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Matériel et méthodes Matériels et Méthodes I. Souris transgéniques Les différentes lignées de souris sont hébergées dans une animalerie EOPS (Exempte d’Organisme Pathogène Spécifique). Les souris gain de fonction bcat sta ont été produites au laboratoire. Elles ont été obtenues par l’expression d’une forme stabilisée de β-caténine sous contrôle du promoteur de la tyrosinase qui est spécifique du lignage mélanocytaire. Les souris utilisées pour ce projet ont été croisées vingt fois en retour sur le fond génétique C57BL/6. Les souris perte de fonction bcat∆ex2-6 ont été produites par le laboratoire de R Kelmer (Max Plank Institute of Immunobiologie, Freiburg) (Brault et al., 2001). Elles ont été obtenues par l’inactivation spécifique du gène de la β-caténine dans le lignage mélanocytaire grâce au système Cre/LoxP. Les souris utilisées ont été croisées dix à onze fois en retour sur le fond génétique C57BL/6. Les souris Tyr ::Cre ont été produites au laboratoire (Delmas et al., 2003). La recombinase Cre est exprimée spécifiquement dans le lignage mélanocytaire grâce au promoteur de la tyrosinase. Les souris utilisées ont été croisées dix à onze fois en retour sur le fond génétique C57BL/6. Les souris Dct ::LacZ ont été obtenues par le laboratoire du Dr Jackson (MRC Human Genetics Unit, Western General Hospital, Edimburg, UK). Le promoteur Dct étant spécifique du lignage mélanocytaire, ces souris expriment le gène rapporteur LacZ de façon spécifique dans ce lignage. Les souris utilisées pour le croisement avec les souris bcat sta et les souris bcat∆ex2-6 ont été croisées onze fois en retour sur le fond génétique C57BL/6. Le croisement des souris Tyr ::Cre avec celles de la lignée bcat∆ex2-6 dont les exons 2 à 6 du gène de la β-caténine sont entourés par 2 sites LoxP permet le défloxage et l’inactivation du gène de la β-caténine spécifiquement dans le lignage mélanocytaire. Les croisements avec les souris transgéniques Dct::LacZ (Mackenzie, 1997) des lignées bcat∆ex2-6 et bcat sta permettront de mettre en évidence les mélanoblastes. 43
Matériel et méthodes II. Génotypages des différentes lignées de souris L’ADN est extrait à partir des queues de souris prélevées lors du marquage des animaux. Les queues sont incubées toute la nuit à 55°C dans une solution contenant 50mM de KCl, 10mM de Tris pH8,8 à 25°C, 0,1% triton, 0,4µg/ml de protéinase K, 0,005% tween 20. La protéinase K est ensuite inactivée par chauffage pendant 20 minutes à 95°C. Les réactions de PCR (Polymérase Chain Reaction) sont réalisées avec 1µl de cette solution. L’ADN est amplifié par PCR en utilisant 0.5 unité de Taq polymérase en présence de 0.2mM dNTP, 1mM de chaque amorce, 5mM KCl, 10mM Tris HCl pH8.3, 0.1% triton X-100, 1.5mM MgCl2. La réaction d’amplification est initiée par trois cycles longs d’amplification (1mn à 94°C, 1mn à 58°C, 1mn à 72°C) suivis de trente cycles courts (30s à 94°C, 30s à 58°C, 30s à 72°C). Une étape supplémentaire d’élongation à 72°C pendant 10mn est ajoutée à la fin des cycles. Pour chaque lignée de souris transgéniques, des amorces spécifiques sont utilisées. Le couple sens LL125 5’-GTC ACT CCA GGG GTT GCT GG-3’ et antisens LL296 5’-CCG CCG CAT AAC CAG TGA-3’ amplifie un fragment de 473 pb spécifique de Cre. Les amorces sens : LL347 5’-TAC ACT ATT GAA TCA-3’, et antisens LL348 5’-CAC CAT GTC CTC TGT CTA TCC-3’, LL349 5’-AAG GTA GAG TGA TGA AAG TTG TT- 3’amplifient un fragment de 221pb pour l’allèle sauvage, un fragment de 324pb pour l’allèle « floxé ». Les amorces sens : LL220 5’-GCG TTG GCA ATT TAA CCG CC-3’ et antisens LL221 5’-CAG TTT ACC CGC TCT GCT AC-3’amplifient un fragment de 429pb pour le gène LacZ. III. Traitement des embryons Les femelles porteuses d’embryons sont sacrifiées au stade embryonnaire voulu et la corne utérine est prélevée. La corne est ensuite disséquée dans du PBS froid pour en extraire les embryons. Ceux-ci sont alors fixés dans du paraformaldhéyde (PFA) concentré à 4% pendant 6 h ou durant la nuit en fonction des expérimentations. Ils sont ensuite enrobés dans un milieu d’enrobage OCT Tissue-Tek® (Sakura Finetek Europe). 44
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