Remerciements - Bibliothèques de l'Université de Lorraine

Matériel et méthodes
IV. Coloration X-Gal des embryons
Les embryons prélevés sont pré-fixés par le glutaraldéhyde concentré à
0,25%. Après plusieurs rinçages, ils sont incubés dans une solution perméabilisante
(MgCl2 2mM, Na-deoxycholate 0,01%, NP-40 0,02%) durant 30minutes, puis durant
3 à 48h dans la solution de coloration (Ferricyanide, Ferrocyanide, MgCl2, NP-40
0,02%, Na-deoxycholate 0,01% et X-Gal 0,04%). Enfin les embryons sont fixés dans
le paraformaldéhyde à 4%.
Les mélanoblastes marqués par la coloration X-Gal sont bleus et sont donc
visibles à l’œil nu. Les comptes de mélanoblastes sont effectués sur les embryons
totaux et sur les coupes d’embryons au niveau troncal après coloration.
V. Immunofluorescences sur coupes d’embryons
Des coupes de 0,7 microns sont réalisées dans la partie troncale des
embryons. Après lavage par une solution de PBS (Biowest) et de Tween 20 à 0,1%,
les lames sont bouillies dans du tampon citrate durant 20 minutes (solution de citrate
de sodium à 0,01M et Tween 20 à 0,025% ramenée à pH6) pour découvrir les
antigènes. Pour éviter les marquages non spécifiques les lames sont incubées 20
minutes avec une solution de PBS-tween et de sérum de singe à 5%. Les anticorps
primaires sont alors déposés. L’incubation se fait durant la nuit. Le lendemain les
lames sont lavées à nouveau dans la solution de PBS-tween et les anticorps
secondaires sont déposés et incubés à 37°C pendant une heure. Les lames sont
ensuites marquées par le DAPI et montées avec le liquide de montage gel/mount®
(Biomeda Corp.)
Les anticorps utilisés lors des immunofluorescences anti caspase-3-clivée sont les
anticorps primaires anti β-galactosidase polyclonal de chèvre (Biogenesis) et anti
caspase-3-clivée polyclonal de lapin (Cell signaling). Les anticorps secondaires sont
les anticorps Alexa 555 anti chèvre et Alexa 488 anti lapin (Molecular probes).
Les anticorps utilisés lors des immunofluorescences anti BrdU sont les
anticorps primaires anti β-galactosidase polyclonal de chèvre (Biogenesis) et
anticorps anti BrdU monoclonal de souris (BD Biosciences). Les anticorps
secondaires sont les anticorps Alexa 555 anti chèvre et Alexa 488 anti souris
(Molecular probes). Pour ces immunofluorescences, le BrdU est injecté en deux fois
au temps t 0 puis au temps t 0 +20min. (injection totale de 100µg par gramme de masse
45