BIOINFORMATIQUE STRUCTURALE MAI 2006 L'objet du TP est de ...

BIOINFORMATIQUE STRUCTURALE
MAI 2006
L'objet du TP est de vous familiariser tout d’abord avec l’utilisation d’outils d’analyses et
d’interrogations de bases de données en biologie. Ces outils seront ensuite appliqués à l’étude
des relations séquence – structure – fonction dans une famille de protéines. Les aminaocyl-
ARNt synthétases seront utilisées comme exemple d’illustration.
LES REPONSES AUX QUESTIONS SONT A RENDRE SUR UNE COPIE SEPAREE.
1 SEULE COPIE EST DEMANDEE PAR BINOME.
Ce TD/TP contient 6 parties :
• PARTIE A: "SEQUENCE RETRIEVAL SOFTWARE (SRS) "
• PARTIE B : UTILISATION D’"ENTREZ" AU NCBI
• PARTIE C : INTERPRO
• PARTIE D : RECHERCHE DE SIMILARITE PAR BLAST
• PARTIE E : RELATIONS SEQUENCE-STRUCTURE-FONCTION
• PARTIE F : D’UNE SEQUENCE A UNE FONCTION ET A UNE
STRUCTURE
Ces parties sont indépendantes et peuvent être traitées librement. Néanmoins, il est
conseillé de suivre la progression proposée.
Les sites Web suivant seront utilisés :
• http://www.infobiogen.fr/
• http://www.ebi.ac.uk
o http://www3.ebi.ac.uk/Services/WebFeat/
• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
• http://pbil.univ-lyon1.fr/
• http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/
Vous allez utiliser des logiciels présents en local sur vos PCs :
• Pour la visualisation des structures 3D, vous allez utiliser 2 logiciels
o SPDBV et O
• Le logiciel Chimera sera utilisé pour visualiser des corrélations séquence –
structure.
• Le logiciel Pymol sera utilisé pour créer des dessins ou figures couleurs de
qualité.
• Le logiciel Indonesia sera utilisé pour trouver des similarités de structures à
partir des coordonnées.
• Les logiciels BioEdit et PFAAT pour la visualisation des alignements multiples
Pour une vision en 3D des structures, les ordinateurs SGI seront utilisés.

PARTIE A: "Sequence Retrieval Software (SRS) "
On utilisera le serveur SRS7 d’Infobiogen
http://www.infobiogen.fr/
Dans la page d’accueil d’Infobiogen, cliquez sur SRS.
En cas de problèmes à Infobiogen, allez à l’EBI (http://srs.ebi.ac.uk/)
1. Familiarisation à la recherche :
Dans le menu "Select Databanks"
• Combien de bases de données sont accessibles par ce serveur ?
• Parmi celles-ci, quelles sont les banques généralistes de séquences de protéines ?
• Quelles différences faites vous entre UNIREF100, UNIREF90, UNIREF50 ?
Pour la suite de cette question, sélectionnez la base "UNIPROT".
Utilisez si nécessaire le menu "Standard query form" ou "Extended query form"
• Combien d’entrées contient cette banque de données ?
• Combien d’entrées sont relatives aux aminoacyl-ARNt synthétases ?
• Combien d’entrées sont relatives aux arginyl-ARNt synthétases ?
• Combien d’entrées sont relatives à l’arginyl-ARNt synthétase humaine ?
2. Recherche de séquences:
Recherchez la séquence dont le numéro d’accès est P21889 ("Primary accession number")
dans la banque UNIPROT.
• De quelle protéine s’agit-il ?
• Donnez quelques informations sur la fonction de cette protéine.
• Quelles sont ses caractéristiques principales : nombre d’acides aminés, poids
moléculaire.
• Quel est le numéro d’accès de cette protéine dans la banque EMBL ?
o A quelle division de la banque EMBL appartient-elle ?
o De quel organisme s’agit-il ?
o Quelle est la longueur de la séquence nucléotidique correspondante ?
o En utilisant les mots clés de la rubrique "Features" ("source", "cds",
"mat_peptide",…), faire un schéma représentant les éléments génétiques
connus de cette séquence sur un schéma.
Pour cette question, vous pouvez consulter les pages d’aide suivantes :
http://www3.ebi.ac.uk/Services/WebFeat/

PARTIE B : Utilisation d’"ENTREZ" au NCBI
On utilisera le site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Recherche dans la banque PUBMED.
1) Recherchez l’article intitulé : "Gapped BLAST and PSI-BLAST : a new generation of
protein database search programs". On utilisera l’index (Preview/Index) pour une recherche
avec combinaison de mots clés.
• Quelle est la date de parution de cet article ?
• Quel est le nom de la publication (nom de la revue)?
• Affichez le résumé
• L’article complet est-il accessible gratuitement en ligne au format PDF ?
• Certains articles ne sont pas accessibles gratuitement, pourquoi ?
• Combien d’articles sont considérés comme proches de celui-ci et répertoriés ?
• Parmi ces articles, combien ont été publiés en 2005 ?
Recherche dans la banque "STRUCTURE"
2) Dans cette banque, recherchez les entrées correspondants aux aspartyl-ARNt synthétases.
• Combien de structures tridimensionnelles sont accessibles ? donnez les codes PDB
• Combien sont d’origine bactérienne ?
• Combien sont d’origine eucaryotique ?
• Combien de structures contiennent des ligands ? Précisez dans chaque cas les ligands
présents et leurs intérêts dans la fonction de cette protéine.
• Combien de structures ont été déterminées par diffraction des rayons X ? Pour chaque
structure, donnez la limite de diffraction des données.
• Combien de structures ont été déterminées par RMN ?
3) Dans cette banque, recherchez les entrées correspondants aux lysyl-ARNt synthétases.
• Combien de structures tridimensionnelles sont accessibles ? donnez les codes PDB
• Combien sont d’origine bactérienne ?
• Combien sont d’origine eucaryotique ?
• Combien de structures contiennent des ligands ? Précisez dans chaque cas les ligands
présents et leurs intérêts dans la réaction d’aminoacylation.
• Combien de structures ont été déterminées par diffraction des rayons X ? Pour chaque
structure, donnez la limite de diffraction des données.
• Combien de structures ont été déterminées par RMN ? A quoi correspondent ces
structures RMN ? Comparez avec les structures RX.
PARTIE C : INTERPRO
On utilisera l’accès aux banques de l’EBI : http://www.ebi.ac.uk ("Bioinformatics Products
and Services")
• Dans Interpro, cherchez la fiche correspondant aux motifs et profils des aminoacyl-
ARNt synthétase de classe II. On pourra par exemple utiliser la séquence de la
protéine dont le code est P21889 ("Primary accession number") dans la banque
UNIPROT.
• Donnez le numéro de cette fiche dans PROSITE (type PS*****)
• Combien y a-t-il de faux négatifs pour ce profil ?
• Combine y a-t-il de faux positifs pour ce profil ?

PARTIE D : Recherche de similarité par BLAST :
Reprendre la protéine dont le numéro d’accès est P21889 ("Primary accession number") dans
la banque UNIPROT.
Allez sur la page d’entrée du pôle de bioinformatique lyonnais : http://pbil.univ-lyon1.fr/
ou alors Blastp au NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
Dans Similarity search, Cliquer sur Blast-protein.
Copier et coller la séquence correspondant à P21889 dans la fenêtre de Blast et lancer la
recherche sur la base UNIPROT-SWISSPROT
Les résultats apparaissent classés par E croissants.
• Donnez la signification du paramètre E-value
• Pour quelle valeur de E trouve-t-on la première séquence qui n’est plus une AspRS ?
o Quel est le pourcentage d’identité pour la HSP ?
• Citez 2 aminoacyl-ARNt synthétases similaires aux AspRS.
• Montrez sur un schéma de la séquence les zones de similarités entre ces 3 aminoacyl-
ARNt synthétases
Multi-alignement (ClustalW)
Sur la page contenant la liste des résultats, inscrire 0.0 dans la case with threshold lesser or
equal, cliquer SELECT puis désélectionner toutes les séquences manuellement.
Ne sélectionner (en cochant) que les séquences d’AspRS suivantes :
• 3 bactéries E. coli, T. thermophilus et M. leprae (suffixe ECO, THETH, MYCLE),
• 3 archaebactéries A. fulgidus, P. kodakaraensis et A. pernix (ARCFU, PYRKO,
AERPE)
• 3 eucaryotes C. elegans, levure (cytosolique) et humain (CAEEL, YEAST, HUMAN).
Cliquer sur EXTRACT puis sur ALIGN. Page suivante, cliquer sur SUBMIT. En examinant
globalement les longueurs de séquences,
• en quoi les 3 séquences d’eucaryotes se distinguent-ils des autres groupes ?
• Les bactéries possèdent une particularité, laquelle? La localiser en utilisant les 3
motifs propres aux aminoacyl-ARNt synthétases de la classe 2 comme repères.
Un alignement partiel de 59 AspRSs.
Récupérer l’alignement de 59 AspRSs sur la page des documents de cours (http://wwwbio3d-igbmc.u-strasbg.fr/~cava/bioinfo/tps/asprs_pir-59.pir)
et sauvez le sur bureau de
votre PC. Comme son nom l’indique, c’est un fichier au format PIR.
A l’aide du logiciel BioEdit (ou PFAAT) disponible sur votre PC, visualisez cet alignement
(menu File, open)
• Les conclusions globales tirées de l’alignement des 9 séquences sont-elles
confirmées ?
• Trouvez les acides aminés strictement conservés dans toutes les séquences.
• Donnez leur position dans la séquence de l’aspartyl-ARNt synthétase d’E. coli
(séquence notée esche coli).

CONSERVED DOMAINS :
Accéder à la page de Blast au NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)
Utiliser Protein-Protein Blast pour la protéine dont le numéro d’accès est P21889 ("Primary
accession number") dans la banque. Entrez la séquence de la protéine dans la fenêtre
correspondante, et en vérifiant que l’option do CD-Search est activée, cliquez sur BLAST
• Donnez le nom et les principales caractéristiques des domaines conservés trouvés dans
cette protéine.
PARTIE E : RELATIONS SEQUENCE-STRUCTURE-FONCTION
1) Effectuez une recherche dans SCOP (http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/) par mot clé
pour trouver l'aspartyl-ARNt synthétase d’E. coli (attention aux symboles utilisés)
• Pourquoi obtient-on 2 réponses pour cette protéine précise? Examiner les 2 réponses.
• Dans quels types de repliements (fold), superfamilles et familles se classent le
domaine catalytique et le domaine amino-terminal?
• Indiquer ces 2 domaines ainsi que les 3 motifs sur un schéma de la séquence.
• Le site catalytique des aminoacyl-ARNt synthétases est-il trouvé dans d’autres
protéines ? si oui lesquelles ? pouvez donner un peu plus de précision sur la similarité
de structure trouvée ?
2) Par un moyen de votre choix, en utilisant SCOP ou ENTREZ, récupérer et sauvez sur votre
bureau les fichiers de coordonnées suivants :
• le complexe AspRS -ARNt de E. coli (2 fichiers, avec et sans aspartyl-adenylate)
• le complexe AspRS-ARNt-ATP de levure
• le complexe AspRS – ARNt de T. Thermophilus
• l’AspRS de P. kodakaraensis.
Décrivez les informations présentes dans ces structures (protéines et ligands présents)
3) Examinez la structure du complexe AspRS-ARNt Asp de levure avec SPDBV. (color by
chain, show Calpha only).
• Quel est l'état oligomérique de la protéine (structure quaternaire)?
• Affichez le monomère A avec son ARNt (color by secondary structure, supprimer les
chaînes latérales).
• Identifiez l'extrémité N-terminale (Glu 68).
• A votre avis, pourquoi les 67 premiers acides aminés ne sont pas présents dans le
fichier PDB ?
Cette protéine comporte 3 domaines: le domaine N-terminal, le domaine catalytique et un
domaine charnière qui les joint.
• Avec quels domaines l'anticodon et le bras accepteur de l'ARNt entrent-ils en contact?
4) Affichez les 3 motifs propres aux aminoacyl-ARNt de la classe 2 (motif 1 : résidus 240-
273, motif 2 : résidus 311-342 et motif 3 : résidus 518-535, numérotation levure). Quel type
de structure forment-ils? (Affichage en Calpha)
Affichez l'ATP présent dans le site catalytique et se centrer dessus.
• Quels types d'interactions ATP-protéines sont visibles?
• Quelle est l’extrémité de l’ARNt qui entre dans le site catalytique ?

5) Affichez les acides aminés strictement conservés dans l’alignement des 59 AspRS fourni.
A l’aide des structures que vous avez à votre disposition, essayez de donner une explication à
la pression de conservation présente à ces positions de la séquence.
6) Exemple d'interaction ARN-protéine (anticodon)
Centrez le complexe sur U35 et n'affichez que les acides aminés 100 à 200 et les bases 30 à
40.
• Avec quels éléments de structure secondaire interagit l'ARNt?
N'affichez les chaînes latérales que pour R119, G121, F127, Q138 et E188 et l'ARNt.
• Quels sont les types d'interactions ARN-protéines visibles ici? (compute Hbonds dans
tools)
7) Superposition des 3 AspRS
Superposez le complexe aspRS-ARNt de T. thermophilus à la structure de levure (Utilisez
Magic fit dans Fit). Superposez également l’aspRS d’archaebactérie à l’ensemble. (Color by
layer).
Les domaines catalytiques étant superposés que constate-t-on pour les autres domaines et pour
l'ARNt (bonne ou mauvaise)?
Au niveau modulaire, la structure de T. thermophilus présente une particularité par rapport à
celle de levure. Laquelle ? Indiquez les résidus aux bornes de la région concernée.
D’après l'alignement de séquences, est-elle spécifique de T. thermophilus ou plus générale ?
La situer sur le schéma de la séquence de levure (question 1).
8) OB fold
Examiner dans SCOP la classification correspondant au repliement du type OB fold. Que
signifie OB?
Récupérer un fichier PDB de la nucléase staphylococcale. Superposer la partie du domaine de
l'aspRS de levure correspondant (S105-T200) et l'OB fold de la nucléase (K6-K97). Pour cela,
cliquer sur pour la superposition des résidus 118, 123 et 127 de l’aspRS respectivement
sur les résidus 15, 20 et 24 de la nucléase. Dessiner le diagramme topologique de l'OB fold.
PARTIE F : d’une séquence à une fonction et à une structure.
L’objectif ici est d’obtenir le maximum d’information à partir d’un fragment de séquence
d’une protéine.
Récupérez ce fragment de séquence dans
• http://www-bio3d-igbmc.u-strasbg.fr/~cava/bioinfo/tps/seq_unknown.txt
1. Il vous est demandé :
a. Le nom et la fonction de la protéine susceptible de correspondre à ce fragment
b. Le nom de l’organisme dont est issue cette protéine.
c. La longueur de la séquence
2. Quelle est référence bibliographique correspondant aux résultats de séquençage de ce
génome ?
3. Trouvez un arbre phylogénétique indiquant la position de cet organisme dans l’arbre de la
vie.
4. Après réflexion, vous devez vous rendre compte que la protéine correspondant à ce
fragment n’est certainement pas active ? Pourquoi, que semble-t-il manquer? Quelle est la
particularité de cette protéine ? Trouvez ce qui manque.
5. Donnez les numéros d’accès dans UNIPROT nécessaire pour la protéine fonctionnelle.
6. Des structures tridimensionnelles d’homologues de cette protéine sont-elles connues ? si
oui, donnez les codes PDB correspondants.
7. Proposez un schéma de la protéine complète en indiquant les régions fonctionnelles
connues.
(Facultatif : illustrez sur un dessin couleur les différents modules en utilisant PYMOL)