Elodie Martin - EPHE

Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes
MINISTÈRE DE L'ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR ET DE LA RECHERCHE
ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
Sciences de la Vie et de la Terre
MEMOIRE
Présenté
Par
Elodie MARTIN
ATAXIE SPINOCÉRÉBELLEUSE DE TYPE 7 : MODÉLISATION CHEZ LA DROSOPHILE ET ÉTUDE IN VITRO D’UNE VOIE D’INTÉRÊT THÉRAPEUTIQUE VIA LES CLASTOSOMES
Soutenu le 28 septembre 2007 devant le jury suivant :
Pr. MIGNOTTE Bernard, Président du jury.
Dr. VERDIER Jean-Michel, directeur d’Etudes EPHE.
Dr. LECOURTOIS Magalie, rapporteur externe.
Dr. NABBOUT Rima, examinateur externe,
Dr. STEVANIN Giovanni, tuteur scientifique, examinateur.
Dr. SITTLER Annie, co-tuteur scientifique, examinateur.
Laboratoire de Vieillissement cérébral et pathogenèse des maladies neurodégénératives de l’EPHE, INSERM UMR 710, Montpellier.
Directeur : Dr.VERDIER Jean-Michel
Directeur d’Etudes : Jean-Michel.Verdier@univ-montp2.fr
Laboratoire de Neurologie et Thérapeutique Expérimentale, Equipe 1 : Génétique des maladies du système nerveux central (Pr. Alexis Brice), INSERM UMR 679, Paris.
Directeur : Dr. HIRSCH Etienne
Tuteur scientifique : stevanin@ccr.jussieu.fr
ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE
ATAXIE SPINOCÉRÉBELLEUSE DE TYPE 7 : MODÉLISATION CHEZ LA DROSOPHILE ET ÉTUDE IN VITRO D’UNE VOIE D’INTÉRÊT THÉRAPEUTIQUE VIA LES CLASTOSOMES
MARTIN Elodie
Le 28 Septembre 2007
RESUME
L’ataxie spinocérébelleuse de type 7 (SCA7) est une pathologie neurodégénérative autosomique dominante causée par une expansion de répétition de triplets codants CAG, donnant lieu à une expansion de polyglutamine (polyQ) dans la protéine ataxine 7 (Atxn7). L’ataxie SCA7 appartient au groupe des maladies à
ansions de glutamines qui compte également, la maladie de Huntington (MH), la maladie de Kennedy (SMBA) et 6 autres ataxies spinocérébelleuses [SCA1, 2, 3, 6 et 17 ainsi que l’atrophie dentato-rubro-pallidoluysienne (DRPLA)].
Dans toutes ces pathologies, l’expansion de polyQ confère des propriétés toxiques aux protéines qui s’accumulent de façon aberrantes dans les neurones et forment des inclusions neuronales intranucléaires (NIIs). Ces NIIs représentent une des caractéristiques majeures de ces affections et semblent être une des clés
la compréhension de la physiopathologie dans ses maladies sans toutefois en être la cause princeps.
L’ataxie SCA7 représente un bon modèle d’étude des maladies à polyQ en raison de la sévérité de la pathologie même pour des répétitions de taille modérée, facilitant ainsi sa modélisation. De plus, les lésions neuropathologiques concernent plusieurs régions cérébrales, rendant possible l’exploration des spécificités
atteinte dans cette affection. Enfin, l’absence de ressources thérapeutiques dans ces maladies, et dans SCA7 en particulier, requiert des approches ciblées visant à identifier des voies d’intérêt thérapeutique.
Dans un premier temps, j’ai souhaité participer à l’élaboration de modèles d’étude simples de l’ataxie SCA7 dans le but de dégager des cibles pour de futurs essais thérapeutiques. La Drosophile s’est avérée être le modèle de choix pour une telle approche. Nous avons donc généré un modèle de Drosophile exprimant
forme d’Atxn7 tronquée de façon pan neuronale. L’originalité du modèle, en comparaison avec d’autres modèles polyQ, était la nature inductible et ciblée au système nerveux adulte de cette expression. Ce modèle reproduit les caractéristiques majeures de la pathologie humaine: une accumulation de la protéine
ologique sous forme de NIIs dans les neurones, une très faible mort neuronale suggérant un dysfonctionnement neuronal à l’origine du phénotype, et une diminution progressive de l’activité locomotrice en relation avec une diminution de la durée de vie des mouches. Nous avons également mis en évidence une
rsibilité possible du phénotype par arrêt de l’expression de la protéine mutante accompagnée d’une désagrégation des NIIs, ce qui suggère ainsi que cette pathologie pourrait répondre à un traitement. Enfin, ce modèle nous a permis de réaliser un premier crible de gènes modificateurs basés sur la longévité des mouches
nsi d’identifier comme modulateurs des gènes impliqués dans d’autres pathologies à polyQ, mais aussi, et pour la première fois, des gènes spécifiques à l’ataxie SCA7. Ce modèle est donc pertinent pour rechercher d’autres gènes modulateurs du phénotype et ainsi dégager des pistes pour mieux comprendre cette
ologie.
D’autre part, du fait de la réversibilité possible du phénotype SCA7 observé chez les mouches, je me suis également intéressée à un partenaire de l’Atxn7, mais aussi d’autres protéines à polyQ, la protéine PML (promyelocytic leukaemia protein) comme cible thérapeutique. En effet, PML est le composant majeur des
s nucléaires (CN) que nous avons montré fréquemment associés aux NIIs dans les pathologies à polyQ. Compte tenu du rôle potentiel des CNs dans la dégradation des protéines, nous avons montré in vitro que l’isoforme IV de PML conduisait à la formation de CNs enrichis en protéines de la voie
uitine/protéasome, les clastosomes, et qu’elle était capable de recruter l’Atxn7 mutante ou sauvage afin d’entraîner sa dégradation via la protéasome, prévenant ainsi la formation des agrégats. Le béta-interféron, qui stimule l’expression de PML IV, permet également de prévenir l’accumulation de la protéine mutée et
mente également sa dégradation.
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Les deux approches auxquelles j’ai participé, in vivo et in vitro, nous ont ainsi permis de mettre en évidence des voies d’intérêt pour l’étude de la pathogénèse de l’ataxie SCA7, mais aussi des autres pathologies à polyQ : les partenaires de l’Atxn7 et les clastosomes.
TS-CLES : ataxie spinocérébelleuse de type 7, polyglutamine, ataxine 7, neurodégénérescence, Drosophile, béta-interféron, clastosomes, dégradation.
TABLE DES MATIERES
ABREVIATIONS 4
ADDIN EN.CITE Robitaille19977302730217Robitaille, Y.Lopes-
Cendes, I.Becher, M.Rouleau, G.Clark, A. W.The neuropathology of CAG repeat diseases: review and update of genetic and molecular featuresBrain
Pathol.901-
92673atrophyCAGcanadaclassificationDiseasegeneticshuntington's
diseasemuscular atrophyneurodegenerative diseasespathologyQuebec1997ROBITAILLE1997Zoghbi20009934993417Zoghbi, H.
Y.Orr, H. T.Glutamine repeats and neurodegenerationAnnu.Rev.Neurosci.217-
24723:ataxiaatrophyDiseaseexpansiongenesglutamineHuntington
Diseasemuscular atrophyneurodegenerative diseasesneuronspolyglutaminespinocerebellar ataxiaSpinocerebellar
Ataxias2000ZOGHBI2000(Robitaille et al., 1997; Zoghbi and Orr, 2000). Elle est causée par une expansion de polyQ dans le gène codant pour le
récepteur aux androgènes (AR). La maladie débute entre 20 et 50 ans par des crampes puis par une faiblesse musculaire, des troubles de l’élocution (dysarthrie), des fasciculations et une dysphagie, et peut s'accompagner d'une perte partielle des caractères sexuels secondaires. Les femmes
hétérozygotes sont généralement asymptomatiques. Cependant, la maladie ne modifie généralement pas l’espérance de vie des patients.
II. La maladie de Huntington
La maladie de Huntington (MH) est la plus fréquente des affections à polyQ, touchant moins de 1 personne sur 5 000 en France. La forme majoritaire (95%) est due à une expansion de glutamines dans l’exon 1 du gène codant pour la protéine huntingtine (htt). Cette maladie se transmet
selon le mode autosomique dominant et touche indistinctement les hommes et les femmes. Elle se manifeste en général chez l'adulte entre 30 et 50 ans. Cependant, il existe des formes dites juvéniles qui débutent avant 20 ans. Elle se caractérise par des troubles progressifs du caractère ou du
comportement (irritabilité ou syndrome dépressif) qui initient souvent la maladie, par des troubles cognitifs (déficit attentionnel) et surtout des mouvements brusques, involontaires et saccadés que l’on dit "choréiques" et qui ont valu à cette maladie le surnom de "danse de Saint-Guy" au cours du
19ème siècle. L'évolution de ces troubles entraîne des chutes, des troubles de la déglutition, une dysarthrie et l’apparition d’une démence ainsi qu’une perte d'autonomie débouchant sur un état grabataire et un pronostic fatal en 15 à 20 ans. L’examen neuropathologique révèle une perte neuronale
qui touche de manière prépondérante les neurones GABAergiques efférents du striatum, et qui est plus importante dans le noyau caudé que dans le putamen (Robitaille et al., 1997; Vonsattel et al., 1985). Dans les cas à début précoce, le cortex, l’hypothalamus et le cervelet (cellules de Purkinje)
sont souvent touchés (Vonsattel and DiFiglia, 1998), avec une atrophie du volume cérébral pouvant atteindre 20%.
III. Les ataxies cérébelleuses autosomiques dominantes
Les ADCA (ADCA pour Autosomal dominant cerebellar ataxia) constituent un vaste groupe de maladies neurodégénératives héréditaires cliniquement et génétiquement hétérogènes, dont la prévalence est d’environ 5/100 000 (Hirayama et al., 1994; Pratt and Pratt, 1967).
Bien qu’il existe des formes dues à des expansions non-codantes dans certains gènes (SCA10, SCA12) ou des mutations conventionnelles dans des gènes particulièrement exprimés dans les cellules de Purkinje (SCA5/SPTBN2 ; SCA13/KCNC3 ; SCA14/PRKCG), la grande majorité des
cas est expliquée par des expansions polyQ dans les gènes SCA1, 2, 3, 6/CACNA1A, 7, 17/TBP et DRPLA (Brice, 2007). Dernièrement, il a été montré que SCA8 pourrait aussi s’ajouter à ce groupe d'affections (Moseley et al., 2006; Paulson, 2006), mais cette maladie semble répondre à des
mécanismes plus complexes résultant de l'effet de la répétition CAG traduite en polyglutamine associé à l'effet de cette même répétition sur un autre transcrit inversé (répétition CTG non traduite).
Les différentes maladies de ce groupe, particulièrement celles dues à des expansions polyQ, présentent de nombreuses caractéristiques communes (Stevanin et al., 2000). Il s’agit dans tous les cas de neurodégénerescences progressives qui présentent une évolution fatale en 10 à 20 ans.
L'ataxie apparaît généralement vers la troisième ou la quatrième décennie. Elle se caractérise par un trouble de la coordination des mouvements dû à l'atteinte du cervelet et/ou de ses afférences et efférences (Greenfield, 1954; Koeppen, 1984). La direction et l'amplitude des mouvements volontaires
ainsi que les contractions musculaires nécessaires à l'équilibre et à la marche sont perturbées. L’ataxie s'accompagne généralement d'autres signes neurologiques, à l'origine d’une grande hétérogénéité clinique. La perte neuronale touche variablement les noyaux des nerfs crâniens bulboprotubérentiels,
les olives bulbaires, les noyaux gris centraux, les noyaux pontiques et mésencéphaliques, le cortex cérébelleux (cellules de Purkinje et cellules des grains) et les noyaux profonds du cervelet (Robitaille et al., 1997). Les lésions peuvent également toucher des fibres myélinisées telles
que les faisceaux ponto-cérébelleux (fibres moussues) et olivo-cérébelleux (fibres grimpantes), ainsi que dans la moelle, les cordons postérieurs, les faisceaux spino-cérébelleux et pyramidaux. La grande variabilité de l’atteinte peut aller d’une atrophie cérébello-olivaire pure à des profils plus
complexes où le pont et les noyaux gris centraux sont aussi touchés.
En 1981, Anita Harding a défini une classification clinique simple des ADCA en trois types (Harding, 1981) fondée à la fois sur leurs spécificités lésionnelles et sur les caractéristiques cliniques qui en résultent. Dans le type I, les signes suivants peuvent se rencontrer: syndrome pyramidal
et extrapyramidal, trouble de la sensibilité profonde, ophtalmoplégie, troubles cognitifs. Les lésions dégénératives peuvent toucher le nerf optique, les systèmes ponto-médullaires, les noyaux gris centraux, le cortex cérébral, le tractus spinal ou les nerfs périphériques. La maladie de Machado-
Joseph (MJD ou SCA3) fait partie de ce groupe. Le type II, associe constamment ces signes à une dégénérescence maculaire progressive qui conduit à la cécité. Il ne comprend pour l’instant que la forme SCA7. Enfin, dans le type III, le syndrome cérébelleux est pur, d’évolution lente et parfois
accompagné par des troubles de la sensibilité profonde.
B. Caractéristiques moléculaires des expansions trinucléotidiques CAG des maladies à polyglutamine et corrélations phénotype-génotype
La taille des répétitions varie d’un individu à l’autre et augmente au cours des générations successives, et plus particulièrement chez l’homme. L’évolution du nombre de répétitions et de leur structure suggère leurs sélections positivement au cours de l’évolution (Hardy and Orr, 2006).
Ainsi, une nouvelle classe de mutations dites dynamiques ou instables a été impliquée dans seize affections, incluant de nombreuses pathologies affectant le système nerveux. Il s’agit le plus souvent d’expansions de trinucléotides répétés, polymorphes dans la population, qui deviennent
pathogènes au-delà d'un seuil de répétitions, variable en fonction du gène considéré. De plus, le nombre de répétitions porté par l’allèle pathologique peut varier, souvent en augmentant, au cours de sa transmission à la descendance. Le profil d’atteinte varie aussi en fonction du gène, allant de
troubles développementaux comme dans le syndrome de l’X fragile à des troubles neurodégénératifs à début tardif comme pour la maladie de Huntington ou les ataxies héréditaires.
Ces mutations dynamiques sont de deux types (Cummings and Zoghbi, 2000) : 1) des expansions généralement de grande taille situées dans des régions non codantes de gènes qui comportent des motifs (CGG)n, (GCC)n, (CTG)n, (GAA)n, (CAG)n, observés dans le syndrome de l'X fragile
(FRAXA et FRAXE), la dystrophie myotonique de Steinert (DM), les ataxies cérébelleuses autosomiques dominantes SCA8 et SCA12 (SCA pour Spinocerebellar ataxia) et l'ataxie de Friedreich (FA). Les mécanismes physiopathologiques mis en jeu par les expansions non codantes sont
généralement des pertes de fonction, totales ou partielles, dues à une répression de l’expression du gène correspondant ;
2) des expansions de taille modérée de trinucléotides CAG ou GCG dans des régions codantes de gènes, qui ont pour conséquence des expansions de polyglutamine ou de polyalanine dans les protéines correspondantes, comme dans la maladie de Huntington (MH), le syndrome de Kennedy
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(SBMA), sept formes d’ataxies cérébelleuses autosomiques dominantes (SCA1, SCA2, SCA3, SCA6, SCA7, SCA17 et l'atrophie dentato-rubro-pallidoluysienne [DRPLA]) et la dystrophie musculaire oculo-pharyngée (OPMD).
A. Caractéristiques cliniques des différentes pathologies à polyglutamine
De façon intéressante, les 9 pathologies causées par des expansions de polyglutamines (polyQ), toutes de transmission autosomique dominante sauf la maladie de Kennedy qui est liée au chromosome X, sont essentiellement des pathologies neurodégénératives progressives. Les gènes
impliqués sont d’expression ubiquitaire sans lien évident entre eux, selon nos connaissances actuelles, qui sont encore limitées. Cependant les fonctions des protéines sont encore la plupart du temps assez mal connues et pourraient être impliquées dans les neurodégénérescences observées,
particulières à chacune de ces maladies.
I. L’atrophie musculaire spinobulbaire
L’atrophie musculaire spinobulbaire (SBMA pour spinal and bulbar musular atrophy) est aussi appelée maladie de Kennedy. C’est une maladie de transmission récessive liée au chromosome X qui est due à une perte sévère progressive des motoneurones au niveau de la corne antérieure
de la moelle épinière et des neurones moteurs du bulbe (Robitaille et al., 1997; Zoghbi and Orr, 2000). Elle est causée par une expansion de polyQ dans le gène codant pour le récepteur aux androgènes (AR). La maladie débute entre 20 et 50 ans par des crampes puis par une faiblesse musculaire,
des troubles de l’élocution (dysarthrie), des fasciculations et une dysphagie, et peut s'accompagner d'une perte partielle des caractères sexuels secondaires. Les femmes hétérozygotes sont généralement asymptomatiques. Cependant, la maladie ne modifie généralement pas l’espérance de vie des
patients.
(Dorsman et al., 2002; Kashi et al., 1997; Mar Alba et al., 1999). Cette sélection positive peut être liée au fait que les séquences de polyglutamine résultant de ces répétitions sont souvent retrouvées dans des protéines intervenant dans la régulation de la transcription (Robitaille et al., 1997; Vonsattel
et al., 1985). Dans les cas à début précoce, le cortex, l’hypothalamus et le cervelet (cellules de Purkinje) sont souvent touchés (Vonsattel and DiFiglia, 1998), avec une atrophie du volume cérébral pouvant atteindre 20%.
III. Les ataxies cérébelleuses autosomiques dominantes
Les ADCA (ADCA pour Autosomal dominant cerebellar ataxia) constituent un vaste groupe de maladies neurodégénératives héréditaires cliniquement et génétiquement hétérogènes, dont la prévalence est d’environ 5/100 000 (Hirayama et al., 1994; Pratt and Pratt, 1967).
Bien qu’il existe des formes dues à des expansions non-codantes dans certains gènes (SCA10, SCA12) ou des mutations conventionnelles dans des gènes particulièrement exprimés dans les cellules de Purkinje (SCA5/SPTBN2 ; SCA13/KCNC3 ; SCA14/PRKCG), la grande majorité des
cas est expliquée par des expansions polyQ dans les gènes SCA1, 2, 3, 6/CACNA1A, 7, 17/TBP et DRPLA (Brice, 2007). Dernièrement, il a été montré que SCA8 pourrait aussi s’ajouter à ce groupe d'affections (Moseley et al., 2006; Paulson, 2006), mais cette maladie semble répondre à des
mécanismes plus complexes résultant de l'effet de la répétition CAG traduite en polyglutamine associé à l'effet de cette même répétition sur un autre transcrit inversé (répétition CTG non traduite).
Les différentes maladies de ce groupe, particulièrement celles dues à des expansions polyQ, présentent de nombreuses caractéristiques communes (Stevanin et al., 2000). Il s’agit dans tous les cas de neurodégénerescences progressives qui présentent une évolution fatale en 10 à 20 ans.
L'ataxie apparaît généralement vers la troisième ou la quatrième décennie. Elle se caractérise par un trouble de la coordination des mouvements dû à l'atteinte du cervelet et/ou de ses afférences et efférences (Greenfield, 1954; Koeppen, 1984). La direction et l'amplitude des mouvements volontaires
ainsi que les contractions musculaires nécessaires à l'équilibre et à la marche sont perturbées. L’ataxie s'accompagne généralement d'autres signes neurologiques, à l'origine d’une grande hétérogénéité clinique. La perte neuronale touche variablement les noyaux des nerfs crâniens bulboprotubérentiels,
les olives bulbaires, les noyaux gris centraux, les noyaux pontiques et mésencéphaliques, le cortex cérébelleux (cellules de Purkinje et cellules des grains) et les noyaux profonds du cervelet (Robitaille et al., 1997). Les lésions peuvent également toucher des fibres myélinisées telles
que les faisceaux ponto-cérébelleux (fibres moussues) et olivo-cérébelleux (fibres grimpantes), ainsi que dans la moelle, les cordons postérieurs, les faisceaux spino-cérébelleux et pyramidaux. La grande variabilité de l’atteinte peut aller d’une atrophie cérébello-olivaire pure à des profils plus
complexes où le pont et les noyaux gris centraux sont aussi touchés.
En 1981, Anita Harding a défini une classification clinique simple des ADCA en trois types (Harding, 1981) fondée à la fois sur leurs spécificités lésionnelles et sur les caractéristiques cliniques qui en résultent. Dans le type I, les signes suivants peuvent se rencontrer: syndrome pyramidal
et extrapyramidal, trouble de la sensibilité profonde, ophtalmoplégie, troubles cognitifs. Les lésions dégénératives peuvent toucher le nerf optique, les systèmes ponto-médullaires, les noyaux gris centraux, le cortex cérébral, le tractus spinal ou les nerfs périphériques. La maladie de Machado-
Joseph (MJD ou SCA3) fait partie de ce groupe. Le type II, associe constamment ces signes à une dégénérescence maculaire progressive qui conduit à la cécité. Il ne comprend pour l’instant que la forme SCA7. Enfin, dans le type III, le syndrome cérébelleux est pur, d’évolution lente et parfois
accompagné par des troubles de la sensibilité profonde.
(Katti et al., 2000) où les domaines polyglutamine sont connus pour avoir un rôle transactivateur (Escher et al., 2000; Gerber et al., 1994).
La tendance des répétitions à croître en taille au cours des générations successives et l’existence d’une corrélation négative entre l’âge de début et le nombre de nucléotides répétés , conduit à un phénomène d'anticipation, c'est-à-dire une diminution de l'âge de début de la maladie.
L'anticipation se voit surtout au cours de transmissions paternelles à cause du nombre important de divisions des cellules de la lignée germinale masculine, l'ovogenèse ne comptant qu’un nombre limité de divisions au cours de l’embryogenèse. Selon des études chez la souris, la taille des
expansions transmises augmente avec l’âge paternel, suggérant que l'instabilité est liée à des erreurs de réplication et/ou de réparation pendant les étapes de divisions pré méiotiques des cellules germinales (Dorsman et al., 2002; Kashi et al., 1997; Mar Alba et al., 1999). Cette sélection positive peut
être liée au fait que les séquences de polyglutamine résultant de ces répétitions sont souvent retrouvées dans des protéines intervenant dans la régulation de la transcription (Katti et al., 2000) où les domaines polyglutamine sont connus pour avoir un rôle transactivateur (Escher et al., 2000; Gerber
et al., 1994).
La tendance des répétitions à croître en taille au cours des générations successives et l’existence d’une corrélation négative entre l’âge de début et le nombre de nucléotides répétés , conduit à un phénomène d'anticipation, c'est-à-dire une diminution de l'âge de début de la maladie.
L'anticipation se voit surtout au cours de transmissions paternelles à cause du nombre important de divisions des cellules de la lignée germinale masculine, l'ovogenèse ne comptant qu’un nombre limité de divisions au cours de l’embryogenèse. Selon des études chez la souris, la taille des
expansions transmises augmente avec l’âge paternel, suggérant que l'instabilité est liée à des erreurs de réplication et/ou de réparation pendant les étapes de divisions pré méiotiques des cellules germinales (Mangiarini et al., 1997; Savouret et al., 2003; Savouret et al., 2004; Zhang et al., 2002b).
Cette instabilité liée à l'âge à la conception a également été mise en évidence chez les patients atteints de maladie de Huntington (Goldberg et al., 1993).
C. Mécanismes pathogènes dans les maladies à polyglutamine
Deux hypothèses majeures, pouvant-être liées entre elles, ont été émises pour expliquer le rôle des expansions de polyglutamine dans la pathogenèse : un gain de fonction de la protéine mutée peut-être dû à une modification de la conformation native de la protéine et entraîner la
formation d’inclusions intranucléaires (NIIs pour neuronal intranuclear inclusions) et des interactions anormales.
I. Le gain de fonction
Des études chez l'homme et dans des modèles expérimentaux ont démontré la causalité d’un gain de fonction to;keyword>MiceMice, Inbred C57BLMice, KnockoutMice,
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TransgenicMosaicismMutS Homolog 2 ProteinMyotonic Dystrophy/genetics/metabolismProtein-Serine-Threonine Kinases/*geneticsProto-Oncogene
Proteins/deficiency/genetics/*metabolismSpermatogenesis/geneticsSpermatogonia/*metabolism*Trinucleotide Repeat Expansion2004Jan0270-7306 (Print)14701736http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=14701736 eng(Mangiarini
et al., 1997; Savouret et al., 2003; Savouret et al., 2004; Zhang et al., 2002b). Cette instabilité liée à l'âge à la conception a également été mise en évidence chez les patients atteints de maladie de Huntington (Goldberg
et al., 1993).
C. Mécanismes pathogènes dans les maladies à polyglutamine
Deux hypothèses majeures, pouvant-être liées entre elles, ont été émises pour expliquer le rôle des expansions de polyglutamine dans la pathogenèse : un gain de fonction de la protéine mutée peut-être dû à une modification de la conformation native de la protéine et entraîner la
formation d’inclusions intranucléaires (NIIs pour neuronal intranuclear inclusions) et des interactions anormales.
I. Le gain de fonction
Des études chez l'homme et dans des modèles expérimentaux ont démontré la causalité d’un gain de fonction toxique, dans les maladies à polyglutamine.
Chez l’homme :
- Ces maladies n’ont jamais été corrélées à des mutations non-sens ou faux-sens dans ces gènes, c'est-à-dire à des mutations affectant la fonction de la protéine. Par exemple, les patients qui présentent une diminution de 50% de l’expression de la huntingtine (protéine responsable de la
MH) par délétion d’un des allèles du gène IT15 (gène muté dans la MH) ne présentent pas le phénotype MH (Ambrose et al., 1994; Housman, 1995). De même, les patients atteints d’un syndrome du testicule féminisant présentent une perte totale de la fonction du récepteur aux androgènes (AR),
mais pas de phénotype neurologique (Quigley et al., 1992). Chez les patients SBMA, une perte partielle de la fonction du gène AR explique la gynécomastie et la fertilité réduite, mais ne rend pas compte de la perte neuronale sélective des motoneurones observée dans cette affection (Robitaille et
al., 1997).
- Les patients homozygotes pour la mutation de type expansion de polyQ dans le gène IT15, bien que présentant une évolution plus rapide (Squitieri et al., 2003), n’ont pas un phénotype plus sévère que les porteurs hétérozygotes avec des nombres de répétitions comparables (Durr et al.,
1999; Myers et al., 1989; Wexler et al., 1987), suggérant qu’une seule copie mutée suffit à être toxique. Cependant, cela reste débattu dans le cas des ataxies dominantes SCA3, SCA6 et DRPLA (Matsumura et al., 1997; Sato et al., 1995; Sobue et al., 1996).
Et dans les modèles animaux :
- Chez la souris, l’inactivation (« knock out » ou KO) de l'homologue murin du gène IT15 ou du gène SCA1 présentent un phénotype soit létal embryonnaire soit cognitif modéré, respectivement (Ambrose et al., 1994; Housman, 1995). De même, les patients atteints d’un syndrome du
testicule féminisant présentent une perte totale de la fonction du récepteur aux androgènes (AR), mais pas de phénotype neurologique (Duyao et al., 1995; Matilla et al., 1998; Nasir et al., 1995; Zeitlin et al., 1995) mais aucun phénotype neurologique semblable à ceux que l’on observe chez les
souris portant une expansion CAG dans ces mêmes gènes (Mangiarini et al., 1996; Orr et al., 1993). De façon interessante, la surexpression de la htt mutée chez le KO htt restaure la viabilité des animaux, suggérant que la forme mutée de la htt remplit donc au moins partiellement la(les)
fonction(s) normale(s) de la htt sauvage (Hodgson et al., 1996).
- Des résultats concordants obtenus dans deux modèles transgéniques SBMA, un modèle souris (Katsuno et al., 2002) et un modèle Drosophile (Takeyama et al., 2002), montrent que seule la relocalisation nucléaire du AR mutant (provoquée par la liaison avec la testostérone ou un agoniste)
est nécessaire à l’apparition du phénotype. La conservation ou la non-conservation de son activité transcriptionnelle n’ayant, elle, pas d’impact.
- L’insertion d’une expansion de polyglutamine dans une protéine de ménage (Ordway et al., 1997) et sa sur-expression dans un modèle murin provoque un phénotype neurologique progressif et fatal avec des stigmates neuropathologiques semblables à ceux des pathologies à polyQ
(formation d’agrégats nucléaires, voir ci-après).
L’ensemble de ces éléments permet de conclure que la mutation, sans exclure une perte partielle de fonction, confère un gain de fonction toxique aux protéines qui pourrait intervenir au niveau protéique, la toxicité de la protéine mutée augmentant avec la longueur de la polyglutamine.
Cette toxicité a d’abord été observée in vitro, et les modèles cellulaires et animaux ont corroboré ces résultats.
II. La perte de fonction
Bien qu’un gain de fonction toxique soit clairement impliqué dans certains aspects de la pathogénèse, notamment, la formation des inclusions, une contribution de la fonction des protéines normales est débattue.
Dans le cas de la MH, l’inactivation conditionnelle de l’homologue murin du gène IT15 (Hdh), chez l’adulte, conduit à une neurodégénéresence progressive suggérant un rôle de la htt normale dans la survie neuronale (Dragatsis et al., 2000). De plus, il a été mis en évidence une activité
anti-apoptotique de la protéine sauvage qui devient pro-apoptotique en présence d’une expansion de polyQ (Cattaneo et al., 2001). Ainsi, une perte de fonction partielle de la htt, via sa fonction de régulation de l’expression du BDNF, pourrait expliquer la vulnérabilité préférentielle des neurones
striataux dans cette maladie . Chez les patients SBMA, une perte partielle de la fonction du gène AR explique la gynécomastie et la fertilité réduite, mais ne rend pas compte de la perte neuronale sélective des motoneurones observée dans cette affection (Robitaille et al., 1997).
- Les patients homozygotes pour la mutation de type expansion de polyQ dans le gène IT15, bien que présentant une évolution plus rapide (Squitieri et al., 2003), n’ont pas un phénotype plus sévère que les porteurs hétérozygotes avec des nombres de répétitions comparables (Zuccato et al.,
2001; Zuccato et al., 2003). En effet, le BDNF est un facteur neurotrophique produit par les neurones corticaux et nécessaire à la survie des neurones striataux dont l’expression est augmentée par la htt normale et se trouve diminuée dans le cerveau des patients.
De même, dans les ataxies SCA7 et SCA1, l’expansion de polyQ semble perturber la fonction des complexes protéiques auxquels l’ataxine 7 et l’ataxine 1 appartiennent (Lam et al., 2006; Palhan et al., 2005).
III. Les inclusions
1) Caractéristiques neuropathologiques
L’agrégation et le dépôt de protéines mal repliées est un phénomène observé dans de nombreuses maladies neurodégénératives (Hardy and Orr, 2006). Dans le cas des pathologies à polyQ, les inclusions se présentent sous la forme d’agrégats ronds, insolubles, d’environ 1 à 2 µm de
diamètre, clairement distinctes du nucléole et excluant la chromatine (SCA6 faisant exception, car la protéine mutée est détectée dans des agrégats péri-nucléaires) (Ishikawa et al., 1999). Ces inclusions contiennent la protéine pathologique et sont toutes reconnues par l’anticorps 1C2 (Stevanin et
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al., 1996; Trottier et al., 1995), spécifique des expansions de polyglutamine et suggérant un changement de conformation de la protéine pathologique. Elles sont également marquées par des anticorps dirigés contre l’ubiquitine, suggérant qu’elles contiennent des protéines destinées à être
dégradées.
2) Composition des inclusions (NIIs)
Les inclusions contiennent également de nombreuses protéines indispensables au bon fonctionnement de la cellule, telles des facteurs de transcription et des co-activateurs et des o-répresseurs du complexe d’initiation de la transcription. On retrouve également séquestré, des protéines
appartenant à la voie ubiquitine/protéasome ou des protéines chaperons (Durr et al., 1999; Myers et al., 1989; Wexler et al., 1987), suggérant qu’une seule copie mutée suffit à être toxique. Cependant, cela reste débattu dans le cas des ataxies dominantes SCA3, SCA6 et DRPLA (Matsumura et al.,
1997; Sato et al., 1995; Sobue et al., 1996).
(Abel et al., 2001; Chai et al., 1999; Cummings et al., 1998; Schmidt et al., 2002; Stenoien et al., 1999). Là encore, ce recrutement milite en faveur d’une conformation anormale de ces protéines.
3) Mécanismes de formation des inclusions
En 1994, Max Perutz et al. avaient observé que les répétitions polyQ s’associaient pour former des brins β reliés par des ponts hydrogènes qu’ils ont appelé « polar zippers » (Perutz et al., 1994). L’analyse de ces structures par microscopie électronique et diagramme aux rayons X montre
qu’elles correspondent à des feuillets β enroulés en cylindre de 20 résidus glutamine par tour d’hélice (Perutz et al., 2002). Ces structures nécessitent un « noyau » d’au moins 2 tours pour être stables, soit une quarantaine de glutamines, ce qui correspond précisément au seuil pathologique de
taille d’expansions observées chez les patients sauf dans l’ataxie SCA6, qui, justement présente des différences majeures en terme d’agrégation. Ce modèle d’agrégation et de fibrillation semble donc bien rendre compte du phénomène observé in vivo (Scherzinger et al., 1999).
De plus, il a également été suggéré que les répétitions de glutamines pourraient être la cible de transglutaminases spécifiques dans certaines populations neuronales (Green, 1993). Les isoformes neuronales de ces enzymes peuvent catalyser la formation de liaisons covalentes entre des
chaînes de glutamine et différents polypeptides ce qui conduit à la formation de complexes insoluble in vitro (Kahlem et al., 1996). Des résultats similaires ont été obtenus in vitro avec la huntingtine, l’atrophine-1 et le récepteur aux androgènes mutés (Kahlem et al., 1998). De plus, des
inhibiteurs des transglutaminases ralentissent significativement la mort cellulaire et l’agrégation dans un modèle cellulaire de DRPLA (Duyao et al., 1995; Matilla et al., 1998; Nasir et al., 1995; Zeitlin et al., 1995) mais aucun phénotype neurologique semblable à ceux que l’on observe chez les
souris portant une expansion CAG dans ces mêmes gènes (Igarashi et al., 1998). Ces enzymes sont très exprimées dans le cerveau (Gilad and Varon, 1985; Kim et al., 1999b) et sont augmentées dans les cerveaux de patients Huntington (Karpuj et al., 1999; Lesort et al., 1999). De ce fait, il est
probable que ces enzymes participent à l’agrégation neuronale des protéines à polyglutamine.
4) NIIs : rôle ou conséquence dans la pathogénèse
Si au départ l’agrégation neuronale de ces protéines et la formation caractéristique de NIIs semblait un mécanisme très prometteur pour expliquer la toxicité des protéines mutantes mal conformées, le rôle des inclusions dans la pathogénèse reste encore très discuté (DiFiglia et al., 1997;
Scherzinger et al., 1997; Scherzinger et al., 1999; Skinner et al., 1997). Il a été montré que la formation d’inclusions n’est pas nécessaire au développement de la pathologie dans un modèle murin d’ataxie SCA1 (Klement et al., 1998) et qu’elle peut être dissociée de la mort cellulaire (Kim and Tanzi,
1998) ou même refléter un mécanisme protecteur dans la MH ou SCA1 (Mangiarini et al., 1996; Orr et al., 1993). De façon interessante, la surexpression de la htt mutée chez le KO htt restaure la viabilité des animaux, suggérant que la forme mutée de la htt remplit donc au moins partiellement
la(les) fonction(s) normale(s) de la htt sauvage (Hodgson et al., 1996).
- Des résultats concordants obtenus dans deux modèles transgéniques SBMA, un modèle souris (Katsuno et al., 2002) et un modèle Drosophile (Arrasate et al., 2004; Bowman et al., 2005; Lam et al., 2006; Saudou et al., 1998). Cependant, quel que soit le rôle des inclusions en elles-mêmes,
elles témoignent de la propriété d’agrégation de la protéine mutée, ce qui, en soi, reflète un gain de fonction anormale de la protéine via un changement de sa conformation native et une modification de ses capacités d’interaction.
Le recrutement de protéines au sein des NIIs s’accompagne parfois de la déplétion de certains acteurs cellulaires de la fraction soluble, comme c’est le cas pour la sous-unité S4 du protéasome chez les patients SCA7 (Matilla et al., 2001) ou du facteur de transcription CBP chez les patients
MH (Nucifora et al., 2001). Ainsi, même si le rôle des inclusions dans l’initiation du processus pathologique reste débattu, leur implication dans la progression de la maladie est fort probable.
D. Hypothèses physiopathologiques
Les différentes conséquences cellulaires de ces changements ont été massivement étudiées et caractérisées (au moins partiellement) depuis plus de 15 ans pour aboutir à l’identification de mécanismes clés de la pathogenèse des maladies à polyglutamine.
I. Accumulation de protéines et dérégulation du protéasome
Lorsque les protéines à polyQ s’accumulent pour former des inclusions, elles recrutent un certain nombre de protéines des voies ubiquitine/protéasome et des voies de réponse aux protéines mal conformées, comme l’ubiquitine, les sous-unités du protéasome et les chaperons moléculaires
(Takeyama et al., 2002), montrent que seule la relocalisation nucléaire du AR mutant (provoquée par la liaison avec la testostérone ou un agoniste) est nécessaire à l’apparition du phénotype. La conservation ou la non-conservation de son activité transcriptionnelle n’ayant, elle, pas d’impact.
- L’insertion d’une expansion de polyglutamine dans une protéine de ménage (Ordway et al., 1997) et sa sur-expression dans un modèle murin provoque un phénotype neurologique progressif et fatal avec des stigmates neuropathologiques semblables à ceux des pathologies à polyQ
(formation d’agrégats nucléaires, voir ci-après).
L’ensemble de ces éléments permet de conclure que la mutation, sans exclure une perte partielle de fonction, confère un gain de fonction toxique aux protéines qui pourrait intervenir au niveau protéique, la toxicité de la protéine mutée augmentant avec la longueur de la polyglutamine.
Cette toxicité a d’abord été observée in vitro, et les modèles cellulaires et animaux ont corroboré ces résultats.
II. La perte de fonction
Bien qu’un gain de fonction toxique soit clairement impliqué dans certains aspects de la pathogénèse, notamment, la formation des inclusions, une contribution de la fonction des protéines normales est débattue.
Dans le cas de la MH, l’inactivation conditionnelle de l’homologue murin du gène IT15 (Hdh), chez l’adulte, conduit à une neurodégénéresence progressive suggérant un rôle de la htt normale dans la survie neuronale (Dragatsis et al., 2000). De plus, il a été mis en évidence une activité
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anti-apoptotique de la protéine sauvage qui devient pro-apoptotique en présence d’une expansion de polyQ (Cattaneo et al., 2001). Ain;Trinucleotide Repeat Expansionultrastructure2001ABEL2001PM:11152658 Schmidt20027767776717Schmidt,
T.Lindenberg, K. S.Krebs, A.Schols, L.Laccone, F.Herms, J.Rechsteiner, M.Riess,
O.Landwehrmeyer, G. B.Department of Medical Genetics, University of Tubingen, GermanyProtein surveillance machinery in brains with spinocerebellar ataxia type 3: redistribution and
differential recruitment of 26S proteasome subunits and chaperones to neuronal intranuclear inclusionsAnnals.of.Neurology302-
310513adenosinetriphosphataseanalysisantibodiesataxiabraincell
nucleuscysteineCysteine EndopeptidasesEndopeptidasesfamilygeneticsgermanyHeat-Shock
ProteinsHumanHydrolasesimmunohistochemistryinclusion bodiesinclusionsmachado-joseph
diseasemetabolismMolecular ChaperonesMultienzyme Complexesnerve tissue proteinsneuronspeptide fragmentsPeptide
Hydrolasesponsproteinsspinocerebellar ataxiaSupport,Non-U.S.Gov'ttissue distributionubiquitinunited
states2002SCHMIDT2002PM:11891825 (Abel et al., 2001; Chai et al., 1999; Cummings et al., 1998; Schmidt et al., 2002;
Stenoien et al., 1999). Comme nous l’avons vu plus haut, ce recrutement indique ainsi une conformation anormale de la protéine.
Bien que débattu au départ, les études récentes ont montré que le protéasome est toujours actif malgré la présence de protéines à polyQ (Bowman et al., 2005; Kaytor et al., 2004; Michalik et al., 2004). Ceci indiquerait plutôt une tentative de la cellule pour éliminer une espèce protéique
toxique. Il a d’ailleurs été observé une augmentation de l’autophagie dans différents modèles de MH (Ravikumar et al., 2004). De même, l’augmentation de la clearance des protéines à polyglutamine (augmentation d’activité de l’ubiquitine/protéasome ou de l’autophagie) ou la stimulation d’un
repliement normal via la surexpression de chaperons semblent des stratégies thérapeutiques prometteuses (Zuccato et al., 2001; Zuccato et al., 2003). En effet, le BDNF est un facteur neurotrophique produit par les neurones corticaux et nécessaire à la survie des neurones striataux dont l’expression
est augmentée par la htt normale et se trouve diminuée dans le cerveau des patients.
De même, dans les ataxies SCA7 et SCA1, l’expansion de polyQ semble perturber la fonction des complexes protéiques auxquels l’ataxine 7 et l’ataxine 1 appartiennent (Lam et al., 2006; Palhan et al., 2005).
r>Benzer, S.Genetic suppression of polyglutamine toxicity in DrosophilaScienceScienceScience (New York, N.Y1837-18402875459amino acid sequenceanatomy
&ampAnimalanimals,transgeniccaliforniachemistrycloning,molecularcrosses,geneticDiseaseDisease
Models,AnimalDNA Transposable Elementsdrosophiladrosophila melanogasterembryologyExpressed Sequence TagsEyeeye
abnormalitiesFemalegenesgenes,insectgenes,suppressorgeneticsheatHeat-Shock
ProteinshistologyHumanMalemetabolismmolecular sequence datanerve degenerationneurodegenerative
diseasespeptidesPhenotypephysiologypolyglutamineproteinsrepetitive sequences,nucleic
acidretinaSupport,Non-U.S.Gov'tsupport,u.s.gov't,nonp.h.s.Support,U.S.Gov't,P.H.S.suppression,genetictoxicity2000KAZEMIESFARJANI2000Bailey200224824817Bailey, C. K.Andriola, I.
F.Kampinga, H. H.Merry, D. E.Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, Thomas Jefferson University, 208 Bluemle Life Sciences Building, 233 S. 10th Street, Philadelphia, PA 19107,
USAMolecular chaperones enhance the degradation of expanded polyglutamine repeat androgen receptor in a cellular model of spinal and bulbar muscular atrophyHuman.Molecular.Genetics515-
523115analysisandrogen receptoratrophyBiochemistryCAGCell
CultureDiseaseenglandexpansionfamilyHalf-LifeinclusionsMolecular Chaperonesmuscular
atrophyneurodegenerative diseasespharmacologypolyglutamineSBMAsolubilitytoxicityTrinucleotide Repeat
Expansion2002BAILEY2002PM:11875046 (Bailey et al., 2002; Carmichael et al., 2000; Chan et al., 2000; Janer et al.,
2006; Kazemi-Esfarjani and Benzer, 2000; Ravikumar et al., 2004; Warrick et al., 1999; Warrick et al., 2005).
II. Dérégulations des fonctions nucléaires
La localisation nucléaire de la protéine, notamment la htt et l’ataxine 1, sont des prérequis pour la pathogenèse (Klement et al., 1998; Saudou et al., 1998).
Bien que n’ayant pas d’homologie fonctionnelle, la plupart des protéines à polyglutamine sont impliquées dans la régulation de la transcription (Helmlinger et al., 2006). Ainsi, les protéines mutées dans la SBMA et SCA17, nommément le AR et TBP, sont des facteurs de transcription
connus (La Spada et al., 1991; Nakamura et al., 2001). Un rôle de régulation de la transcription a aussi été identifié pour la htt et l’ataxine 3 (mutée dans SCA3) (Li et al., 2002; Zuccato et al., 2003) ainsi que pour l’atrophine 1 (mutée dans DRPLA) (Zhang et al., 2002a). Enfin, l’ataxine 7 (mutée
dans SCA7) et l’ataxine 1 (mutée dans SCA1) ont récemment été identifiées comme composants de complexes régulateurs de la transcription (Hardy and Orr, 2006). Dans le cas des pathologies à polyQ, les inclusions se présentent sous la forme d’agrégats ronds, insolubles, d’environ 1 à 2 µm de
diamètre, clairement distinctes du nucléole et excluant la chromatine (SCA6 faisant exception, car la protéine mutée est détectée dans des agrégats péri-nucléaires) (Ishikawa et al., 1999). Ces inclusions contiennent la protéine pathologique et sont toutes reconnues par l’anticorps 1C2 (Stevanin et
al., 1996; Trottier et al., 1995), spécifique des expansions de polyglutamine et suggérant un changement de conformation de la protéine pathologique. Elles sont également marquées par des anticorps dirigés contre l’ubiquitine, suggérant qu’elles contiennent des protéines destinées à être
dégradées.
2) Composition des inclusions (NIIs)
Les inclusions contiennent également de nombreuses protéines indispensables au bon fonctionnement de la cellule, telles des facteurs de transcription et des co-activateurs et des o-répresseurs du complexe d’initiation de la transcription. On retrouve également séquestré, des protéines
appartenant à la voie ubiquitine/protéasome ou des protéines chaperons (Helmlinger et al., 2004; Lam et al., 2006; Serra et al., 2006; Tsai et al., 2004). Il faut noter que de nombreuses dérégulations transcriptionelles ont été observées précocement dans des modèles animaux et chez des patients
atteints de MH, SCA1, DRPLA et SCA7, en général avant l’apparition des symptômes, des NIIs et de la dégénérescence neuronale (Abou-Sleymane et al., 2006; Cha et al., 1998; La Spada et al., 2001; Lin et al., 2000; Luthi-Carter et al., 2000). De plus, le recrutement et la séquestration de nombreux
autres facteurs de transcription dans les NIIs perturberait également la régulation transcriptionelle de nombreux gènes pouvant conduire à un dysfonctionnement neuronal et une dégénérescence (Cha, 2000; La Spada et al., 2001).
Il semblerait également que le métabolisme des ARN soit altéré dans ces pathologies à polyQ. En effet, l’ataxine 2, par exemple, interagit avec une protéine impliquée dans l’épissage : l’A2BP1 (pour ataxin 2 binding protein 1) (Shibata et al., 2000). De plus, les expansions
trinucléotidiques transcrites, qu’elles soient traduites ou non, ont la propriété de former des épingles à cheveux au niveau ARN, capables de recruter des protéines de liaison aux ARN doubles brins (Sobczak et al., 2003). Ces structures secondaires de l’ARN peuvent provoquer une perturbation
délétère de l’épissage et du traitement de certains ARN cellulaires (Peel et al., 2001).
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II. Dérégulations de fonctions cytoplasmiques
Bien que l’action neurotoxique de ces protéines soit principalement nucléaire, ces protéines sont d’abord synthétisées dans le cytoplasme avant d’être exportées vers le noyau quand elles sont mutantes.
1) Modifications post-traductionnelles
La toxicité des protéines à polyQ peut nécessiter une modification post-traductionnelle telle qu’une phospholylation, via Akt, dans le cas de l’ataxine 1 (Emamian et al., 2003). D’autre part, la relocalisation nucléaire des protéines à polyQ fait souvent intervenir un clivage protéolytique,
notamment parce que les formes entières de ces protéines (> 40kD) sont trop grandes pour pouvoir entrer passivement dans le noyau (Goldfarb et al., 1986; Goldfarb et al., 1996). Ceci a en effet été mis en évidence dans le cas de la MH (DiFiglia et al., 1997) et SCA3 (Paulson et al., 1997b) ainsi
que dans la SBMA, la DRPLA, SCA2 et SCA7 (Tarlac and Storey, 2003). Dans ces maladies, la présence d’une forme tronquée de la protéine semble très fortement liée à la translocation de la protéine dans le noyau (Abel et al., 2001; Chai et al., 1999; Cummings et al., 1998; Schmidt et al., 2002;
Stenoien et al., 1999). Là encore, ce recrutement milite en faveur d’une conformation anormale de ces protéines.
3) Mécanismes de formation des inclusions
En 1994, Max Perutz et al. avaient observé que les répétitions polyQ s’associaient pour former des brins β reliés par des ponts hydrogènes qu’ils ont appelé « polar zippers » (Perutz et al., 1994). L’analyse de ces structures par microscopie électronique et diagramme aux rayons X montre
qu’elles correspondent à des feuillets β enroulés en cylindre de 20 résidus glutamine par tour d’hélice (Perutz et al., 2002). Ces structures nécessitent un « noyau » d’au moins 2 tours pour être stables, soit une quarantaine de glutamines, ce qui correspond précisément au seuil pathologique de
taille d’expansions observées chez les patients sauf dans l’ataxie SCA6, qui, justement présente des différences majeures en terme d’agrégation. Ce modèle d’agrégation et de fibrillation semble donc bien rendre compte du phénomène observé in vivo (Scherzinger et al., 1999).
De plus, il a également été suggéré que les répétitions de glutamines pourraient être la cible de transglutaminases spécifiques dans certaines populations neuronales (Green, 1993). Les isoformes neuronales de ces enzymes peuvent catalyser la formation de liaisons covalentes entre des
chaînes de glutamine et différents polypeptides ce qui conduit à la formation de complexes insoluble in vitro (Kahlem et al., 1996). Des résultats similaires ont été obtenus in vitro avec la huntingtine, l’atrophine-1 et le récepteur aux androgènes mutés (Paulson et al., 1997a; Paulson et al., 1997b)
et à la toxicité (Ellerby et al., 1999a; Ellerby et al., 1999b; Paulson et al., 1997a; Paulson et al., 1997b; Warrick et al., 1998). Ces formes clivées seraient obtenues suite à l’action de caspases activées que l’on retrouve dans les NIIs (Sanchez et al., 1999; Zander et al., 2001) et dont ces protéines à
polyglutamine sont des substrats (Wellington et al., 1998). En revanche, l’ataxine 1 et TBP, toutes deux nucléaires, ne semblent pas clivées par les caspases (Ellerby et al., 1999b; Wellington and Hayden, 2000).
Ainsi, le blocage des voies apoptotiques et en particulier des caspases activées a démontré une certaine efficacité de neuroprotection dans les maladies à polyglutamine in vitro (Kahlem et al., 1998). De plus, des inhibiteurs des transglutaminases ralentissent significativement la mort
cellulaire et l’agrégation dans un modèle cellulaire de DRPLA (Igarashi et al., 1998). Ces enzymes sont très exprimées dans le cerveau (Wellington et al., 2000) et in vivo chez la Drosophile (Warrick et al., 1998) et la souris (Chen et al., 2000; Kim et al., 1999a). Cependant, l’apoptose étant un
évènement tardif de la dysfonction cellulaire, l’inhibition du clivage protéique pourrait s’avérer d’un intérêt thérapeutique limité dans ces maladies.
2) Dysfonctions mitochondriales
Des dysfonctions mitochondriales et des anomalies du métabolisme énergétique ont été mises en évidence très tôt dans les maladies à polyglutamine. Ainsi, il a été observé une réduction du métabolisme du glucose et de l’activité des complexes mitochondriaux ainsi qu’une élévation du
niveau de lactate chez les patients atteints de MH (Browne et al., 1997; Gu et al., 1996). Ces anomalies métaboliques sont d’ailleurs observées très précocement chez les individus porteurs de la htt mutée, plusieurs années avant l’apparition des symptômes (Antonini et al., 1996; Feigin et al., 2001).
Ces défauts métaboliques et ces atteintes mitochondriales semblent partagées par les autres maladies à polyglutamine comme SCA1, SCA2 et SCA3 (Mastrogiacomo et al., 1996; Matsuishi et al., 1996). De plus, l’absorption de composés stimulant le métabolisme énergétique, tels le coenzyme Q10
ou la créatine se sont révélés protecteurs dans des modèles murins de MH et de SCA1 (Gilad and Varon, 1985; Kim et al., 1999b) et sont augmentées dans les cerveaux de patients Huntington (Karpuj et al., 1999; Lesort et al., 1999). De ce fait, il est probable que ces enzymes participent à
l’agrégation neuronale des protéines à polyglutamine.
4) NIIs : rôle ou conséquence dans la pathogénèse
Si au départ l’agrégation neuronale de ces protéines et la formation caractéristique de Nth-address>Geriatric Research Education and Clinical Center, Bedford Veterans Administration Medical Center, Bedford, Massachusetts 01730, USA. rjferr@bu.eduTherapeutic
effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington's diseaseJ NeurosciJ Neurosci1592-
9225Acetamides/*therapeutic useAdministration, OralAnimalsBehavior, Animal/drug effectsBody Weight/drug
effectsBrain/drug effects/pathologyCerebral Ventricles/drug effects/pathologyDisease Models, AnimalDisease ProgressionDrug Evaluation,
PreclinicalDrug SynergismFemaleHumansHuntington Disease/*drug therapy/genetics/pathologyMagnetic Resonance
ImagingMaleMiceMice, TransgenicMotor Activity/drug effectsNerve Tissue Proteins/geneticsNuclear Proteins/geneticsOrgan
Size/drug effectsSurvival RateTreatment OutcomeUbiquinone/*analogs & derivatives/*therapeutic use2002Mar 11529-2401
(Electronic)11880489http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=11880489 eng(Ferrante
et al., 2002; Ferrante et al., 2000). Cette atteinte mitochondriale pourrait participer à la neurotoxicité des polyQ. En effet, la déplétion en énergie entraîne des perturbations de l’homéostasie du calcium et du traffic
intracellulaire, deux processus clés de la préservation des neurones.
IV. Perturbation de la fonction normale des protéines
Comme nous l’avons vu plus haut, malgré un effet indéniable de l’expansion de polyQ dans la pathologie par gain de fonction toxique, une perte de fonction partielle de la protéine et/ou de son complexe protéique contribue certainement aux processus pathologiques (voir chapitre C. II.)
V. Bilan
Ces études nous permettent de dire que les cellules ne subissent pas passivement l’expression et l’action de protéines délétères mais réagissent activement pour essayer d’éliminer ces produits toxiques. Il semble ainsi que les NIIs résultent à la fois d’un mécanisme gain de fonction
intrinsèque aux protéines avec expansion de polyglutamine et d’un mécanisme cellulaire visant à re-conformer ces protéines correctement et/ou à les cibler vers des sites de dégradation. Reste une question d’équilibre entre d’un côté les effets délétères de ces agrégats qui encombrent la cellule et
attirent et séquestrent des composants cellulaires majeurs et d’un autre côté la protection cellulaire qui peut résulter de la concentration des protéines délétères au sein de « paquets» dans lesquels leurs interactions sont limitées et elles y sont dégradées.
De plus, les protéines mutantes semblent engendrer des dérégulations précoces au niveau cytoplasmique qui peuvent à long terme participer directement à la neurodégénérescence, notamment en altérant le métabolisme mitochondrial. Ces dérégulations primaires sont potentiellement à
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l’origine de la translocation des protéines mutantes vers le noyau, via l’action de protéases spécifiques comme les caspases, lorsque ces protéines ne sont pas naturellement nucléaires. Une fois ce passage dans le noyau réalisé, sans lequel ces protéines restent peu ou pas toxiques, elles entraînent
de nombreuses dérégulations transcriptionnelles. Celles-ci ont pour conséquence de renforcer les altérations cytoplasmiques et d’entraîner des perturbations cellulaires en cascade, causant de graves dysfonctions neuronales et aboutissant finalement à la mort de la cellule.
E. L’ataxie spinocérébelleuse de type 7 (SCA7)
Au cours de la préparation de mon diplôme EPHE, j’ai tenté d’apporter quelques compléments de réponse aux questions concernant les mécanismes physiopathologiques mis en jeu dans des pathologies à polyQ grâce à l’étude de modèles in vitro et in vivo de l’une ce ces maladies,
l’ataxie spinocérébelleuse de type 7 (SCA7).
I. Un bon modèle d’étude
L’ataxie SCA7 fait partie des maladies à polyQ (Stevanin et al., 1998). Parmi ces dernières, la plus étudiée est la MH, mais 7 des neufs maladies à polyglutamine actuellement identifiées sont des ataxies spinocérébelleuses (SCA1, 2, 3, 6, 7, 17 et DRPLA). SCA7 représente un modèle
d’étude intéressant car on y retrouve toutes les caractéristiques majeures de ces ataxies à polyglutamine et des maladies à polyglutamine en général.
Comme la plupart des ataxies spinocérébelleuses, les cibles principales atteintes dans SCA7 sont le cervelet, avec une perte massive des cellules de Purkinje, et le tronc cérébral (Michalik et al., 2004). Les lésions observées résultent le plus souvent d’une évolution lentement progressive
mais il a été rapporté des atteintes multisystémiques (notamment cardiaques) d’évolution rapide chez les cas infantiles (Benton et al., 1998; David et al., 1998; Whitney et al., 2007). L’ataxie SCA7 se distingue toutefois des autres ataxies à polyQ par la présence d’une atteinte de la rétine, se
traduisant pas une perte d’acuité visuelle pouvant entraîner la cécité des patients (Enevoldson et al., 1994; Gouw et al., 1994). Cette rétinopathie est due à une dégénérescence des photorécepteurs affectant tout d’abord les cônes puis les bâtonnets (Michalik et al., 2004).
II. Historique de l’identification du gène SCA7
Le gène SCA7 a été localisé sur le chromosome 3 en position 3p12-13 au sein de notre laboratoire (Benomar et al., 1995; David et al., 1996). Du fait de l’existence d’un phénomène d’anticipation très marqué dans les familles (Benomar et al., 1994), il a été très vite proposé que la mutation
en cause soit en fait une mutation dynamique. Deux techniques différentes ont permis de prouver cela: 1) d’une part la mise en évidence d’une protéine porteuse d’une longue séquence de polyglutamine reconnue par l’anticorps 1C2 chez les patients par rapport aux contrôles à partir d’extraits
protéiques de lymphoblastes et de cortex cérébral (Stevanin et al., 1996; Trottier et al., 1995); 2) et d’autre part, la mise en évidence de fragments génomiques CAG répétés de plus grande taille chez les patients que chez les contrôles par la technique Repeat Expansion Detection (Lindblad et al.,
1996). Le clonage du gène SCA7 a donc été réalisé en mettant cette connaissance à profit par la recherche de séquences CAG répétées dans l’ADN génomique de la région candidate en 3p. C’est ainsi qu’un ADNc nouveau, comportant un motif répété de 10 CAG, a pu être identifié. Ce motif
répété était allongé de plusieurs dizaines d’unités chez les patients (David et al., 1997).
III. Caractéristiques du gène SCA7 et de la protéine ataxine 7 (Atxn7)
Le gène SCA7 code pour la protéine ataxine 7 (892 acides aminés) qui est exprimée de façon ubiquitaire dans le cerveau ainsi que dans de nombreux tissus. Elle présente généralement une localisation nucléaire et cytoplasmique (Cancel et al., 2000) qui semble être régulée par les
différents sites de localisation nucléaire ou d’export nucléaire présents sur la séquence protéique.
Chez les patients, on observe une accumulation nucléaire de la protéine ainsi que la formation de NIIs (Cancel et al., 2000; Holmberg et al., 1998). La présence de ces NIIs n’est pas corrélée avec la perte neuronale alors que l’accumulation nucléaire l’est (Cancel et al., 2000; Holmberg et al.,
1998; Jonasson et al., 2002).
Cette accumulation nucléaire de l’ataxine 7 est peut-être régulée par le clivage de la protéine dont un fragment N-terminal a été décrit à plusieurs reprises dans des modèles murins et chez des patients (Garden et al., 2002; Yvert et al., 2000). La protéine présente notamment différents sites
de clivages par la caspase 7 (aux acides aminés 266 et 344) qui semblent pouvoir réguler la localisation et la cytotoxicité de cette protéine (Garden, 2006)(DiFiglia et al., 1997; Scherzinger et al., 1997; Scherzinger et al., 1999; Skinner et al., 1997). Il a été montré que la formation d’inclusions n’est
pas nécessaire au développement de la pathologie dans un modèle murin d’ataxie SCA1 (Klement et al., 1998) et qu’elle peut être dissociée de la mort cellulaire (Kim and Tanzi, 1998) ou même refléter un mécanisme protecteur dans la MH ou SCA1 .
1) La fonction de l’ataxine7
Comme plusieurs autres protéines à polyglutamine, l’ataxine 7 joue un rôle dans la régulation de la transcription. En effet, il a été montré en 2004 que l’ataxine 7 appartient aux complexes SAGA-like : TFTC (TATA-binding protein-free TAF-containing complex) et STAGA
(SPT3/TAF9/GCN5 acetyltransferase complex), impliqués dans l’acétylation des histones, l’épissage et la réparation de l’ADN (Helmlinger et al., 2004). La fonction précise de l’Atxn7 au sein de ces complexes n’est pas encore connue mais il semblerait qu’elle interagisse directement avec la
protéine acétyl-transférase GCN5 de ces complexes. L’ataxine-7 mutée paraît être responsable d’une dérégulation de l’acétylation des histones entraînant une modification du niveau de transcription de certains gènes (Helmlinger et al., 2006; Palhan et al., 2005; Strom et al., 2005). Une baisse de la
transcription des gènes rétiniens (Abou-Sleymane et al., 2006; Helmlinger et al., 2006; McMahon et al., 2005; Palhan et al., 2005) et de la transcription dépendante de CBP ou de RORα1 (Strom et al., 2005) sont ainsi observés. Cependant, l’altération de l’activité histone acétyl-transférase des
complexes semble variable (Helmlinger et al., 2006; McMahon et al., 2005) et l’activité normale de l’ataxine 7 native reste confuse entre une potentielle fonction activatrice (Arrasate et al., 2004; Bowman et al., 2005; Lam et al., 2006; Saudou et al., 1998). Cependant, quel que soit le rôle des
inclusions en elles-mêmes, elles témoignent de la propriété d’agrégation de la protéine mutée, ce qui, en soi, reflète un gain de fonction anormale de la protéine via un changement de sa conformation native et une modification de ses capacités d’interaction.
Le recrutement de protéines au sein des NIIs s’accompagne parfois de la déplétion de certains acteurs cellulaires de la fraction soluble, comme c’est le cas pour la sous-unité S4 du protéasome chez les patients SCA7 (Matilla et al., 2001) ou du facteur de transcription CBP chez les patients
MH (McMahon et al., 2005; Palhan et al., 2005) ou une fonction inhibitrice (Strom et al., 2005). La question d’un gain de fonction normale et/ou d’une perte de fonction partielle reste donc posée dans SCA7.
2) Les différents modèles expérimentaux
Toutes ces caractéristiques font de SCA7 un modèle très pertinent pour l’étude des maladies à polyglutamine. Ainsi, différents modèles in vitro et in vivo de cette maladie ont été mis au point, notamment dans notre équipe, pour tenter de comprendre les mécanismes physiopathologiques
impliqués dans SCA7.
F. Problématique et Objectifs
I. Modélisation chez la Drosophile comme outil de choix pour identifier des voies d’intérêt thérapeutique
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Les différents modèles déjà établis, bien qu’essentiels à la compréhension de la pathologie, ne permettent pas un criblage facile et rapide des voies d’intérêt thérapeutique. Nous avons donc généré un modèle Drosophile de l’ataxie SCA7, exprimant de façon inductible une forme tronquée
d’ataxine 7, normale ou mutante, dans tous les neurones du système nerveux afin de disséquer les mécanismes pathogènes de SCA7 de façon simple et systématique et d’identifier des gènes modulateurs du phénotype dans une visée thérapeutique.
Drosophila melanogaster est en effet un outil très puissant qui présente de nombreux avantages. En effet, environ 75% des loci liés à une pathologie chez l’homme ont au moins un homologue chez la Drosophile avec un très fort degré de conservation de la fonction des gènes (Cauchi and
van den Heuvel, 2006). Le cerveau de Drosophile est aussi un atout pour la modélisation de maladies neurodégénératives. Il compte environ 300,000 neurones qui sont organisés, comme pour les mammifères en zones de fonctions spécifiques, par exemple, la mémoire, l’olfaction, la vision.
D’autre part, l’existence d’une très grande collection de mutants permet la réalisation de cribles génétiques afin d’appréhender les mécanismes physiopathologiques mis en place. De plus, il s’agit d’un organisme facile d’entretien, qui possède un cycle de vie assez court. Il est également possible,
et de manière très simple grâce au système UAS/GAL4, de cibler l’expression du transgène d’intérêt de façon tissu spécifique dans l’œil, les muscles, les neurones ou de façon ubiquitaire.
Ainsi, la Drosophile s’est avérée être un très bon modèle pour l’étude des maladies neurodégénératives en général (Muqit and Feany, 2002; Zoghbi and Botas, 2002) et pour les maladies à polyQ en particulier (Jackson et al., 1998; Warrick et al., 1998).
En collaboration avec l’équipe d’Hervé Tricoire (CNRS UMR7592, Institut Jacques Monod,), nous avons donc généré un modèle drosophile SCA7 et comparé les voies pathogéniques identifiées dans les modèles déjà existants avec les voies impliquées dans notre modèle SCA7. Cette
démarche nous a permis de confirmer certains mécanismes généraux de la neurotoxicité des protéines à polyQ mais aussi de mettre en évidence des mécanismes spécifiques de SCA7. L’originalité de notre modèle a consisté à utiliser un système inductible permettant le ciblage au système
nerveux adulte uniquement afin de s’affranchir des problèmes développementaux propres à la Drosophile, et surtout nous permettant de tester la réversibilité du phénotype par arrêt de l’expression du transgène.
II. Etude d’une voie d’intérêt thérapeutique médiée par un interacteur de l’ataxine 7 : la protéine PML
Malgré l’expression ubiquitaire de l’ataxine 7, la dégénérescence ciblée de certaines structures suggère que des interactions spécifiques ont lieu dans ces structures. Ainsi, il a été montré que la protéine CAP (Cbl-associated protein) était recrutée dans les agrégats d’Atxn7 et jouerait un
rôle dans l’ubiquitylation de la protéine pathologique, et donc dans sa dégradation (Lebre et al., 2001). D’autre part, la protéine PML (promyelocytic leukemia protein) colocalise avec une partie des inclusions dans les cerveaux de patients atteints de maladies à polyglutamines, dont SCA7
(Takahashi et al., 2003; Takahashi et al., 2002). PML contient un domaine RING présent chez les enzymes E3 ubiquitine ligase, suggérant que PML puisse jouer un rôle dans l’ubiquitylation de protéines intranucléaires (Nucifora et al., 2001). Ainsi, même si le rôle des inclusions dans l’initiation du
processus pathologique reste débattu, leur implication dans la progression de la maladie est fort probable.
D. Hypothèses physiopathologiques
Les différentes conséquences cellulaires de ces changements ont été massivement étudiées et caractérisées (au moins partiellement) depuis plus de 15 ans pour aboutir à l’identification de mécanismes clés de la pathogenèse des maladies à polyglutamine.
I. Accumulation de protéines et dérégulation du protéasome
Lorsque les protéines à polyQ s’accumulent pour former des inclusions, elles recrutent un certain nombre de protéines des voies ubiquitine/protéasome et des voies de réponse aux protéines mal conformées, comme l’ubiquitine, les sous-unités du protéasome et les chaperons moléculaires
(Freemont, 2000; Jensen et al., 2001; Shiels et al., 2001). De plus, PML est l’un des composants majeurs des corps nucléaires (CNs) (Jensen et al., 2001). Ces structures sont décrites comme étant un lieu de stockage dans le noyau (Negorev and Maul, 2001) et semblent être impliquées la mort
cellulaire par apoptose et dans la régulation de la transcription (Borden, 2002; Woulfe, 2007). D’ailleurs, une sous-population de CNs, les clastosomes, qui sont enrichis en composants de la voie ubiquitine/protéasome ont été décrits comme un lieu potentiel de dégradation dans le noyau (Lafarga et
al., 2002). Grâce à l’utilisation de modèles in vitro, nous avons confirmé l’implication de PML et des clastosomes dans la dégradation de l’ataxine 7.
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1997;sinclusionsLameness,AnimalLightMaleMDmetabolismmicemice,inbred c57blmice,transgenicMolecular
Chaperonesmotor neuron diseasemuscular atrophyMuscular Disorders,Atrophicnerve degenerationNeurofilament
ProteinsneuronspathologypeptidesPhenotypephysiopathologypolyglutamineprionspromoter regions
(genetics)proteinsreceptors,androgenSBMAsequence deletionSupport,Non-
U.S.Gov'tSupport,U.S.Gov't,P.H.S.transcription,genetictransgenesTrinucleotide Repeat Expansionultrastructure2001ABEL2001PM:11152658
Schmidt20027767776717Schmidt, T.Lindenberg, K.
S.Krebs, A.Schols, L.Laccone, F.Herms, J.Rechsteiner, M.Riess, O.Landwehrmeyer, G. B.Department of Medical Genetics, University of Tubingen, GermanyProtein
surveillance machinery in brains with spinocerebellar ataxia type 3: redistribution and differential recruitment of 26S proteasome subunits and chaperones to neuronal intranuclear inclusionsAnnals.of.Neurology302-
310513adenosinetriphosphataseanalysisantibodiesataxiabraincell nucleuscysteineCysteine
EndopeptidasesEndopeptidasesfamilygeneticsgermanyHeat-Shock ProteinsHumanHydrolasesimmunohistochemistryinclusion
bodiesinclusionsmachado-joseph diseasemetabolismMolecular ChaperonesMultienzyme Complexesnerve tissue proteinsneuronspeptide
fragmentsPeptide Hydrolasesponsproteinsspinocerebellar ataxiaSupport,Non-U.S.Gov'ttissue distributionubiquitinunited
states2002SCHMIDT2002PM:11891825 (Abel et al., 2001; Chai et al., 1999; Cummings et al., 1998; Schmidt et al., 2002; Stenoien et al., 1999). Comme
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nous l’avons vu plus haut, ce recrutement indique ainsi une conformation anormale de la protéine.
Bien que débattu au départ, les études récentes ont montré que le protéasome est toujours actif malgré la présence de protéines à polyQ (Bowman et al., 2005; Kaytor et al., 2004; Michalik et al., 2004). Ceci indiquerait plutôt une tentative de la cellule pour éliminer une espèce protéique
toxique. Il a d’ailleurs été observé une augmentation de l’autophagie dans différents modèles de MH (Ravikumar et al., 2004). De même, l’augmentation de la clearance des protéines à polyglutamine (augmentation d’activité de l’ubiquitine/protéasome ou de l’autophagie) ou la stimulation d’un
repliement normal via la surexpression de chaperons semblent des stratégies thérapeutiques prometteuses
17Bailey, C. K.Andriola, I. F.Kampinga, H. H.Merry, D. E.Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, Thomas Jefferson
University, 208 Bluemle Life Sciences Building, 233 S. 10th Street, Philadelphia, PA 19107, USAMolecular chaperones enhance the degradation of expanded polyglutamine repeat androgen receptor in a cellular model of spinal and bulbar muscular
atrophyHuman.Molecular.Genetics515-523115analysisandrogen
receptoratrophyBiochemistryCAGCell CultureDiseaseenglandexpansionfamilyHalf-
LifeinclusionsMolecular Chaperonesmuscular atrophyneurodegenerative
diseasespharmacologypolyglutamineSBMAsolubilitytoxicityTrinucleotide Repeat
Expansion2002BAILEY2002PM:11875046 (Bailey et al., 2002; Carmichael et al., 2000; Chan et al., 2000; Janer et al.,
2006; Kazemi-Esfarjani and Benzer, 2000; Ravikumar et al., 2004; Warrick et al., 1999; Warrick et al., 2005).
II. Dérégulations des fonctions nucléaires
La localisation nucléaire de la protéine, notamment la htt et l’ataxine 1, sont des prérequis pour la pathogenèse (Klement et al., 1998; Saudou et al., 1998).
Bien que n’ayant pas d’homologie fonctionnelle, la plupart des protéines à polyglutamine sont impliquées dans la régulation de la transcription (Helmlinger et al., 2006). Ainsi, les protéines mutées dans la SBMA et SCA17, nommément le AR et TBP, sont des facteurs de transcription
connus (La Spada et al., 1991; Nakamura et al., 2001). Un rôle de régulation de la transcription a aussi été identifié pour la htt et l’ataxine 3 (mutée dans SCA3) (Li et al., 2002; Zuccato et al., 2003) ainsi que pour l’atrophine 1 (mutée dans DRPLA) (Zhang et al., 2002a). Enfin, l’ataxine 7 (mutée
dans SCA7) et l’ataxine 1 (mutée dans SCA1) ont récemment été identifiées comme composants de complexes régulateurs de la transcription (Helmlinger et al., 2004; Lam et al., 2006; Serra et al., 2006; Tsai et al., 2004). Il faut noter que de nombreuses dérégulations transcriptionelles ont été
observées précocement dans des modèles animaux et chez des patients atteints de MH, SCA1, DRPLA et SCA7, en général avant l’apparition des symptômes, des NIIs et de la dégénérescence neuronale (Abou-Sleymane et al., 2006; Cha et al., 1998; La Spada et al., 2001; Lin et al., 2000; Luthi-
Carter et al., 2000). De plus, le recrutement et la séquestration de nombreux autres facteurs de transcription dans les NIIs perturberait également la régulation transcriptionelle de nombreux gènes pouvant conduire à un dysfonctionnement neuronal et une dégénérescence (Cha, 2000; La Spada et al.,
2001).
Il semblerait également que le métabolisme des ARN soit altéré dans ces pathologies à polyQ. En effet, l’ataxine 2, par exemple, interagit avec une protéine impliquée dans l’épissage : l’A2BP1 (pour ataxin 2 binding protein 1) (Shibata et al., 2000). De plus, les expansions
trinucléotidiques transcrites, qu’elles soient traduites ou non, ont la propriété de former des épingles à cheveux au niveau ARN, capables de recruter des protéines de liaison aux ARN doubles brins (Sobczak et al., 2003). Ces structures secondaires de l’ARN peuvent provoquer une perturbation
délétère de l’épissage et du traitement de certains ARN cellulaires (Peel et al., 2001).
II. Dérégulations de fonctions cytoplasmiques
Bien que l’action neurotoxique de ces protéines soit principalement nucléaire, ces protéines sont d’abord synthétisées dans le cytoplasme avant d’être exportées vers le noyau quand elles sont mutantes.
1) Modifications post-traductionnelles
La toxicité des protéines à polyQ peut nécessiter une modification post-traductionnelle telle qu’une phospholylation, via Akt, dans le cas de l’ataxine 1 (Emamian et al., 2003). D’autre part, la relocalisation nucléaire des protéines à polyQ fait souvent intervenir un clivage protéolytique,
notamment parce que les formes entières de ces protéines (> 40kD) sont trop grandes pour pouvoir entrer passivement dans le noyau (Goldfarb et al., 1986; Goldfarb et al., 1996). Ceci a en effet été mis en évidence dans le cas de la MH (DiFiglia et al., 1997) et SCA3 (Paulson et al., 1997b) ainsi
que dans la SBMA, la DRPLA, SCA2 et SCA7 (Tarlac and Storey, 2003). Dans ces maladies, la présence d’une forme tronquée de la protéine semble très fortement liée à la translocation de la protéine dans le noyau (Paulson et al., 1997a; Paulson et al., 1997b) et à la toxicité (Ellerby et al., 1999a;
Ellerby et al., 1999b; Paulson et al., 1997a; Paulson et al., 1997b; Warrick et al., 1998). Ces formes clivées seraient obtenues suite à l’action de caspases activées que l’on retrouve dans les NIIs (Sanchez et al., 1999; Zander et al., 2001) et dont ces protéines à polyglutamine sont des substrats
(Wellington et al., 1998). En revanche, l’ataxine 1 et TBP, toutes deux nucléaires, ne semblent pas clivées par les caspases (Ellerby et al., 1999b; Wellington and Hayden, 2000).
Ainsi, le blocage des voies apoptotiques et en particulier des caspases activées a démontré une certaine efficacité de neuroprotection dans les maladies à polyglutamine in vitro (Wellington et al., 2000) et in vivo chez la Drosophile (Warrick et al., 1998) et la souris (Chen et al., 2000; Kim et
al., 1999a). Cependant, l’apoptose étant un évènement tardif de la dysfonction cellulaire, l’inhibition du clivage protéique pourrait s’avérer d’un intérêt thérapeutique limité dans ces maladies.
2) Dysfonctions mitochondriales
Des dysfonctions mitochondriales et des anomalies du métabolisme énergétique ont été mises en évidence très tôt dans les maladies à polyglutamine. Ainsi, il a été observé une réduction du métabolisme du glucose et de l’activité des complexes mitochondriaux ainsi qu’une élévation du
niveau de lactate chez les patients atteints de MH (Browne et al., 1997; Gu et al., 1996). Ces anomalies métaboliques sont d’ailleurs observées très précocement chez les individus porteurs de la htt mutée, plusieurs années avant l’apparition des symptômes (Antonini et al., 1996; Feigin et al., 2001).
Ces défauts métaboliques et ces atteintes mitochondriales semblent partagées par les autres maladies à polyglutamine comme SCA1, SCA2 et SCA3 (Mastrogiacomo et al., 1996; Matsuishi et al., 1996). De plus, l’absorption de composés stimulant le métabolisme énergétique, tels le coenzyme Q10
ou la créatine se sont révélés protecteurs dans des modèles murins de MH et de SCA1 (Ferrante et al., 2002; Ferrante et al., 2000). Cette atteinte mitochondriale pourrait participer à la neurotoxicité des polyQ. En effet, la déplétion en énergie entraîne des perturbations de l’homéostasie du calcium
et du traffic intracellulaire, deux processus clés de la préservation des neurones.
IV. Perturbation de la fonction normale des protéines
Comme nous l’avons vu plus haut, malgré un effet indéniable de l’expansion de polyQ dans la pathologie par gain de fonction toxique, une perte de fonction partielle de la protéine et/ou de son complexe protéique contribue certainement aux processus pathologiques (voir chapitre C. II.)
V. Bilan
Ces études nous permettent de dire que les cellules ne subissent pas passivement l’expression et l’action de protéines délétères mais réagissent activement pour essayer d’éliminer ces produits toxiques. Il semble ainsi que les NIIs résultent à la fois d’un mécanisme gain de fonction
intrinsèque aux protéines avec expansion de polyglutamine et d’un mécanisme cellulaire visant à re-conformer ces protéines correctement et/ou à les cibler vers des sites de dégradation. Reste une question d’équilibre entre d’un côté les effets délétères de ces agrégats qui encombrent la cellule et
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attirent et séquestrent des composants cellulaires majeurs et d’un autre côté la protection cellulaire qui peut résulter de la concentration des protéines délétères au sein de « paquets» dans lesquels leurs interactions sont limitées et elles y sont dégradées.
De plus, les protéines mutantes semblent engendrer des dérégulations précoces au niveau cytoplasmique qui peuvent à long terme participer directement à la neurodégénérescence, notamment en altérant le métabolisme mitochondrial. Ces dérégulations primaires sont potentiellement à
l’origine de la translocation des protéines mutantes vers le noyau, via l’action de protéases spécifiques comme les caspases, lorsque ces protéines ne sont pas naturellement nucléaires. Une fois ce passage dans le noyau réalisé, sans lequel ces protéines restent peu ou pas toxiques, elles entraînent
de nombreuses dérégulations transcriptionnelles. Celles-ci ont pour conséquence de renforcer les altérations cytoplasmiques et d’entraîner des perturbations cellulaires en cascade, causant de graves dysfonctions neuronales et aboutissant finalement à la mort de la cellule.
E. L’ataxie spinocérébelleuse de type 7 (SCA7)
Au cours de la préparation de mon diplôme EPHE, j’ai tenté d’apporter quelques compléments de réponse aux questions concernant les mécanismes physiopathologiques mis en jeu dans des pathologies à polyQ grâce à l’étude de modèles in vitro et in vivo de l’une ce ces maladies,
l’ataxie spinocérébelleuse de type 7 (SCA7).
I. Un bon modèle d’étude
L’ataxie SCA7 fait partie des maladies à polyQ (Stevanin et al., 1998). Parmi ces dernières, la plus étudiée est la MH, mais 7 des neufs maladies à polyglutamine actuellement identifiées sont des ataxies spinocérébelleuses (SCA1, 2, 3, 6, 7, 17 et DRPLA). SCA7 représente un modèle
d’étude intéressant car on y retrouve toutes les caractéristiques majeures de ces ataxies à polyglutamine et des maladies à polyglutamine en général.
Comme la plupart des ataxies spinocérébelleuses, les cibles principales atteintes dans SCA7 sont le cervelet, avec une perte massive des cellules de Purkinje, et le tronc cérébral (Michalik et al., 2004). Les lésions observées résultent le plus souvent d’une évolution lentement progressive
mais il a été rapporté des atteintes multisystémiques (notamment cardiaques) d’évolution rapide chez les cas infantiles (Benton et al., 1998; David et al., 1998; Whitney et al., 2007). L’ataxie SCA7 se distingue toutefois des autres ataxies à polyQ par la présence d’une atteinte de la rétine, se
traduisant pas une perte d’acuité visuelle pouvant entraîner la cécité des patients (Enevoldson et al., 1994; Gouw et al., 1994). Cette rétinopathie est due à une dégénérescence des photorécepteurs affectant tout d’abord les cônes puis les bâtonnets (Michalik et al., 2004).
II. Historique de l’identification du gène SCA7
Le gène SCA7 a été localisé sur le chromosome 3 en position 3p12-13 au sein de notre laboratoire (Benomar et al., 1995; David et al., 1996). Du fait de l’existence d’un phénomène d’anticipation très marqué dans les familles (Benomar et al., 1994), il a été très vite proposé que la mutation
en cause soit en fait une mutation dynamique. Deux techniques différentes ont permis de prouver cela: 1) d’une part la mise en évidence d’une protéine porteuse d’une longue séquence de polyglutamine reconnue par l’anticorps 1C2 chez les patients par rapport aux contrôles à partir d’extraits
protéiques de lymphoblastes et de cortex cérébral (Stevanin et al., 1996; Trottier et al., 1995); 2) et d’autre part, la mise en évidence de fragments génomiques CAG répétés de plus grande taille chez les patients que chez les contrôles par la technique Repeat Expansion Detection (Lindblad et al.,
1996). Le clonage du gène SCA7 a donc été réalisé en mettant cette connaissance à profit par la recherche de séquences CAG répétées dans l’ADN génomique de la région candidate en 3p. C’est ainsi qu’un ADNc nouveau, comportant un motif répété de 10 CAG, a pu être identifié. Ce motif
répété était allongé de plusieurs dizaines d’unités chez les patients (David et al., 1997).
III. Caractéristiques du gène SCA7 et de la protéine ataxine 7 (Atxn7)
Le gène SCA7 code pour la protéine ataxine 7 (892 acides aminés) qui est exprimée de façon ubiquitaire dans le cerveau ainsi que dans de nombreux tissus. Elle présente généralement une localisation nucléaire et cytoplasmique (Cancel et al., 2000) qui semble être régulée par les
différents sites de localisation nucléaire ou d’export nucléaire présents sur la séquence protéique.
Chez les patients, on observe une accumulation nucléaire de la protéine ainsi que la formation de NIIs (Cancel et al., 2000; Holmberg et al., 1998). La présence de ces NIIs n’est pas corrélée avec la perte neuronale alors que l’accumulation nucléaire l’est (Cancel et al., 2000; Holmberg et al.,
1998; Jonasson et al., 2002).
Cette accumulation nucléaire de l’ataxine 7 est peut-être régulée par le clivage de la protéine dont un fragment N-terminal a été décrit à plusieurs reprises dans des modèles murins et chez des patients (Garden et al., 2002; Yvert et al., 2000). La protéine présente notamment différents sites
de clivages par la caspase 7 (aux acides aminés 266 et 344) qui semblent pouvoir réguler la localisation et la cytotoxicité de cette protéine (Garden, 2006).
1) La fonction de l’ataxine7
Comme plusieurs autres protéines à polyglutamine, l’ataxine 7 joue un rôle dans la régulation de la transcription. En effet, il a été montré en 2004 que l’ataxine 7 appartient aux complexes SAGA-like : TFTC (TATA-binding protein-free TAF-containing complex) et STAGA
(SPT3/TAF9/GCN5 acetyltransferase complex), impliqués dans l’acétylation des histones, l’épissage et la réparation de l’ADN (Helmlinger et al., 2004). La fonction précise de l’Atxn7 au sein de ces complexes n’est pas encore connue mais il semblerait qu’elle interagisse directement avec la
protéine acétyl-transférase GCN5 de ces complexes. L’ataxine-7 mutée paraît être responsable d’une dérégulation de l’acétylation des histones entraînant une modification du niveau de transcription de certains gènes (Helmlinger et al., 2006; Palhan et al., 2005; Strom et al., 2005). Une baisse de la
transcription des gènes rétiniens (Abou-Sleymane et al., 2006; Helmlinger et al., 2006; McMahon et al., 2005; Palhan et al., 2005) et de la transcription dépendante de CBP ou de RORα1 (Strom et al., 2005) sont ainsi observés. Cependant, l’altération de l’activité histone acétyl-transférase des
complexes semble variable (Helmlinger et al., 2006; McMahon et al., 2005) et l’activité normale de l’ataxine 7 native reste confuse entre une potentielle fonction activatrice (McMahon et al., 2005; Palhan et al., 2005) ou une fonction inhibitrice (Strom et al., 2005). La question d’un gain de fonction
normale et/ou d’une perte de fonction partielle reste donc posée dans SCA7.
2) Les différents modèles expérimentaux
Toutes ces caractéristiques font de SCA7 un modèle très pertinent pour l’étude des maladies à polyglutamine. Ainsi, différents modèles in vitro et in vivo de cette maladie ont été mis au point, notamment dans notre équipe, pour tenter de comprendre les mécanismes physiopathologiques
impliqués dans SCA7.
F. Problématique et Objectifs
I. Modélisation chez la Drosophile comme outil de choix pour identifier des voies d’intérêt thérapeutique
EPHE Banque de Monographies SVT 11

Les différents modèles déjà établis, bien qu’essentiels à la compréhension de la pathologie, ne permettent pas un criblage facile et rapide des voies d’intérêt thérapeutique. Nous avons donc généré un modèle Drosophile de l’ataxie SCA7, exprimant de façon inductible une forme tronquée
d’ataxine 7, normale ou mutante, dans tous les neurones du système nerveux afin de disséquer les mécanismes pathogènes de SCA7 de façon simple et systématique et d’identifier des gènes modulateurs du phénotype dans une visée thérapeutique.
Drosophila melanogaster est en effet un outil très puissant qui présente de nombreux avantages. En effet, environ 75% des loci liés à une pathologie chez l’homme ont au moins un homologue chez la Drosophile avec un très fort degré de conservation de la fonction des gènes (Cauchi and
van den Heuvel, 2006). Le cerveau de Drosophile est aussi un atout pour la modélisation de maladies neurodégénératives. Il compte environ 300,000 neurones qui sont organisés, comme pour les mammifères en zones de fonctions spécifiques, par exemple, la mémoire, l’olfaction, la vision.
D’autre part, l’existence d’une très grande collection de mutants permet la réalisation de cribles génétiques afin d’appréhender les mécanismes physiopathologiques mis en place. De plus, il s’agit d’un organisme facile d’entretien, qui possède un cycle de vie assez court. Il est également possible,
et de manière très simple grâce au système UAS/GAL4, de cibler l’expression du transgène d’intérêt de façon tissu spécifique dans l’œil, les muscles, les neurones ou de façon ubiquitaire.
Ainsi, la Drosophile s’est avérée être un très bon modèle pour l’étude des maladies neurodégénératives en général (Muqit and Feany, 2002; Zoghbi and Botas, 2002) et pour les maladies à polyQ en particulier (Jackson et al., 1998; Warrick et al., 1998).
En collaboration avec l’équipe d’Hervé Tricoire (CNRS UMR7592, Institut Jacques Monod,), nous avons donc généré un modèle drosophile SCA7 et comparé les voies pathogéniques identifiées dans les modèles déjà existants avec les voies impliquées dans notre modèle SCA7. Cette
démarche nous a permis de confirmer certains mécanismes généraux de la neurotoxicité des protéines à polyQ mais aussi de mettre en évidence des mécanismes spécifiques de SCA7. L’originalité de notre modèle a consisté à utiliser un système inductible permettant le ciblage au système
nerveux adulte uniquement afin de s’affranchir des problèmes développementaux propres à la Drosophile, et surtout nous permettant de tester la réversibilité du phénotype par arrêt de l’expression du transgène.
II. Etude d’une voie d’intérêt thérapeutique médiée par un interacteur de l’ataxine 7 : la protéine PML
Malgré l’expression ubiquitaire de l’ataxine 7, la dégénérescence ciblée de certaines structures suggère que des interactions spécifiques ont lieu dans ces structures. Ainsi, il a été montré que la protéine CAP (Cbl-associated protein) était recrutée dans les agrégats d’Atxn7 et jouerait un
rôle dans l’ubiquitylation de la protéine pathologique, et donc dans sa dégradation (Lebre et al., 2001). D’autre part, la protéine PML (promyelocytic leukemia protein) colocalise avec une partie des inclusions dans les cerveaux de patients atteints de maladies à polyglutamines, dont SCA7
(Takahashi et al., 2003; Takahashi et al., 2002). PML contient un domaine RING présent chez les enzymes E3 ubiquitine ligase, suggérant que PML puisse jouer un rôle dans l’ubiquitylation de protéines intranucléaires (Freemont, 2000; Jensen et al., 2001; Shiels et al., 2001). De plus, PML est l’un
des composants majeurs des corps nucléaires (CNs) (Jensen et al., 2001). Ces structures sont décrites comme étant un lieu de stockage dans le noyau (Negorev and Maul, 2001) et semblent être impliquées la mort cellulaire par apoptose et dans la régulation de la transcription (Borden, 2002; Woulfe,
2007). D’ailleurs, une sous-population de CNs, les clastosomes, qui sont enrichis en composants de la voie ubiquitine/protéasome ont été décrits comme un lieu potentiel de dégradation dans le noyau (Lafarga et al., 2002). Grâce à l’utilisation de modèles in vitro, nous avons confirmé
l’implication de PML et des clastosomes dans la dégradation de l’ataxine 7.
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