1 - Bibliothèques de l'Université de Lorraine

Table des Matières
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3. Résultats complémentaires................................................................................................. 223
PARTIE 3
Etude de l’importance des domaines protéiques qui sont additionnels dans
l’ARN:Ψ-synthase Pus7p par rapport à l’enzyme TruD
1. Identification des domaines additionnels de Pus7p par rapport à TruD ............................ 228
1.1. Stratégie utilisée ........................................................................................................ 228
1.2. Résultats obtenus par alignements multiples de séquence........................................ 229
2. Délétions des domaines additionnels en vue de tester leur importance fonctionnelle....... 232
2.1. Raffinement des alignements de séquence par la prise en compte de la structure 2D
des protéines..................................................................................................................... 232
2.2. Production de gènes codant des protéines ou chaque insertion est individuellement
éliminée ............................................................................................................................ 234
3. Production et purification des mutants Δ1, Δ3, Δ4 et Δ5 de l’enzyme Pus7p de S.
cerevisiae.......................................................................................................................... 238
4. Test de l’activité des mutants Δ1, Δ3, Δ4 et Δ5 de l’enzyme Pus7p de S. cerevisiae
240
5. Optimisation des conditions de production et purification de la protéine Pus7 de S.
cerevisiae et du variant Pus7Δ5 en vue d’études structurales .......................................... 242
5.1. Optimisation des conditions de production......................................................... 242
5.2. Optimisation des conditions de purification........................................................ 245
5.3. Production, purification et cristallisation du mutant Pus7Δ5 de S. cerevisiae.... 247
PARTIE 4
Etude du rôle fonctionnel possible des résidus Ψ dans le snRNA U2 de
S. cerevisiae
1. Contexte ............................................................................................................................. 250
2. Démarche expérimentale.................................................................................................... 251
3. Résultats ............................................................................................................................. 254
A. Production et caractérisation des souches de S. cerevisiae portant des délétions
individuelles ou multiples des gènes PUS1, PUS7 et snR81 ........................................... 254
1. Souche ΔPus1ΔPus7............................................................................................... 254
1.1. Approche utilisée pour interrompre les ORF Pus1 et Pus7 dans une même
souche................................................................................................................... 254
1.2. Analyse phénotypique et génotypique de la souche ΔPus1ΔPus7 ................ 255
1.3. Caractérisation de la souche ΔPus1ΔPus7 par analyse de l’activité ARN:Ψsynthase
sur les ARNt Asp , ARNt Val et pré-ARNt Tyr .............................................. 258
2. Souches ΔsnR81, Δ1ΔsnR81, Δ7ΔsnR81 et Δ1Δ7ΔsnR81 ................................... 260
2.1. Approche utilisée pour interrompre le gène codant le snoRNA H/ACA dans
les différentes souches.......................................................................................... 260
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