également une autre fonction, celle de
nucléateur lors de la biominéralisation (Scott, 1988 ; Birk et al., 1995 ; Buchaille et al., 2000 ;
Embery et al., 2001 ; Petersson et al., 2003). En solution, le biglycane lui-même a été décrit
comme étant nucléateur des cristaux d’hydroxyapatite et à de plus fortes concentrations, inhibiteur
de la croissance des cristaux (Boskey et Coll, 1997).
Dans tous les cas, la fonction des PG dans la bioméralisation pourrait être expliquée au moins en
partie par leur structure intrinsèque. En effet, les chaines glycosaminoglycanes contiennent
plusieurs groupements sulfates et carboxyles qui confèrent aux PG une capacité importante à fixer
le calcium.
d. La phosphatase alcaline
La phosphatase alcaline est une protéine de surface cellulaire, mais elle a aussi été isolée de la
matrice minéralisée. Il existe quatre isoformes, dont une, la phosphatase alcaline tissu nonspécifique
(TNAP) présente dans l’os, la dent, le foie et le rein.
II – 4 – 3 Protéines exprimées par les odontoblastes et les cellules
des tissus minéralisés
a. L’ostéocalcine
Cette protéine contient trois résidus γ-carboxyglutamiques (Price, 1992), qui forment un motif
d’hélice permettant à l’ostéocalcine de se lier au calcium et aux phosphates des surfaces
cristallines. Elle pourrait agir comme un inhibiteur de la minéralisation (Young et al., 1992).
On la trouve dans l’os, où elle est très abondante, la dentine et le cément (Linde et al., 1982 ;
Bronckers et al., 1987 ; Davideau et al., 1996 ; Lian et al., 1999). Sa synthèse est stimulée par la
vitamine D (Lian et al., 1989), la parathormone et des facteurs de croissance.
b. La protéine de la matrice dentinaire (DMP1 ou AG1)
La DMP1 a d’abord été isolée dans la matrice dentinaire (George et al., 1994), mais ensuite elle a
été localisée aussi dans d’autres cellules des tissus minéralisés : ostéoblastes, cémentoblastes et
les améloblastes sécréteurs (D’Souza et al., 1997). C’est une protéine hautement phosphorylée,
EPHE Banque de Monographies SVT 20

iche en sérine, en acide glutamique et en acide aspartique et qui contient également une
séquence adhésive arginine-glycine-aspartate (RGD). Elle est capable de lier les ions calcium. Il a
été suggéré qu’elle participe à l’initiation et/ou la régulation de la formation de l’hydroxyapatite
(Butler et Ritchie, 1995).
c. La sialoprotéine osseuse (BSP)
La BSP est une protéine fortement glycosylée et sulfatée, isolée à partir de l’os (Fisher et al.,
1983 ; Franzen et Heinegard, 1985). C’est une protéine riche en acide glutamique et aspartique
qui contient des sites potentiels de liaison au calcium et à l’hydroxyapatite (Fisher et al., 1990).
Elle est synthétisée et sécrétée par les ostéoblastes, les odontoblastes, les cémentoblastes et les
améloblastes (Shapiro et al., 1993 ; MacNeil et al., 1996 ; Chen et al., 1992 ; 1998). Alors que la
fonction de la BSP n’a pas été identifiée de façon certaine, il a été montré que cette protéine
pouvait servir de nucléateur pour la formation des cristaux d’hydroxyapatites (Hunter et Goldberg,
1993). Mais bien que son expression soit généralement associée à la biominéralisation, la
présence d’une séquence RGD dans sa structure primaire semble indiquer d’autres fonctions pour
cette protéine. La BSP favorise d’ailleurs l’attachement et l’étalement de cellules d’ostéosarcome
de rat sur des boîtes plastiques recouvertes avec cette protéine, par l’intermédiaire de l’intégrine
aVb3. On sait de plus, que la BSP stimule l’élévation de la concentration intracellulaire en calcium
cytosolique libre, par l’interaction avec l’intégrine (Paniccia et al., 1995). Cette interaction pourrait
donc servir, à la fois, à l’attachement cellulaire et avoir une fonction de voie de signalisation.
Quoiqu’il en soit, l’intervention potentielle de ces fonctions dans la formation des tissus conjonctifs
minéralisés et/ou dans l’émail reste à être déterminée.
II – 4 – 4 Protéines spécifiques des odontoblastes
Nous avons pu voir précédemment que les odontoblastes partagent l’expression de nombreuses
protéines avec d’autres tissus, notamment les cellules du tissu osseux. Dans ces rappels, seules
quelques protéines communes à l’os et à la dentine ont été citées, mais il existe des centaines
d’autres protéines exprimées par les ostéoblastes et les odontoblastes. Shi et al. (2001) ont
montré par microarray que des progéniteurs d’odontoblastes et des progéniteurs d’ostéoblastes
possédent un niveau similaire d’expression sur plus de 4000 gènes connus. Cette technique n’a
pas permis de détecter de gènes exclusivement présents dans l’une des populations.
Actuellement, seules deux protéines sont connues pour être plus spécifiquement exprimées et
sécrétées par les odontoblastes : la phosphoprotéine dentinaire (DPP) et la sialoprotéine
dentinaire (DSP). Ces deux molécules sont produites par le clivage d’un précurseur protéique
commun. Ce dernier est codé par un seul gène nommé sialophosphoprotéine dentinaire (dspp)
(MacDougall et al., 1997), localisé sur le chromosome 4 humain. Récemment, la Dspp a été
observée dans l’oreille et l’os (Xiao et al., 2001 ; Qin et al., 2002), mais à l’état de trace. Ces deux
protéines restent donc les marqueurs de la différenciation odontoblastique. Des expériences
EPHE Banque de Monographies SVT 21

d’immunomarquage et d’hybridation in situ ont montré que la DSP et la DPP étaient synthétisées
et sécrétées par les odontoblastes jeunes, les odontoblastes matures et transitoirement par les
préaméloblastes (D’souza et al., 1997 ; Bronckers et al., 1993 ; Bègue-Kirn et al., 1998a ; 1998 b ;
Bleicher et al., 1999 ; Papagerakis et al., 2002). Le rôle crucial de la dspp a été démontré sur des
souris knockout (Screenath et al., 2003), celle-ci orchestrerait les évènements essentiels de la
minéralisation dentinaire incluant très probablement la régulation de l’expression des
protéoglycanes.
a. La phosphoprotéine dentinaire (DPP) ou phosphoryne
C’est la protéine non collagénique majeure de la dentine (Butler, 1998), elle est riche en acide
aspartique (35 - 38 %) et phosphosérine (45 – 50 %). La phosphorylation des résidus sérine est
sous la dépendance de la caséine-kinase II d’abord, puis de la caséine kinase I qui termine la
phosphorylation. In vitro, l’inactivation de ces deux kinases conduit à l’altération des processus de
minéralisation. Elle est capable de se lier au calcium (Linde et Goldberg, 1993) et participerait à
l’initiation et au contrôle de la formation minérale (Veis, 1993 ; Linde et Goldberg, 1993 ; Butler,
1995 ; 1998 ; Ritchie, 1997). D’autre part, la DPP est capable de se lier, de manière covalente, au
collagène de type I (Stetler-Stevenson et Veis, 1986 ; Traub et al., 1992). Le site de liaison au
collagène se situe au niveau de la bande « e », qui est impliquée dans le dépôt initial du minéral.
Le rôle de la DPP serait de servir d’interface entre le collagène et la phase minérale dans la
dentine. Après fixation de la DPP sur le collagène, il y aurait concentration des ions calcium à
l’intérieur de la fibre de collagène, provoquant ainsi la nucléation des cristaux d’hydroxyapatite.
Ensuite, elle participerait à la détermination de la forme et de la taille des cristaux en se liant aux
cristaux nouvellement formés et en ralentissant leur croissance (Füredi-Milhofer et al., 1994 ;
Butler, 1998).
b. La sialoprotéine dentinaire (DSP)
Cette protéine est riche en acide aspartique et glutamique et en résidus sérine et glycine (Butler et
al., 1992). Elle possède des sites potentiels de phosphorylation, mais il n’a pas été possible de
montrer la présence de phosphate lié sur la DSP (Butler et al., 1992). Cette protéine est localisée
dans les odontoblastes jeunes et matures, dans la dentine mais aussi dans les préaméloblastes
(Bronckers et al., 1993 ; MacDougall et al., 1999a ; Ritchie et al., 1997). La protéine mais pas les
ARNm, a été aussi détectée dans les cellules pulpaires (D’Souza et al., 1992 ; 1997). Son rôle
dans la dentinogenèse reste inconnu. Elle ne contient pas de séquence RGD qui permettent
l’attachement cellulaire comme cela a été trouvé pour d’autres protéines riches en acide sialique
(ostéopontine). D’ailleurs, elle peut ralentir le développement des cristaux, à l’état libre, comme
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cela a été montré pour la DPP et l’ostéopontine mais l’effet de la DSP in vitro est beaucoup moins
important que ces deux dernières protéines (Butler, 1998). Finalement, il a été proposé qu’elle
pourrait jouer un rôle dans les interactions épithélio-mésenchymateuses (Butler, 1998) et dans la
nucléation des cristaux de l’émail (MacDougall et al., 1998a)
III – Etude des odontoblastes
III – 1 Difficultés d’étude de ce type cellulaire
La situation particulière de l’odontoblaste au sein du complexe dentino-pulpaire complique
l’analyse de cette cellule in vivo. En effet, les odontoblastes forment une couche unicellulaire à la
surface de la pulpe et ne représentent qu’un très faible pourcentage des cellules
mésenchymateuses. De plus, ces cellules ont un prolongement enchassé dans la MEC. Leur
isolement est donc difficile et fournit très peu de cellules.
Ces contraintes ont rendu nécessaire la mise au point de systèmes de culture favorisant la
différenciation odontoblastique. Les différents modèles sont basés sur le même postulat : les
cellules pulpaires ou des sous-populations de ces cellules dans la dent mature ont encore, dans
des conditions favorables, la capacité de se différencier en odontoblastes, par des mécanismes
similaires à ceux mis en jeu pendant le développement embryonnaire. Ce sont des odontoblastes
dits de seconde génération, que l’on peut voir apparaître in vivo en réponse à certains
phénomènes pathologiques pour remplacer les odontoblastes originels. Ces cellules ont la
capacité, en absence d’épithélium odontogène et de MB, de synthétiser une dentine réparatrice
(Lesot et al., 1993 ; 1994.)
Deux grands types d’approches ont été utilisées pour induire la différenciation de cellules
précurseurs en odontoblastes et favoriser également la dentinogénèse in vitro : les cultures
d’organes et les cultures de cellules pulpaires.
III – 2 Méthodes utilisées pour contourner les difficultés
III – 2 – 1 Cultures de papilles dentaires
L’utilisation de ce type de modèle permet de conserver les relations intercellulaires et une certaine
morphologie cellulaire originelle, c’est pourquoi beaucoup de recherches ont été menées dans
cette voie, avec plus ou moins de succès. Lesot et al. (1985) ont cultivés des papilles dentaires sur
filtres millipores recouverts de collagène de type I et/ou de fibronectine. Dans ce cas, aucune
polarisation n’a pu être observée.
En revanche, lorsque les filtres millipores sont recouverts de fractions dentinaires (Cam et al.,
1986 ; Lesot et al., 1986), le maintien d’odontoblastes polarisés est possible.
Bègue-Kirn et al. (1992) ont cultivés des papilles dentaires (ne contenant que des
préodontoblastes en division) en milieu semi-solide supplémenté en TGFb ou en BMP2 combinés
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avec de l’héparine ou de la fibronectine, ou en fractions solubles dans l’EDTA de la dentine. Dans
ces conditions, il a été possible de maintenir et surtout d’initier la différenciation d’odontoblastes.
La polarisation et la différenciation fonctionnelle des odontoblastes sont donc stimulées par
association de protéines de la dentine et de facteurs de croissance. En effet, les expériences in
vitro (Bègue-Kirn et al., 1994) suggèrent que l’immobilisation des facteurs de croissance actifs par
l’héparine ou la fibronectine est nécessaire pour induire la polarisation cytologique des
odontoblastes et éventuellement pour l’accumulation de la matrice dans la partie apicale. Le
piégeage des facteurs de croissance simulerait l’immobilisation des composants par la membrane
basale, in vivo.
III – 2 – 2 Cultures de tranches de dent
Dans le même souci de préserver l’architecture tridimensionnelle, des modèles ont été réalisés à
partir de tranche de dent mature mises en culture. Ces systèmes ont l’avantage de permettre, en
plus, l’investigation de la dentinogenèse réparatrice et réactionnelle. Le comportement de
l’odontoblaste peut alors être examiné indépendamment de toutes réactions inflammatoires, que
l’on voit apparaître lors d’une atteinte tissulaire .
Des coupes transversales épaisses d’incisives de rats ont été mises en culture (Sloan et al., 1998)
et ont servi à l’étude de l’influence de différents isoformes du TGFβ. Pour se faire des billes
d’agarose chargées des différents isoformes ont été placées au sein du complexe dentino-pulpaire
des coupes. Les résultats montrent que le TGFb1 et -b3 stimulent la sécrétion de la MEC par les
odontoblastes et sont mitogènes pour les cellules pulpaires.
Dans certaines cultures, le TGFβ3 semblait induire également l’émergence de nouvelles cellules
différenciées et polarisées de type odontoblastique (Sloan, 1999 ; Sloan et Smith, 1999 ; Sloan et
al., 2000)
Magloire et al. (1996) ont quand à eux, mis en culture des coupes épaisses de dents humaines
extraites pour raisons orthodontiques chez de jeunes patients. La mise en place d’un micro-tube à
la surface dentinaire à proximité de la pulpe permet d’étudier l’influence de certaines molécules sur
les cellules pulpaires, par diffusion de ces facteurs à travers les tubules dentinaires. Le TGFβ1
induit la synthèse de collagène a1(I) par les cellules imprégnées de facteurs (Melin et al., 2000) et
l’application de NGF (nerve growth factor) induirait des changements dans la morphologie
cellulaire (Magloire et coll, 1997). La réalisation d’une cavité triturante (cavité se situant sur la face
de la dent au contact des aliments) avant la mise en culture permet de mimer l’atteinte dentinaire
(fraisage, carie) et doit permettre d’étudier les principales étapes de la cicatrisation pulpaire et
notamment l’origine des cellules qui se différencient en odontoblastes de seconde génération.
Toutefois, comme dans le cas des cultures de papilles dentaires, ce modèle ne permet pas d’isoler
les cellules et donc d’étudier la cascade des réactions aboutissant à la différenciation
odontoblastique.
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III – 2 – 3 Cultures de cellules pulpaires
L’étude des mécanismes de régulation impliqués dans la différenciation terminale et la synthèse
de matrice in vitro requiert un grand nombre de cellules homogènes au niveau phénotypique et
génotypique.
Pour répondre à cet objectif, de nombreuses tentatives cherchant à induire la différenciation
odontoblastique, ont été réalisées. Certains systèmes ont utilisés des cellules de rat (Kasugaï et
al., 1988 ; Liang et al., 1990 ; Kawase et al., 1990 ; Hayashi et al., 1993), de souris (MacDougall
et al., 1995 ; 1998 ; Andrews et al., 1993), de bovin (Nakashima, 1991 ; 1992 ; Nakashima et al.,
1994 ; Satoyoshi et al., 1995 ; Hanks et al., 1998) et d’humain (Magloire et Dumont, 1976 ;
Magloire et al., 1981 ; Seux et al., 1991 ; Kuo et al., 1992 ; Tsukamoto et al., 1992 ; Shiba et al.,
1995 ; Nakade et al., 1999). Toutes ces techniques ne conduisent pas à la différenciation de
cellules en odontoblastes. La plupart du temps les cellules obtenues sont de types fibroblastiques
ou préodontoblastiques exprimant en fonction des systèmes, les molécules de la MEC sécrétées à
ces mêmes stades in vivo telles que la phosphatase alcaline, l’ostéocalcine, le collagène de type I
ou la fibonectine. Ces cellules s’organisent le plus souvent en nodules composés de plusieurs
couches cellulaires (Nakashima, 1991 ; 1992 ; Nakashima et al., 1994 ; Kuo et al., 1992 ; Andrews
et al., 1993) qui en présence de βGP présentent des aires de minéralisation (Tsukamato et al.,
1992 ; MacDougall et al., 1992 ; Shiba et al., 1995). Quelques auteurs mettent en évidence des
protéines directement reliées au phénotype odontoblaste, telles que DMP1, la DSP, la DPP ou des
protéines « phosphoryne-like » (MacDougall et al., 1992 ; Hanks et al., 1998 ; Kasugaï et al.,
1993).
Dans certains de ces systèmes, les auteurs ont immortalisé des cellules du mésenchyme pulpaire
de souris (MacDougall et al., 1995 ; Hanks et al., 1998) ou humaines (Panagakos, 1998), par
l’antigène T du virus SV40. Récemment, une autre lignée cellulaire odontoblastique, immortalisée
par la télomérase, a été mise au point, capable de produire de la dentine-like minéralisée in vivo et
in vitro (Hao et al., 2002).
D’autres auteurs ont employé ces cultures de cellules pulpaires sur divers substrats tels que la
fibronectine, des microcristaux de carbonate de calcium ou au sein d’éponge de collagène de type
I et de chondroïtine sulfate par exemple (Veron et al., 1990 ; Bouvier et al., 1990 ; Seux et al.,
1991). Ces études avaient pour but de simuler l’architecture en trois dimensions et l’environnement
cellulaire des odontoblastes in vivo, représentés par les molécules de la MEC et les facteurs fixés
sur cette matrice.
III – 2 – 4 Microdissection à capture laser
Récemment une nouvelle méthode a été utilisée par Hoffmann et al. (2001 ; 2002) : la
microdissection à capture laser. Cette approche permet d’obtenir une population pure et intact de
préodontoblastes et d’odontoblastes. Le protocole nécessite des coupes très fines (12-14 µm) de
tête d’embryon ou de nouveaux-nés de souris, congelée ou enrobée dans de la paraffine. Comme
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la morphologie des odontoblastes s’identifie facilement, la dissection se fait directement sous
microscope avec le laser, qui envoie des pulses de faible énergie. Cet appareil opère avec
précision, ce qui permet d’isoler uniquement les odontoblastes. Ceux-ci sont ensuite catapultés
dans une capsule microfuge (microfuge cap), et peuvent ensuite servir pour l’extraction d’ARNs.
En effet, il a été montré que les ARNs issus d’odontoblastes disséqués à partir de trois molaires
sont suffisants en quantité et en qualité pour réaliser des études d’expression de gène.
L’utilisation de la microdissection à capture laser est donc un moyen valable pour extraire des
ARNs à partir d’une population réduite de cellules.
III – 3 Technique mise en œuvre dans notre laboratoire
III – 3 – 1 Culture cellulaire (Couble et al., 2000)
Le laboratoire a développé un système de culture favorisant la différenciation de cellules pulpaires
en odontoblastes. La méthode consiste à mettre en culture des explants de pulpe dentaire en
présence de milieu supplémenté en SVF (sérum de veau fœtal). Ce type de milieu permet la
croissance des cellules pulpaires précurseurs. L’addition de bêta-glycérophosphate (βGP) dans le
milieu, permet d’obtenir des cellules ayant les caractéristiques morphologiques et fonctionnelles
des odontoblastes. Les cellules sont polarisées et présentent un prolongement cytoplasmique et
des jonctions complexes similaires à celles qui lient les odontoblastes in vivo. Des études
structurales ont montrées que les organites intracellulaires se concentrent principalement au
niveau du corps cellulaire, tandis que le prolongement contient uniquement les éléments du
cytosquelette et des vésicules sécrétrices.
Ces cellules ont la capacité de déposer une matrice abondante riche en collagène de type I, où
l’on peut observer ensuite une aire de minéralisation. L’étude de l’expression des gènes par RT-
PCR révèle que les odontoblastes polarisés expriment la chaine a1 du collagène et que les
odontoblastes de l’aire de minéralisation expriment la dspp.
Ce système de culture cellulaire induit la différenciation de cellules pulpaires précurseurs (CPP) en
odontoblastes, au niveau morphologique mais également au niveau fonctionnel. De plus ces
cellules présentent une organisation similaire à la couche odontoblastique in vivo.
III – 3 – 2 Construction d’une banque spécifique des odontoblastes
(Buchaille et al., 2000)
Afin d’étudier les gènes exprimés spécifiquement dans la couche odontoblastique, le laboratoire à
construit une banque d’ADNc, à partir de cultures de CPP et d’odontoblastes. La faible quantité
d’ARNs totaux extraits de ces cultures a déterminé le choix de la technique employée pour la
construction de la banque. La technique PCR d’hybridation soustractive suppressive (SSH PCR),
développée par Clontech (Palo Alto, CA, USA), a semblé la plus appropriée. En effet, celle-ci
permet d’enrichir le milieu réactionnnel en ADNc spécifiques d’un des deux types cellulaires (choisi
au préalable). Les ADNc en abondance identique dans les CPP et les odontoblastes ont donc été
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supprimés tandis que les ADNc en plus grande quantité dans les odontoblastes ont été amplifiés
de manière exponentielle. Cette technique permet également l’élimination des ADNc surexprimés
dans les CPP.
Les ADNc soustraits ont ensuite été clonés dans un vecteur TA, qui a servi a transformer les
bactéries Escherichia Coli, permettant ainsi de créer une banque de clones spécifiques des
odontoblastes. Après avoir validé ce modèle de banque, les gènes retrouvés ont été alignés avec
ceux contenus dans les banques grâce au logiciel BLAST.
Les gènes retrouvés ont été classés dans les trois catégories ci-après :
Ø Gènes déjà identifiés dans les odontoblastes et gènes ubiquitaires (tableau 2)
Ø Gènes déjà identifiés dans d’autres types cellulaires (Tableau 3)
Ø Gènes inconnus (Tableau 4)
Parmi les clones de la banque, 40% correspondent à des gènes inconnus. Les alignements
informatiques ont montrés que 80% des ces clones possèdent plus de 80% d’homologie avec des
séquences exprimées (EST) ou des séquences génomiques. Le potentiel de découverte de
nouveaux gènes responsables du phénotype odontoblastique est par conséquent très important.
La réalisation d’un reverse northern dot-blot dans le cadre de la banque a permis d’évaluer le
niveau de surexpression de chaque gène dans les odontoblastes par rapport aux cellules
pulpaires précurseurs (tableau 4).
Comme cela a été décrit précedemment, il existe peu de données sur le phénotype des
odontoblastes. Seule, la dspp a été décrite comme spécifique de ces cellules. Mais l’expression
propre aux odontoblastes concerne probablement d’autres gènes. Ainsi l’étude des clones de cette
dernière catégorie devrait permettre d’identifier, s’ils existent, d’autres gènes caractéristiques des
odontoblastes.
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