Remerciements - Bibliothèques de l'Université de Lorraine

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UNIVERSITÉ NANCY I – HENRI POINCARÉ
FACULTÉ DES SCIENCES PHARMACEUTIQUES ET
BIOLOGIQUES
THÈSE
pour l’obtention du grade de
DOCTEUR EN PHARMACIE
Présentée et soutenue publiquement par
THIBAUT EGUETHER
le 30 juin 2009
Titre:
Rôle de la protéine beta-caténine dans la
prolifération du lignage mélanocytaire.
Directeur de thèse : Pr. Jean-Louis MERLIN
JURY
Pr. Jean-Louis Merlin, faculté de pharmacie, Nancy université
Pr. Jean-Yves Jouzeau, faculté de pharmacie, Nancy université
Pr. Philippe Becuwe, faculté des sciences, Nancy université
Président
Examinateur
Examinateur

Imprimatur

Personnel de l’université
UNIVERSITE Henri Poincaré - Nancy 1
FACULTE DE PHARMACIE
DOYEN
Chantal FINANCE
Vice-Doyen
Francine PAULUS
Président du Conseil de la Pédagogie
Pierre LABRUDE
Responsable de la Commission de la Recherche
Jean-Claude BLOCK
Directeur des Etudes
Gérald CATAU
Responsable de la Commission des Relations Internationales
Janine SCHWARTZBROD
Responsable de la Communication
Francine KEDZIEREWICZ
Responsable de la Commission Hygiène Sécurité
Laurent DIEZ
Responsable de la filière Officine : Gérald CATAU
Responsables de la filière Industrie : Isabelle LARTAUD
Jean-Bernard REGNOUF de VAINS
Responsable du CEPH :
Jean-Michel SIMON
(Collège d’Enseignement Pharmaceutique Hospitalier)
Doyen Honoraire : Claude VIGNERON Professeur Emérite : Gérard SIEST
Professeurs Honoraires
Thérèse GIRARD
Michel JACQUE
Lucien LALLOZ
Pierre LECTARD
Vincent LOPPINET
Marcel MIRJOLET
François MORTIER
Maurice PIERFITTE
Louis SCHWARTZBROD
Maîtres de Conférences Honoraires
Marie-Claude FUZELLIER
Françoise HINZELIN
Marie-Andrée IMBS
Marie-Hélène LIVERTOUX
Jean-Louis MONAL
Marie-France POCHON
Anne ROVEL
Maria WELLMAN-ROUSSEAU
Assistante Honoraire
Marie-Catherine BERTHE
1

Personnel de l’université
ENSEIGNANTS
PROFESSEURS
Gilles AULAGNER ………………………………… Pharmacie clinique
Alain BAGREL …………………………………….. Biochimie
Jean-Claude BLOCK ……………………………. . Santé publique
Christine CAPDEVILLE-ATKINSON ……………. Pharmacologie cardiovasculaire
Chantal FINANCE ………………………………… Virologie, Immunologie
Pascale FRIANT-MICHEL ……………………….. Mathématiques, Physique,
Audioprothèse
Marie-Madeleine GALTEAU……………………… Biochimie clinique
Christophe GANTZER ……………………………. Microbiologie environnementale
Max HENRY ………………………………………. Botanique, Mycologie
Jean-Yves JOUZEAU ……………………………. Bioanalyse du médicament
Pierre LABRUDE …………………………………. Physiologie, Orthopédie,
Maintien à domicile
Dominique LAURAIN-MATTAR………………….. Pharmacognosie
Isabelle LARTAUD………………………………… Pharmacologie
Pierre LEROY……………………………………… Chimie physique générale
Philippe MAINCENT………………………………. Pharmacie galénique
Alain MARSURA…………………………………... Chimie thérapeutique
Patrick MENU…………………………………........ Physiologie et physiopathologie
humaine
Jean-Louis MERLIN………………………………... Biologie cellulaire oncologique
Alain NICOLAS……………………………………... Chimie analytique
Jean-Bernard REGNOUF de VAINS…………….. Chimie thérapeutique
Bertrand RIHN……………………………………… Biochimie, Biologie moléculaire
Janine SCHWARTZBROD ………………………... Bactériologie, Parasitologie
Jean-Michel SIMON………………………………... Economie de la santé,
Législation pharmaceutique
Claude VIGNERON………………………………... Hématologie, Physiologie
MAITRES DE CONFERENCES
Monique ALBERT………………………………….. Bactériologie, Virologie
Sandrine BANAS…………………………………… Parasitologie
Mariette BEAUD…………………………………… Biologie cellulaire
Emmanuelle BENOIT……………………………… Communication et Santé
Michel BOISBRUN………………………………… Chimie thérapeutique
Catherine BOITEUX………………………………... Biophysique, Audioprothèse
François BONNEAUX……………………………... Chimie thérapeutique
Cédric BOURA……………………………………... Physiologie
Gérald CATAU……………………………………... Pharmacologie
Jean-Claude CHEVIN………………………………. Chimie générale et minérale
Igor CLAROT………………………………………. Chimie analytique
Jocelyne COLLOMB……………………………….. Parasitologie, Organisation
animale
Joël COULON……………………………………… Biochimie
Sébastien DADE…………………………………… Bio-informatique
Dominique DECOLIN……………………………… Chimie analytique
Béatrice DEMORE…………………………………. Pharmacie clinique
2

Personnel de l’université
Joël DUCOURNEAU………………………………. Biophysique, Audioprothèse,
Acoustique
Florence DUMARCAY…………………………….. Chimie thérapeutique
François DUPUIS………………………………….. Pharmacologie
Raphaël DUVAL…………………………………… Microbiologie clinique
Béatrice FAIVRE………………………………….. Hématologie
Adel FAIZ…………………………………………… Biophysique-accoustique
Luc FERRARI……………………………………… Toxicologie
Stéphane GIBAUD…………………………………. Pharmacie clinique
Françoise HINZELIN………………………………. Mycologie, Botanique
Thierry HUMBERT………………………………… Chimie organique
Frédéric JORAND………………………………….. Santé et Environnement
Francine KEDZIEREWICZ………………………… Pharmacie galénique
Alexandrine LAMBERT……………………………. Informatique, Biostatistiques
Brigitte LEININGER-MULLER……………………. Biochimie
Faten MEHRI-SOUSSI…………………………..... Hématologie biologique
Christophe MERLIN………………………………... Microbiologie environnementale
et moléculaire
Blandine MOREAU………………………………… Pharmacognosie
Maxime MOURER…………………………………. Pharmacochimie
supramoléculaire
Dominique NOTTER……………………………….. Biologie cellulaire
Francine PAULUS………………………………….. Informatique
Christine PERDICAKIS……………………………. Chimie organique
Caroline PERRIN-SARRADO…………………….. Pharmacologie
Virginie PICHON………………………………….... Biophysique
Anne SAPIN……………………………………….... Pharmacie galénique
Marie-Paule SAUDER……………………………… Mycologie, Botanique
Nathalie THILLY……………………………………. Santé publique
Gabriel TROCKLE…………………………………. Pharmacologie
Noëlle VAULTIER………………………………….. Biodiversité végétale et fongique
Mohamed ZAIOU…………………………………... Biochimie et Biologie moléculaire
Colette ZINUTTI……………………………………. Pharmacie galénique
PROFESSEUR ASSOCIE
Anne MAHEUT-BOSSER…………………………. Sémiologie
PROFESSEUR AGREGE
Christophe COCHAUD…………………………….. Anglais
ASSISTANT
Annie PAVIS………………………………………..
Bactériologie
SERVICE COMMUN DE DOCUMENTATION DE L’UNIVERSITE (SCD)
Anne-Pascale PARRET…………………………… Directeur
Jeannine GOLEC……………………………….. Responsable de la section
Pharmacie - Odontologie
3

Serment des apothicaires
SERMENT DES APOTHICAIRES
Je jure, en présence des maîtres de la Faculté, des conseillers de
l’ordre des pharmaciens et de mes condisciples :
Ð’ honorer ceux qui m’ont instruit dans les préceptes de mon art
et de leur témoigner ma reconnaissance en restant fidèle à leur
enseignement.
Ð’exercer, dans l’intérêt de la santé publique, ma profession
avec conscience et de respecter non seulement la législation en
vigueur, mais aussi les règles de l’honneur, de la probité et du
désintéressement.
Ðe ne jamais oublier ma responsabilité et mes devoirs envers le
²malade et sa dignité humaine ; en aucun cas, je ne consentirai à
utiliser mes connaissances et mon état pour corrompre les
mœurs et favoriser des actes criminels.
Que les hommes m’accordent leur estime si je suis fidèle à mes
promesses.
Que je sois couvert d’opprobre et méprisé de mes confrères si j’y
manque.
4

« LA FACULTE N’ENTEND DONNER AUCUNE
APPROBATION, NI IMPROBATION AUX OPINIONS EMISES
DANS LES THESES, CES OPINIONS DOIVENT ETRE
CONSIDEREES COMME PROPRES A LEUR AUTEUR »
5

Remerciements
Remerciements
Aux membres du jury :
Je remercie Monsieur le professeur Jean-Louis Merlin de m’avoir fait
l’honneur de diriger ce travail de thèse. Vous m’avez fait découvrir au long de mon
cursus universitaire combien la recherche dans le domaine de l’oncologie peut-être
passionnante. Soyez assuré de ma sincère gratitude.
Je remercie Monsieur le professeur Jean-Yves Jouzeau d’avoir accepté de
juger ce travail. Vous avez toujours pris le temps de discuter, souvent entre deux
portes, des questions que je me posais sur la recherche et le monde universitaire. Ces
échanges m’ont toujours beaucoup apporté. Soyez assuré de mon profond respect.
Je remercie Monsieur le professeur Philippe Becuwe d’avoir accepté de juger
ce travail de thèse.
A mon laboratoire de Master 2:
Je remercie Monsieur le docteur Lionel Larue pour m’avoir accueilli au sein
du laboratoire de génétique du développement des mélanocytes à l’Institut Curie.
Je remercie Madame le docteur Véronique Delmas pour la direction
scientifique de ce travail au jour le jour.
Je remercie Madame le docteur Anne-Marie Tassin pour son soutien et sa
bonne humeur durant cette année de Master. Vous m’avez fait confiance et avez
accepté de diriger ma thèse de Sciences dans votre nouveau laboratoire à l’Institut
Curie. Je suis heureux de continuer mon parcours scientifique avec vous et de
bénéficier de votre rigueur et de votre expérience de la biologie cellulaire et du
centrosome. Soyez assurée de ma profonde admiration.
Mes remerciements vont également aux autres membres du laboratoire :
Jacky Bonaventure, Laurence Denat, Christine Longvert, Flavie Luciani, Isabelle
6

Remerciements
Puig, Delphine Champeval, Irina Berlin et Sophie Colombo. Votre aide scientifique
et technique m’a été précieuse durant ce travail.
A ma famille:
A ma mère, pharmacien, qui m’a ouvert la voie dans ces études
passionnantes.
A mon père, maître de conférences, qui m’a ouvert la voie dans ce qui sera,
je l’espère, mon futur métier.
Les mots manquent toujours pour exprimer sa reconnaissance aux personnes qui
comptent le plus. Merci à vous pour votre soutien durant ces longues années d’études
(je sais, ce n’est pas fini…). Merci pour votre amour sans faille. Vous êtes mon
modèle et je suis fier d’être votre fils. Je n’oublierai jamais que c’est grâce à vous
que j’en suis là aujourd’hui.
A mon frère. Les désaccords de notre enfance ont laissé place à une certaine
harmonie, inévitable pour deux musiciens… Je suis heureux de la complicité qui
nous unit aujourd’hui.
A mes grands parents et à ma grande tante, merci pour l’amour et l’attention
que vous m’avez toujours témoigné. Vous m’avez laissé des souvenirs d’enfance
heureux, c’est un des plus beaux cadeaux que l’on emporte dans sa vie d’adulte.
Aux autres personnes de cette grande famille, cousins, cousines, oncles,
tantes trop nombreux pour être tous cités, je n’oublie cependant personne : vous
m’avez tous apporté beaucoup, merci d’être toujours là, unis.
A mes amis:
A mes camarades de la faculté, Bastien, Arnaud, Sébastien, Hélène, Nadine,
Aude, Amandine, Carole, Alice, vous qui êtes maintenant mes confrères. Pour tous
ces moments passés ensemble au soleil, au ski, ou simplement sur les bancs des
amphithéâtres Parisot, ou Béné, je vous remercie. Nous avons tous pris des chemins
bien différents et nous illustrons à merveille la diversité de notre formation !!
7

Remerciements
A mes amis de Belmont et aux petits débrouillards, Camille, Fabien,
Charlotte, Pierre, Clothilde, Manu, Adèle, Ameline. Toutes ces colos, animations et
formations à vos cotés restent inoubliables. Je crois que les enfants que l’on nous
confie sortent toujours heureux de nos sessions, et ça c’est magique.
A mes amis du lycée (et d’avant), Fred, Solenn, Nath, Lidwine, Delphine. On
ne se voit pas tous les jours, c’est vrai, mais notre amitié dure depuis si longtemps…
merci d’être toujours présents.
A Amélie. Nous nous sommes rencontrés au collège, nous voilà toujours
aussi complice et plus proche que jamais. Qui pouvait penser alors que tu deviendrais
un jour ma belle sœur ? Je vous souhaite à tous les deux beaucoup de bonheur, vous
le méritez.
8

Sommaire
Sommaire
REMERCIEMENTS 6
SOMMAIRE 9
ABREVIATIONS 11
INDEX DES TABLES 13
INDEX DES FIGURES. 14
RESUME 15
INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE 16
I. LE LIGNAGE MELANOCYTAIRE 16
A. LE MELANOCYTE ET SON CONTEXTE 16
1. Structure de la peau 16
2. Localisation des mélanocytes 18
3. Fonction des mélanocytes 19
B. ORIGINE ET DEVENIR DU MELANOCYTE 20
1. Rappels de développement 20
2. Développement normal des mélanocytes 22
3. Détermination du lignage mélanocytaire 23
C. TRANSFORMATION DES MELANOCYTES : LE MELANOME 25
1. Définitions et épidemiologie 25
2. Développement 26
3. Diagnostic 28
4. Classification 29
a. Classification anatomoclinique. 29
b. Classification de l’American Joint Committee on Cancer 29
5. Facteurs de risque 30
a. Le rôle de l’environnement : l’exposition solaire 30
b. La prédisposition familiale 31
6. Traitements 31
a. Chirurgie 31
b. Autres traitements 31
7. Prévention 32
a. La prévention primaire. 32
b. La prévention secondaire 32
II. LA PROTEINE β-CATENINE 33
A. STRUCTURE DE β-CATENINE 33
B. β-CATENINE UNE PROTEINE MULTIFONCTIONNELLE 34
C. REGULATION DE LA LOCALISATION SUBCELLULAIRE DE β-CATENINE PAR WNT : LA VOIE
WNT/β-CATENINE 35
D. GENES CIBLES DE Β-CATENINE DANS LE LIGNAGE MELANOCYTAIRE 36
E. ROLE DE β-CATENINE DANS LA PROLIFERATION CELLULAIRE ET L’APOPTOSE 38
1. β-caténine et prolifération 38
9

Abréviations
2. β-caténine et apoptose 39
F. ROLE DE β-CATENINE DANS LE LIGNAGE MELANOCYTAIRE 39
1. Rôle de β-caténine dans le développement normal des mélanocytes 39
a. Rôle de β-caténine dans les cellules souches mélanocytaires 40
2. Rôle de β-caténine dans le développement pathologique des mélanocytes 40
III. PROBLEMATIQUE : POURQUOI ETUDIER LE ROLE DE β-CATENINE DANS LA
PROLIFERATION DU LIGNAGE MELANOCYTAIRE. 42
MATERIELS ET METHODES 43
I. SOURIS TRANSGENIQUES 43
II. GENOTYPAGES DES DIFFERENTES LIGNEES DE SOURIS 44
III. TRAITEMENT DES EMBRYONS 44
IV. COLORATION X-GAL DES EMBRYONS 45
V. IMMUNOFLUORESCENCES SUR COUPES D’EMBRYONS 45
VI. TRAITEMENT STATISTIQUE DES DONNEES 46
RESULTATS 47
I. ETUDE DE LA REPARTITION DES MELANOBLASTES DANS LE DERME ET L’EPIDERME AU
COURS DU DEVELOPPEMENT. 47
A. PRINCIPE 47
B. RESULTATS 48
II. ETUDE DE LA MORT CELLULAIRE PAR APOPTOSE. 49
A. PRINCIPE 49
B. RESULTATS 50
III. ETUDE DE LA PROLIFERATION. 51
A. PRINCIPE 51
B. RESULTATS 52
DISCUSSION 55
CONCLUSION 58
BIBLIOGRAPHIE 59
10

Abréviations
Abréviations
ADN
APC
ARN
BrdU
CCN
CRD-BP
CK-1
DAPI
DCT
DKK
dNTP
g
GSK-3
h
ICAT
L
LDL
LEF
LRP
M
MITF
ND
NLS
N.S.
PBS
PCP
PCR
PFA
POU
Sec
Acide Desoxyribonucléique
Adenomatous Polyposis Coli
Acide Ribonucléique
Bromodeoxy-Uridine
Cellules de la Crête Neurale
Coding Region Determinant-Binding Protein
Casein Kinase-1
Dichlorhydrate de 4',6-diamidino-2-phenylindole
Dopachrome Tautomérase
Dickkopf
2’-Desoxynucléotide-5’-Triphosphate
Gramme
Glycogen Synthase Kinase-3
Heure
β-catenin interacting protein
Litre
Low Density Lipoprotein
Lymphoïd Enhancer Factor
LDL-receptor Related Protein
Molaire (mol/L)
Microphtalmia –associated Transcription Factor
Non Déterminé
Nuclear Localization Signal
Non Significatif
Phosphate Buffered Saline
Planar Cell Polarity
Polymerase Chain Reaction
Paraformaldhéyde
Pit-1, Oct-1, Unc-86
Secondes
11

Abréviations
TBP
TEM
TLE
TCF
Tris
WT
X-gal
Tata Binding Protein
Transition Epithélium Mésenchyme
Transducin Like Enhancer of split
T Cell Factor
Tri-(hydroxyméthyl)-aminométhane
Wild Type (sauvage)
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside
12

Index des tables et figures
Index des tables
Tableau 1 : décomptes des mélanoblastes et pourcentage de
mélanoblastes apoptotiques dans l’épiderme en fonction des stades de
développement.........................................................................................50
Tableau 2 : décomptes des mélanoblastes et pourcentage de
mélanoblastes apoptotiques dans le derme en fonction des stades de
développement.........................................................................................50
Tableau 3 : décomptes des mélanoblastes et pourcentage de
mélanoblastes prolifératifs dans l’épiderme en fonction des stades de
développement.........................................................................................52
Tableau 4 : décomptes des mélanoblastes et pourcentage de
mélanoblastes prolifératifs dans le derme en fonction des stades de
développement.........................................................................................53
13

Index des tables et figures
Index des figures.
Figure 1. Représentation schématique de la structure de la peau en trois
dimensions...............................................................................................17
Figure 2. Représentation schématique de la structure de l'épiderme. ...19
Figure 3. Voies de synthèse de la mélanine............................................20
Figure 4. Formation du tube neural .......................................................22
Figure 5. Développement des mélanocytes.............................................24
Figure 6. Homéostasie des cellules souches mélanocytaires. ................25
Figure 7. Schéma général de transformation des mélanocytes en
mélanome. ...............................................................................................27
Figure 8. Règle de l'ABCDaire...............................................................28
Figure 9. Classification pTNM conjointe de l’American Joint Committee
on Cancer et de l’Union Internationale Contre le Cancer, 6 ème édition. .30
Figure 10. Structure de β-caténine et domaines d'interactions
protéine/protéine.....................................................................................34
Figure 11. Multilocalisation et multifonctionnalité de β-caténine.........35
Figure 12. La voie Wnt/β-caténine. ........................................................38
Figure 13. Evolution au cours du développement du nombre de
mélanoblastes dans les compartiments dermique et épidermique..........47
Figure 14. Mise en évidence des mélanoblastes en apoptose. ...............49
Figure 15. Mise en évidence des mélanoblastes prolifératifs.................52
Figure 16. Evolution au cours du développement de la prolifération des
mélanoblastes..........................................................................................53
14

Résumé
Résumé
La protéine β-caténine est une protéine multi fonctionnelle qui joue un rôle important
dans la prolifération, la survie et la différentiation de plusieurs types de cellules ainsi
que dans la détermination du lignage mélanocytaire. Pour étudier son rôle dans
l’évolution de ce lignage au cours du développement, deux mutants murins perte et
gain de fonction de β-caténine ont été développés. Ils présentent tous les deux un
phénotype de robe (le mutant perte de fonction est blanc et le mutant gain de
fonction est gris) du à une diminution du nombre de mélanoblastes par rapport aux
souris sauvages.
Cette étude s’est attachée à étudier la répartition des mélanoblastes dans les
compartiments dermique et épidermique au cours du développement ainsi que les
mécanismes cellulaires en jeu dans l’apparition des phénotypes des souris mutantes.
Les résultats montrent que la diminution du nombre de mélanoblastes se fait
majoritairement dans l’épiderme et que ce phénomène implique une diminution de la
prolifération chez les deux mutants par rapport aux souris sauvages. β-caténine est
une protéine qui possède plusieurs fonctions et de nombreux partenaires. Cette étude
montre une autre de ses facettes en mettant en lumière son rôle fondamental dans la
prolifération des mélanocytes.
15

Introduction – Le lignage mélanocytaire
Introduction bibliographique
Ce travail à pour problématique l’étude de la fonction d’une protéine, β-
caténine, au cours du développement du lignage mélanocytaire. Plus précisément,
nous nous sommes attachés à essayer de comprendre le rôle qu’elle peut jouer dans
la prolifération de ce lignage.
Dans cette introduction, nous allons donc tout d’abord explorer le lignage
mélanocytaire, son contexte, son développement normal et son développement
pathologique : le mélanome cutané. Dans une seconde partie, nous étudierons la
protéine β-caténine, sa structure, son implication dans la prolifération cellulaire et
dans le développement du lignage mélanocytaire.
I. Le lignage mélanocytaire
A. Le mélanocyte et son contexte
Chez les mammifères, les mélanocytes sont localisés dans différents organes : on les
trouve dans la peau, l’œil, et l’oreille interne.
Dans la suite de ce travail nous nous intéresserons uniquement aux mélanocytes de la
peau.
1. Structure de la peau
La peau n’est pas un simple tissu protecteur, c’est un organe complexe qui
tire son origine des différents feuillets embryologiques. Par exemple, certaines
parties de la peau se développent à partir des mêmes tissus que le cerveau et restent
connecté au système nerveux central par l’intermédiaire des nerfs. La peau constitue
donc un avant-poste de notre système nerveux : c’est l’interface entre notre
organisme et l’environnement. Elle permet de ressentir les changements de
température et la douleur mais aussi de développer le sens du toucher
D’une surface de 18000 cm 2 en moyenne chez l’homme adulte, elle est composée
d’environ 2000 milliard de cellules et se structure en trois couches superposées. De
la surface du corps vers la profondeur, on trouve successivement : L’épiderme qui est
un épithélium de revêtement, le derme qui est un tissu conjonctif et l’hypoderme qui
est un tissu adipeux (Fig. 1).
16

Introduction – Le lignage mélanocytaire
Figure 1. Représentation schématique de la structure de la peau en trois
dimensions.
Les trois couches de la peau sont représentées : l'hypoderme, le derme et l'épiderme. Dans
l'hypoderme se trouvent des vaisseaux sanguins et lymphatiques, les glandes sudoripares et du tissu
adipeux. Le derme est la couche la plus épaisse et contient des vaisseaux sanguins et lymphatiques,
des nerfs, le follicule pileux et les glandes sébacées. L'épiderme est la couche la plus superficielle. Il
est pluri-stratifié et contient des terminaisons nerveuses.
L’épiderme est la couche la plus superficielle de la peau. C’est un épithélium
pavimenteux pluristratifié et kératinisé. Il est composé de quatre types de cellules :
les kératinocytes, les cellules de Langerhans, les cellules de Merkel et les
mélanocytes (Fig.2).
Les kératinocytes sont les cellules majoritaires en nombre dans l’épiderme. Ces
cellules progressent de l’intérieur de l’épiderme vers la surface et ce faisant subissent
une évolution morphologique : les cellules s’aplatissent et s’épaississent pour
finalement se transformer en cornéocytes et desquamer à la surface de la peau. A un
instant donné, l’ensemble de ces cellules dans leurs différents états morphologiques
constituent 4 couches : la couche germinative (ou couche basale) qui est la couche où
se renouvellent les keratinocytes, la couche à épines (ou spineuse), la couche
granuleuse et la couche cornée (compacte puis desquamante)
17

Introduction – Le lignage mélanocytaire
Les cellules de Langerhans sont des cellules dendritiques dérivées des Cellules
Souches Hématopoïétiques. Elles sont présentes dans tous les épithéliums
pavimenteux stratifiés chez les mammifères et elles sont dispersées entre les
kératinocytes de la couche à épines de l’épiderme. Leur rôle est d’initier et de
propager les réponses immunes dirigées contre les antigènes appliqués sur la peau :
Après avoir capté l’antigène, les cellules de Langerhans activées quittent l’épiderme
et gagnent les ganglions lymphatiques satellites où elles présentent les déterminants
antigéniques aux lymphocytes T.
Les cellules de Merkel sont situées dans la couche germinative entre les kératinocytes
basaux, au contact d’une terminaison nerveuse libre. Ce sont des mécanorécepteurs
qui auraient également des fonctions inductives et trophiques sur les terminaisons
nerveuses de l’épiderme.
Les mélanocytes ses situent dans la couche basale à la jonction avec le derme. Leur
localisation et leur fonction seront étudiées plus loin.
Le derme est un tissu conjonctif lâche en périphérie et plus dense en profondeur. Il
contient de nombreux vaisseaux sanguins et lymphatiques, des nerfs et des
terminaisons nerveuses sensitives libres et corpusculaires, ainsi que les glandes
sébacées. Le derme assure à la fois la résistance et l’élasticité de la peau.
L’hypoderme constitue la couche la plus profonde de la peau. C’est un tissu
conjonctif lâche richement vascularisé contenant des proportions variables de tissu
adipeux. Il contient les glandes sudoripares et permet la régulation de la température
du corps. De plus, il amortit les chocs et protège les organes profonds des blessures.
2. Localisation des mélanocytes
Chez la souris, la plupart des mélanocytes sont situés dans les follicules
pileux. Ils peuvent aussi se trouver dans les régions à faible pilosité comme la pinae.
Chez l’homme, ils sont localisés dans l’épiderme ils établissent des contacts avec les
kératinocytes adjacents. Les mélanocytes transfèrent la mélanine aux kératinocytes
par l’intermédiaires de vésicules appelées mélanosomes (Fig.2). Chaque mélanocyte
assure ce transfert vers 30 à 40 kératinocytes : c’est l’unité épidermique de
mélanisation. Le ratio mélanocyte/kératinocyte est constant, suggérant que la
prolifération de ces cellules est finement régulée.
18

Introduction – Le lignage mélanocytaire
Figure 2. Représentation schématique de la structure de l'épiderme.
Les quatre couches de l'épiderme sont représentées: la couche basale, la couche épineuse, la couche
granuleuse et la couche cornée. Le mélanocyte est situé à la jonction entre le derme et l'épiderme. Ses
dendrites s'insinuent entre les kératinocytes adjacents pour transférer les mélanosomes, vésicules
contenant la mélanine.
3. Fonction des mélanocytes
Les mélanocytes sont des cellules dendritiques qui ont comme fonction la
mélanogenèse, c’est-à-dire, la synthèse de la mélanine. La mélanine est le pigment
naturel de la peau. Elle est responsable en grande majorité de sa couleur et de celle
des phanères et elle est également connue pour jouer un rôle primordial dans la
protection de la peau contre les rayons ultra-violets. Le terme générique de mélanine
correspond en fait à deux pigments différents : on distingue la phéomélanine, qui est
de couleur jaune orangée, de l’eumélanine qui est de couleur marron-noire. Seule
l’eumélanine protège réellement les cellules contre les rayonnements ultra-violets.
La synthèse de ces deux pigments se fait à partir de la tyrosine qui est oxydée
en Dopa puis en Dopaquinone grâce à la tyrosinase (Fig. 3). L’ajout d’une cystéine
sur la position 2 ou 5 du phénol de la Dopa conduit à la formaton d’intermédiaires
benzothiazines puis à la phéomélanine. La transformation de la dopaquinone en
19

Introduction – Le lignage mélanocytaire
dopachrome puis l’action de la dopachrome tautomérase (Dct ou trp2) et de trp1
conduisent à la formation de l’eumélanine.
Figure 3. Voies de synthèse de la mélanine.
Les voies de synthèse de l'eumélanine et de la phéomélanine sont représentées. Les enzymes
nécessaires à la synthèse de la mélanine sont la Tyrosinase, Dct et Trp1. La Tyrosinase est impliquée
dans les deux premières étapes de la voie de synthèse. Dct et Trp1 sont impliquées dans les dernières
étapes de synthèse de l'eumélanine.
B. Origine et devenir du mélanocyte
1. Rappels de développement
Après la fécondation (cyto et caryogamie), le zygote subit deux types de
modifications : une migration le long des trompes de Fallope qui s’accompagne de sa
segmentation. La segmentation est, en fait, une suite de divisions cellulaires donnant
naissance à des cellules de plus en plus petites. Très tôt les divisions deviennent
asynchrones et les cellules produites sont déterminées vers un devenir particulier.
Ensuite, le zygote devient le blastocyste limité par une couche cellulaire périphérique
continue nommée trophoblaste. Au pôle embryonnaire, les cellules forment une
masse en contact avec le trophoblaste : c’est le bouton embryonnaire. A l’autre pôle
la cavité séparant ces deux ensembles s’appelle le blastocèle.
20

Introduction – Le lignage mélanocytaire
Plus tard, le bouton embryonnaire se transforme en une ébauche de disque
embryonnaire qui sera à l’origine de l’embryon. Il est constitué de l’épiblaste
(ectoderme primaire) et de l’hypoblaste (endoderme primaire). Après la gastrulation
et la mise en place de la chorde, l’embryon se présente sous la forme d’un disque
embryonnaire à trois feuillets : un feuillet dorsal épiblastique devenu l’ectoderme, un
feuillet moyen le chordo-mesoblaste (avec la chorde dans l’axe cranio-caudal et le
mésoblaste latéralement) et un feuillet ventral, l’endoderme.
Ensuite il y a différentiation de la plaque et de la gouttière neurale : en avant du
nœud de Hensen l’ectoderme recouvrant l’axe antéropostérieur s’épaissit. Comme
l’épaississement est plus important au niveau de la partie crâniale, il prend la forme
d’une raquette de tennis. C’est la plaque neurale (ou neuroectoderme) qui va ensuite
s’étendre au niveau caudal. Le reste du feuillet dorsal donne l’ectoderme non neural.
Dans la suite du développement, les bords de la plaque neurale se relèvent pour
former la gouttière neurale qui fait saillie dans la cavité amniotique (Fig. 4). Les
zones de part et d’autre de cette gouttière faisant le lien avec l’ectoderme non neural
forment les crêtes neurales.
Finalement, les bords de la gouttière neurale se rejoignent et fusionnent pour former
le tube neural. Lors de cette fusion, les crêtes neurales se retrouvent isolées dans le
mésenchyme intra-embryonnaire sous-jacent de part et d’autre du tube neural (Fig.4).
21

Introduction – Le lignage mélanocytaire
Figure 4. Formation du tube neural (Gammill and Bronner-Fraser, 2003)
Sont représentées 4 étapes successives de la formation du tube neural. Les bords de la plaque neurale
(mauve) se replient pour former la gouttière neurale. Les bords de la gouttière neurale (vert) se
rejoignent et fusionnent pour former le tube neural. Les crêtes neurales (vert) se retrouvent alors
isolées dans le mésenchyme.
2. Développement normal des mélanocytes
Les mélanocytes dérivent des cellules des crêtes neurales (CCN) (Fig 5), cellules
progénitrices pluripotentes. Dans la région troncale, les cellules précurseur de ces
cellules sont localisées à la bordure de la plaque neurale et de l’ectoderme non
neural. Une transformation morphogénétique permet à ces progéniteurs épithéliaux
de devenir mésenchymaux : c’est la transition épithélium-mésenchyme (Cox et al,
1998). Grâce à cela, les CCN acquièrent la motilité et s’engagent dans la migration.
Des différents chemins de migrations possibles, seules les cellules précurseurs des
22

Introduction – Le lignage mélanocytaire
mélanocytes empruntent la voie dorso-latérale (Le Douarin and Kalcheim, 1999)
(Fig.5). Les CCN entrent alors dans une région appellée MSA (Migrating Staging
Area) située entre la partie dorsale du somite, la partie latérale du tube neural et la
partie ventrale de l’ectoderme (Weston, 1991).
Au niveau de la tête et au niveau du tronc, différents chemins de migrations sont
empruntés par les CCN. Les voies de migrations sont liées au devenir de ces cellules.
Dans les deux cas, les cellules précurseur des mélanocytes empruntent la voie dorsolatérale
(Le Douarin and Kalcheim, 1999).
Les mécanismes qui sous tendent la survie et la prolifération des
mélanoblastes durant le développement sont complexes et mettent en jeu diverses
protéines comme Pax3 (Paired box 3) (Hornyak et al., 2001; Minchin and Hughes,
2008), Sox 10 (SRY-box containing gene 10) (Wegner, 2005), Mitf (Microphtalmia
associated transcription factor) (Opdecamp et al., 1997), Kit (c-kit tyrosine kinase
receptor) (Ito et al., 1999), l’Endothéline-3 et son récepteur EDNRB (Endothelin
Receptor B) (Shin et al., 1999) ou encore la métalloprotéase Adamts20 (Silver et al.,
2008)
3. Détermination du lignage mélanocytaire
La détermination du lignage mélanocytaire est réalisée très tôt au cours du
développement embryonnaire chez la souris (jour embryonnaire 9 (E9)), avant même
le début de la migration des mélanoblastes (Wilson et al., 2004). Un nombre restreint
de mélanoblastes est déterminé. Ce sont les mélanoblastes fondateurs. Un
mélanoblaste est une cellule non pigmentée, promise à devenir un mélanocyte si
aucun événement extérieur ne l'en empêche. Les mélanoblastes précurseurs
prolifèrent puis migrent. Les mélanoblastes migrent entre l'ectoderme de surface et
les somites (E10,5-E11), suivant un gradient temporel rostro-caudal. À E11,5, les
mélanoblastes entrent dans le derme. Ils passent ensuite la membrane basale et
pénètrent dans l’épiderme à partir du jour embryonnaire 12,5 (E12,5) chez la souris
(Mayer, 1973; Yoshida et al., 1996). Tout au long du développement, il existe une
prolifération importante des cellules du lignage puisque, à partir d’un nombre réduit
de cellules fondatrices, se développent plusieurs milliers de mélanoblastes.
23

Introduction – Le lignage mélanocytaire
Figure 5. Développement des mélanocytes.
Cette figure représente une coupe schématique transversale d'un embryon de vertébré, au niveau
troncal et à différentes périodes du développement embryonnaire. Les différentes étapes du
développement des mélanocytes sont représentées du haut à gauche vers le bas à droite. Les cellules
bleues sont les cellules dérivées de la crête neurale, migrant sur la voie dorso-ventrale, entre le tube
neural (TN) et le somite. Les cellules blanches sont les mélanoblastes. Au cours du développement
normal, les mécanismes cellulaires se succèdent: transition épithélium-mésenchyme (Cox et al.),
détermination, prolifération, migration, apoptose et différenciation. Les mélanocytes (M) interagissent
avec les kératinocytes (K) et leur transfèrent la mélanine.
À partir de E15,5 les mélanoblastes migrent vers la matrice des follicules pileux
naissants. Ces mélanoblastes folliculaires se concentrent dans la niche du follicule
pileux, le "bulge". Ces cellules prolifèrent pour assurer le maintien de l'homéostasie
des cellules souches mélanocytaires (Fig. 6). D'autres se différencient en
mélanocytes matures. Un mélanocyte mature est défini comme une cellule
produisant de la mélanine. A la naissance, le mélanocyte est fonctionnel.
24

Introduction – Le lignage mélanocytaire
Figure 6. Homéostasie des cellules souches mélanocytaires.
(A) Les cellules souches mélanocytaires sont situées dans le "bulge" des follicules pileux dans la peau
adulte. Elles peuvent soit proliférer pour se renouveler (flèche violette), soit quitter le "bulge" vers le
bulbe du follicule pileux (flèche rouge) et se différencier en mélanocytes. (B) Les cellules souches
mélanocytaires du "bulge" se divisent afin de produire des cellules filles qui se renouvellent (cellule
violette) et des cellules qui se différencient (cellule rose puis rouge).
C. Transformation des mélanocytes : le mélanome
1. Définitions et épidemiologie
Les mélanomes sont des tumeurs malignes développées aux dépends des
mélanocytes. Le terme naevus, lui, désigne toute hyperplasie des mélanocytes
circonscrite et bénigne dans la peau.
Les tumeurs mélanocytaires sont à distinguer des mélanoses circonscrites
(pigmentations dues à l’hyperfonctionnement des mélanocytes) et des tumeurs
épithéliales non mélanocytaires pigmentées bénignes (kératoses séborrhéiques) ou
malignes (carcinomes basocellulaires).
25

Introduction – Le lignage mélanocytaire
A l’heure actuelle, 2 à 3 millions de cancers de la peau sont détectés chaque année
dans le monde parmi lesquels 132000 mélanomes malins. De plus, bien que
l’évolution dans le temps de l’incidence de ces cancers soit difficile à évaluer, on sait
qu’aux Etats-Unis et en Australie, elle à plus que doublée entre les années 1960 et
1980. Ces cancers sont donc une préoccupation majeure de santé publique.
Le mélanome malin cutané ne représente que 5 à 10% des cancers de la peau, mais il
est le plus agressif puisqu’il représente la première cause de mortalité par cancer
dans les pays industrialisés. Son incidence double tous les 10 ans depuis 50 ans dans
la population caucasienne. En France, on estime cette incidence à 5 à 10 nouveaux
cas pour 100000 habitants et par an.
C’est une tumeur qui touche tous les âges en dehors de l’enfant chez qui le
mélanome est exceptionnel.
La mortalité (1,2 à 1,5 pour 100000 habitants par an en France) tend à augmenter
moins vite que l’incidence ce qui peut-être attribué au diagnostique plus précoce
(Saiag et al., 2002).
2. Développement
Les mélanocytes sont normalement dispersés dans l’épiderme où ils
établissent des interactions hétérotypiques avec les kératinocytes adjacents. La
prolifération d’un groupe de mélanocytes peut former un naevus. Les mélanocytes
sont alors regroupés les uns avec les autres, établissent des interactions
homotypiques et perdent tout contact avec les kératinocytes. Les naevi communs
sont bénins et peuvent rester stables durant des années. En absence de méthode
satisfaisante pour apprécier la fréquence des mélanomes venant des naevi, on admet
que la plupart des mélanomes naissent de novo hors de tout précurseur identifiable.
Le risque de transformation maligne des petits naevi communs est d’ailleurs quasi
nul (Saiag et al., 2002).
L’histogenèse des mélanomes suit la théorie biphasique : le modèle de Clark
(Clark et al., 1984) qui postule que les mélanomes évoluent dans une première phase
horizontalement en nappe (RGP = Radial Growth Phase ou phase d’expansion
horizontale). Les cellules se multiplient au dessus de la lame basale sans la franchir
(phase intraépidermique). Puis il y a un envahissement des couches supérieures de
l’épiderme dans une phase microinvasive. Enfin, les cellules pénètrent profondément
26

Introduction – Le lignage mélanocytaire
le derme dans une phase verticale (VGP = Vertical Growth Phase ou phase
d’expansion verticale).
Le passage de la phase RGP à la phase VGP est critique car le mélanome acquiert
alors des propriétés nouvelles : les cellules sont invasives, la lame basale est
fragmentée et ne fait plus barrière à la progression tumorale. La phase ultime de
transformation du mélanome est alors l’acquisition du pouvoir d’essaimage à
distance ou pouvoir métastatique par les cellules malignes. Les cellules peuvent alors
pénétrer les circulations sanguine et lymphatique et coloniser de nouveaux tissus et
organes.
Figure 7. Schéma général de transformation des mélanocytes en mélanome.
Au cours des différentes étapes de lésions mélanocytaires, les mélanocytes acquièrent de nouvelles
caractéristiques. Dans la peau normale, les dendrites des mélanocytes (en noir et blanc) s'insinuent
entre les kératinocytes (rose). Le nævus apparaît lorsque les mélanocytes commencent à proliférer et à
s'agréger. Le nævus est dit dysplasique quand les mélanocytes prolifèrent de façon incontrôlée. La
phase d'expansion horizontale (RGP) est considérée comme le premier stade de tumorigénicité. La
phase d'expansion verticale (VGP) est considérée comme le premier stade vers le phénotype invasif.
Cette phase mène directement au mélanome métastatique, dans lequel les cellules subissent une
intravasation pour s'infiltrer dans les systèmes vasculaire et lymphatique, puis une extravasation pour
envahir d'autres tissus et former des métastases.
27

Introduction – Le lignage mélanocytaire
3. Diagnostic
Le diagnostic du mélanome est anatomo-clinique. L’interprétation
anatomopathologique est souveraine dans l’affirmation du diagnostic, la prise de
décision thérapeutique et l’évaluation du pronostic.
Le diagnostic clinique repose sur l’analyse morphologique d’une lésion
cutanée habituellement pigmentée et sur l’histoire de cette lésion rapportée par le
malade selon les règles de l’ABCDaire.
Un mélanome se présente habituellement sous la forme d’une lésion asymétrique (A)
à bords (B) irréguliers. Les bords sont souvent encochés ou polycycliques. La
couleur (C) est inhomogène avec des nuances variables dans les teintes du brun au
noir, mais aussi des zones décolorées blanches ou inflammatoires rouges, ou
cicatricielles bleutées.
L’évolutivité se traduit par un diamètre (D) de la lésion supérieur à 6 mm ou
l’augmentation de ce diamètre et par la notion d’évolution/extension (E) permanente
de la lésion changeant non seulement de taille, mais aussi de forme, de couleur et de
relief. Le critère E peut être documenté par des photographies comparatives.
Figure 8. Règle de l'ABCDaire.
La colonne de gauche représente des nævi, celle de droite des mélanomes. La lettre E, pour Évolution,
s'ajoute à cet ABCDaire.
28

Introduction – Le lignage mélanocytaire
Toute lésion suspecte de mélanome doit être excisée en vu d’un examen
histopathologique. L’examen histologique permet d’affirmer la nature mélanocytaire
de la tumeur et sa malignité. Il permet également d’évaluer son degré d’invasion en
profondeur et de mesurer son épaisseur (indice de Breslow = distance entre les
cellules malignes mélanocytaires la plus superficielle et la plus profonde) qui est le
principal facteur pronostic (Saiag et al., 2002)
4. Classification
Les objectifs d’une classification en cancérologie sont multiples : aide à la
détermination du pronostic, aide au choix et à l’évaluation de la stratégie
thérapeutique, échange d’informations entre les différents centres notamment.
a. Classification anatomoclinique.
Cette classification tente de résumer les nombreux profils évolutifs du
mélanome en plusieur grandes catégories :
- Mélanome superficiel extensif (60 à 70% des cas) d’évolution initialement
horizontale puis rapidement verticale
- Mélanome nodulaire (10 à 20% des cas) d’évolution très rapidement verticale
- Mélanome lentigineux qui ont une évolution horizontale pendant des mois
voire des années.
- Mélanome acral (2 à 10% des cas) des paumes, plantes et ongles
- Mélanome de Dubreuilh (5 à 10% des cas) des zones cutanées atrophiques
dégradées par des expositions solaires régulières pendant des décennies (visage du
sujet âgé)
- Mélanomes des muqueuses.
A invasion locale tumorale identique, toutes ces formes ont le même pronostic.
b. Classification de l’American Joint Committee on
Cancer
C’est une classification pronostique basée sur des courbes de survie. Cette
classification a été validée sur la plus vaste analyse multivariée réalisée : plus de
17000 patients inclus suivis pendant plus de 5 ans de façon prospective.
Pour la tumeur primitive (critère T, stades I et II), l’indice de Breslow et
l’ulcération sont les deux plus puissants facteurs prédictifs.
29

Introduction – Le lignage mélanocytaire
Pour l’atteinte ganglionnaire (critère N, stade III), trois facteurs pronostiques
indépendants ont été retenus : le nombre de ganglions métastatiques, le caractère
microscopique (détecté par la technique du ganglion sentinelle) ou macroscopique
(cliniquement palpable) de la métastase ganglionnaire et enfin la présence ou
l’absence d’ulcérations de la tumeur primitive.
Pour les métastases à distance (critère M, stade IV), les métastases cutanées et sous
cutanées à distance puis les métastases pulmonaires ont un meilleur pronostic que les
autres métastases viscérales. Le taux de LDH est un facteur de mauvais pronostic
(Longvert and Saiag, 2008).
D’après Negrier et al, Ann Venereol Dermatol 2005.
Figure 9. Classification pTNM conjointe de l’American Joint Committee on
Cancer et de l’Union Internationale Contre le Cancer, 6 ème édition.
pT = primary Tumor (tumeur primaire) ; N = lymph Nodes (ganglions lymphatiques) ; M = Metastasis
(métastases)
5. Facteurs de risque
a. Le rôle de l’environnement : l’exposition solaire
Le soleil est le seul facteur d’environnement impliqué dans l’épidémiologie
du mélanome. De nombreuses études épidémiologiques descriptives et cas-témoins
attribuent le rôle majeur aux expositions intermittentes et à celles reçues dans
l’enfance. Cependant, il y a des exceptions : les mélanomes du sujet âgé (mélanome
de Dubreuilh) sont à l’évidence liés aux expositions cumulatives. De plus les
mélanomes des plantes et des paumes ne sont pas directement liés aux expositions
solaires (Saiag et al., 2002).
30

Introduction – Le lignage mélanocytaire
b. La prédisposition familiale
Environ 10% des mélanomes surviennent dans un contexte de mélanome
familial (défini comme au moins deux mélanomes sur trois générations).
Sont génétiquement transmises :
- La sensibilité au soleil qui s’exprime par le phototype
- La capacité à générer des naevi qui se traduit par le phénotype naevique c’est
à dire le nombre, la taille et l’aspect des naevi.
6. Traitements
a. Chirurgie
Le seul traitement curatif pour un patient atteint d’un mélanome primaire est
la chirurgie. Celle-ci doit comporter des marges d’exérèse suffisantes pour éviter la
récidive. Le rationnel de cette attitude repose sur la propagation de micrométastases
à partir de la tumeur primitive par l’intermédiaire des vaisseaux sanguins et
lymphatiques. La marge de tissu sain a donc pour but théorique d’éviter cette
propagation (Negrier et al., 2005).
b. Autres traitements
Il n’existe aucune indication de traitement adjuvant par radiothérapie au stade
loco régional même après un curage et rupture capsulaire ganglionnaire. De même,
aucune indication de chimiothérapie adjuvante ne doit être maintenue dans le cas
d’un mélanome localisé : aucune étude clinique contrôlée n’a pu faire la preuve
d’une quelconque efficacité des cytostatiques à ce stade même sur les tumeurs les
plus épaisses. Les études contrôlées de la chimiothérapie sur membre isolé perfusé
ont montré l’absence d’impact de cette méthode sur la survie globale et la survie sans
récidive.
Aucun procédé de vaccination n’a démontré à ce jour d’effets en situation
adjuvante dans le mélanome.
L’interféron alpha possède l’AMM en France dans le mélanome de « mauvais
pronostic initial ». Cependant, l’efficacité de ce traitement en terme de survie globale
est contesté et insuffisamment démontré pour ne faire considérer cette thérapeutique
adjuvante autrement que comme une option (Negrier et al., 2005).
31

Introduction – Le lignage mélanocytaire
7. Prévention
a. La prévention primaire.
Elle est basée sur les conseils de protection solaire ou plus exactement « de conduite
pratique vis à vis du soleil ». Les enquêtes grand public montrent que les français
connaissent les risques de cancers cutanés induits par le soleil mais sans que cela
modifie leurs habitudes solaires. Des campagnes de sensibilisation ont lieu en
France, mais semblent de peu de poids encore. Pour être efficaces, elles doivent être
répétées.
b. La prévention secondaire
Elle est basée sur le dépistage précoce des mélanomes. On peut distinguer :
o L’auto surveillance réalisée par le patient lui-même, qui a l’avantage de pouvoir
être réalisée fréquemment mais qui nécessite une formation par le médecin ou
l’infirmière.
o Le dépistage précoce par le médecin lors de visites régulières. Ce type de dépistage
est essentiellement envisageable pour des sujets à risque. Le personnel para médical,
notamment les infirmières peuvent participer à ce dépistage.
o Les campagnes de dépistage qui permettent de sensibiliser la population au risque
du mélanome, mais ont l’inconvénient de ne toucher le plus souvent que les
personnes acceptant une démarche volontaire de dépistage. Elles doivent être
répétées pour être efficace.
32

Introduction –La protéine β-caténine
II. La protéine β-caténine
A. Structure de β-caténine
β-caténine est une protéine d’environ 88 kDa chez l’homme. La structure primaire de
cette protéine consiste en : (i) une région N-terminale d’environ 130 acides aminés,
région cruciale pour la régulation du niveau cytoplasmique de β-caténine, (ii) une
région centrale de 550 acides aminés qui présente 12 répétitions du domaine ARM
(Armadillo), assurant les interactions protéine-protéine et (iii) une région C-terminale
de 100 acides aminés portant la fonction de transactivation (Fig.10).
La partie N-terminale de β-caténine contient quatre résidus sérine et thréonine
(Ser33, Ser37, Thr41 et Ser45 chez l’homme) hautement conservés entre les
différentes espèces (Peifer et al., 1994). La kinase CK1α (Casein Kinase 1α)
phosphoryle le résidu Ser45 (Liu et al., 2002). La sérine/thréonine kinase GSK-3
phosphoryle les résidus Thr41, Ser37 et Ser33 de manière séquentielle (Hagen and
Vidal-Puig, 2002; van Noort et al., 2002). Les résidus Ser33 et Ser37 phosphorylés
constituent le site de reconnaissance de β-caténine par la protéine β-Trcp, qui est un
composant de la machinerie d’ubiquitination (Aberle et al., 1997; Kitagawa et al.,
1999; Winston et al., 1999).Cette ubiquitination adresse β-caténine au protéasome
pour sa dégradation (Aberle et al., 1997; Winston et al., 1999).
La région centrale de β-caténine présente 12 répétitions du domaine Armadillo
(ARM). Le domaine Armadillo est un type de motif répété de 42 acides aminés et
replié en hélice α . Les différentes hélices sont elles-mêmes reliées par des boucles,
ce qui confère à ce domaine une structure spatiale très allongée. Des mutants de
délétion ont permis de montrer que la région de liaison de β-caténine aux
cadhérines (Orsulic and Peifer, 1996),à APC (Hulsken et al., 1994), aux facteurs
Lef/Tcf (Behrens et al., 1996), et à Mitf (Schepsky et al., 2006), entre autres, est
localisée au niveau des domaines ARM (Fig10).
La région C-terminale de β-caténine porte la fonction de transactivation requise
pour l’activation des gènes par le complexe β-caténine/Tcf (van de Wetering et al.,
1997).
33

Introduction –La protéine β-caténine
Figure 10. Structure de β-caténine et domaines d'interactions protéine/protéine.
Les 12 domaines Armadillo de la protéine β-caténine sont notés de 1 à 12. Les protéines interagissant
avec β-caténine, ainsi que les domaines d'interaction sont indiqués par une ligne noire.
B. β-caténine une protéine multifonctionnelle
β-caténine est présente dans les différents compartiments de la cellule et joue des
rôles différents en fonction de sa localisation subcellulaire (Fig.11). Au niveau
membranaire, β-caténine est impliquée dans l’adhérence cellulaire en reliant les
cadhérines aux filaments d’actine. Au niveau cytoplasmique, elle intervient dans la
voie de signalisation Wnt/β-caténine. Au niveau nucléaire, β-caténine agit comme
facteur de transcription, en association avec les facteurs Lef/Tcf (Lymphoïd
Enhancer Factor/T Cell Factor). Ce complexe est capable de réguler la transcription
de différents types de gènes : (i) des gènes spécifiques du lignage mélanocytaire,
comme Mitf-M (Takeda et al., 2000), (ii) des gènes dont l’expression est restreinte à
certains lignages, comme Brn-2 , (Goodall et al., 2004) et (iii) des gènes ubiquitaires,
comme c-myc ou Cycline D1, impliqués dans le cycle cellulaire (He et al., 1998a;
Shtutman et al., 1999; Tetsu and McCormick, 1999).
34

Introduction –La protéine β-caténine
Figure 11. Multilocalisation et multifonctionnalité de β-caténine.
Les différentes fonctions de β-caténine dépendent de sa localisation subcellulaire. À la membrane, β-
caténine est associée aux cadhérines et à α-caténine et est ainsi impliquée dans l'adhérence cellulecellule.
Dans le cytoplasme, elle est impliquée dans la voie Wnt, associée à GSK3β/Axine et APC.
Dans le noyau, elle interagit avec les facteurs Lef/Tcf pour réguler la transcription de ses gènes cibles.
C. Régulation de la localisation subcellulaire de β-
caténine par Wnt : la voie Wnt/β-caténine
Plusieurs voies de signalisation sont activées par la famille des facteurs Wnt. Ces
cascades de signalisation régulent de façon importante le devenir des cellules : la
voie Wnt/Calcium régule l’adhésion cellulaire et la motilité, la voie PCP (Planar Cell
Polarity) régule la polarité planaire et les mouvements morphogénétiques et la voie
canonique (encore appelée voie Wnt/β-caténine) régule la prolifération cellulaire et
la différencation.
En absence de ligand Wnt (Fig 12A), β-caténine est recrutée au sein d’un complexe
de destruction contenant les protéines APC (Adenomatous Polyposis Coli), axine et
GSK-3 (Glycogen Synthase Kinase 3). β-caténine est phosphorylée par CK1α et
35

Introduction –La protéine β-caténine
GSK-3β sur les sérines et thréonines de la partie N-terminale de β-caténine. Cette
phosphorylation entraîne l’ubiquitination et la dégradation de β-caténine par le
protéasome. Dans le noyau, les gènes cibles de cette voie sont maintenus dans un état
réprimé par les facteurs de transcription de la famille Lef/Tcf complexés à des corépresseurs
de la famille Groucho/TLE (Transducin-like enhancer of split) (Brantjes
et al., 2001; Cavallo et al., 1998; Roose et al., 1998). Les protéines de cette famille
sont des co-répresseurs transcriptionnels recrutant des histones désacétylases ou des
histones sur les promoteurs des gènes cibles (Chen and Courey, 2000; Narlikar et al.,
2002). Ainsi, en absence de Wnt, les niveaux cytoplasmique et nucléaire de β-
caténine sont très faibles. β-caténine est associée aux cadhérines à la membrane
plasmique, ce qui la protège de la dégradation. Les gènes cibles de β-caténine sont
réprimés.
En présence de ligand Wnt (Fig 12B), un complexe se forme entre Wnt, le récepteur
LRP5/6 (LDL-receptor-related proteins 5 and 6) et Frizzled (Fz) (He et al., 2004). Ce
complexe recrute les protéines Dishevelled (Dsh ou Dvl) et axine à la membrane
(Bilic et al., 2007). Le récepteur LRP5/6 est alors phosphorylé par la CK1γ (Casein
kinase 1γ). Cette phosphorylation active le récepteur LRP6. La séquestration de
l'axine à la membrane inhibe l'interaction entre l'axine et GSK-3β (He et al., 2004).
GSK-3 est phosphorylée par Dsh. GSK-3 inactive n'est plus capable de phosphoryler
β-caténine. Il en résulte une accumulation de β-caténine dans le cytoplasme et par
conséquent une augmentation du temps de demi-vie de β-caténine. Au-delà d’un
certain niveau dans le cytoplasme, β-caténine est transloquée dans le noyau où elle
interagit avec les facteurs Lef/Tcf pour activer la transcription de ses gènes cibles.
D. Gènes cibles de β-caténine dans le lignage
mélanocytaire
De nombreux gènes sont connus pour être des cibles de LEF/β-caténine (environ 70).
Cependant, dans le lignage mélanocytaire, les gènes Mitf-M, Brn-2, Dct
(Dopachrome tautomérase) et Nr-CAM (Neuronal Cell Adhesion Molecule) sont
particulièrement importants.
L'enzyme Dct intervient dans la synthèse de la mélanine. C'est un marqueur précoce
des mélanoblastes puisqu'il s'exprime à partir de E10,5 (Hou et al., 2000). Ce gène a
36

Introduction –La protéine β-caténine
été identifié comme une cible de Lef/β-caténine par une analyse de puces à ADN
(Conacci-Sorrell et al., 2002).
Nr-CAM est très fortement exprimée dans les cellules de mélanomes et pourrait
jouer un rôle dans l'initiation de la prolifération cellulaire et la migration.
Mitf est un facteur de transcription dont il existe plusieurs isoformes. L’isoforme M-
Mitf est exprimée uniquement dans le lignage mélanocytaire. Cette isoforme est
capable de réguler des gènes contrôlant deux mécanismes antagonistes : la
différenciation et la prolifération cellulaire des mélanoblastes (Denat, 2007). Enfin,
Brn-2 est un facteur de transcription qui appartient à la famille des protéines à
domaine POU (Pit-1, Oct-1, Unc-86) qui est un domaine de liaison à l’ADN. Ce
facteur a été décrit pour la première fois dans le lignage mélanocytaire comme une
protéine se liant à une séquence particulière exprimée dans toutes les lignées de
mélanomes malins humains testés (Cox et al., 1988). De plus, plusieurs études
montrent que Brn-2 est nécessaire au maintien du phénotype mélanocytaire
(Thomson et al., 1995) Enfin, Brn-2 est associé à la prolifération et à la
transformation des cellules en mélanome (Thomson et al., 1995).
37

Introduction –La protéine β-caténine
Figure 12. La voie Wnt/β-caténine.
(A) En absence de ligand Wnt, β-caténine est dégradée et les gènes cibles sont maintenus silencieux.
(B) En présence de Wnt actif, GSK3 est inhibée et la dégradation de β-caténine est diminuée. Le
complexe Tcf/β-caténine active les gènes cibles de la voie. APC, Adenomatous Polyposis Coli ; β-cat,
β-caténine ; CBP, Creb-binding protein ; CK, Casein Kinase; DKK, Dickkopf ; DSH, Dishevelled ;
GBP, GSK3-binding protein ; GSK, Glycogen Synthase Kinase ; LRP, LDL receptor-related protein ;
sFRP, secreted Frizzled-related protein; Tcf, T-cell factor.
E. Rôle de β-caténine dans la prolifération cellulaire et
l’apoptose
Différentes expériences génétiques de perte et gain de fonction ont révélé le rôle de
β-caténine dans de nombreux processus cellulaires comme la détermination, la
prolifération cellulaire et l’apoptose.
1. β-caténine et prolifération
Au cours du développement, Lin et collaborateurs ont montré que β-caténine est
impliquée de façon primordiale dans la prolifération et la survie des progéniteurs
cardiovasculaires via la régulation du facteur de transcription Islet1 chez la souris
(Lin et al., 2007). Dans les cellules de carcinomes du côlon, Tetsu et collaborateurs
ont montré que β-caténine active la transcription du proto-oncogène cycline D1
(Tetsu and McCormick, 1999). De plus He et collaborateurs ont montré que
38

Introduction –La protéine β-caténine
l’expression de l’oncogène C-Myc est activée par β-caténine dans des cellules de
cancer colorectal (He et al., 1998b). Il existe également des cibles moins ubiquitaires
de β-caténine impliquées dans la prolifération. Il a été démontré in vitro que
l’expresion de Brn-2 - qui est un facteur de transcription restreint au lignage
mélanocytaire - est régulée par β-caténine et contrôle la prolifération dans les
cellules de mélanomes (Goodall et al., 2004). Enfin, Carreira et collaborateurs ont
montré que la protéine M-Mitf – qui est un facteur de transcription spécifique des
mélanocytes dont l’expression est régulée par β-caténine – régule la progression du
cycle cellulaire à travers la régulation de p21 et de p27 (Carreira et al., 2005;
Carreira et al., 2006).
2. β-caténine et apoptose
Ces dernières années, des études ont mis en lumière les liens entre β-caténine et
apoptose. Brault et collaborateurs ont observé qu’en inactivant spécifiquement β-
caténine dans la région d’expression de Wnt-1, la quantité de CCN apoptotiques est
augmentée dès E9 (Brault et al., 2001). Nishimura et collaborateurs ont montré que
dans les cellules souches mélanocytaires, la perte de Bcl2 -qui est une cible
transcriptionnelle indirecte de β-caténine- entraîne une apoptose sélective excluant
les mélanocytes différenciés (Nishimura et al., 2005). Enfin des travaux récents ont
montré qu’une inactivation de la protéine de liaison à l’ARN CRD-BP (Coding
Region Determinant-Binding Protein) -qui est une cible transcriptionnelle de β-
caténine- résulte en une induction de l’apoptose (Elcheva et al., 2008)
F. Rôle de β-caténine dans le lignage mélanocytaire
1. Rôle de β-caténine dans le développement normal
des mélanocytes
β-caténine est impliquée dans de nombreux évènements au cours du développement,
notamment la formation des mélanocytes. Les facteurs Wnt impliqués dans le
lignage mélanocytaire sont Wnt-1 et Wnt-3a. Ces deux facteurs sont impliqués dans
la détermination des cellules dérivées de la partie dorsale du tube neural et le devenir
des mélanocytes. En effet, Ikeya et collaborateurs ont montré que les souris
déficientes en facteurs wnt 1 et wnt 3a n’ont pas de mélanoblastes (Dunn et al., 2000;
Ikeya et al., 1997). De plus, β-caténine est exprimée dans les mélanoblastes et les
39

Introduction –La protéine β-caténine
mélanocytes durant le développement (Butz and Larue, 1995). Des expériences de
perte et de gain de fonction, dans de nombreuses espèces, ont permis de montrer que
β-caténine est directement impliquée dans la détermination des mélanoblastes. En
effet, chez le poisson-zèbre, la surexpression de β-caténine dans les cellules de la
crête neurale avant leur migration induit la formation de cellules pigmentaires
(Dorsky et al., 2000). Chez la souris, il a été montré que la perte de fonction
conditionnelle de β-caténine dans les cellules de la crête neurale mène à une absence
totale de mélanoblatses. (Hari et al., 2002).
a. Rôle de β-caténine dans les cellules souches
mélanocytaires
La voie Wnt/β-caténine joue un rôle crucial à la fois dans le maintien des cellules
souches mélanocytaires dans un état non différencié et le démarrage de leur
programme de différenciation en mélanocytes. En effet, le devenir des cellules
souches mélanocytaires est régulé par l'interaction entre Wnt et différents facteurs de
transcription (Lang et al., 2005; Sommer, 2005). En absence de Wnt, Pax3 se lie aux
facteurs Lef/Tcf et recrute le co-répresseur Groucho à l'ADN. Ainsi, Pax3 réprime
l'expression du gène Dct et les cellules souches restent dans un état non différencié.
En présence de Wnt, l'activation de β-caténine abolit la répression du promoteur du
gène Dct médiée par Pax3 et Mitf prend la place de Pax3 sur le promoteur. Ainsi,
l'expression du gène Dct est activée et les cellules souches commencent leur
différenciation.
2. Rôle de β-caténine dans le développement
pathologique des mélanocytes
β-caténine est impliquée dans le développement pathologique des mélanocytes. Le
rôle de β-caténine dans les mélanomes a été suggéré pour la première fois en 1996
par l'identification d'une forme mutée de β-caténine comme étant un antigène
spécifique des mélanomes reconnus par des lymphocytes infiltrés dans la tumeur
(Robbins et al., 1996). La découverte d'une surexpression de β-caténine dans environ
27% de lignées de mélanome a confirmé le rôle majeur joué par la voie Wnt/βcaténine
dans les mélanomes (Rubinfeld et al., 1997). D'autres études confirment que
β-caténine est retrouvée fréquemment dans le cytoplasme ou le noyau des
mélanomes (Rimm et al., 1999). Cependant, le regroupement de différentes analyses
40

Introduction –La protéine β-caténine
montre que 9 lignées de mélanome sur 107 (soit 8,5%) présentent une mutation du
gène β-caténine (Rubinfeld et al., 1997) alors que 7 mélanomes in vivo sur 210 (soit
3,3%) présentent de telles mutations (Demunter et al., 2002; Larue and Delmas,
2006; Reifenberger et al., 2002; Rimm et al., 1999). De ces résultats, nous pouvons
tirer deux conclusions.
D'une part, les mutations de β-caténine retrouvées dans les mélanomes ne peuvent
pas expliquer les 27% d'activation anormale de la voie Wnt/β-caténine. D'autres
protéines liées à cette voie sont donc impliquées. L'expression de DKK1, DKK2 et
DKK3 est diminuée dans de nombreux mélanomes (Kuphal et al., 2004). Une
mutation de APC produisant une protéine tronquée a été retrouvée dans 1 lignée de
mélanome humain sur 40 (Worm et al., 2004). Une mutation de APC a été retrouvée
dans 1 mélanome sur 37 (Reifenberger et al., 2002). Des mutations de ICAT ont été
retrouvées dans 1 mélanome sur 37 (Reifenberger et al., 2002). L'expression de
ICAT est diminuée de 2 à 5 fois dans 28 mélanomes sur 36. Enfin, l'expression de
LEF1 est augmentée dans certaines lignées de mélanomes (Henderson et al., 2002;
Murakami et al., 2001). Cependant, ces résultats ne suffisent pas à expliquer les 27%
d'activation anormale de la voie Wnt dans les mélanomes et d'autres protéines sont
nécessairement impliquées.
D'autre part, la fréquence de mutation de β-caténine est plus importante dans les
mélanomes in vitro que dans les mélanomes in vivo. Deux hypothèses peuvent
expliquer ces chiffres: (i) soit les mutations de β-caténine surviennent de façon
stochastique dans les cellules de mélanome en culture et procurent un avantage
prolifératif à la cellule qui est ainsi sélectionnée au cours de la culture ; (ii) soit les
mutations de β-caténine sont présentes dans la tumeur primaire et favorisent
l'immortalisation et donc la mise en culture des cellules portant la mutation (Larue
and Delmas, 2006).
Les conséquences de l'activation de β-caténine dans les mélanocytes ne sont pas
encore connues. Cependant, il a été montré que l'expression ectopique de β-caténine
dans des lignées de mélanomes n'exprimant pas de β-caténine nucléaire endogène
induit la prolifération de ces cellules, ainsi que leur croissance clonale (Widlund and
Fisher, 2003).
41

Introduction –problématique
III. Problématique : pourquoi étudier le rôle de β-
caténine dans la prolifération du lignage
mélanocytaire.
β-caténine joue un rôle dans la détermination du lignage mélanocytaire, donc dans
les phases précoces du développement. De plus, les facteurs wnt jouent un rôle dans
la différentiation des cellules de l’épiderme et la formation des follicules pileux
(Huelsken et al., 2001). La problématique est de savoir si la voie wnt/β-caténine peut
avoir un rôle dans les étapes plus tardives du développement du lignage
mélanocytaire. Le but de cette étude est d’établir le rôle de β-caténine non plus dans
la détermination du lignage mélanocytaire mais dans son évolution au cours du
développement.
Dans cette optique, la stratégie utilisée au laboratoire est l’étude de mutants gain et
perte de fonction pour β-caténine chez la souris. Le mutant gain de fonction (bcat sta )
a été obtenu par l’expression d’une forme stabilisée de β-caténine dans le lignage
mélanocytaire. Le mutant perte de fonction (bcat∆Ex2-6) a été obtenu par
l’inactivation du gène de β-caténine par le système Cre /LoxP spécifiquement dans le
lignage mélanocytaire. Les souris ayant toutes un fond génétique C57bl/6 sont de
couleur noire. Les deux mutants obtenus présentent un phénotype de robe: le mutant
gain de fonction est gris tandis que le mutant perte de fonction est blanc (Figure
13A). L’hypopigmentation où l’absence de pigments est due à une diminution ou une
absence de pigments dans les follicules pileux.
Les travaux précédents ont montré une réduction importante du nombre des
mélanoblastes au cours du développement (Fig 13B) chez les mutants gain et perte
de fonction. La diminution est visible dès le jour embryonnaire 12,5 (E12,5) et elle
s’accentue pour atteindre environ 65% chez le mutant gain de fonction et plus de
90% chez le mutant perte de fonction à E15,5.
Les expériences mises en place dans le cadre de ce projet de thèse ont eu pour but
de définir les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans cette
réduction du nombre de mélanoblastes.
42

Matériel et méthodes
Matériels et Méthodes
I. Souris transgéniques
Les différentes lignées de souris sont hébergées dans une animalerie EOPS
(Exempte d’Organisme Pathogène Spécifique).
Les souris gain de fonction bcat sta ont été produites au laboratoire. Elles ont été
obtenues par l’expression d’une forme stabilisée de β-caténine sous contrôle du
promoteur de la tyrosinase qui est spécifique du lignage mélanocytaire. Les souris
utilisées pour ce projet ont été croisées vingt fois en retour sur le fond génétique
C57BL/6.
Les souris perte de fonction bcat∆ex2-6 ont été produites par le laboratoire de R
Kelmer (Max Plank Institute of Immunobiologie, Freiburg) (Brault et al., 2001).
Elles ont été obtenues par l’inactivation spécifique du gène de la β-caténine dans le
lignage mélanocytaire grâce au système Cre/LoxP. Les souris utilisées ont été
croisées dix à onze fois en retour sur le fond génétique C57BL/6.
Les souris Tyr ::Cre ont été produites au laboratoire (Delmas et al., 2003). La
recombinase Cre est exprimée spécifiquement dans le lignage mélanocytaire grâce au
promoteur de la tyrosinase. Les souris utilisées ont été croisées dix à onze fois en
retour sur le fond génétique C57BL/6.
Les souris Dct ::LacZ ont été obtenues par le laboratoire du Dr Jackson (MRC
Human Genetics Unit, Western General Hospital, Edimburg, UK). Le promoteur Dct
étant spécifique du lignage mélanocytaire, ces souris expriment le gène rapporteur
LacZ de façon spécifique dans ce lignage. Les souris utilisées pour le croisement
avec les souris bcat sta et les souris bcat∆ex2-6 ont été croisées onze fois en retour sur
le fond génétique C57BL/6.
Le croisement des souris Tyr ::Cre avec celles de la lignée bcat∆ex2-6 dont les exons
2 à 6 du gène de la β-caténine sont entourés par 2 sites LoxP permet le défloxage et
l’inactivation du gène de la β-caténine spécifiquement dans le lignage mélanocytaire.
Les croisements avec les souris transgéniques Dct::LacZ (Mackenzie, 1997) des
lignées bcat∆ex2-6 et bcat sta permettront de mettre en évidence les mélanoblastes.
43

Matériel et méthodes
II. Génotypages des différentes lignées de souris
L’ADN est extrait à partir des queues de souris prélevées lors du marquage
des animaux. Les queues sont incubées toute la nuit à 55°C dans une solution
contenant 50mM de KCl, 10mM de Tris pH8,8 à 25°C, 0,1% triton, 0,4µg/ml de
protéinase K, 0,005% tween 20. La protéinase K est ensuite inactivée par chauffage
pendant 20 minutes à 95°C. Les réactions de PCR (Polymérase Chain Reaction) sont
réalisées avec 1µl de cette solution.
L’ADN est amplifié par PCR en utilisant 0.5 unité de Taq polymérase en présence de
0.2mM dNTP, 1mM de chaque amorce, 5mM KCl, 10mM Tris HCl pH8.3, 0.1%
triton X-100, 1.5mM MgCl2. La réaction d’amplification est initiée par trois cycles
longs d’amplification (1mn à 94°C, 1mn à 58°C, 1mn à 72°C) suivis de trente cycles
courts (30s à 94°C, 30s à 58°C, 30s à 72°C). Une étape supplémentaire d’élongation
à 72°C pendant 10mn est ajoutée à la fin des cycles. Pour chaque lignée de souris
transgéniques, des amorces spécifiques sont utilisées. Le couple sens LL125 5’-GTC
ACT CCA GGG GTT GCT GG-3’ et antisens LL296 5’-CCG CCG CAT AAC CAG
TGA-3’ amplifie un fragment de 473 pb spécifique de Cre. Les amorces sens :
LL347 5’-TAC ACT ATT GAA TCA-3’, et antisens LL348 5’-CAC CAT GTC
CTC TGT CTA TCC-3’, LL349 5’-AAG GTA GAG TGA TGA AAG TTG TT-
3’amplifient un fragment de 221pb pour l’allèle sauvage, un fragment de 324pb pour
l’allèle « floxé ». Les amorces sens : LL220 5’-GCG TTG GCA ATT TAA CCG
CC-3’ et antisens LL221 5’-CAG TTT ACC CGC TCT GCT AC-3’amplifient un
fragment de 429pb pour le gène LacZ.
III. Traitement des embryons
Les femelles porteuses d’embryons sont sacrifiées au stade embryonnaire
voulu et la corne utérine est prélevée. La corne est ensuite disséquée dans du PBS
froid pour en extraire les embryons. Ceux-ci sont alors fixés dans du
paraformaldhéyde (PFA) concentré à 4% pendant 6 h ou durant la nuit en fonction
des expérimentations. Ils sont ensuite enrobés dans un milieu d’enrobage OCT
Tissue-Tek® (Sakura Finetek Europe).
44

Matériel et méthodes
IV. Coloration X-Gal des embryons
Les embryons prélevés sont pré-fixés par le glutaraldéhyde concentré à
0,25%. Après plusieurs rinçages, ils sont incubés dans une solution perméabilisante
(MgCl2 2mM, Na-deoxycholate 0,01%, NP-40 0,02%) durant 30minutes, puis durant
3 à 48h dans la solution de coloration (Ferricyanide, Ferrocyanide, MgCl2, NP-40
0,02%, Na-deoxycholate 0,01% et X-Gal 0,04%). Enfin les embryons sont fixés dans
le paraformaldéhyde à 4%.
Les mélanoblastes marqués par la coloration X-Gal sont bleus et sont donc
visibles à l’œil nu. Les comptes de mélanoblastes sont effectués sur les embryons
totaux et sur les coupes d’embryons au niveau troncal après coloration.
V. Immunofluorescences sur coupes d’embryons
Des coupes de 0,7 microns sont réalisées dans la partie troncale des
embryons. Après lavage par une solution de PBS (Biowest) et de Tween 20 à 0,1%,
les lames sont bouillies dans du tampon citrate durant 20 minutes (solution de citrate
de sodium à 0,01M et Tween 20 à 0,025% ramenée à pH6) pour découvrir les
antigènes. Pour éviter les marquages non spécifiques les lames sont incubées 20
minutes avec une solution de PBS-tween et de sérum de singe à 5%. Les anticorps
primaires sont alors déposés. L’incubation se fait durant la nuit. Le lendemain les
lames sont lavées à nouveau dans la solution de PBS-tween et les anticorps
secondaires sont déposés et incubés à 37°C pendant une heure. Les lames sont
ensuites marquées par le DAPI et montées avec le liquide de montage gel/mount®
(Biomeda Corp.)
Les anticorps utilisés lors des immunofluorescences anti caspase-3-clivée sont les
anticorps primaires anti β-galactosidase polyclonal de chèvre (Biogenesis) et anti
caspase-3-clivée polyclonal de lapin (Cell signaling). Les anticorps secondaires sont
les anticorps Alexa 555 anti chèvre et Alexa 488 anti lapin (Molecular probes).
Les anticorps utilisés lors des immunofluorescences anti BrdU sont les
anticorps primaires anti β-galactosidase polyclonal de chèvre (Biogenesis) et
anticorps anti BrdU monoclonal de souris (BD Biosciences). Les anticorps
secondaires sont les anticorps Alexa 555 anti chèvre et Alexa 488 anti souris
(Molecular probes). Pour ces immunofluorescences, le BrdU est injecté en deux fois
au temps t 0 puis au temps t 0 +20min. (injection totale de 100µg par gramme de masse
45

Matériel et méthodes
corporelle). Le sacrifice pour récupérer les embryons est effectué deux heures après
la première injection.
VI. Traitement statistique des données
L’ensemble des analyses statistiques effectuées sur les données issues des
expérimentations ont été effectuées grâce au logiciel StatEl® (Adsciences). Les
moyennes ont été comparées à l’aide du test de Student et les pourcentages observés
ont été comparés grâce au test du χ 2 ou à défaut, grâce au test p exact de Fisher.
46

Matériel et méthodes
Résultats
I. Etude de la répartition des mélanoblastes dans le
derme et l’épiderme au cours du développement.
Les résultats présentés dans cette section proviennent de manipulations
majoritairement effectuées par Aurélie Herbette, précédemment au laboratoire, que
j’ai finalisées.
A. Principe
Pour connaître le nombre de mélanoblastes dans les compartiments dermique et
épidermique, des coupes d’embryons sur un bruit de fond Dct::LacZ ont été
effectuées à différents stades embryologiques. La coloration par X-Gal permet de
visualiser à l’œil nu les mélanoblastes qui apparaissent en bleu (Fig. A). Chaque
nombre de mélanoblastes a été déterminé à partir de 65 à 136 sections sur au moins
deux embryons.
Figure 13. Evolution au cours du développement du nombre de mélanoblastes
dans les compartiments dermique et épidermique.
A : Coupes histologiques au niveau troncal d’embryons des 3 lignées de souris étudiées. B : Nombre
de mélanoblastes dans l’épiderme et dans le derme par section aux différents stades embryologiques.
Les histogrammes verts représentent les données des mutants perte de fonction, en bleu celles des
souris sauvages et en rouge celle des mutants gain de fonction.
47

Résultats
B. Résultats
Dans l’épiderme, on constate une augmentation importante du nombre de
mélanoblastes au cours du développement chez les souris sauvages (plus de 300 fois
plus de mélanoblastes à E15,5 qu’à E11,5). L’augmentation chez le mutant gain de
fonction est réduite (environ 70 fois plus de mélanoblastes à E15,5 par rapport à
E11,5). Elle est minime chez le mutant perte de fonction (à peine 10 fois plus de
mélanoblastes à E15,5) (Fig.2 B). Pour chacun des stades étudiés, les différences
constatées entre chaque mutant et les souris sauvages sont significatives avec un
risque d’erreur p inférieur à 10 -5.
Dans le derme, on constate que les variations dans le nombre de mélanoblastes au
cours du développement sont beaucoup moins importantes que dans l’épiderme (au
maximum deux fois plus entre les stades E11,5 et E12,5) pour les souris sauvages
(Fig.2 B). De plus, ces variations ne sont pas orientées vers une augmentation ou une
diminution du nombre de mélanoblastes entre les stades E11,5 et E15,5. Il semble
donc qu’il y ait une relative stabilité du nombre de mélanoblastes dans le derme au
cours du développement. Les différences dans les nombres de mélanoblastes entre
les mutants et les souris sauvages montrent, comme pour l’épiderme, une tendance à
la diminution sur l’ensemble des stades chez le mutant gain de fonction et à partir de
E12,5 chez le mutant perte de fonction.
Pour chacun des stades étudiés, à la fois dans le derme et l’épiderme, les différences
constatées entre chaque mutant et les souris sauvages sont significatives avec un
risque d’erreur p au moins inférieur à 3,8.10 -4 . Seule la différence entre le mutant
perte de fonction et les souris sauvages au stade E13,5 n’est pas significative.
Pour les deux mutants les variations constatées dans l’épiderme corroborent dans
l’ensemble les observations faites avec les comptes de mélanoblastes sur les
embryons in toto. La réduction du nombre de mélanoblastes peut être due à une
augmentation de l’apoptose ou encore à une réduction de la prolifération
48

Résultats
II. Etude de la mort cellulaire par apoptose.
A. Principe
Pour connaître le nombre de mélanoblastes apoptotiques, la présence de la
caspase-3-clivée est détectée sur des coupes d’embryons ayant un fond génétique
Dct::LacZ à différents stades embryologiques.
Grâce à une double immunofluorescence, la détection de la β-galactosidase permet
d’identifier les cellules du lignage mélanocytaire, celui de la caspase-3 clivée permet
d’identifier les cellules en apoptose. La colocalisation des deux marquages indique
alors un mélanoblaste en apoptose (Fig. 3A).
Les comptes de mélanoblastes sont effectués à la fois dans le derme et dans
l’épiderme. Si la limite de l’épiderme est relativement aisée à caractériser, la limite
de profondeur du derme est difficile à estimer très précisément (Fig. 3B). Les
comptes de mélanoblastes ont été effectués à partir de 20 à 108 sections et sur un à
quatre embryons.
Figure 14. Mise en évidence des mélanoblastes en apoptose.
Cette figure représente différentes photographies d’une même coupe embryonnaire au stade de
développement E13.5. On peut observer une cellule possédant le double marquage de la β-
galactosidase et de la caspase-3 clivée. B. Limites du derme et de l’épiderme. Ep : Epiderme, De :
Derme.
49

Résultats
B. Résultats
Epiderme
Souris
Stade
Nombre
de
sections
Nombre de
cellules
β-gal+
Nombre de
cellules
β-gal+ par
sections
Nombre
de
cellules
caspase+
Pourcentage
de cellules
caspase+
Bcat
∆ex2-6
E12,5 40 34 0,85 0 0%
E13,5 103 106 1,03 0 0%
E14,5 112 163 1,46 0 0%
E12,5 43 35 0,81 0 0%
WT
E13,5 108 539 4,99 0 0%
E14,5 35 1100 31,43 0 0%
E12,5 21 13 0,62 0 0%
Bcat*
E13,5 108 160 1,48 0 0%
E14,5 29 454 15,66 0 0%
Tableau 1 : décomptes des mélanoblastes et pourcentage de mélanoblastes
apoptotiques dans l’épiderme en fonction des stades de développement.
Derme
Souris
Stade
Nombre
de
sections
Nombre de
cellules
β-gal+
Nombre de
cellules
β-gal+ par
sections
Nombre
de
cellules
caspase+
Pourcentage
de cellules
caspase+
Bcat
∆ex2-6
E12,5 40 145 3,63 5 3,45%
E13,5 103 120 1,17 6 5%
E14,5 112 52 0,5 0 0%
E12,5 43 119 2,77 1 0,8%
WT
E13,5 108 355 3,29 12 3,4%
E14,5 35 104 2,97 0 0%
E12,5 21 112 5,33 0 0%
Bcat*
E13,5 108 98 0,91 3 3,1%
E14,5 29 40 1,38 0 0%
Tableau 2 : décomptes des mélanoblastes et pourcentage de mélanoblastes
apoptotiques dans le derme en fonction des stades de développement.
50

Résultats
marqueurs
Dans l’épiderme, il est intéressant de noter qu’aucune colocalisation des
des mélanoblastes et de l’apoptose n’a été observée à aucun stade
embryonnaire et pour aucune des lignées de souris. Il semble donc que les
mélanoblastes ne meurent pas par apoptose dans ce compartiment durant les phases
du développement observées.
Dans le derme, on constate qu’au stade E14,5, aucune des lignées de souris ne
présente de mélanoblastes apoptotiques. Pour les stades E12,5 et E13,5, les
pourcentages de mélanoblastes en apoptose chez le mutant gain de fonction et chez
les souris sauvages sont comparables (les différences observées ne sont pas
significatives selon le test du p exact de Fisher). Pour le mutant perte de fonction, les
différences observées aux stades E12,5 et E13,5 sont plus importantes que pour le
mutant gain de fonction, cependant, les variations observées ne sont pas
significatives pour une valeur de p inférieure à 0,05.
Le rôle de l’apoptose dans l’apparition des phénotypes de mutants semble
donc être mineur voire nul.
III. Etude de la prolifération.
A. Principe
Pour connaître le nombre de mélanoblastes prolifératifs, nous avons effectué
une double immunofluorescence sur des coupes d’embryons ayant un fond génétique
Dct::LacZ à différents stades embryologiques avec deux anticorps primaires dirigés
contre la β-galactosidase et contre le BrdU.
Les souris mères sont injectées en deux temps avec du BrdU (100µg par gramme de
masse corporelle) deux heures avant le sacrifice pour récupérer les embryons.
Les cellules doublement marquées sont donc les mélanoblastes prolifératifs, c’est-àdire
qui ont effectué au moins une partie de la phase S du cycle cellulaire au cours
des deux heures (Fig.4).
Les comptes de mélanoblastes ont été effectués à partir de 20 à 107 sections et sur un
à quatre embryons.
51

Résultats
Figure 15. Mise en évidence des mélanoblastes prolifératifs.
Cette figure représente différentes photographies d’une même coupe d’un embryon de souris sauvage
au stade de développement E14.5. On peut observer deux mélanoblastes (cellules positives au
marquage β-gal). L’un a incorporé le BrdU (flèche) et l’autre non (point).
Souris
Bcat∆ex2-
6
WT
Bcat*
B. Résultats
Stade
Nombre de
sections
Epiderme
Nombre de
cellules
β-gal+
Nombre de
cellules
β-gal+ par
sections
Nombre de
cellules
BrdU+
Pourcentage
de cellules
BrdU+
E12,5 64 26 0,4 5 19,2%
E13,5 71 147 2,1 65 44,2%
E14,5 55 139 2,5 43 30,9%
E12,5 30 27 0,9 10 37%
E13,5 107 617 5,8 443 71,8%
E14,5 20 498 24,9 257 51,6%
E12,5 ND ND ND ND ND
E13,5 74 169 2,3 81 47,9%
E14,5 27 285 10,6 141 49,5%
Tableau 3 : décomptes des mélanoblastes et pourcentage de mélanoblastes
prolifératifs dans l’épiderme en fonction des stades de développement.
52

Résultats
Souris
Bcat∆ex2-
6
WT
Bcat*
Stade
Nombre de
sections
Derme
Nombre de
cellules
β-gal+
Nombre de
cellules
β-gal+ par
sections
Nombre de
cellules
BrdU+
Pourcentage
de cellules
BrdU+
E12,5 64 197 3,1 37 18,8%
E13,5 71 129 1,8 31 24%
E14,5 55 46 0,8 10 21,7%
E12,5 30 155 5,2 53 34,2%
E13,5 82 259 3,16 67 25,9%
E14,5 20 53 2,65 18 34%
E12,5 ND ND ND ND ND
E13,5 66 150 2,3 36 24%
E14,5 27 30 1,1 10 33,3%
Tableau 4 : décomptes des mélanoblastes et pourcentage de mélanoblastes
prolifératifs dans le derme en fonction des stades de développement.
Dans l’épiderme, on peut tout d’abord noter un pic dans la prolifération des
mélanoblastes au stade E13,5 pour la lignée de souris sauvages comme pour le
mutant perte de fonction. Pour le mutant gain de fonction, même en l’absence de
comptes au stade E12,5, il ne semble pas y avoir de pic de prolifération, les deux
pourcentages aux stades étudiés étant très semblables.
Figure 16. Evolution au cours du développement de la prolifération des
mélanoblastes.
Les histogrammes verts représentent les données des mutants perte de fonction, en bleu celles des
souris sauvages et en rouge celles des mutants gain de fonction.
n.s : non significatif pour p

Résultats
Dans l’épiderme, pour le mutant perte de fonction, on observe une réduction
statistiquement significative (p

Discussion
Discussion
Les travaux antérieurs à cette étude ont montré le rôle important que joue β-
caténine dans la détermination du lignage mélanocytaire lors des étapes précoces du
développement. La problématique était donc de savoir si cette même protéine
pouvait jouer également un rôle dans les étapes plus tardives et notamment dans la
prolifération de ce lignage.
La stratégie de création de mutants perte et gain de fonction pour la β-caténine a
permis de montrer que le niveau d’expression de β-caténine a un rôle sur l’expansion
du lignage mélanocytaire puisque les deux mutant présentent un phénotype de robe
(une hypopigmentation ou une absence de pigmentation) due à une réduction du
nombre de mélanoblastes au cours du développement.
Ce travail a donc eu pour but d’étudier :
1-La répartition des mélanoblastes dans les compartiments dermique et épidermique
au cours du développement.
2-Les causes de la réduction du nombre des mélanoblastes chez les deux mutants.
L’étude de la répartition des mélanoblastes dans les deux compartiments de la
peau durant le développement a permis de montrer l’évolution exponentielle du
nombre de mélanoblastes dans l’épiderme chez les souris sauvages. Au niveau du
derme, l’évolution au cours du développement est plus complexe à analyser. Tout
d’abord, il faut noter que le nombre d’embryons inclus pour chaque stade est
relativement faible (deux embryons pour chaque génotype). Il demande à être
augmenté pour confirmer les variations observées. De plus, ces variations ne sont pas
orientées vers une diminution ou une augmentation du nombre de mélanoblastes
entre les deux stades les plus extrêmes (E11,5 et E15,5). Enfin, les variations entre
les stades sont faibles en comparaison avec celles observées dans l’épiderme et ne
sont pas toutes statistiquement significatives. En conclusion, il existe une certaine
stabilité dans le nombre de mélanoblastes dermiques au cours du temps.
Au vu de ces deux phénomènes –une relative stabilité dans le derme et une
croissance exponentielle dans l’épiderme- nous pouvons émettre l’hypothèse que les
divisions des mélanoblastes dans le derme se font sur un mode asymétrique : une
55

Discussion
cellule fille restant dans le derme et l’autre entrant dans l’épiderme où elle continue à
proliférer.
Pour les mutants perte et gain de fonction de β-caténine cette étude a permis de
montrer clairement que la diminution du nombre de mélanoblastes observée dans les
expériences faites sur les embryons in toto, est principalement due à une diminution
du nombre des mélanoblastes dans le compartiment épidermique où les réductions
sont importantes pour le mutant gain de fonction et particulièrement drastique pour le
mutant perte de fonction. Au niveau dermique, on observe également une diminution
pour les deux mutants à partir du stade E12,5, mais les différences avec les souris
sauvages sont beaucoup plus faibles que dans l’épiderme et il n’y a pas de nette
différence entre les deux mutants.
Dans la suite de ce travail, nous avons essayé de comprendre la cause de cette
diminution du nombre de mélanoblastes et nous avons tout d’abord voulu savoir si
l’apoptose était impliquée. Nous montrons grâce aux immunofluorescences détectant
la caspase-3-clivée qu’aux stades étudiés les mélanoblastes de l’épiderme ne meurent
par apoptose dans aucune des lignées de souris étudiées.
Dans le derme, on observe une faible proportion de mélanoblastes apoptotiques chez
les souris sauvages à E12,5 et E13,5. Chez les souris gain de fonction, il n’y a pas de
différence significative avec les souris sauvages. Le phénomène apoptotique ne
permet donc pas d’expliquer l’apparition du phénotype chez ce mutant. Chez le
mutant perte de fonction, au stade E12,5, l’apoptose est légèrement plus élevée que
chez les souris sauvages. Cependant, cette différence reste faible, non significative,
et n’explique pas la diminution très importante du nombre de mélanoblastes chez ce
mutant.
Il semble donc que l’apoptose joue un rôle respectivement minime ou nul dans
l’apparition des phénotypes des mutants perte et gain de fonction pour β-caténine.
Pour confirmer ces résultats et notamment l’augmentation de l’apoptose aux stade
E12,5 et E13,5 chez le mutant perte de fonction, il serait bon d’augmenter le nombre
d’embryons par stades.
Comme l’apoptose est peu ou n’est pas impliquée dans l’apparition des
phénotypes, nous avons voulu savoir si la prolifération des mélanoblastes chez les
mutants pouvait être mise en cause. Nous montrons grâce aux immunofluorescences
détectant le BrdU que la prolifération des mélanoblastes est diminuée de manière
importante (20 à 25%) et significative dans l’épiderme des embryons mutants perte
56

Discussion
de fonction à au moins deux stades (E13,5 et E14,5) par rapport aux souris sauvages.
Nous montrons également une diminution significative de la prolifération des
mélanoblastes de l’épiderme chez le mutant gain de fonction mais uniquement au
stade E13,5.
Dans le derme, on n’observe pas de diminution significative de la prolifération chez
le mutant gain de fonction et un seul stade (E12,5) montre une diminution
significative chez le mutant perte de fonction.
Bien que ces résultats nécessitent également confirmation par l’étude d’autres
embryons, ils permettent de donner un début d’explication sur les causes de
l’apparition des phénotypes des mutants. En effet, comme nous l’avons déjà
mentionné, la diminution du nombre des mélanoblastes se fait majoritairement dans
l’épiderme chez les deux mutants. Ici, nous démontrons une diminution de la
prolifération dans ce compartiment à au moins un stade chez les deux mutants.
Cependant, si cette diminution peut suffire à expliquer une hypopigmentation chez le
mutant gain de fonction, il est peu probable que ce seul phénomène soit en jeu dans
l’absence de pigmentation des mutants perte de fonction. On peut tout de même noter
que chez ces derniers, la diminution de la prolifération dans le derme est continue sur
au moins deux stades. De plus, il y a également une réduction de prolifération au
niveau du derme ce qui peut être un phénomène concourant à la baisse du nombre de
mélanoblastes dans les deux compartiments. Enfin l’apoptose apporte peut-être une
petite contribution au phénotype.
D’autres phénomènes peuvent être recherchés pour expliquer le phénotype de ces
mutants. Précédemment dans le laboratoire, une étude a été effectuée montrant
l’absence de transdifférentiation ou de perte de différenciation du lignage
mélanocytaire chez les deux mutants. Dans l’avenir, d’autres mécanismes de mort
cellulaire (comme l’autophagie) ainsi que la sénescence pourront être étudiés.
57

Conclusion
Conclusion
Cette étude a eu pour but d’explorer la répartition des mélanoblastes dans les
différents compartiments de la peau au cours du développement embryonnaire de la
souris et d’expliquer les mécanismes amenant à la perte des mélanoblastes qui
caractérise les phénotype des souris mutantes perte de fonction et gain de fonction
pour β-caténine.
La durée du stage durant lequel j’ai réalisé ce travail et le temps que nécessitent les
expérimentations in vivo chez la souris n’ont permis d’étudier qu’un nombre limité
d’embryons. Cependant les résultats obtenus permettent de donner une vue générale
du comportement des mélanoblastes au cours du développement. Ils donnent
également un début d’explication en ce qui concerne les phénotypes des lignées de
souris mutantes car ils montrent une perte de prolifération pour les deux mutants. Le
rôle de l’apoptose est peu important. Sa faible contribution au phénotype du mutant
perte de fonction demande à être confirmée.
β-caténine est une protéine qui possède plusieurs fonctions et de nombreux
partenaires. Cette étude montre une autre de ses facettes en mettant en lumière son
rôle fondamental dans la prolifération des mélanocytes
58

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Thibaut EGUETHER – Thèse de doctorat en pharmacie.- 30 juin 2009
Résumé
La protéine β-caténine est une protéine multi fonctionnelle qui joue un rôle important
dans la prolifération, la survie et la différentiation de plusieurs types de cellules ainsi
que dans la détermination du lignage mélanocytaire. Pour étudier son rôle dans
l’évolution de ce lignage au cours du développement, deux mutants murins perte et
gain de fonction de β-caténine ont été développés. Ils présentent tous les deux un
phénotype de robe (le mutant perte de fonction est blanc et le mutant gain de fonction
est gris) du à une diminution du nombre de mélanoblastes par rapport aux souris
sauvages.
Cette étude s’est attachée à étudier la répartition des mélanoblastes dans les
compartiments dermique et épidermique au cours du développement ainsi que les
mécanismes cellulaires en jeu dans l’apparition des phénotypes des souris mutantes.
Les résultats montrent que la diminution du nombre de mélanoblastes se fait
majoritairement dans l’épiderme et que ce phénomène implique une diminution de la
prolifération chez les deux mutants par rapport aux souris sauvages. β-caténine est une
protéine qui possède plusieurs fonctions et de nombreux partenaires. Cette étude
montre une autre de ses facettes en mettant en lumière son rôle fondamental dans la
prolifération des mélanocytes.
Mots clés : Mélanocytes, mélanome, beta-caténine, génétique de la souris, biologie
du développement.