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Résultats marqueurs Dans l’épiderme, il est intéressant de noter qu’aucune colocalisation des des mélanoblastes et de l’apoptose n’a été observée à aucun stade embryonnaire et pour aucune des lignées de souris. Il semble donc que les mélanoblastes ne meurent pas par apoptose dans ce compartiment durant les phases du développement observées. Dans le derme, on constate qu’au stade E14,5, aucune des lignées de souris ne présente de mélanoblastes apoptotiques. Pour les stades E12,5 et E13,5, les pourcentages de mélanoblastes en apoptose chez le mutant gain de fonction et chez les souris sauvages sont comparables (les différences observées ne sont pas significatives selon le test du p exact de Fisher). Pour le mutant perte de fonction, les différences observées aux stades E12,5 et E13,5 sont plus importantes que pour le mutant gain de fonction, cependant, les variations observées ne sont pas significatives pour une valeur de p inférieure à 0,05. Le rôle de l’apoptose dans l’apparition des phénotypes de mutants semble donc être mineur voire nul. III. Etude de la prolifération. A. Principe Pour connaître le nombre de mélanoblastes prolifératifs, nous avons effectué une double immunofluorescence sur des coupes d’embryons ayant un fond génétique Dct::LacZ à différents stades embryologiques avec deux anticorps primaires dirigés contre la β-galactosidase et contre le BrdU. Les souris mères sont injectées en deux temps avec du BrdU (100µg par gramme de masse corporelle) deux heures avant le sacrifice pour récupérer les embryons. Les cellules doublement marquées sont donc les mélanoblastes prolifératifs, c’est-àdire qui ont effectué au moins une partie de la phase S du cycle cellulaire au cours des deux heures (Fig.4). Les comptes de mélanoblastes ont été effectués à partir de 20 à 107 sections et sur un à quatre embryons. 51
Résultats Figure 15. Mise en évidence des mélanoblastes prolifératifs. Cette figure représente différentes photographies d’une même coupe d’un embryon de souris sauvage au stade de développement E14.5. On peut observer deux mélanoblastes (cellules positives au marquage β-gal). L’un a incorporé le BrdU (flèche) et l’autre non (point). Souris Bcat∆ex2- 6 WT Bcat* B. Résultats Stade Nombre de sections Epiderme Nombre de cellules β-gal+ Nombre de cellules β-gal+ par sections Nombre de cellules BrdU+ Pourcentage de cellules BrdU+ E12,5 64 26 0,4 5 19,2% E13,5 71 147 2,1 65 44,2% E14,5 55 139 2,5 43 30,9% E12,5 30 27 0,9 10 37% E13,5 107 617 5,8 443 71,8% E14,5 20 498 24,9 257 51,6% E12,5 ND ND ND ND ND E13,5 74 169 2,3 81 47,9% E14,5 27 285 10,6 141 49,5% Tableau 3 : décomptes des mélanoblastes et pourcentage de mélanoblastes prolifératifs dans l’épiderme en fonction des stades de développement. 52
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