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Matériel & Méthodes
ensuite dirigés via l’interface au moyen de gradients de tension et de pression vers l’analyseur
de masse où règne un vide poussé et qui permet la séparation des ions en fonction de leur
rapport masse/charge (m/z). Le spectromètre de masse utilisé est de géométrie Q-TOF
(Quadrupole - Time Of Flight), le Q-TOF Micro (Waters, Manchester, UK). Au cours de nos
expériences l’analyseur de type TOF permet de séparer les ions en fonction de leur vitesse, ellemême
dépendante de leur masse à énergie cinétique constante pour tous les ions. Les analyseurs
TOF mesurent le temps que mettent les ions pour franchir une distance fixe.
4.2.2. Contrôle qualité par spectrométrie de masse ESI dénaturante
Afin de vérifier si notre protéine purifiée possède bien le poids moléculaire attendu, les
échantillons sont concentrés en utilisant des cellules de concentration YM-10 (Vivaspin) jusqu’à
une concentration d’au moins 30 µM. L’analyse par spectrométrie de masse électrospray peut
être réalisée après dessalage par chromatographie liquide en phase inverse sur une colonne C4
ou C8 (Pharmacia). L’échantillon est injecté sur la cartouche, il est dessalé par une solution
H2O, 0,1% acide tri-fluoroacétique, puis la protéine est éluée par une solution à 60%
CH3CN/H2O (9/1 volume/volume), 0,1% acide tri-fluoroacétique. Dans les deux cas,
l’échantillon est injecté à un débit de 5 µL/min. Les paramètres de la source ESI du
spectromètre de masse sont : une tension de capillaire de 3 kV et les voltages du cône
d’échantillonnage et du cône d’extraction sont respectivement de 55 V et 2 V. Les spectres de
masse sont enregistrés dans une gamme de 500-2100 en rapport m/z.
Les différentes données sont enregistrées et traitées par le logiciel Masslynx (Waters).
5. Cristallographie R-X
5.1. Introduction à la cristallographie des rayons X
L’observation de l’arrangement des atomes constituant les macromolécules que nous
cherchons à étudier, implique l’utilisation d’ondes électromagnétiques dont la longueur d’onde
est de l’ordre de grandeur de l’objet à observer. Dans le cas de la cristallographie aux rayons X,
particulièrement adaptée à la visualisation de ces objets, on utilise le rayonnement X dont la
longueur d’onde est de l’ordre de l’Angström (10 -10 m). Lorsqu’une molécule est soumise au
rayonnement X, ses électrons diffusent des rayons X dans toutes les directions. Le signal produit
par une molécule isolée est trop faible pour être mesuré. Par contre, dans un cristal,
l’arrangement tridimensionnel périodique des molécules induit des interférences entre les
rayonnements diffusés par chacune d’elles. Dans certaines directions bien précises (dictées par
la géométrie du cristal), il y a amplification du signal par interférences constructives : c’est le
phénomène de diffraction. Une expérience de diffraction consiste à faire tourner un cristal dans
le faisceau incident de manière à amener tous les plans qui le composent en position de
diffraction et à mesurer l’intensité de chacune des réflexions. A partir de leur intensité et après
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