Remerciements - Bibliothèques de l'Université de Lorraine
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Matériel et métho<strong>de</strong>s<br />
IV. Coloration X-Gal <strong>de</strong>s embryons<br />
Les embryons prélevés sont pré-fixés par le glutaraldéhy<strong>de</strong> concentré à<br />
0,25%. Après plusieurs rinçages, ils sont incubés dans une solution perméabilisante<br />
(MgCl2 2mM, Na-<strong>de</strong>oxycholate 0,01%, NP-40 0,02%) durant 30minutes, puis durant<br />
3 à 48h dans la solution <strong>de</strong> coloration (Ferricyani<strong>de</strong>, Ferrocyani<strong>de</strong>, MgCl2, NP-40<br />
0,02%, Na-<strong>de</strong>oxycholate 0,01% et X-Gal 0,04%). Enfin les embryons sont fixés dans<br />
le paraformaldéhy<strong>de</strong> à 4%.<br />
Les mélanoblastes marqués par la coloration X-Gal sont bleus et sont donc<br />
visibles à l’œil nu. Les comptes <strong>de</strong> mélanoblastes sont effectués sur les embryons<br />
totaux et sur les coupes d’embryons au niveau troncal après coloration.<br />
V. Immunofluorescences sur coupes d’embryons<br />
Des coupes <strong>de</strong> 0,7 microns sont réalisées dans la partie troncale <strong>de</strong>s<br />
embryons. Après lavage par une solution <strong>de</strong> PBS (Biowest) et <strong>de</strong> Tween 20 à 0,1%,<br />
les lames sont bouillies dans du tampon citrate durant 20 minutes (solution <strong>de</strong> citrate<br />
<strong>de</strong> sodium à 0,01M et Tween 20 à 0,025% ramenée à pH6) pour découvrir les<br />
antigènes. Pour éviter les marquages non spécifiques les lames sont incubées 20<br />
minutes avec une solution <strong>de</strong> PBS-tween et <strong>de</strong> sérum <strong>de</strong> singe à 5%. Les anticorps<br />
primaires sont alors déposés. L’incubation se fait durant la nuit. Le len<strong>de</strong>main les<br />
lames sont lavées à nouveau dans la solution <strong>de</strong> PBS-tween et les anticorps<br />
secondaires sont déposés et incubés à 37°C pendant une heure. Les lames sont<br />
ensuites marquées par le DAPI et montées avec le liqui<strong>de</strong> <strong>de</strong> montage gel/mount®<br />
(Biomeda Corp.)<br />
Les anticorps utilisés lors <strong>de</strong>s immunofluorescences anti caspase-3-clivée sont les<br />
anticorps primaires anti β-galactosidase polyclonal <strong>de</strong> chèvre (Biogenesis) et anti<br />
caspase-3-clivée polyclonal <strong>de</strong> lapin (Cell signaling). Les anticorps secondaires sont<br />
les anticorps Alexa 555 anti chèvre et Alexa 488 anti lapin (Molecular probes).<br />
Les anticorps utilisés lors <strong>de</strong>s immunofluorescences anti BrdU sont les<br />
anticorps primaires anti β-galactosidase polyclonal <strong>de</strong> chèvre (Biogenesis) et<br />
anticorps anti BrdU monoclonal <strong>de</strong> souris (BD Biosciences). Les anticorps<br />
secondaires sont les anticorps Alexa 555 anti chèvre et Alexa 488 anti souris<br />
(Molecular probes). Pour ces immunofluorescences, le BrdU est injecté en <strong>de</strong>ux fois<br />
au temps t 0 puis au temps t 0 +20min. (injection totale <strong>de</strong> 100µg par gramme <strong>de</strong> masse<br />
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