Diplôme Emilie Montes - EPHE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE
ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
Sciences de la Vie et de la Terre
MEMOIRE
présenté par
Emilie Montes
pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique de Hautes Etudes
EMBRYOGENESE SOMATIQUE ET TRANSFORMATION GENETIQUE
DU COTONNIER VIA AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
Mise au point d’une méthode de transformation sur tissus embryogènes
Soutenu le 16 octobre 2009 devant le jury suivant :
- Président : Mireille Rossel
- Rapporteur : Jean-Luc Verdeil
- Examinateur : Mylène Durand-Tardif
- Tuteur scientifique : Catherine Pannetier
- Tuteur pédagogique : Flore Renaud-Païtra
Mémoire préparé sous la direction de
Catherine Pannetier
Laboratoire de Biologie Cellulaire, INRA Centre de Versailles Directeur : Herman Höfte
Route de St Cyr, 78026 VERSAILLES CEDEX
pannetie@versailles.inra.fr
Et de
Dr Flore Renaud-Païtra
Laboratoire de Génétique et Biologie Cellulaire Directeur : Bernard Mignotte
EPHE (Sciences de la Vie et de la Terre)
UMR 8159 CNRS/UVSQ/EPHE, Batiment Fermat - Maison 4 (2éme étage)
Université de Versailles St Quentin
45, Avenue des Etats-Unis, 78035 VERSAILLES CEDEX
flore.renaud@uvsq.fr
ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
EPHE Banque de Monographies SVT 1

SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE
EMBRYOGENESE SOMATIQUE ET TRANSFORMATION GENETIQUE DU COTONNIER
VIA AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
Mise au point d’une méthode de transformation sur tissus embryogènes
Emilie Montes
(16 octobre 2009)
RESUME
Le cotonnier Gossypium hirsutum L., famille des Malvaceae, représente la première source de textile
végétale. Il est actuellement cultivé dans une centaine de pays sur 34 millions d’hectares. La production
mondiale est estimée pour 2009 à 30 millions de tonnes de fibre. Aujourd’hui, plus de 40% des cotonniers
cultivés sont transgéniques et expriment en particulier une résistance aux insectes ravageurs. La méthode de
transgénèse la plus couramment utilisée est basée sur l’utilisation de la bactérie Agrobacterium tumefaciens et
sur la régénération de plantes in vitro par embryogenèse somatique. Cette méthode consiste à obtenir à partir
d’explants d’hypocotyles des cellules transformées qui se multiplient sous forme de cals. A partir de ceux-ci,
dans certaines conditions de milieu de culture, des cellules embryogènes apparaissent et des embryons
somatiques peuvent être régénérés pour donner ensuite des plantes entières. Cependant, ce procédé est très
consommateur de temps, de main d’œuvre et de matériel végétal. Le travail qui fait l’objet du présent mémoire
porte sur le développement d’une méthode alternative basée sur l’utilisation des tissus embryogènes comme
matériel de départ. En effet, ce matériel différencié est relativement facile à obtenir à partir de cals non
transformés, il peut être aisément maintenu en culture sur des milieux dépourvus de substances de croissance
et porte des capacités certaines de régénération de plantes. Cette méthode doit permettre de gagner en
efficacité et en temps. Nous avons mis l’accent sur la caractérisation des lignées embryogènes les plus aptes à
la transformation. Les caractéristiques morphologiques, les paramètres de croissance, certaines données
histologiques de ces lignées « compétentes » ont été définis. L’influence de la souche d’agrobactérie a été
étudiée. Il est apparu que des souches dites hypervirulentes (AGL1, EHA105) ne donnaient pas de meilleurs
résultats que la souche C58 porteuse du plasmide de virulence pMP90. Le type d’agrégat de cellules
embryogènes conduisant à un taux élevé de transformation a également été étudié. La phase de culture à
laquelle les tissus doivent être prélevés pour être inoculés par l’agrobactérie a été déterminée. Bien que certains
résultats méritent d’être confirmés sur un vaste échantillon de cultures d’origine différente, nous pouvons
proposer une méthode pour transformer génétiquement des tissus embryogènes cultivés in vitro. La faisabilité et
la fiabilité de la méthode devront être montrées par l’obtention de plantes transférables en serre, leur analyse
moléculaire et la transmission des transgènes à la descendance.
MOTS CLES : cotonnier, embryogenèse somatique, transformation génétique, tissus embryogènes,
Agrobacterium tumefaciens
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2009 est l'année internationale des fibres naturelles. L'idée a pris forme lors d'une réunion de pays
producteurs et consommateurs de fibres qui s'est tenue à la FAO, Organisation des Nations Unies pour
l'Alimentation et l'Agriculture, en 2006.
Les fibres naturelles sont des substances filamenteuses issues de végétaux et d'animaux. Elles sont
tissées, tricotées ou tressées pour confectionner des textiles indispensables à la société. Elles sont utilisées
pour l’habillement, pour des biens de consommation et dans l’industrie. Tous les pays du monde produisent,
d’une manière ou d’une autre, des fibres naturelles.
Les fibres d'origine végétale sont issues de la tige, de la feuille ou de la graine de plantes diverses. Des
millions de personnes à travers le monde, notamment dans les pays les plus pauvres, tirent leurs moyens de
subsistance de la production et du traitement des fibres naturelles. Celles-ci contribuent ainsi à la sécurité
alimentaire et au développement économique d’un très grand nombre de paysans.
Près de 30 millions de tonnes de fibres naturelles sont produites chaque année dans le monde, la
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principale étant le coton avec 25 millions de tonnes de fibre par an, soit cinq fois plus que toutes les autres
fibres naturelles réunies (données FAO, 2006). Les plus anciens fragments de tissus à base de coton datent de
8000 ans et proviennent de la vallée de l’Indus au Pakistan. Grâce à l'invention des machines à filer et à tisser
au 18e siècle, la Grande-Bretagne est devenue le principal exportateur de textiles et le moteur de la révolution
industrielle en Europe. L'Amérique du Nord a développé la culture du coton pour répondre aux besoins de
l'industrie textile britannique. Puis, la culture s'est répandue dans le monde entier et la transformation de la fibre
a joué un rôle de premier plan dans l'industrialisation de nombreux pays. L’approvisionnement en coton brut est
assuré surtout par la Chine, les États-Unis, l'Inde, le Pakistan, l'Ouzbékistan, le Brésil et l’Egypte. Aujourd’hui, le
coton est cultivé dans 130 pays.
· 1 Le cotonnier :
1.1 Taxonomie :
Le cotonnier est une dicotylédone de la famille des Malvacées dans laquelle se trouve par exemple les
roses trémières, les hibiscus, le cacaoyer. Dans cette famille, le genre botanique Gossypium L. rassemble 50
espèces de cotonniers répertoriées dont 45 sont diploïdes et 5 tétraploïdes. De nouvelles espèces continuent
d’être découvertes (Wendel et Cronn, 2002).
Le genre Gossypium serait issu d’un phylum ancestral, aujourd’hui disparu, qui se serait différencié il y a plus de
cent millions d’années en plusieurs groupes génomiques sous l’influence de la pression de sélection induite par
la dérive des continents (Ndungo et al., 1988 ; Wendel et Cronn, 2002). Huit groupes génomiques désignés par
les lettres majuscules A, B, C, D, E, F, G et K, comprenant des espèces de cotonnier diploïdes,
(2n=2x=26 chromosomes) sont à ce jour reconnus. Par une hybridation naturelle entre espèces des génomes A
et D suivie d’un doublement spontané du nombre de chromosomes, un groupe génomique allo-tétraploïde
(2n=4x=52 chromosomes) désigné par le symbole (AD) est apparu, il y a environ un million d’années (Wendel et
Cronn, 2002).
Aujourd’hui, quatre espèces sont cultivées : deux espèces diploïdes, Gossypium arboreum et Gossypium
herbaceum (coton indien, fibres épaisses et courtes), ainsi que deux espèces tétraploïdes, Gossypium
barbadense (coton égyptien, fibres longues et fines, 5% de la production mondiale) et Gossypium
hirsutum (fibres intermédiaires, 90% de la production mondiale).
2.2 Caractéristiques morphologiques de Gossypium hirsutum L.:
Sur le plan botanique, le cotonnier est considéré comme une plante pérenne ; en pratique, il est cultivé
comme une plante annuelle. En champs, il atteint une hauteur de 80 cm à 2 m.
La partie souterraine du cotonnier comprend une racine principale pivotante et un système de racines latérales.
La partie aérienne comporte une tige principale qui porte les rameaux. En se développant, la tige forme des
nœuds au niveau desquels partent deux types de rameaux, les rameaux végétatifs et les rameaux fructifères.
Ces derniers sont formés de segments successifs en zigzag. Chaque segment porte latéralement à son
extrémité une feuille et un organe fructifère. Trois types de feuilles sont observés : les feuilles cotylédonaires, les
premières feuilles (leur nombre est très variable) et les feuilles proprement dites qui peuvent présenter un assez
grand polymorphisme sur une même plante. Les différents stades de développement de la plante sont
représentés sur la.
La fleur est constituée de trois bractées et d’un calice formé de cinq sépales. La corolle est formée de 5 pétales
à préfloraison tordue dont la coloration varie entre le blanc et le jaune vif. L’androcée est composé d’étamines
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en nombre variable. Le gynécée comprend un ovaire constitué de trois à cinq carpelles divisant le fruit en
autant de loges dans chacune desquelles on trouve six à douze ovules, le style, le stigmate et des nectaires qui
sécrètent un nectar attirant les insectes.
Le cotonnier est une plante essentiellement autogame. Selon les conditions environnementales, le taux
d’allogamie peut atteindre 30%. Le pollen est transporté par les insectes pollinisateurs.
Le fruit du cotonnier est une capsule qui mesure de 4 à 8 cm de long sur 3 ou 4 cm de diamètre en son
renflement maximum. Il est lisse, de forme ovoïde, possède 4 à 5 loges contenant chacune 6 à 12 graines sur
lesquelles se développent le linter et les fibres .
La fibre a pour origine une cellule épidermique du tégument de la graine. Sa constitution est unicellulaire et est
composée de cellulose à 90 %, plus de 95 % à maturité. Les autres substances contenues dans la fibre sont
des protéines, des pectines, des sucres réducteurs et des cires.
Elle peut atteindre 30 à 40 mm de longueur. Elle est naturellement blanche ou colorée (marron, kaki, ocre, vert
grisé).
1.3 Culture du cotonnier :
Le cotonnier est le roi incontesté de l'industrie textile mondiale. Il pousse sur tous les continents. Il
demande de la chaleur, beaucoup de soleil et d’eau pour sa floraison, puis un temps sec pour permettre la
maturation et la déhiscence de ses capsules.
La culture cotonnière est répartie sur 36 millions d’hectares, occupant ainsi 2,5 % de la surface cultivée de la
planète.
En Afrique de l’ouest, c’est une culture pluviale, dans de petites fermes à forte densité de main-d'œuvre, peu
intensive où le labour et le travail se font grâce aux animaux de trait. La récolte est manuelle.
En Chine ou en Afrique les surfaces cultivées par un agriculteur sont souvent de moins d’un hectare.
Dans les d’autres pays producteurs, tels que les Etats-Unis, l’Australie ou l’Argentine par exemple, c’est une
culture irriguée et mécanisée qui utilise beaucoup de pesticides et d’engrais. Certaines exploitations couvrent
plus de mille hectares.
Entre le semis et la récolte, il s’écoule de 140 à 230 jours selon les variétés de cotonnier et les conditions
climatiques. Pendant sa croissance, plusieurs stades sont définis : le stade de levée qui dure de six à dix voire
trente jours dans de mauvaises conditions de culture, le stade végétatif (développement de la plante, des
branches, des ramifications), le stade reproductif qui correspond au stade où les premières fleurs apparaissent.
La floraison peut durer de 40 à 70 jours suivant les variétés et les conditions de culture. Elle est échelonnée
c'est-à-dire que sur un même plant se trouvent à la fois des boutons floraux, des fleurs et des capsules à tous
les stades de développement. Cette capacité influence les caractéristiques agronomiques. En effet, en début de
floraison, lors de l’attaque d’un insecte ravageur, le cotonnier peut compenser les pertes occasionnées par une
nouvelle formation de fleurs.
50 jours après la germination, les premières fleurs apparaissent. La fleur est jaune à l’ouverture et devient roseviolet
une fois fécondée . Elle doit être fécondée dans les 24 heures sinon elle meurt. Après la fécondation, la
capsule se forme. Chaque capsule est composée de quatre à cinq loges. Elle peut contenir plus d’une trentaine
de graines entourées de fibre.
Une fois mûres, les capsules aux parois épaisses et rigides s’ouvrent et laissent apparaître les fibres de coton
qui entourent les graines . 40 à 50 jours sont nécessaires à la maturité de la capsule.
L’ensemble formé par la graine entourée de sa fibre est appelé le coton graine. Il est constitué en moyenne de
55% des graines, 40% de fibres et 5% de déchets.
1.4 Produits du cotonnier et importance économique :
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La graine de coton est utilisée pour l’industrie et pour l’alimentation.
L’amande de la graine est riche en huile et en protéines. Cependant, elle contient un pigment toxique pour
l’homme et tous les animaux monogastriques, le gossypol. Elle doit alors être traitée. Des variétés de cotonniers
dites « glandless » ont été crées pour contourner ce problème. Ce sont des plantes qui ne contiennent pas de
glandes à gossypol.
Les idées actuelles de protection de l’environnement et la nécessité de développer de nouvelles sources de
biocarburants font de la graine de cotonnier une potentialité de biodiesel. L’huile de l’amande peut être utilisée
sous forme brute ou estérifié (diester), les résidus ligno-cellulosiques pour la production d’huile par pyrolyse, les
déchets de fibres d’usine d’égrenage pour la production d’éthanol après fermentation.
Les tourteaux de coton (pâte qui reste après l’extraction de l’huile) sont destinés à l’alimentation animale, pour
des fertilisants ou des substrats de culture de champignons.
La coque de la graine peut être brulée pour produire l’énergie nécessaire aux huileries. Elle est aussi utilisée
dans l’alimentation animale ou pour la fabrication de dérivés de synthèse en industrie chimique.
Mais le principal produit du cotonnier est sa fibre. Après la récolte, le coton graine, est acheminé à l'usine
d'égrenage. La fibre est alors séparée de la graine et des impuretés. Les fibres sont ensuite compressées dans
des balles, emballées et transportées par bateau pour l’exportation.
La filature consiste à transformer en un textile linéaire des masses de fibre de coton livrées en balles de
différentes origines. Après le nettoyage, les fibres sont démêlées, individualisées puis rassemblées sous forme
de longs rubans (c’est le cardage). Les fibres de chaque ruban sont regroupées en un ruban régulier (c’est
l’étirage). L’affinage du ruban et la torsion des fibres permet d’obtenir le fil (c’est la filature proprement dite).
L’enchevêtrement en spirale des fibres confère au fil sa cohésion et sa résistance. Enfin, le fil peut être tissé, ce
qui donne une matière plus extensible, souple et aérée.
La fibre, une fois filée, est utilisée à 60% dans la confection, à 35% dans l’ameublement et à 5% pour les
vêtements professionnels.
Elle sert aussi dans le domaine médical et dans le domaine de l’hygiène (coton hydrophile (ouate), compresses,
bandes de gaze, tampon hygiénique, coton tige).
Le linter, formé de courtes fibres de cellulose qui reste autour de la graine après l’égrenage, est utilisé dans la
fabrication de feutre, de garniture en literie, de compresses de gaze, de mèches, mais aussi dans
l’ameublement et l’automobile.
Le tableau 1 indique quelques chiffres très récents sur l’évolution de la production de fibres de coton dans le
monde depuis 2004. En 2009, la production est estimée à 23 millions de tonnes de fibres dans le monde (ICAC
cotton this week, 2009).
C’est une culture importante pour des millions de paysans des pays en développement et les revenus qu'elle
engendre contribuent à la sécurité alimentaire des ménages ruraux. Il est estimé, qu’à l’échelle mondiale, la
production de coton fournit directement près de 350 millions d’emplois de sa culture à sa transformation.
Ces dernières décennies, le coton a conservé ses parts de marché en dépit de la forte concurrence des tissus
synthétiques comme le polyester. L'amélioration de la production et des technologies de transformation a permis
de juguler les coûts et le coton est toujours prisé des consommateurs. La part de marché des vêtements et des
articles pour la maison en coton, devrait rester stable, mais le futur de la fibre dépendra des progrès
technologiques, notamment d'une meilleure gestion des maladies et des insectes ravageurs du cotonnier.
1.5 Amélioration génétique :
Afin de créer des variétés de cotonniers plus productrices, plus résistantes aux stress biotiques et
abiotiques et afin d’obtenir une fibre de meilleure qualité, les sélectionneurs disposent de différentes méthodes.
Dans un premier temps, ont été développés des méthodes dites « classiques » :
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1.5.1 La sélection classique :
La sélection individuelle ou massale (les graines des plantes choisies pour des critères agronomiques
intéressants dans une population sont semées pour la culture suivante) permet d'appliquer une pression de
sélection modérée tout en conservant une variabilité génétique à long terme. Elle est de mise en oeuvre très
simple, mais elle est inefficace pour des caractères peu héritables.
La sélection généalogique est une méthode par stabilisation des caractères favorables au cours de plusieurs
générations et l’autofécondation dans la descendance de croisements entre deux ou plusieurs variétés. Elle est
la plus utilisée.
La sélection massale pedigree, développée par Harland au Pérou (Harland, 1949), est une variante des
méthodes précédentes.
Elle a pour but la recherche d'un progrès génétique à court terme et le maintien d'une variabilité forte. A chaque
génération les meilleurs individus sont choisis en nombre égal dans les meilleures lignées.
La sélection participative a été développée récemment, les producteurs volontaires, aux côtés des chercheurs,
choisissent les variétés dans les populations en sélection. Aux champs, ils sélectionnent les plantes les plus
intéressantes.
Bien qu’il soit probable que des caractères de résistance aux insectes existent chez certains cotonniers
sauvages, la sélection classique n'a apporté que des solutions partielles et indirectes comme la modification de
la forme des feuilles (qui permet une meilleure pénétration des insecticides dans la végétation) ou l'absence de
glandes à nectaire. Il est donc très compréhensible que le cotonnier ait été une des premières plantes cultivées
à faire l'objet de recherches pour l'introduction par génie génétique de caractères de résistance aux insectes.
C’est pourquoi ont été développés des méthodes faisant appel à des outils biotechnologiques.
1.5.2 La cartographie du génome et la sélection assistée par marqueurs moléculaires d’ADN
(SAM) :
Les marqueurs moléculaires de l’ADN rendent possible une sélection directe des gènes dans le génome
de la plante. Ils permettent d’identifier et de localiser avec précision les portions de chromosomes qui
contiennent des gènes favorables à l’expression de caractéristiques agronomiques ou technologiques
intéressantes. Ces portions de chromosomes sont appelés QTL (quantitative trait loci). Le sélectionneur s’efforce
alors d’accumuler dans une même plante tous les QTL qui paraissent porter des gènes favorables : c’est la
sélection assisté par marqueurs (SAM). La sélection est faite à partir du génotype plutôt que du phénotype
comme dans la sélection classique. Le sélectionneur espère améliorer la qualité de la fibre par l’accumulation
dans une même plante des QTL favorables. Cette technique est aussi utilisée pour tenter de créer des
cotonniers résistants aux maladies (maladie bleue, ramulariose) au Brésil.
Cette solution semble plutôt prometteuse, mais elle n’en est qu’au stade de recherche. En revanche, la
transformation génétique du cotonnier est une méthode très avancée actuellement et déjà mise en application.
1.5.3 La transformation génétique du cotonnier :
Les maladies provoquées par les virus, les bactéries ou les champignons perturbent la croissance du
cotonnier ou détruisent ses fruits. Quant aux insectes ravageurs, ils attaquent le cotonnier tout au long de son
cycle occasionnant des dommages en terme de rendement et de qualité.
Quelques uns de ces insectes ravageurs sont principalement des lépidoptères comme les Heliothis qui
s’attaquent aux boutons floraux et des piqueurs suceurs (le puceron, Aphis gossypii ou la mouche blanche
Bemisia tabacci). Ils occasionnent des dégâts considérables qui peuvent anéantir les récoltes ou empêcher la
filature (le coton est rendu collant à cause des sécrétions des pucerons). La lutte contre les insectes ravageurs
représente donc pour cette plante un enjeu de toute première importance.
La production de coton est fortement tributaire des pesticides chimiques pour anéantir les insectes nuisibles.
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Avant la culture des cotonniers transgéniques résistant aux insectes, on estime que près de 30% du marché
des insecticides chimiques étaient consacrés à la protection de la culture cotonnière, alors que cette culture
n'occupait qu'environ 2% des surfaces cultivées.
Pendant une campagne de culture d’une variété traditionnelle le nombre de traitements peut atteindre 15 aux
Etats-Unis et aller jusqu’à 30 en Chine sur une culture de 140 à 230 jours suivant la variété cultivée.
Les produits chimiques ont longtemps été la solution universelle aux problèmes posés par les insectes, mais ils
sont responsables de conséquences non négligeables sur la santé humaine et sur l’environnement. De plus,
bon nombre de ravageurs sont devenus résistants à de nombreux pesticides chimiques.
L’une des alternatives aux produits chimiques a été la lutte intégrée. C’est une méthode qui a recours à toutes
les techniques nécessaires pour réduire les populations d'organismes nuisibles de façon efficace et économique,
tout en respectant l'environnement.
Ces techniques sont regroupées selon plusieurs catégories telles que la lutte préventive (destruction des
résidus, culture piège), la lutte chimique raisonnée (alternance d’insecticide, insecticides peu toxiques), la lutte
biologique (valorisation des auxiliaires natifs, piégeage sexuel de masse), la lutte variétale (variétés à cycle
court, plantes transgéniques). La lutte intégrée a apporté des solutions à court ou moyen termes, mais n’a pas
été totalement efficace.
Le génie génétique qui permet de faire produire par la plante elle-même une molécule insecticide offre donc
une alternative tout à fait intéressante.
Le cotonnier est l’une des premières plantes cultivées pour laquelle la technologie de la transformation
génétique a été mise en œuvre pour la création de variétés commerciales. Les premières plantes transgéniques
de cotonnier ont été obtenues via Agrobacterium tumefaciens (Umbeck et al, 1987, Firoozabady et al, 1987).
C'est cette méthode qui est encore la plus généralement pratiquée aussi bien par les compagnies privées
(Monsanto, Bayer...) que par les laboratoires d'institutions publiques.
Découverte, en 1902 d’abord, au Japon dans un élevage de vers à soie, puis de nouveau isolée et identifiée en
Thuringe par Berliner, en 1911, la bactérie du sol Bacillus thuringiensis synthétise, lors de sa sporulation, une
endotoxine qui détruit les cellules épithéliales du tube digestif des insectes. Des cotonniers ont donc été
transformés avec un gène codant pour une de ces endotoxines et ont donné, ainsi, à la plante, son propre
système de défense : c’est le coton Bt. Une publication de Perkal et coll rapporte en 1990 l'introduction d'un gène de la
bactérie Bacillus thuringiensis (Bt) dans le génome du cotonnier. Six ans plus tard, la première variété de cotonnier Bt est
commercialisée aux USA. Aujourd'hui, treize ans après cette première variété transgénique (Bollgard I, Monsanto), la culture
de variétés issues de la biotechnologie a pris une ampleur remarquable (15 millions d'hectares en 2008 soit 12 % des cultures
transgéniques globales, C.James, 2008) dans le monde et en particulier dans les pays du Sud. Il a depuis été introduit
commercialement dans six autres pays: Argentine, Colombie, Chine, Inde, Indonésie et Afrique du sud.
En Chine, les cotonniers transgéniques ont relancé la culture du coton et les quantités d’insecticides ont été
réduites au 2/3. En 2008, le nombre de champs de coton Bt en Chine a augmenté de 9,6% et l’utilisation des
insecticides est réduite de 60% avec des implications positives sur l’environnement et la santé des fermiers. De
plus, ils ont vu leur revenu augmenté de 220 $US à l’hectare, une amélioration non négligeable pour les
conditions de vie de ces petits paysans (C James, ISAAA brief 39, 2008). Associée aux autres modes de lutte
intégrée, cette méthode conduit à une consommation moindre des insecticides.
La transformation génétique du cotonnier n’a pas pour seul objectif la résistance aux insectes. Les premières
variétés de cotonnier transgéniques ont été développées pour la résistance aux herbicides. Les recherches les
plus récentes concernant le cotonnier transgénique portent sur les résistances aux stress abiotiques comme la
sécheresse et la salinité.
Le coton génétiquement modifié est en plein essor : en 2004, les variétés de coton génétiquement modifié
couvraient le cinquième de la surface mondiale de coton. Leur récolte a représenté un tiers de la production
mondiale. Ces variétés fourniront la moitié de production mondiale de fibre en 2010.
La transgénèse représente également un outil essentiel pour la compréhension du fonctionnement du génome.
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C’est ainsi une technologie qui permet, dans le cas du cotonnier, l’étude des gènes impliqués dans la synthèse
de cellulose et dans l’élongation cellulaire et donc du développement de la fibre. Les études ont pour but à
terme d’augmenter les rendements et la qualité de la fibre ou lui conférer de nouvelles propriétés telles que
l’infroissabilité et la meilleure prise de teinture.
· 2 Les biotechnologies végétales :
Les biotechnologies sont un ensemble de méthodes qui utilise des organismes vivants ou une partie de
ces organismes pour d’une part, mieux comprendre les mécanismes biologiques et d’autre part, améliorer ou
créer des produits dans différents secteurs : l'industrie alimentaire, l’industrie pharmaceutique ou l'agriculture.
Les biotechnologies végétales, prises ici au sens culture in vitro et transgénèse, qui utilisent un fragment de
plantes pour reproduire un individu identique comme dans le micro-bouturage ou qui associent deux plantes
comme dans la micro-greffe sont des biotechnologies anciennes. Aujourd’hui, ces techniques se sont affinées et
partent de fragments plus petits ou de cellules isolées ou de gamètes. Leurs applications sont nombreuses, on
les retrouve dans l’horticulture, dans les conservatoires pour préserver la diversité variétale ou sauvegarder des
espèces menacées et dans la recherche pour l’amélioration des plantes.
2.1 Notions générales de culture in vitro:
Dès 1902, un biologiste allemand, Haberland, observe les potentialités naturelles de la multiplication
végétative. Suite à ces travaux, il énonce le premier principe qui ouvrira la voie de la micropropagation des
végétaux : la totipotence cellulaire. Elle peut se définir comme étant la capacité d’une cellule végétale à
régénérer un autre individu identique à celui dont elle est issue.
La culture in vitro de plantes a principalement pour objet de régénérer une plante entière à partir de cellules, de
tissus végétaux ou d’organes (graine immature, embryon, ovule, pollen, bourgeon terminal, bourgeon axillaire,
morceau de tige, morceau de feuille, de pétale de fleur, …). L’explant doit trouver dans son milieu de culture
tout ce dont il a besoin pour survivre, se multiplier et régénérer de nouveaux individus, (minéraux, eau, sucres,
vitamines, acide aminés et hormones). Les phytohormones sont dans ces techniques d’une grande importance.
Deux types d’hormones de croissance sont utilisés en culture in vitro : les auxines et les cytokinines.
La culture in vitro est un ensemble de méthodes faisant intervenir d'une part l'asepsie (stérilisation du matériel,
désinfection des explants) et d'autre part des conditions de culture parfaitement contrôlées (milieux de culture
définis pour chaque type de plante, température, lumière, humidité). Il est possible de définir plusieurs types de
multiplication in vitro :
2.1.1 La micropropagation:
Différents procédés de micropropagation ont été développés. Il s’agit d’une part de techniques qui relèvent du
micro-bouturage et d’autre part de méthodes basés sur la totipotence des cellules végétales et qui permettent la
néoformation de bourgeons ou d’embryons somatiques.
2.1.1.1 Développement de méristèmes caulinaires pré-éxistants :
C’est un mode de micropropagation qui accélère le fonctionnement normal des bourgeons formés sur une
plante. L’explant initial peut être un méristème, un bourgeon terminal ou axillaire, ou enfin un fragment de tige
avec un bourgeon axillaire. Quelque soit le type de tissu initial, une tige et une touffe feuillée est produite avec
ou sans cytokinines. Cette tige peut être multipliée après avoir été découpée au niveau d’un nœud et repiquée
dans un milieu neuf enrichit en auxines pour son enracinement. Une fois le réseau racinaire développé, les
plantules sont acclimatées en terre.
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2.1.1.2 La multiplication par bourgeonnement adventif ou organogenèse:
Dans ce cas, la formation de méristèmes caulinaires se fait au niveau d’un site inhabituel. L’explant peut
être un organe, une portion de tissus ou des cellules isolées.
Sous l’influence des substances de croissance et plus particulièrement des cytokinines, il peut soit y avoir la
formation d’un bourgeon néoformé directement à partir de cellule de l’explant initial (ceci est un événement
rare), soit les cellules de l’explant initial se divisent rapidement et forme un cal primaire qui peut donner des
bourgeons néoformés. Ensuite, les bourgeons sont transférés dans un milieu contenant de l’auxine pour
l’enracinement.
2.1.2 L’embryogenèse somatique :
L’explant initial est un fragment d’organe. La régénération se fait en absence de toute fécondation par
l’intermédiaire d’un cal qui est un amas de cellules indifférenciées. Le cal se différencie en cellules embryogènes
(cellules dont les parois sont épaissies, qui a un gros noyau et un nucléole très visible) qui donnent naissance
soit par une origine unicellulaire soit par une origine pluricellulaire à des proembryons puis à des embryons qui
se développent en plantules entières. Lors de leur développement, les embryons somatiques suivent
l’embryogenèse somatique.
C’est la technique de culture in vitro la plus avancée en terme de création de nouveautés génétiques dans la
mesure où c’est le processus par lequel le cotonnier peut être régénéré in vitro. Ce processus est donc utilisé
en transgenèse. Les tissus embryogènes peuvent être maintenus in vitro et peuvent générer des embryons en
grande quantité. Les tissus embryogènes peuvent être maintenues en milieu solide ou liquide.
Les suspensions sont un mode de multiplication des tissus embryogènes. Les cellules et/ou les amas de cellules
en état actif de division se développent et se multiplient de façon homogène dans un milieu liquide.
2.1.3 Les protoplastes :
La culture de protoplastes (cellules débarrassées de leur paroi pecto-cellulosique par digestion
enzymatique) présente un intérêt dans la mesure où il est possible d’effectuer des manipulations génétiques.
En effet, ces cellules se prêtent à l’introduction de matériel génétique étranger, la fusion inter-spécifique, l’étude
électro-physiologique de la membrane plasmique. Cependant, toutes les espèces ne peuvent pas régénérer à
partir de protoplastes et les rendements sont faibles.
2.1.4 La production de plantes haploïdes :
La production de plantes haploïdes (issues d’une cellule sexuelle mâle ou femelle sans fécondation) est
d’un grand intérêt pour l’amélioration des plantes. Cette technique donne naissance à des lignées pures puisque
la même information génétique est portée sur les deux chromosomes. Ce sont des homozygotes.
On peut mentionner l’androgenèse dont l’explant initial est l’anthère immature (à partir des microspores, il peut y
avoir apparition d’embryons directement ou après formation d’un cal haploïde ) et la gynogenèse, une autre voie
d’obtention de plante haploïde à partir de gamètes femelles (ovaires non fécondés).
2.2 La culture in vitro du cotonnier :
Pratiquement toutes les techniques de culture de tissus ont été étudiées sur le cotonnier : la culture de
méristèmes, d’apex, de boutures, la culture d'anthères, d'ovules et d'embryons, les cals et les suspensions
cellulaires, obtention de protoplastes, de points végétatifs ainsi que l'embryogenèse somatique. Les objectifs de
ces études étaient donc très variés.
Si certains de ces objectifs sont en liaison étroite avec des problèmes d'amélioration de la culture cotonnière
(création d'hybrides interspécifiques, utilisation pour les prospections, fusions somatiques), d'autres constituent
des outils d'étude de certains problèmes physiologiques et de développement de la plante (développement,
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qualité de la fibre...).
2.2.1 Culture de méristèmes, d’apex, de boutures :
La micro-propagation par culture de méristèmes ou d’apex a fait l’objet de peu de travaux. Les
pourcentages de régénération de plantes entières sont faibles (Price et Smith, 1984 ; Bajaj et Gill, 1986). Depuis,
d’autres groupes ont obtenues des plantes régénérées à partir de méristèmes prééxistants de cotonnier (Zhang
et al, 1996 ; Agrawal et al, 1997 ; Gupta et al, 1997 ; Hemphill et al, 1998 ; Hazra et al, 2000…).
La culture de méristèmes a été développée essentiellement comme outil pour la transformation génétique afin
de s'affranchir des difficultés rencontrées à régénérer par embryogenèse somatique des cultivars
agronomiquement intéressants. Des plantes récalcitrantes à la régénération par embryogénèse somatique
peuvent être multipliées par ce mode de culture puisque cette technique n’est pas dépendante du génotype de
la plante.
La mise en culture in vitro de boutures a été proposée comme technique de collecte de germoplasme lors de
prospections lorsque le matériel végétal n'est présent qu'au stade végétatif (Altman et al, 1990). Ces travaux ont
mis en évidence la difficulté d'enracinement in vitro de boutures de cotonnier. L’une des possibilités pour
surmonter ce problème et qui s’avère efficace est le greffage (Luo et Gould, 1999 ; Jin et al, 2006a).
2.2.2 Culture d’anthères, d'ovules et d'embryons :
Des cals diploïdes et haploïdes ont été obtenus en 1978 par androgénèse (Barrow et al, 1978). L’haplodiploïdisation
chez le cotonnier a été très peu décrite.
Des études sur la culture d’anthères ont permis de détecter la différenciation de structures embryoïdes (Hsi et
Wu, 1981). Des plantes régénérées de cals de G.Hirsutum ont été obtenues de culture d’anthères (Zhang et al,
2000).
Par contre, la culture d'ovules et d'embryons zygotiques est un domaine de la culture d'organes qui a été assez
largement étudié. Ces travaux ont été essentiellement développés pour deux objectifs : étude de la formation et
du développement de la fibre (culture d'ovules) et production d'hybrides interspécifiques (cultures d'ovules et
d'embryons immatures).
La culture d'ovules a tout d'abord été développée, dans les années 70, pour étudier le développement des
fibres, par l'équipe de Beasley dont les travaux ont permis d'améliorer de façon significative la compréhension
des mécanismes physiologiques impliqués dans le développement de la fibre de cotonnier (Beasley et al, 1974).
Des études ont été conduites pour examiner les différences hormonales existant entre les fibres de G. hirsutum
et de G. barbadense. Le but à terme est d'identifier des paramètres biochimiques qui pourraient être manipulés
moléculairement ou génétiquement pour modifier la qualité de la fibre (J Gould Texas A&M University, cité dans
Stewart, 1991).
Bien que l'introduction de caractéristiques de variétés sauvages, grâce aux techniques de culture in vitro, ne
semble pas avoir retenu beaucoup l'attention des améliorateurs du cotonnier, un certain nombre de travaux ont
été réalisés sur le sauvetage d'embryons pour la création de différents hybrides interspécifiques.
C'est le cas de la création d'hybrides G. hirsutum x G. arboreum, (Shubhada Thengane et al, 1986), de G.
hirsutum x G. barbadense (Refaat et al, 1984) par culture d'embryons in ovulo. C'est le cas également de
l'introgression du caractère "glanded plant-glandless seed" provenant de G. sturtianum (diploïde de génomeC)
dans le génome des cotonniers cultivés de génome AD (Altman et al, 1987). Le but est d'obtenir un cotonnier
pourvu de glandes à gossypol dans toutes les parties de la plante sauf dans la graine afin de la rendre
comestible sans traitement tout en maintenant les défenses naturelles de la plante que certains auteurs
attribuent aux glandes à gossypol. Un programme d'introgression de cytoplasmes de variétés sauvages
diploïdes dans les cotonniers cultivés, G. barbadense, a été développé par l'équipe de Stewart (Université
d'Arkansas, Lafayette) (Stewart, 1991, Umbeck et Stewart, 1985). Le groupe de B A Triplett a largement utilisé
la culture d'ovules in vitro dans le cadre d'études sur le déterminisme des caractéristiques de la fibre. Il est en
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effet relativement facile d'obtenir le développement de fibres in vitro (Triplett, 2000).
2.2.3 Protoplastes :
Des protoplastes de cotylédons (Khasanov et Butenko, 1979), d’hypocotyles (Bhojwani et al, 1977) et de
feuilles (Firoozabady et DeBoer, 1986) de cotonnier ont été obtenus. Firoozabady et DeBoer, 1986 ont réussi à
obtenir des micro-colonies de 2-3 cellules chez G. hirsutum et de 5-8 cellules chez G. barbadense à partir de
protoplastes de cotylédons. En 1994, Peeters et collaborateurs ont rapporté l'obtention de plantes à partir de
protoplastes issus de suspensions embryogènes de la variété Coker 312 (Peeters et al, 1994).
Bojinov et coll. (2001) ainsi que Boonrumpun et coll (1997) ont précisé les conditions d'obtention de cals à partir
de protoplastes de mésophyle. L'état d'avancement des travaux sur la culture de protoplastes n'a pas encore
permis d'appliquer cette technique ni à l'obtention de cotonniers transgéniques ni à la création d'hybrides
somatiques. Pourtant, les conditions d’isolation et de culture des protoplastes ont, de nouveau, été explorées
(Sun et al, 2005a, 2005b).
2.2.4 Suspensions cellulaires :
L'utilisation des cals, et plus particulièrement des suspensions cellulaires, a été essentiellement
développée dans l'optique de sélectionner des variants dits somaclonaux présentant des caractéristiques
agronomiques intéressantes ou pour l'étude de mécanismes biochimiques. Ainsi, divers travaux portant sur les
intéractions avec des pathogènes ont été entrepris (Stewart, 1991). Concernant la recherche de variants
somaclonaux, l'équipe de Trolinder, s'appuyant sur la régénération via l’embryogenèse somatique a publié
l'obtention de plantules de cotonnier résistant aux fortes températures (Trolinder et Shang, 1991) après avoir
exposé des suspensions cellulaires à des températures élevées et sélectionné les lignées résistantes; cependant
les auteurs précisent que les plantes obtenues sont stériles.
Les suspensions cellulaires ont été un moyen pour tenter d’améliorer la production d’embryons de certains
types sauvage de cotonniers (Sun et al, 2006), mais elles sont souvent utilisées comme une étape intermédiaire
au cours de la transgénèse pour obtenir une culture importante de cellules transformées. Wilkins et coll (2004)
ont utilisé les suspensions cellulaires après la transformation génétique des explants. Les tissus embryogènes
ont été sélectionnés pour accélérer la morphogénèse, amplifier le nombre d’embryons somatiques et produire
des embryons de haute qualité.
2.2.5 Embryogenèse somatique :
La régénération du cotonnier utilise un processus d'embryogenèse somatique. Les premières obtentions
d'embryons somatiques ont été rapportées en 1979 à partir de cultures en suspension issues de fragments
d'hypocotyles de G. klotzschianum (Price et Smith, 1979) ou d'explants de cotonniers adultes de la même
espèce (Finer et Smith, 1984). La régénération de plantes de l'espèce G. hirsutum a ensuite été rapportée par
différentes équipes.
Tout d'abord, Davidonis et Hamilton (1983) ont obtenu des embryons somatiques à partir de cultures de plus de
2 ans. Puis différentes publications sont parues sur l'obtention d'embryons somatiques et de plantules, à partir
de fragments d'hypocotyles ou de cotylédons de l'espèce cultivée G. hirsutum (Shoemaker et al, 1986; Trolinder
et Goodin, 1987) ou à partir de fragments de feuilles (Gawel et al, 1986). L'influence des constituants du milieu
de culture, éléments minéraux, sources carbonées, substances de croissance, ainsi que celle de l'origine
tissulaire des explants ont été étudiées par Trolinder et Goodin (1988a-b). Des améliorations dans le taux de
développement des embryons somatiques en plantules ont été apportées par Finer (1988) sur du matériel issu
de suspensions embryogènes. On peut penser qu'actuellement l'ensemble des laboratoires utilisant la
régénération du cotonnier in vitro, le plus souvent pour le transfert de gènes, développe un processus dérivé de
celui mis au point par Trolinder. Il s'agit de l'obtention d'un cal parenchymateux à partir de fragments
d'hypocotyles issus de germinations aseptiques. Ce cal donne ensuite naissance à des tissus embryogènes qui
peuvent être maintenus en culture en milieu solide ou en suspension. Le processus est relativement long
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puisqu'il faut au moins 3 mois pour obtenir le cal embryogène. Par ailleurs, le taux de conversion des
embryoïdes en plantes entières transférables en sol est faible et de nombreux embryons somatiques anormaux
sont obtenus. Peu de travaux ont été effectués sur l'amélioration de cette phase du processus de régénération
par embryogenèse somatique chez le cotonnier. Des améliorations minimes ont pu être apportées après tri des
embryons en différentes classes morphologiques et modification des conditions de culture (Voo et al, 1991).
La régénération du cotonnier par embryogenèse somatique induit très fréquemment l'apparition de variations
somaclonales. Ces "variations" peuvent conduire à la stérilité des plants régénérés. Des analyses
cytogénétiques ont été effectuées (Altman et al, 1991).
De plus, seules quelques variétés présentent de bonnes capacités de régénération. Il s'agit de variétés coker
toutes dérivées de la même variété (Coker 100). La régénération d'autres variétés a pu être obtenue (Trolinder
et Xhijian 1989; Cousins et al, 1991; Firoozabady et Deboer, 1993) mais les rendements sont toujours inférieurs.
Gawel et Robacker (1990) ont suggéré que la capacité à la régénération était un caractère héritable.
L'importance qu'ont pris ces dernières années les travaux de transfert de gènes chez le cotonnier a entraîné un
manque d'intérêt pour les problèmes de biologie cellulaire et de régénération.
Wu et coll en 2004 ont développé un nouveau protocole pour augmenter l’efficacité de l’embryogènèse
somatique et de la régénération de plantes de 10 cultivars de cotonniers chinois récalcitrants.
Jin et coll ont rapporté en 2006 que les cultivars chinois auraient de meilleure capacité de régénération de
plante via l’embryogénèse somatique (la formation d’embryon somatique est plus importante et est obtenue en
deux mois) que les lignées Coker.
2.3 La transgénèse végétale :
La transgénèse végétale est une technique qui consiste à introduire un ou plusieurs gènes dans des
cellules végétales menant à la transmission et à l’expression du ou des gènes d’intérêt ou transgène(s), aux
générations successives. Les plantes transgéniques obtenues ont acquis un ou plusieurs caractères, qu’elles
transmettront à leurs descendances.
2.3.1 Méthodes de transfert de gènes :
2.3.1.1 Transfert direct :
Des méthodes dites de transfert direct utilisent des moyens physiques ou chimiques pour permettre la
pénétration d'ADN, généralement sous forme de plasmides dans une cellule végétale. La paroi cellulaire des
végétaux est un obstacle difficile à franchir, c’est pourquoi ce mode de transformation doit se faire dans des
conditions qui peuvent faciliter la pénétration de l’ADN dans la cellule.
C’est le cas de la transformation de protoplastes et de la biolistique. L’ADN doit ensuite atteindre le noyau et
s’intégrer aux chromosomes de la cellule végétale.
Plusieurs types de traitement peuvent être mis en œuvre afin de permettre la transformation des
protoplastes :
· Le polyéthyléneglycol (PEG) désorganise la membrane plasmique et permet le
transfert de l'ADN à travers celle-ci. Ces molécules migrent jusqu’au noyau où
l’ADN est susceptible d’intégrer les chromosomes;
· La fusion entre les protoplastes et des liposomes (vésicules artificielles de
phospholipides encapsulant l'ADN à transférer) ;
· L’électroporation consiste à soumettre un mélange de protoplastes et d'ADN à
une série de chocs électriques de courte durée et de tension élevée. Le champ
électrique provoque la déstabilisation de la membrane plasmique et induit alors
la formation de pores au travers desquels les molécules d'ADN peuvent
transiter.
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Le phénomène est réversible et la membrane reprend ensuite son état initial, laissant le protoplaste parfaitement
viable et capable de reformer une paroi.
La pénétration de l'ADN à travers la paroi pecto-cellulosique des cellules végétales peut être forcée grâce
à la biolistique. La technique consiste à utiliser un canon à particules. De toutes petites billes d'or ou de
tungstène enrobées d'ADN sont projetées sur le tissu à transformer. Ces billes projetées ont suffisamment
d'énergie cinétique pour traverser la paroi et la membrane des cellules sans leur infliger de dommages
irréparables. L'ADN est introduit dans les tissus, les plantes régénérées sont transformées.
2.3.1.2 Transfert via Agrobacterium tumefaciens :
Un autre mode de transfert d’ADN, plus couramment pratiqué, peut permettre d’obtenir des cellules
végétales transformées : le transfert indirect. L’un des procédés les plus utilisés et qui fait appel à un
phénomène naturel est l’infection par Agrobacterium tumefaciens.
Agrobacterium est une bactérie du sol responsable de l’apparition de tumeurs au niveau du collet chez de
nombreuses espèces végétales, suite à des blessures, chez les dicotylédones. Cette maladie a été appelée
galle du collet ou « crown gall ». Agrobacterium tumefaciens possède dans sa cellule un plasmide de haut
poids moléculaire, le plasmide Ti (« Tumor inducing ») portant les gènes responsables de la virulence de la
bactérie.
Le processus d’infection consiste au transfert d’une portion bien définie du plasmide Ti, l’ADN-T (ADN de
transfert) dans le génome des cellules végétales. L’expression des gènes de l’ADN-T engendre, d’une part, la
biosynthèse d’auxines et de cytokinines et d’autre part, la biosynthèse d’opines. Les cellules infectées voient
donc leur balance hormonale modifiée et se dédifférencient pour se diviser de façon anarchique en développant
une tumeur. Les opines, quant à elles, sont utilisées comme substrat de croissance par la bactérie.
Deux portions du plasmide Ti sont nécessaires au transfert de gènes : la région Vir et l’ADN-T.
Les gènes de la région Vir codent pour des protéines qui interviennent dans les mécanismes de duplication de
l’ADN-T et du transfert de la copie de l’ADN-T dans le génome de la cellule hôte).
La bactérie A. tumefaciens réalise donc un processus de transfert de gènes. L'idée s'est donc développée
d'utiliser cette propriété pour transférer des gènes d'intérêt en les intégrant à l'ADN-T. Le plasmide Ti sauvage
est modifié de façon à supprimer sa capacité à provoquer la maladie et à garder sa capacité à infecter les
cellules et à transférer des gènes dans les cellules .
Les bactéries modifiées pour réaliser le transfert de gènes d’intérêt dans les cellules végétales porte différents
types de vecteurs. Ce sont, en particulier des vecteurs fonctionnant en système binaire. Le plasmide Ti est
remplacé par deux plasmides. Le premier, souvent appelé vecteur autonome, porte un ADN-T réduit aux
frontières, mais entre lesquelles ont été intégrés les gènes à transférer à la plante. Le second, appelé plasmide
Ti désarmé (l’ADN-T a été supprimé), porte les fonctions de virulence qui agissent de façon à permettre le
transfert du T-DNA du vecteur autonome.
L’ADN-T modifié, porteur du gène d’intérêt et d’un gène sélectionnable des cellules transformées (gène
marqueur), est transféré dans les cellules végétales et s’intègre à l’ADN génomique. Ces gènes sont parfois
associés à un gène rapporteur qui permet une visualisation simple et rapide des cellules ou tissus transformés.
Les méthodes de sélection des transformants diffèrent et sont basées sur la résistance aux antibiotiques, sur la
résistance aux herbicides ou sur l’acquisition d’une nouvelle voix métabolique. Les cellules ou tissus inoculés
sont cultivés sur un milieu qui permet non seulement la sélection des transformants potentiels, mais aussi
l’élimination de l’agrobactérie grâce à un antibiotique décontaminant.
Pour s’assurer du transfert du gène d’intérêt, des analyses moléculaires du gène transféré et de l’expression du
gène sont effectuées.
2.3.2 Transformation génétique du cotonnier :
La majorité des travaux utilisant la culture in vitro chez le cotonnier ont pour objectif le transfert de gènes.
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La première publication mentionnant la transformation du cotonnier décrit l’injection d’ADN dans des embryons
immatures (Zhou et al, 1983). Mais, les résultats obtenus sont peu convaincants.
La biolistique fait partie des méthodes testées pour transformer le cotonnier à partir de suspensions
embryogènes (Finer et Mc Mullen, 1990). K.Rajasekaran et coll ont, en 1999, tenté d’améliorer la méthode. Ils
sont parvenus à la transformation stable de cellules embryogènes en suspension et à régénérer des plantes
fertiles en moins de trois mois. Mais la transformation de tissus plus âgés produisent des plantes
morphologiquement anormales et stériles.
Afin de pouvoir s'affranchir de la difficulté à transformer différents génotypes, la transformation via
Agrobacterium sur méristèmes a été étudiée. Les premiers résultats encourageants ont été publiés en 1988
(Ulian et al, 1988, Gould et Smith, 1988). La transformation par bombardement de particules sur des méristèmes
de variétés agronomiquement intéressantes a été publiée par l'équipe de Mc Cabe (Mc Cabe et Martinell, 1993).
D’autres équipes (Gupta et al, 1997 ; Agrawal et al, 1997 ; Hemphil et al, 1998 ; Ouma et al, 2004) ont publié
des résultats sur la transformation de tissus devant conduire à la régénération de plantes entières sans passage
par l’embryogenèse somatique. Les méthodes développées varient selon les explants utilisés, les milieux de
culture, mais divers cultivars ont été régénérés. Une méthode de transformation par A. tumefaciens a été
publiée en 2002 par Satyavathi sur des explants d’apex de cultivars indien. En 2004, une autre méthode de
transformation du cotonnier par A. tumefaciens a été réalisée en Chine par Li et al. Des grains de pollen ont été
transformés par infiltration d’Agrobacterium tumefaciens sous vide. Ce pollen est ensuite utilisé pour féconder
les plantes à modifier.
Cependant, la régénération de cotonnier transgénique via l’embryogénèse somatique par A. tumefaciens
est la technique de transformation la plus utilisée.
La transformation par Agrobacterium tumefaciens sur le cotonnier a été réalisée à partir de différents explants
issus d’hypocotyles, de feuilles, de cotylédons et d’apex.
Les premiers résultats ont porté sur l'introduction d'un gène marqueur de résistance à un antibiotique à partir
d’explants de cotylédons provenant d’une variété Coker (Umbeck et al, 1987 ; Firoozabady et al, 1987).
Au laboratoire, dans le cadre d’une collaboration avec le CIRAD, une méthode utilisant des explants
d’hypocotyles provenant de jeunes germinations a été développée (Pannetier et al, 1997). Une souche d’A.
tumefaciens porteuse d’un système binaire en phase exponentielle de croissance (pour une meilleure efficacité
de transformation et une meilleure répétabilité des conditions expérimentales) est mis en contact avec des
explants d’hypocotyles. Les explants inoculés sont placés sur un milieu favorisant la croissance des cals grâce à
l’apport d’auxine et de cytokinine (phytohormones de croissance). Pendant 48h, ces explants sont placés en
chambre de culture sur ce milieu afin que les plasmides du système binaire de l’agrobactérie puissent entrer
dans les tissus et que le gène d’intérêt puisse s’intégrer dans l’ADN génomique des cellules végétales.
Ensuite, les explants inoculés sont transférés sur un nouveau milieu de culture contenant non seulement les
phytohormones, mais aussi des antibiotiques, l’un sélectif des cals potentiellement transformés et l’autre
permettant d’éliminer l’agrobactérie.
Après plusieurs subcultures (durée de culture entre deux repiquages), les cals apparus sur les explants sont
isolés sur un milieu de culture dont les taux d’hormones végétales sont diminués pour permettre la
différenciation de cellules embryogènes. Les tissus embryogènes qui apparaissent à plusieurs endroits des cals
sont isolés un à un et chacun donne naissance à une lignée embryogène. Ces lignées se développent sur un
milieu sans hormones pour permettre le développement d’embryons viables.
Le schéma présenté sur la décrit le processus de transformation du cotonnier via l’embryogénèse somatique.
Même si la production de cals issus d’explants inoculés peut atteindre 100%, l’obtention des lignées
embryogènes transformées est plus difficile. Elles apparaissent à la suite de plusieurs repiquages de ces cals
après un délai de plusieurs mois (4 mois minimum le plus souvent). Certaines de ces lignées transformées ne
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produisent pas d’embryons. Celles qui en produisent donnent parfois naissance à des embryons mal formés ou
vitreux, peu de ces embryons donnent des plantules transférables en serre. Le taux de transformation est tel
que sur 100 explants transformés, 7 à 10 lignées de plantes transformées fertiles (Pannetier et al, 2008).
· 3 Sujet de recherche:
3.1 Les objectifs et la stratégie retenue :
La mise en œuvre et l’obtention d’un nombre suffisamment important de cotonniers transformés provenant
de lignées embryogènes différentes sont très consommatrices de temps, de matériel végétal et de mains
d’oeuvre. Elles nécessitent la gestion d’un grand nombre d’explants, la manipulation d’une grande quantité de
milieu de culture et de matériels et la mobilisation d’un bon nombre de personnel.
Par exemple, au laboratoire en 2007, une expérimentation de transfert de gènes sur explants d’hypocotyles de
cotonnier a été menée. Elle a été initiée début février 2007, 1126 explants inoculés ont été mis en culture.
Après 6 à 8 semaines, 956 cals ont été isolés, 437 lignées embryogènes différentes ont été obtenues (46% de
cals ont donné des lignées embryogènes), les premières étant apparues après 3 et 4 mois de subculture et
jusqu’à 6 ou 7 mois pour les dernières.
De ces lignées, 1699 embryons ont été isolés et 7 autres mois ont été nécessaires pour obtenir 281 plantules
transférées en serre. En parallèle, 84 explants non inoculés ont été mis en culture, tous les explants ont donné
des cals et 71% des cals ont produit des lignées embryogènes en 2 ou 3 mois.
Ces chiffres montrent que les tissus embryogènes non transformés sont obtenus plus rapidement et en plus
grandes quantités que les tissus provenant d’explants inoculés. Ces constatations ont conduit l’équipe à
s’intéresser à une méthode alternative de transformation en envisageant les tissus embryogènes comme explant
(Lebouteiller et al, 2001). Cette nouvelle approche de la transformation du cotonnier, en se servant des cals
embryogènes comme source de régénération de plantes transgéniques, a été rapportée en 2004 par S.
Leelavathi et coll. Très peu de publications récentes évoquent la transformation du cotonnier via les tissus
embryogènes, pourtant l’influence de certains paramètres a déjà été rapportée.
Toutes les études publiées portent sur l’utilisation de l’agrobactérie LBA 4404 (Leelavathi et al, 2004 ; Wu et al,
2005 ; Jin et al, 2005 ; Wu, 2008), et aucune comparaison entre souches d’Agrobactéries n’a été publiée.
Souvent, les paramètres étudiés concernent le mode d’action de l’agrobactérie : le temps de contact et la
concentration d’utilisation de la bactérie (Wu et al, 2005 ), l’ajout ou non d’acétosyringone (composé phénolique
efficace pour l’induction de l’expression des gènes Vir nécessaires pour le transfert de l’ADN-T (Jin et al, 2005 ;
Wu, 2008 ), le temps de co-coculture (Wu et al, 2005 ; Jin et al, 2005 ; Wu, 2008 ) et la température de coculture
(Wu, 2008). Ensuite, les essais concernent l’antibiotique de sélection, sa concentration et le temps de
subculture (Leelavathi et al 2004 ; J.Wu et al 2005).
Quant aux tissus embryogènes, ils sont peu caractérisés. Deux équipes ont, en 2005, décrit brièvement l’âge
des tissus et leur état physiologique pour une transformation qui semblerait être plus efficace (J.Wu et al, 2005 ;
S.Jin et al, 2005). S-J. Wu et coll (2008) évoquent succinctement la couleur des agrégats dont la quantité de
dépôt optimal sur milieu sélectif doit être 0,2 à 0,3 g pour une bonne prolifération. Dans tous les cas, leurs
travaux sont réalisés sur des cultivars de cotonniers chinois sur lesquels les auteurs ne donnent aucune
information.
Finalement, très peu de données sur cette nouvelle approche ont été rapportées. Elles concernent
essentiellement le mode d’action d’une bactérie et la sélection des tissus potentiellement transformés ; les tissus
végétaux sont peu caractérisés et les travaux sont sur des cultivars dont les auteurs ne fournissent pas
d’information. Il est donc indispensable de poser de nouveaux jalons et d’acquérir de nouvelles données dans le
cadre de la mise au point d’une méthode alternative de transformation du cotonnier.
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La méthode alternative de transformation basée sur l'utilisation des tissus embryogènes obtenus à partir
de fragments d’hypocotyles se prête à l’amélioration des performances du procédé de régénération des plantes
transformées, mais les éléments évoqués ici sont, la plupart du temps, contradictoires et montrent que chaque
équipe a son propre mode opératoire. Il n’y a pas de méthode universelle et optimisée de transformation des
tissus embryogènes. Ces études nous ont donc conduit à poursuivre nos investigations sur cette méthode. Il
s’agit d’approfondir l’influence de paramètres déjà étudiés dans l’équipe et d’aller plus loin dans l’étude portant
sur la caractérisation des lignées embryogènes utilisées. Cette caractérisation doit mener à un choix des tissus
les plus « réceptifs ».
Les objectifs de l’équipe sont, de pouvoir étudier dans des délais relativement courts l'expression chez le
cotonnier de gènes d'intérêt (résistance aux ravageurs ou aux stress) ou de réaliser des études de génomique
fonctionnelle (développement de la fibre de coton).
Dans le premier cas, il est connu que l'expression des transgènes peut varier considérablement d'un événement
de transformation à un autre, il est donc nécessaire de disposer d'un nombre important d'événements de
transformation.
Dans le deuxième cas, un des thèmes développés porte sur le développement de la fibre de coton constituée à
maturité de plus de 95 % de cellulose. La stratégie retenue utilise l'extinction de gènes impliqués dans la
synthèse de cellulose, afin d’analyser le rôle de ces gènes au cours du développement de la fibre de coton.
Ceci nécessite de tester un grand nombre de gènes.
Il s’agit donc de développer une méthode rapide permettant, avec les moyens à disposition, de générer un
grand nombre d'événements de transformation avec le moins de matériel végétal possible. La mise en œuvre
de cette méthode devrait aussi permettre de réduire les manipulations trop lourdes aujourd’hui et de mobiliser
moins de personnels.
Etant donné ces objectifs, les tissus embryogènes les plus appropriés sont ceux dont les potentialités de
régénération d'embryons sont importantes.
Pour aboutir à une méthode fiable et reproductible, l’étude de deux paramètres importants du processus a été
entreprise : le type d’agrobactérie utilisé pour transmettre le gène d’intérêt et l’état physiologique du matériel
végétal. Plusieurs paramètres des conditions de transfert de gènes de la bactérie à la cellule végétale et de
culture des cellules transformées pour l'obtention de plantes entières ont également été étudiés.
3.2 Résultats acquis au laboratoire :
Les premiers efforts ont porté sur la comparaison de deux souches d’Agrobacterium tumefaciens dont les
plasmides de virulence diffèrent (C58 pGV2260 et C58 pMP90). Les conditions d’utilisation de ces bactéries ont
été testées. Il s’agissait de déterminer laquelle de ces deux souches est la plus apte à transformer les cellules
végétales et à quelle concentration l’efficacité de la transformation est augmentée. Les essais avaient également
porté sur le temps de co-culture et sur des traitements physiques favorisant l’accrochage de la bactérie aux
tissus végétaux (traitements sous vide ou ultrasons) (Lebouteiller, 2001 ; Pannetier et al, 2003).
Le temps de contact entre le matériel végétal et l’agrobactérie, l’influence de la croissance de la bactérie (prise
en phase exponentielle de croissance ou en début de plateau) et l’influence de l’antibiotique de décontamination
ont été également étudiés.
Il s’est avéré que les meilleurs résultats ont été obtenus avec C58::pMP90 prélevée en phase exponentielle de
croissance (106 cellules), diluée au 1/10, pour un temps de contact de 10 minutes. La co-culture établie est de
48h.
Certains antibiotiques de décontamination, tel que la cefotaxime, bloquent le développement des agrobactéries
dans les milieux de culture et dans les explants inoculés mais ils ont des effets défavorables sur la régénération
des embryons somatiques et des plantules.
Nous avons donc conduit un ensemble d'expérimentations pour éliminer la bactérie sans compromettre le
devenir des tissus embryonnaires avec l’utilisation du timentin qui agit à de plus faibles doses (250 mg/L au lieu
de 500 mg/L pour la cefotaxime). Nous avions réalisé des essais préliminaires au travail présenté dans ce
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mémoire, de comportement des tissus embryogènes sur des milieux contenant du timentin. La dose de 250mg/l
avait été retenue comme permettant une bonne élimination de la bactérie et un maintien des capacités de
néoformation d’embryons somatiques. Ainsi, les conditions expérimentales initiales ont été définies sur la base
de ces résultats.
En ce qui concerne le matériel végétal, les premiers résultats avaient permis d’estimer à 10 le nombre
d’évènements de transformation stable (intégration dans le génome) obtenus pour environ 100 mg de tissu pour
le meilleur traitement. Cependant, ces résultats se sont avérés peu répétables d'une lignée embryogène à une
autre et différents problèmes sont apparus lors de la réalisation de la méthode à plus grande échelle.
Définir avec précision, en caractérisant chaque étape du processus de transfert de gène et de régénération de
plantes transformées, l'ensemble des paramètres et conditions de la transformation sur cellules de tissus
embryogènes fait donc l’objet du travail présenté dans ce mémoire.
3.3 Programme de travail :
Le programme de travail envisagé comporte deux volets principaux :
· La caractérisation du matériel végétal afin de pouvoir déterminer le type de tissu le plus apte à la
transformation ;
· Les conditions de réalisation de ce transfert : type de tissu végétal, âge du tissu en culture, type
d’agrobactérie, concentration en agrobactérie…
3.3.1 Caractérisation du matériel végétal :
Les tissus embryogènes représentent un matériel hétérogène constitué en milieu de culture gélosé
d'agrégats méristématiques et embryogènes en multiplication ainsi que de proembryons et embryons somatiques
à différents stades de développement. Les lignées embryogènes qui vont servir aux expérimentations sont,
après leur obtention, sélectionnées selon leur capacité de prolifération et de régénération d’embryons.
Afin de disposer de matériel plus homogène, des cultures en suspension ont été développées à partir de
lignées embryogènes obtenues en milieu gélosé. Pour pouvoir établir les meilleures conditions de
transformation, il est nécessaire de connaître leur comportement en croissance dans différentes conditions de
culture et leur caractérisation cellulaire en différents points de leur développement et de leur multiplication (étude
histologique des agrégats embryogènes et/ou méristématiques). Ce travail a aussi été effectué sur les tissus
embryogènes cultivés sur milieu gélosé. Les études ont été menées avec le plus grand nombre de répétitions et
d’essais possibles de façon à obtenir des résultats analysables statistiquement.
3.3.2 Conditions expérimentales du transfert de gènes :
Il s'agit de définir les différents paramètres intervenant lors du transfert de gènes via A. tumefaciens. Les
études préliminaires avaient conduit à retenir une souche d'A.tumefaciens parmi des souches ayant le même
génome chromosomique (souches C58). D’autres souches bactériennes réputées comme hyper virulentes ont
également été testées.
Le choix s’est porté sur deux agrobactéries, EHA105 déjà testée avec la méthode sur explants d‘hypotcotyle
(X.Guo et al, 2007), sur suspensions embryogènes d’autres plantes comme la patate douce (Yu et al, 2007) ou
des tissus embryogènes d’hévéa (Blanc et al, 2006) et AGL1 déjà testée dans la transformation du blé par
exemple (Jones et al, 2005).
Dans ce cadre, des expérimentations ont été conduites pour préciser les concentrations bactériennes
d’utilisation.
Pour la mise au point de la méthode alternative de transformation, l’utilisation d’un gène rapporteur GFP
(« Green Fluorescent Protein ») n’est pas envisageable dans le cas du cotonnier. En effet, l’auto-fluorescence
des tissus de cotonnier est gênante pour la détection de la GFP (en conditions relativement simple d’observation
macroscopique) que les évènements potentiellement transformés pourraient exprimer. Notre choix s’est donc
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porté sur un plasmide autonome, porteur d’un gène rapporteur GUS (codant pour la bêta-glucoronidase),
pCAMBIA 2301. Le test biochimique permettant de révéler l’expression du gène GUS est létale pour les cellules,
il est donc envisagé de prélever une partie des tissus potentiellement transformés pour l’analyse Gus et de
laisser proliférer le reste des agrégats pour régénérer des embryons.
La transformation du plasmide pCAMBIA 2301 dans les souches bactériennes a fait l’objet d’expérimentations
préalables.
Un point critique est apparu lors des études préliminaires concernant l’utilisation de l’antibiotique de sélection
des transformants d’une part et de la décontamination des cultures d’autre part. Le gène de sélection le plus
fréquemment utilisé chez le cotonnier est celui de la résistance à la kanamycine. Or les tissus embryogènes de
cotonnier réagissent de façon assez aléatoire à la présence de kanamycine dans les milieux de culture et à des
doses élevées (plus de 200mg/L de milieu de culture) des échappées de tissus non transformés sont possibles
(Zhang et al, 2001). Les premières études faites au laboratoire, avaient conduit à utiliser l’hygromycine comme
antibiotique de sélection.
Il s’est avéré que la présence d’hygromycine dans les milieux de culture inhibait la formation des embryons
somatiques. Nos efforts se sont donc portés sur la paromomycine (Guerche, 1987) un analogue de la
kanamycine qui permet donc d’utiliser comme gène marqueur le gène NPTII (néomycine phosphotransférase).
La détermination des conditions de sélection avec la paromomycine a constitué une étude préalable
indispensable.
La mise au point d'une méthode rapide, performante et utilisant une quantité réduite de matériel végétal
ouvrira la porte à l'étude du rôle et de l’expression de nombreux gènes chez le cotonnier, mais aussi permettra
de tester rapidement l'intérêt de tel ou tel transgène pouvant conférer des caractéristiques agronomiques
intéressantes.
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