«Fort potentiel antiseptique des citrates de diaryl butènes portant deux chaînes aminoalkyle
La confirmation du pouvoir antiseptique et désinfectant du produit a été menée conformément aux spécifications des normes et pharmacopée européennes et a touché les phases 1 et 2 du processus de validation de l’activité des antiseptiques.
La confirmation du pouvoir antiseptique et désinfectant du produit a été menée conformément aux spécifications des normes et pharmacopée européennes et a touché les phases 1 et 2 du processus de validation de l’activité des antiseptiques.
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Requête déposée<br />
L’INNORPI<br />
En l’obtention d’un brevet<br />
D’invention<br />
conformément a la loi<br />
No.2000-84 Du 24-08-2000<br />
Patent Application<br />
Addressed to<br />
INNORPI<br />
In accordance with law<br />
No.2000-840<br />
Dated 24-8-2000<br />
- 1 -<br />
0222 توأ<br />
ةعدوم ةضيرع<br />
ينطولا دهعملل<br />
ةءارب<br />
ىلع لوصحلل تافصاوملل<br />
نوناقلا قفو عارتخا<br />
08 يف خرؤملا 0222-48<br />
ددع<br />
TITLE OF INVENTION : : عارتخلاا ناونع<br />
TITRE DE L’INVENTION : <strong>«Fort</strong> <strong>potentiel</strong> <strong>antiseptique</strong> <strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>citrates</strong> <strong>de</strong> <strong>diaryl</strong> <strong>butènes</strong> <strong>portant</strong> <strong>de</strong>ux<br />
<strong>chaînes</strong> <strong>aminoalkyle</strong> ».<br />
PRIORITÉ : : ةيقبسلأا<br />
PRORITY :<br />
PAYS دلبلا<br />
COUNTRY<br />
TUNISIE<br />
NUMERO ددعلا<br />
DATE : خيراتلا<br />
DATE :<br />
TITULAIRE : Centre <strong>de</strong> biotechnologie <strong>de</strong> Sfax (Equipe <strong>de</strong> Procédés <strong>de</strong> Criblage Moléculaire et<br />
Cellulaire, Laboratoire <strong><strong>de</strong>s</strong> Microorganismes et Biomolécules (LMB))<br />
OWNER :<br />
ADDRESS : :ناونعلا<br />
ADRESSE :<br />
Laboratoire <strong>de</strong> Recherche LMB, Centre <strong>de</strong> biotechnologie <strong>de</strong> Sfax (CBS), Route <strong>de</strong> Sidi Mansour<br />
Km 6 – BP 1177, 3018 Sfax, Tunisie<br />
INVENTEUR : : عرتخملا<br />
INVENTOR :<br />
Mehdi EL ARBI, Sami AIFA, Pascal PIGEON, Si<strong>de</strong>n TOP, Meral GÖRMEN et Gérard<br />
JAOUEN<br />
MANDATAIRE : : ليكولا<br />
REPRESENTATIVE :<br />
M. Mohamed KERKENI, Directeur Général <strong>de</strong> Valorisation <strong>de</strong> la Recherche,<br />
Ministère <strong>de</strong> l'Enseignement Supérieur et <strong>de</strong> la Recherche Scientifique<br />
.<br />
خيراتلاو ءاضملإا<br />
SIGATURE ET DATE<br />
DATE AND SIGNATURE
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DEMANDE DE BREVET<br />
DEMANDE DÉPOSÉE AU NOM DU : Centre <strong>de</strong> biotechnologie <strong>de</strong> Sfax<br />
(CBS)<br />
INVENTEURS : Mehdi EL ARBI,<br />
Sami AIFA,<br />
Pascal PIGEON,<br />
Si<strong>de</strong>n TOP,<br />
Meral GÖRMEN,<br />
Gérard JAOUEN.<br />
TITRE : « Fort <strong>potentiel</strong> <strong>antiseptique</strong> <strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>citrates</strong> <strong>de</strong> <strong>diaryl</strong> <strong>butènes</strong> <strong>portant</strong> <strong>de</strong>ux <strong>chaînes</strong><br />
<strong>aminoalkyle</strong> ».<br />
- 2 -
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TITRE : « Fort <strong>potentiel</strong> <strong>antiseptique</strong> <strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>citrates</strong> <strong>de</strong> <strong>diaryl</strong> <strong>butènes</strong> <strong>portant</strong> <strong>de</strong>ux <strong>chaînes</strong><br />
<strong>aminoalkyle</strong> ».<br />
- 3 -
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RESUME :<br />
La présente invention concerne, <strong><strong>de</strong>s</strong> composés chimiques <strong>citrates</strong> <strong>de</strong> <strong>diaryl</strong> <strong>butènes</strong><br />
<strong>portant</strong> <strong>de</strong>ux <strong>chaînes</strong> <strong>aminoalkyle</strong> dont la formule générale est la suivante :<br />
R<br />
( )n<br />
( )n<br />
n = 1 à 5<br />
H<br />
H<br />
- 4 -<br />
R =<br />
L’excellente efficacité antimicrobienne démontrée <strong>de</strong> ces composés [1], a été approfondie par<br />
l’essai du pouvoir <strong>antiseptique</strong> et désinfectant <strong>de</strong> l’un <strong><strong>de</strong>s</strong> produits <strong>de</strong> cette série et <strong>de</strong> son<br />
dérivé formulé.<br />
La confirmation du pouvoir <strong>antiseptique</strong> et désinfectant du produit a été menée conformément<br />
aux spécifications <strong><strong>de</strong>s</strong> normes et pharmacopée européennes et a touché les phases 1 et 2 du<br />
processus <strong>de</strong> validation <strong>de</strong> l’activité <strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>antiseptique</strong>s.<br />
(CO)3 (CO)3<br />
(CO)3 (CO)3
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DESCRIPTION<br />
La lutte contre les maladies infectieuses occupe une gran<strong>de</strong> importance. Bien avant<br />
que le mot <strong>antiseptique</strong> ne soit employé, <strong>de</strong> nombreuses substances ont été utilisées pour<br />
éviter le risque <strong>de</strong> contamination.<br />
Dès l’antiquité, <strong>de</strong> nombreuses substances (épices, essences, huiles végétales), étaient<br />
utilisées pour empêcher la putréfaction <strong><strong>de</strong>s</strong> plaies et l’infection <strong><strong>de</strong>s</strong> blessures. Intuitivement<br />
l’origine environnementale <strong>de</strong> certaines maladies était reconnue. Certaines précautions étaient<br />
donc prises telles que l’eau bouillie, la fumigation <strong><strong>de</strong>s</strong> salles d’opération, … Ainsi, au cours<br />
du temps, les traitements empiriques intuitifs et parfois surnaturels ont évolué pour atteindre<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> bases scientifiques à la fin du XIV ème siècle. Mais, c’est en fait au XVIII ème siècle que le<br />
mot <strong>antiseptique</strong> fut employé par PRINGLE. Ce mé<strong>de</strong>cin militaire écossais, classa un grand<br />
nombre <strong>de</strong> substances appliquées sur la peau et les plaies (camphre, aci<strong><strong>de</strong>s</strong>...). C’est<br />
également à cette pério<strong>de</strong> que furent découvertes les principales molécules encore utilisées<br />
actuellement.<br />
1774 : SCHEELE (1749-1786), chimiste suédois découvrit le chlore.<br />
1789 : BERTHOLLET (1748-1822), chimiste français, découvrit les<br />
hypochlorites. Il les développa dans le petit village <strong>de</strong> JAVEL, aujourd’hui<br />
quai <strong>de</strong> JAVEL dans le 15 ème arrondissement <strong>de</strong> PARIS. Ceci explique la<br />
dénomination d’un produit chloré : eau <strong>de</strong> JAVEL.<br />
1811 : BERNARD COURTOIS (1777-1838), chimiste français isola l’io<strong>de</strong> à<br />
partir <strong>de</strong> cendres <strong>de</strong> plantes marines.<br />
1929 : LUGOL, mé<strong>de</strong>cin français, utilisa ce produit dans le traitement <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
maladies scrofuleuses (adénopathies cervicales chroniques). La teinture d’io<strong>de</strong><br />
a été utilisée en 1839 contre la goutte, l’anthrax, le panaris, puis largement<br />
employée pour traiter les blessures <strong>de</strong> guerre.<br />
Les fon<strong>de</strong>ments scientifiques <strong>de</strong> l’antisepsie et <strong>de</strong> la désinfection reposent sur les<br />
découvertes <strong>de</strong> PASTEUR. La théorie <strong><strong>de</strong>s</strong> micro-organismes responsables d’un certain<br />
nombre <strong>de</strong> maladies infectieuses marqua la rupture avec les pratiques antérieures. La<br />
microbiologie, nouvelle discipline concourut à rendre plus performantes les mesures et<br />
pratiques d’hygiène.<br />
- 5 -
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A partir <strong>de</strong> 1970, l’élaboration par l’AFNOR (association française <strong>de</strong> normalisation)<br />
<strong>de</strong> protocoles normalisés d’étu<strong>de</strong> a permis une meilleure connaissance <strong><strong>de</strong>s</strong> propriétés<br />
antimicrobiennes <strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>antiseptique</strong>s et désinfectants. A la même pério<strong>de</strong>, la pharmacopée<br />
française introduit en Juillet 1985 une note pro pharmacopée sur les préparations<br />
<strong>antiseptique</strong>s. La monographie en vigueur actuellement date <strong>de</strong> 1990. Un comité européen <strong>de</strong><br />
normalisation CEN TC 216 « <strong>antiseptique</strong>s et désinfectants » a été créé dans le but<br />
d'harmoniser les normes dans les différents pays européens.<br />
Actuellement, les infections nosocomiales (IN) constituent un problème majeur en<br />
santé publique. Les IN sont préoccupantes <strong>de</strong> par leur morbidité im<strong>portant</strong>e, la mortalité<br />
associée, le surcoût hospitalier non négligeable et l’émergence <strong>de</strong> bactéries multirésistantes<br />
(BMR).<br />
Une enquête nationale sur la prévalence <strong><strong>de</strong>s</strong> IN a été menée en 2001 par le RAISIN<br />
(Réseau d’alerte, d’investigation et <strong>de</strong> surveillance <strong><strong>de</strong>s</strong> infections nosocomiales) [2]. Cette<br />
enquête a montré un taux <strong>de</strong> prévalence <strong><strong>de</strong>s</strong> IN <strong>de</strong> 6,9 % (nombre <strong>de</strong> patients infectés un jour<br />
donné en fonction du nombre <strong>de</strong> patients hospitalisés présents le même jour). Cette<br />
prévalence est comparable à celle retrouvée lors <strong><strong>de</strong>s</strong> enquêtes multicentriques réalisées dans<br />
d’autres pays européens (Espagne 1990 : 9,9 % ; Norvège 1991 : 6,3 % ; Allemagne 1994 :<br />
3,6 % ; Angleterre 1993–1994 : 9 %).<br />
Les IN les plus fréquemment rencontrées sont les infections urinaires (40 %), les<br />
infections respiratoires (18,7 %), les infections du site opératoire (10 %) et les infections <strong>de</strong> la<br />
peau et <strong><strong>de</strong>s</strong> tissus mous (10 %). Parmi les germes responsables d’IN, les bactéries<br />
apparaissent en première ligne. Les plus souvent en cause sont Escherichia coli (23 %),<br />
Staphylococcus aureus (20 %), Pseudomonas aeruginosa (11 %), Enterococcus spp (6 %) [3].<br />
De façon globale, le taux <strong>de</strong> résistance aux antibiotiques <strong><strong>de</strong>s</strong> bactéries responsables<br />
d’IN est élevé et la proportion <strong>de</strong> BMR observée en France est parmi les plus im<strong>portant</strong>es<br />
d’Europe ; les pays d’Europe du Nord (Danemark, Pays Bas, Norvège…) étant caractérisés<br />
par un très faible taux <strong>de</strong> multirésistance aux antibiotiques. Cette situation préoccupante est<br />
liée à un usage excessif et souvent inadapté <strong><strong>de</strong>s</strong> antibiotiques : prescriptions inappropriées,<br />
doses inadéquates, durée <strong>de</strong> traitement inadaptée… À l’heure actuelle, 64 % <strong><strong>de</strong>s</strong> souches <strong>de</strong> S.<br />
aureus isolées au cours d’IN sont résistantes à la méticilline (on parle <strong>de</strong> Sarm :<br />
- 6 -
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Staphylococcus aureus résistante à la méticilline) [3]. À cela s’ajoute l’émergence <strong>de</strong> souches<br />
<strong>de</strong> Sarm résistantes à <strong>de</strong> nombreuses autres familles d’antibiotiques : macroli<strong><strong>de</strong>s</strong>, aminosi<strong><strong>de</strong>s</strong>,<br />
fluoroquinolones, voire glycopepti<strong><strong>de</strong>s</strong> [3]. D’autres germes hospitaliers multirésistants posent<br />
un grand problème [3] :<br />
- les entérobactéries résistantes aux β lactamines (11 %) (on parle <strong>de</strong> EBLSE :<br />
Entérobactéries à β-Lactamase à spectre étendu) ;<br />
- les entérocoques résistants aux glycopepti<strong><strong>de</strong>s</strong> (1,5 %) (on parle d’ERV : Entérocoques<br />
résistants à la vancomycine) ;<br />
- P. aeruginosa résistant aux céphalosporines <strong>de</strong> troisième génération (17 %)…<br />
Le danger est <strong>de</strong> se retrouver face à une impasse thérapeutique :<br />
- soit aucun antibiotique n’est plus disponible à <strong><strong>de</strong>s</strong> fins <strong>de</strong> traitement d’infections<br />
nosocomiales bactériennes généralement graves puisque touchant <strong><strong>de</strong>s</strong> patients<br />
fragilisés ;<br />
- soit les antibiotiques restant à disposition présentant une toxicité telle que leur usage<br />
est limité, voire non envisageable.<br />
Du fait <strong>de</strong> l’importance <strong><strong>de</strong>s</strong> IN, et <strong>de</strong> la dissémination <strong>de</strong> bactéries présentant <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
résistances aux antibiotiques utilisés en routine, la recherche <strong>de</strong> nouvelles molécules<br />
antibactériennes est un sujet d’importance croissante.<br />
Le mot ANTISEPTIQUE (du grec "anti" : contre et "septikos" dérivé <strong>de</strong> "sepein" :<br />
corrompre) a été utilisé pour la première fois par PRINGLE en 1750 pour qualifier une<br />
substance capable <strong>de</strong> prévenir la détérioration <strong>de</strong> la matière organique. Au milieu du XIX ème<br />
siècle, il s'applique à <strong><strong>de</strong>s</strong> produits capables <strong>de</strong> détruire les microbes pathogènes [4].<br />
La norme AFNOR (NF T 72-101, Mars 1981) [5], définit l’antisepsie comme une<br />
"Opération au résultat momentané permettant au niveau <strong><strong>de</strong>s</strong> tissus vivants, dans la limite <strong>de</strong><br />
leur tolérance, d'éliminer ou <strong>de</strong> tuer les micro-organismes et/ou d'inactiver les virus, en<br />
- 7 -
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fonction <strong><strong>de</strong>s</strong> objectifs fixés. Le résultat <strong>de</strong> cette opération est limité aux micro-organismes<br />
et/ou virus présents au moment <strong>de</strong> l'opération"<br />
Pour l’AFNOR, un <strong>antiseptique</strong> est un “produit ou procédé utilisé pour l’antisepsie<br />
dans <strong><strong>de</strong>s</strong> conditions définies”.<br />
Pour la X ème édition <strong>de</strong> la Pharmacopée française [6], les préparations <strong>antiseptique</strong>s<br />
ont les propriétés citées par l’AFNOR et sont présentées “dans leurs formes d’utilisation et<br />
utilisées telles quelles, sauf exception justifiée et autorisée”.<br />
Pour le comité européen <strong>de</strong> normalisation (CEN/TC 216), un <strong>antiseptique</strong> est “une<br />
substance ou une préparation qui permet le traitement <strong><strong>de</strong>s</strong> tissus vivants en tuant et/ou<br />
inhibant les bactéries, les champignons ou les spores et/ou en inactivant les virus avec<br />
l’intention <strong>de</strong> revenir ou <strong>de</strong> limiter la gravité d’une infection sur ces tissus». Elles présentent<br />
une activité antibactérienne, antifongique, antivirale.<br />
La <strong><strong>de</strong>s</strong>tination d'emploi <strong><strong>de</strong>s</strong> préparations <strong>antiseptique</strong>s doit être précisée (peau saine,<br />
muqueuses, plaies), ainsi que la durée d'application nécessaire à l'obtention <strong>de</strong> l'activité. En<br />
fonction <strong>de</strong> l'indication, l'inactivation par d'éventuelles "substances interférentes" ainsi que les<br />
incompatibilités doivent être indiquées.<br />
La norme AFNOR (NF T 72-101, Mars 1981) [5], définit la désinfection comme une<br />
"Opération au résultat momentané permettant d'éliminer ou <strong>de</strong> tuer les micro-organismes<br />
et/ou d'inactiver les virus indésirables portés par <strong><strong>de</strong>s</strong> milieux inertes contaminés, en fonction<br />
<strong><strong>de</strong>s</strong> objectifs fixés. Le résultat <strong>de</strong> cette opération est limité aux micro-organismes et/ou virus<br />
présents au moment <strong>de</strong> l'opération".<br />
La norme AFNOR (NF T 72-101, Mars 1981) [5], définit le désinfectant comme un<br />
"Produit ou procédé utilisé pour la désinfection ou la décontamination dans <strong><strong>de</strong>s</strong> conditions<br />
définies". La Société Française d'Hygiène Hospitalière (SFHH) définit la désinfection comme<br />
une "Opération utilisant un produit détergent contenant au moins un principe actif reconnu<br />
pour ses propriétés bactérici<strong><strong>de</strong>s</strong>, fongici<strong><strong>de</strong>s</strong>, sporici<strong><strong>de</strong>s</strong> ou viruci<strong><strong>de</strong>s</strong>, c'est à dire un produit<br />
détergent désinfectant".<br />
- 8 -
Page 9 sur 26<br />
L'étu<strong>de</strong> <strong>de</strong> l'activité <strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>antiseptique</strong>s et <strong><strong>de</strong>s</strong> désinfectants a été standardisée par<br />
l'Association Française <strong>de</strong> Normalisation (AFNOR) <strong>de</strong>puis 1975 [4]. Les normes AFNOR<br />
décrivent <strong><strong>de</strong>s</strong> métho<strong><strong>de</strong>s</strong> in vitro permettant d'évaluer la concentration minimale du produit<br />
qui, dans <strong><strong>de</strong>s</strong> conditions déterminées <strong>de</strong> température et <strong>de</strong> temps <strong>de</strong> contact, provoque la<br />
réduction, dans <strong><strong>de</strong>s</strong> proportions préalablement définies, d'une population initiale microbienne.<br />
La réalisation <strong>de</strong> ces normes s'effectue en trois phases :<br />
1. Mise en contact du produit à tester avec un inoculum microbien;<br />
2. Annulation <strong>de</strong> l'activité du produit à l'issue du temps <strong>de</strong> contact selon <strong>de</strong>ux<br />
méthodologies possibles :<br />
- par dilution/neutralisation du mélange (microorganismes / produit),<br />
- par filtration du mélange sur une membrane.<br />
3. Mise en culture <strong><strong>de</strong>s</strong> germes survivants par culture en milieu approprié.<br />
Les normes européennes, en cours d'élaboration, comportent <strong><strong>de</strong>s</strong> normes <strong>de</strong> base<br />
(norme dites <strong>de</strong> phase 1) et <strong><strong>de</strong>s</strong> normes d'application (normes <strong>de</strong> phase 2 et 3) adaptées au<br />
domaine d'utilisation (par exemple : désinfection <strong><strong>de</strong>s</strong> surfaces en agro-alimentaire,<br />
désinfection <strong><strong>de</strong>s</strong> dispositifs médicaux...) [4] :<br />
Phase 1 : Essai en suspension pour évaluer l'activité <strong>de</strong> base du produit. Cette phase,<br />
appliquée aux activités bactérici<strong><strong>de</strong>s</strong> (NF EN 1040 ou NF T 72-152) et fongici<strong><strong>de</strong>s</strong> (NF<br />
EN 1275 ou NF T 72-202), correspond aux anciennes normes AFNOR NF T 72-<br />
150/151 et NF T 72-200/201.<br />
Phase 2 : Essai au laboratoire dans <strong><strong>de</strong>s</strong> conditions les plus représentatives possibles <strong>de</strong><br />
la pratique hospitalière pour déterminer la concentration efficace et l’indication. Cette<br />
phase est divisée en 2 étapes :<br />
- 1 ère étape : essai en suspension comme pour la phase 1, dans <strong><strong>de</strong>s</strong> conditions<br />
plus proches <strong>de</strong> la pratique, par exemple <strong><strong>de</strong>s</strong> espèces <strong>de</strong> micro-organismes<br />
spécifiques <strong>de</strong> l'application et/ou en présence <strong>de</strong> substances interférentes<br />
définies (protéines, eau dure, etc ...).<br />
- 9 -
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- 2 ème étape : essai simulant la pratique, par exemple sur porte-germes pour<br />
les désinfectants <strong>de</strong> surface, sur <strong><strong>de</strong>s</strong> mains artificiellement contaminées pour<br />
les produits <strong><strong>de</strong>s</strong>tinés à la désinfection <strong><strong>de</strong>s</strong> mains par lavage ou friction.<br />
Phase 3 : Essai sur le terrain, dans <strong><strong>de</strong>s</strong> conditions pratiques d'utilisation, afin <strong>de</strong><br />
confirmer la concentration efficace (par exemple, ces essais peuvent être pratiqués<br />
avec <strong><strong>de</strong>s</strong> souches hospitalières).<br />
- 10 -
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Description <strong><strong>de</strong>s</strong> résultats :<br />
1. L’étape (a) <strong>de</strong> cette invention concerne la synthèse <strong><strong>de</strong>s</strong> composés chimiques <strong>de</strong> <strong>citrates</strong><br />
<strong>de</strong> <strong>diaryl</strong> <strong>butènes</strong> <strong>portant</strong> <strong>de</strong>ux <strong>chaînes</strong> <strong>aminoalkyle</strong> :<br />
R<br />
S5<br />
S1<br />
( )n<br />
( )n<br />
H<br />
H<br />
( )n<br />
- 11 -<br />
S2<br />
( )n<br />
S4<br />
60°C<br />
Figure 1 : Schéma <strong>de</strong> synthèse <strong><strong>de</strong>s</strong> produits objet du brevet<br />
La synthèse du produit S5 (avec R= et n=3) a été déjà publiée [1], les produits (avec<br />
R= et n=2), (avec R= et n=4), (avec R= et n=2), (avec R= et n=3), (avec R= et<br />
n=4) et (avec R= et n=3) ont été nouvellement synthétisés alors que les autres ne le sont<br />
pas encore.<br />
S3<br />
( )n<br />
( )n<br />
( )n<br />
( )n
Page 12 sur 26<br />
2. L’étape (b) a porté sur l’estimation <strong>de</strong> l’effet antimicrobien du produit S5 (avec R= et<br />
n=3), <strong>de</strong> sa formulation et du produit commercial « Cytéal ® » contre la souche<br />
Staphylococcus aureus (ATCC 6538) par la métho<strong>de</strong> <strong><strong>de</strong>s</strong> puits.<br />
3. L’étape (c) a consisté à la détermination <strong>de</strong> la CMI et <strong>de</strong> la CMB du produit S5 (avec<br />
R= et n=3) pour les souches <strong>de</strong> référence Escherichia coli (ATCC 10536), Pseudomonas<br />
aeruginosa (ATCC 15442), Staphylococcus Aureus (ATCC 6538), Enterococcus hirae<br />
(ATCC 10541) et Candida albicans (ATCC 10231) ainsi que la souche d’Acinetobacter<br />
baumannii isolée cliniquement.<br />
4. L’étape (d) : Formulation du produit S5 (avec R= et n=3) en <strong>antiseptique</strong>. Ayant<br />
démontré son activité antimicrobienne, le produit S5 (avec R= et n=3) a été formulé en une<br />
solution <strong>antiseptique</strong> ayant une composition i<strong>de</strong>ntique au produit commercial « Cytéal ® » tout<br />
en y remplaçant les principes actifs par notre produit.<br />
5. L’étape (e) : Estimation <strong>de</strong> l’effet <strong>antiseptique</strong> et désinfectant du produit S5 (avec R= et<br />
n=3) et du produit formulé conformément aux normes NFT 72-152 [7] et NF T 72-171 [8].<br />
6. L’étape (f) : Essai <strong>de</strong> l’efficacité du produit S5 (avec R= et n=3) formulé sur une souche<br />
d’Acinetobacter baumannii isolée cliniquement.<br />
7. L’étape (g) : Essai <strong>de</strong> l’efficacité du produit S5 (avec R= et n=3) formulé pour le lavage<br />
hygiénique <strong><strong>de</strong>s</strong> mains conformément à la norme EN 1499 [9].<br />
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EXEMPLES<br />
Exemple 1 : Synthèse et caractérisation <strong><strong>de</strong>s</strong> composés<br />
Certaines réactions ont été effectuées sous atmosphère d’argon. Le THF a été distillé sur<br />
sodium/benzophénone. Le dichloromethane a été distillé sur P2O5. Les autres réactifs et<br />
solvants utilisés, sont <strong><strong>de</strong>s</strong> produits commerciaux. Les chromatographies sur colonne ont été<br />
réalisées sur gel <strong>de</strong> silice Merck 60. Les points <strong>de</strong> fusion <strong><strong>de</strong>s</strong> produits ont été mesurés à l’ai<strong>de</strong><br />
d’un banc Köfler. Les spectres infra-rouges ont été enregistrés sur un spectromètre IR-FT<br />
BOMEM Michelson-100. Les analyses RMN 1 H et 13 C ont été effectuées sur un appareil<br />
Bruker 300 MHz. Les déplacements chimiques () sont mesurés en parties par millions (ppm)<br />
et les constantes <strong>de</strong> couplage (J) sont calculées en Hertz (Hz). Les analyses élémentaires <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
nouveaux produits ont été effectuées au Service <strong>de</strong> Microanalyse <strong>de</strong> l’I.C.S.N. à Gif sur<br />
Yvette.<br />
1,1-Bis[4-(3-dimethylaminopropoxy)phenyl]-2-ferrocenyl-but-1-ene (S4 avec R= et<br />
n=3)<br />
La synthèse du composé S4 s’est faite à partir du composé S1 (Si<strong>de</strong>n Top et al., 2003)<br />
dont la production a été faite au sein <strong>de</strong> l’UMR 7223 et ses étapes sont résumées dans la<br />
figure 1. Les composés S2 et S3 ont été produits par O-alkylation <strong>de</strong> phénols par RX après le<br />
traitement par NaH. Pour ce faire le S1 (1,08 g, 2,56 mmol, 1eq) est dissout dans du THF et<br />
du DMF puis le sodium hydri<strong>de</strong> (0,368 g, 15,3 mmol, 6 eq) est ajouté et le mélange est laissé<br />
en agitation pendant 10 minutes. Le 1,3-dibromopropane (3,098 g, 1,56 ml, 15,3 mmol, 6 eq)<br />
est ajouté et le mélange est chauffé à reflux pendant une nuit. De l’éthanol est ajouté au<br />
mélange réactionnel puis la phase aqueuse est extraite avec 3 x 25 ml <strong>de</strong> CH2Cl2. Les phases<br />
organiques rassemblées, séchées sur MgSO4 et concentrées sous vi<strong>de</strong> puis fractionnées par<br />
colonne <strong>de</strong> silice en utilisant comme éluant un mélange <strong>de</strong> dichlorométhane et d’éther <strong>de</strong><br />
pétrole (90/10) puis on termine l’extraction par du dichlorométhane pur. Trois fractions ont<br />
été récupérées et ont été analysées par RMN. Il s’est avérée que la fraction 1 correspond au<br />
produit S2 avec un ren<strong>de</strong>ment <strong>de</strong> 5% et la fraction 2 est constituée par le produit S3 avec un<br />
ren<strong>de</strong>ment <strong>de</strong> 73%. Pour la production du S4 (1,1-bis[4-(3-Diméthylaminopropoxy)phényl]-<br />
2-ferrocényl-but-1-ène), dans un tube pour réaction sous pression on dissout S3 (0,33 g, 0,5<br />
- 13 -
Page 14 sur 26<br />
mmol ; 1eq) dans du diméthylamine, en solution dans du méthanol, (0,27 g, 3 ml, 2M, 6 eq) et<br />
on maintient la réaction à la température <strong>de</strong> 60°C pendant 24 heures. Le mélange réactionnel<br />
est versé dans 30 ml d’eau puis extrait avec 3 x 25 ml <strong>de</strong> CH2Cl2. Les phases organiques sont<br />
rassemblées, séchées sur MgSO4 et concentrées sous vi<strong>de</strong>. Le composé S4 est obtenu avec un<br />
ren<strong>de</strong>ment <strong>de</strong> 57%.<br />
IR (KBr, /cm -1 ): 3093, 3032, 2947, 2866, 2816, 2765 (CH2, CH3). 1 H NMR (CDCl3): 0.94<br />
(3 H, t, J 7.4 Hz, CH3), 1.79-1.95 (4 H, m, 2 CH2), 2.18 (6 H, s, NMe2), 2.19 (6 H, s, NMe2),<br />
2.37 (2 H, t, J 7.2 Hz, CH2N), 2.40 (2 H, t, J 7.2 Hz, CH2N), 2.50 (2H, q, J 7.4 Hz, CH2), 3.83<br />
(2 H, t, J 1.9 Hz, C5H4), 3.89 (2 H, t, J 6.6 Hz, CH2O), 3.91 (2 H, t, J 6.6 Hz, CH2O), 3.98 (2<br />
H, t, J 1.9 Hz, C5H4), 4.02 (5 H, s, Cp), 6.66 (2 H, d, J 8.7 Hz, C6H4), 6.77 (2 H, d, J 8.7 Hz,<br />
C6H4), 6.86 (2 H, d, J 8.7 Hz, C6H4), 7.02 (2 H, d, J 8.7 Hz, C6H4). 13 C NMR (CDCl3): 15.5<br />
(CH3), 27.5 (CH2), 27.6 (CH2), 27.9 (CH2), 45.5 (2 NMe2), 56.5 (2 CH2N), 66.1 (2 CH2O),<br />
67.9 (2 CH C5H4), 69.1 (5 CH, Cp), 69.3 (2 CH, C5H4), 87.2 (Cipso), 114.1 (2 CH, C6H4),<br />
114.2 (2 CH, C6H4), 130.4 (2 CH, C6H4), 130.9 (2 CH, C6H4), 136.5 (C), 137.2 (C), 137.3<br />
(C), 137.4 (C), 157.3 (2 C). MS (EI, 70 eV) m/z : 594 [M] +. , 121 [CpFe] + , 86<br />
[CH2CH2CH2NMe2] + , 58 [CH2NMe2] + . HRMS (ESI, C36H47FeN2O2: [M+H] + ) calcd:<br />
595.29815, found: 595.29681.<br />
Un même protocole synthétique est applicable si, au lieu <strong>de</strong> l’aromatique ferrocénique<br />
<strong>de</strong> S4, un groupe aryl purement organique ou un autre groupement métallique est utilisé.<br />
Afin <strong>de</strong> rendre le dérivé diaminé S4 soluble dans l’eau et faciliter son utilisation, il a<br />
été transformé en sel citrique. L’addition <strong>de</strong> l’aci<strong>de</strong> citrique dissout dans du THF à la solution<br />
du S4 dissout dans un mélange éther éthylique/THF produit immédiatement le sel citrate S5<br />
(Figure 1).<br />
1,1-bis[4-(3-diméthylamoniumpropoxy)phényl]-2-ferrocényl-but-1-ène citrate (S5 avec<br />
R= et n=3)<br />
Pour la synthèse du S5 (1,1-bis[4-(3-diméthylamoniumpropoxy)phényl]-2-ferrocényl-<br />
but-1-ène citrate), le produit S4 (0,835 g, 1,4 mmol, 1 eq) est dissout dans un ballon contenant<br />
250 ml d’éther. L’aci<strong>de</strong> citrique (0,27 g, 1, 3 mmol, 0,9 eq), préalablement dissout dans du<br />
- 14 -
Page 15 sur 26<br />
THF est ajouté goutte à goutte à la solution du S4. Un précipité jaune du sel se forme<br />
immédiatement. Après arrêt <strong>de</strong> l’agitation, le produit est récupéré par filtration sur verre fritté<br />
puis séché à la pompe à vi<strong>de</strong>. Le produit est obtenu avec un ren<strong>de</strong>ment <strong>de</strong> 84 %.<br />
IR (KBr, /cm -1 ): 3421 (OH), 3032, 2962, 2877, (CH2, CH3), 1720 (CO). 1 H NMR (CD3OD):<br />
0.99 (3 H, t, J 7.4 Hz, CH3), 1.86 (4 H, broad m, 2 CH2), 2.61 (2 H, q, J 7.4 Hz, CH2), 2.66<br />
(2 H, d, J 15.3 Hz, CH2), 2.75 (2 H, d, J 15.3 Hz, CH2), 2.86 and 2.87 (12 H, 2 s, 2 NMe2H + ),<br />
3.30 (4 H, broad m, 2 CH2N), 3.87 (2 H, m, C5H4), 4.02 (6 H, m, 2 CH2O + C5H4), 4.08 (5 H,<br />
s, Cp), 6.75 (2 H, d, J 8.1 Hz, C6H4), 6.90 (4 H, m, J 8.1 Hz, C6H4), 7.08 (2 H, d, J 8.1 Hz,<br />
C6H4). 13 C NMR (CD3SOCD3): 15.3 (CH3), 24.3 (2 CH2), 42.8 (2 NMe2H + ), 44.3 (2 CH2<br />
citrate), 54.5 (2 CH2N), 66.9 (2 CH2O), 67.8 (2 CH, C5H4), 68.6 (2 CH, C5H4), 69.0 (5 CH,<br />
Cp), 71.4 (Cq, citrate), 86.0 (Cipso C5H4), 114.1 (2x2 CH, C6H4), 129.9 (2 CH, C6H4), 130.3 (2<br />
CH, C6H4), 136.2 (C), 136.4 (C), 136.9 (C), 137.1 (C), 156.6 (2 C), 171.5 (2xCO), 176.9<br />
(CO).<br />
Exemple 2 : Prospection <strong>de</strong> l’activité antimicrobienne<br />
Prospection <strong>de</strong> l’activité antimicrobienne in vitro<br />
Le produit S5 (avec R= et n=3) a fait l’objet d’une estimation <strong>de</strong> son effet<br />
antimicrobien contre la souche Staphylococcus Aureus (ATCC 6538) par la métho<strong>de</strong> <strong><strong>de</strong>s</strong> puits<br />
(Figure 2) décrite par Tagg et Mc Given en 1971 (dose testée était <strong>de</strong> 300 µg /ml d’eau).<br />
La Figure 2 illustre l’activité in vitro <strong>de</strong> notre produit <strong>de</strong> synthèse S5 (avec R= et<br />
n=3) (1), du produit commercial « Cytéal ® » (2) et <strong>de</strong> la formulation (3) <strong>de</strong> notre produit (1)<br />
contre la souche Staphylococcus aureus (ATCC 6538).<br />
Il ressort <strong>de</strong> cette figure que notre produit (1) a une activité antimicrobienne qui se<br />
préserve et qui s’accentue après formulation et qui se promet égale à celle du produit<br />
commercial « Cytéal ® ».<br />
- 15 -
Page 16 sur 26<br />
Figure 2 : Inhibition <strong>de</strong> Staphylococcus aureus par les produits testés<br />
Détermination <strong>de</strong> la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) et <strong>de</strong> la Concentration<br />
Minimale Bactérici<strong>de</strong> (CMB).<br />
Suite à la présence <strong>de</strong> zones d’inhibitions significatives, aussi im<strong>portant</strong>es que celle du<br />
produit commercial <strong>de</strong> référence (Figure 2), on est passé à la détermination <strong>de</strong> la<br />
Concentration Minimale Inhibitrice « CMI » et <strong>de</strong> la Concentration Minimale Bactérici<strong>de</strong><br />
« CMB », du produit S5 (avec R= et n=3), par la métho<strong>de</strong> <strong>de</strong> macro dilutions, contre les<br />
pathogènes à l’homme Escherichia coli (ATCC 10536), Pseudomonas aeruginosa (ATCC<br />
15442), Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Enterococcus hirae (ATCC 10541), Candida<br />
albicans (ATCC 10231) et la souche Acinetobacter baumannii isolée cliniquement, pour une<br />
caractérisation plus poussée <strong>de</strong> son effet antimicrobien.<br />
Une solution dans l’eau, <strong>de</strong> concentration 2 mg/ml du produit à tester a été préparée.<br />
Dans le premier tube, contenant 1,6 ml <strong>de</strong> milieu <strong>de</strong> culture liqui<strong>de</strong>, d’une série <strong>de</strong> 5 tubes à<br />
effectuées par transfert <strong>de</strong> 1ml du premier tube au second, puis <strong>de</strong> ce <strong>de</strong>rnier au suivant et<br />
ainsi <strong>de</strong> suite.<br />
2<br />
- 16 -<br />
1<br />
3
Page 17 sur 26<br />
Une fois les dilutions <strong><strong>de</strong>s</strong> produits à tester effectuées, on introduit dans chaque tube 1<br />
ml <strong>de</strong> l’inoculum <strong>de</strong> la souche à tester préalablement préparé.<br />
Un témoin négatif (tube non ensemencé) et un témoin positif (Tube ensemencé) sont<br />
incubés avec les tubes <strong>de</strong> dilution pendant 20 heures à 37°C.<br />
La détermination <strong>de</strong> la concentration minimale inhibitrice est effectué par estimation<br />
visuelle <strong>de</strong> l’apparition ou non <strong>de</strong> trouble dans les tubes incubé et la CMI correspond à la plus<br />
petite concentration restée limpi<strong>de</strong>.<br />
Un ensemencement par strie est effectué dans une boite <strong>de</strong> Pétri à partir <strong><strong>de</strong>s</strong> tubes <strong><strong>de</strong>s</strong><br />
différentes dilutions qui sera par la suite incubé à 37°C pendant 24 heures.<br />
Cette étape va nous permettre <strong>de</strong> déterminer la CMB qui correspond à la dilution qui<br />
arrive à tuer les microorganismes présents dans le tube (se manifeste par l’absence <strong>de</strong><br />
biomasse sur la strie), et <strong>de</strong> confirmer les résultats <strong>de</strong> CMI.<br />
Le tableau 1, illustre les résultats <strong>de</strong> la détermination <strong>de</strong> la CMI et <strong>de</strong> la CMB du<br />
produit objet <strong>de</strong> notre étu<strong>de</strong>.<br />
CMB/CMI<br />
2<br />
4<br />
2<br />
2<br />
2<br />
4<br />
Tableau 1 : Résultats <strong><strong>de</strong>s</strong> CMI et CMB du produit S5 (avec R= et n=3)<br />
12.5 CMI µg/ml<br />
25 CMB µg/ml<br />
3.12 CMI µg/ml<br />
12,5 CMB µg/ml<br />
6.25 CMI µg/ml<br />
12.5 CMB µg/ml<br />
12.5 CMI µg/ml<br />
25 CMB µg/ml<br />
6.25 CMI µg/ml<br />
12.5 CMB µg/ml<br />
62.5 CMI µg/ml<br />
250 CMB µg/ml<br />
- 17 -<br />
Escherichia coli (ATCC 10536)<br />
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442),<br />
Staphylococcus Aureus (ATCC 6538)<br />
Enterococcus hirae (ATCC 10541)<br />
Candida albicans (ATCC 10231)<br />
Acinetobacter baumannii
Page 18 sur 26<br />
Les résultats du tableau précédant confirment ceux trouvés lors <strong>de</strong> la détermination <strong>de</strong><br />
l’inhibition <strong>de</strong> la souche contre la souche Staphylococcus aureus et confirment la nature<br />
bactérici<strong>de</strong> <strong>de</strong> notre produit (rapport CMB/CMI≤4 pour toutes les souches testées). De ce fait<br />
nous avons décidé <strong>de</strong> tester son effet <strong>antiseptique</strong> et ce en appliquant la procédure dictée par<br />
la normalisation européenne.<br />
Exemple 3 : Formulation du composés S5 (avec R= et n=3)<br />
Une solution <strong>antiseptique</strong> ayant une composition i<strong>de</strong>ntique au produit commercial<br />
« Cytéal ® » a été préparée tout en y remplaçant les principes actifs par notre produit.<br />
Tableau 2 : Composition du produit commercial « Cytéal ® » et <strong>de</strong> notre formulation analogue<br />
Composants communs Cytéal ® Formulation<br />
Cocamidopropyl Betaine<br />
Aci<strong>de</strong> Edétique<br />
Diéthanolami<strong>de</strong> <strong>de</strong> Coprah<br />
- 18 -<br />
Hexamidine<br />
(2500 mg/l)<br />
Digluconate chloroxedine<br />
(12882,5 mg/l)<br />
Chlorochrésol<br />
(7500 mg/l)<br />
( )n<br />
( )n<br />
H<br />
(300 mg/l)<br />
Total Principe actif 22882,5 300<br />
Principe actif « Cytéal ® »/ Principe actif « Formulation »<br />
76,275<br />
H
Page 19 sur 26<br />
Exemple 4 : Estimation <strong>de</strong> l’activité <strong>antiseptique</strong> du produit (S5 avec R= et n=3) et <strong>de</strong> la formulation duquel est issu<br />
Le milieu liqui<strong>de</strong> utilisé pour la préparation <strong><strong>de</strong>s</strong> cultures microbiennes, <strong><strong>de</strong>s</strong> inoculums et la détermination <strong>de</strong> la CMI, est un milieu<br />
reconstitué à partir <strong><strong>de</strong>s</strong> constituants du milieu LB (Peptone (10g), extrait <strong>de</strong> levure (5g), NaCl (5g)).<br />
Le milieu <strong>de</strong> culture soli<strong>de</strong> utilisé pour ces essais est le milieu LB dont la composition pour un litre est la suivante : Peptone (10g), extrait<br />
<strong>de</strong> levure (5g), NaCl (5g) et agar bactériologique (18g).<br />
Pour cet essai nous avons appliqué les normes NFT 72-152 et NF T 72-171 et nous avons opéré comme suit :<br />
- Préparation <strong><strong>de</strong>s</strong> suspensions microbiennes à tester<br />
- Contact avec la solution désinfectante à tester<br />
- Filtration et lavage <strong><strong>de</strong>s</strong> filtres pour éliminer les substances actives<br />
- Incubation <strong><strong>de</strong>s</strong> filtres à la température <strong>de</strong> 37°C pendant 24h<br />
- Lecture et calcul du taux <strong>de</strong> réduction microbienne<br />
Pour chacune <strong><strong>de</strong>s</strong> souches testées différentes proportions <strong><strong>de</strong>s</strong> solutions <strong>antiseptique</strong> (1 /9 ; 4/5 et 9/1) et différents temps <strong>de</strong> contact (5min,<br />
30min et 24h) ont été utilisés.<br />
- 19 -
Page 20 sur 26<br />
- Effet <strong>antiseptique</strong> in vitro du 1,1-bis[4-(3-diméthylamoniumpropoxy)phényl]-2-ferrocényl-but-1-ène citrate (S5 avec R= et n=3)<br />
Tableau 3 : Effet <strong>antiseptique</strong> avec et sans substances interférentes<br />
Souches<br />
Escherichia coli<br />
ATCC 10536<br />
Pseudomonas aeruginosa<br />
ATCC 15442<br />
Staphylococcusaureus<br />
ATCC 6538<br />
Enterococcus hirae<br />
ATCC 10541<br />
Candida albicans<br />
ATCC 10231<br />
Inoculum<br />
N:1.75 10 8<br />
N:1.25 10 7<br />
N:1.4 10 8<br />
N:5.6 10 7<br />
N:7 10 6<br />
- 20 -<br />
Avec substances interférentes Sans substances interférentes<br />
Concentration 9/1 4/5 1/9 9/1 4/5 1/9<br />
Temps 5 min 30 min 24 h 5 min 30 min 24 h 5 min 30 min 24 h 5 min 30 min 24 h 5 min 30 min 24 h 5 min 30 min 24 h<br />
Na 58 0 0 >3 10 2 200 150 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 4 3 0 46 9 0 >3 10 2 >3 10 2 0<br />
R 3 10 6<br />
1.75<br />
10 8<br />
1.75<br />
10 8<br />
--<br />
8.7<br />
10 4<br />
N : Contamination initiale ; Na : Contamination après traitement ; R : Taux <strong>de</strong> réduction<br />
1.16<br />
10 5<br />
-- -- --<br />
4.4<br />
10 6<br />
5.8<br />
10 6<br />
1.75<br />
10 8<br />
3.8<br />
10 5<br />
1.9<br />
10 6<br />
1.75<br />
10 8<br />
-- --<br />
Na 0 0 0 0 0 0 >3 10 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0<br />
R<br />
1.25<br />
10 7<br />
1.25<br />
10 7<br />
1.25<br />
10 7<br />
1.25<br />
10 7<br />
1.25<br />
10 7<br />
1.25<br />
10 7<br />
--<br />
1.25<br />
10 7<br />
Na 10 2 0 >3 10 2 180 80 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 2 1 0 65 3 0 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2<br />
R<br />
1.4<br />
10 6<br />
7<br />
10 7<br />
1.4<br />
10 8<br />
--<br />
7<br />
10 4<br />
1.7<br />
10 5<br />
1.25<br />
10 7<br />
-- -- --<br />
1.25<br />
10 7<br />
7<br />
10 6<br />
1.25<br />
10 7<br />
1.4<br />
10 7<br />
1.25<br />
10 7<br />
1.4<br />
10 8<br />
1.25<br />
10 7<br />
2<br />
10 5<br />
1.25<br />
10 7<br />
4.6<br />
10 6<br />
1.25<br />
10 7<br />
1.4<br />
10 8<br />
1.25<br />
10 7<br />
1.25<br />
10 7<br />
1.75<br />
10 8<br />
1.25<br />
10 7<br />
-- -- --<br />
Na 0 0 0 0 0 0 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0<br />
R<br />
5.6<br />
10 7<br />
5.6<br />
10 7<br />
5.6<br />
10 7<br />
5.6<br />
10 7<br />
5.6<br />
10 7<br />
5.6<br />
10 7<br />
2.8<br />
10 5<br />
5.6<br />
10 7<br />
Na 0 0 0 1.8 10 2 0 0 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 0 1 1 >3 10 2 100 0 >3 10 2 >3 10 2 1<br />
R<br />
7<br />
10 6<br />
7<br />
10 6<br />
7<br />
10 6<br />
3.8<br />
10 4<br />
7<br />
10 6<br />
7<br />
10 6<br />
5.6<br />
10 7<br />
-- -- --<br />
5.6<br />
10 7<br />
7<br />
10 6<br />
5.6<br />
10 7<br />
7<br />
10 6<br />
5.6<br />
10 7<br />
7<br />
10 6<br />
5.6<br />
10 7<br />
23<br />
10 1<br />
5.6<br />
10 7<br />
7<br />
10 4<br />
5.6<br />
10 7<br />
7<br />
10 6<br />
5.6<br />
10 7<br />
5.6<br />
10 7<br />
-- --<br />
5.6<br />
10 7<br />
7<br />
10 6
Page 21 sur 26<br />
- Effet <strong>antiseptique</strong> in vitro du produit formulé et du produit commercial « Cytéal ® » (Avec substances interférentes)<br />
Tableau 4 : Effet <strong>antiseptique</strong> du produit formulé en présence <strong>de</strong> substances interférentes<br />
Souches Inoculum<br />
Escherichia coli<br />
ATCC 10536<br />
Pseudomonas aeruginosa<br />
ATCC 15442<br />
Staphylococcus aureus<br />
ATCC 6538<br />
Enterococcus hirae<br />
ATCC 10541<br />
Candida albicans<br />
ATCC 10231<br />
N:<br />
1.75 10 10<br />
N:<br />
1.25 10 7<br />
N:<br />
1.4 10 10<br />
N:<br />
5.6 10 7<br />
N:<br />
7 10 10<br />
- 21 -<br />
N : Contamination initiale ; Na : Contamination après traitement ; R : Taux <strong>de</strong> réduction<br />
- Effet <strong>antiseptique</strong> in vitro du produit formulé sur une souche d’Acinetobacter baumannii (Avec substances interférentes)<br />
Tableau 5 : Effet <strong>antiseptique</strong> sur Acinetobacter baumannii<br />
Produit formulé Cytéal ®<br />
Concentration 9/1 4/5 1/9 9/1 4/5 1/9<br />
Temps 5 min<br />
Souches Inoculum<br />
30<br />
min<br />
24 h 5 min<br />
30<br />
min<br />
24 h 5 min<br />
N : Contamination initiale ; Na : Contamination après traitement ; R : Taux <strong>de</strong> réduction<br />
30<br />
min<br />
24 h 5 min<br />
30<br />
min<br />
24 h 5 min<br />
30<br />
min<br />
24 h 5 min<br />
Na >3 10 2 240 0 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 200 0 >3 10 2 167 0 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2<br />
R --<br />
Acinetobacter baumannii N:6.39 10 8<br />
7.3<br />
10 6<br />
1.75<br />
10 10<br />
-- -- -- -- -- -- --<br />
8.7<br />
10 6<br />
1.75<br />
10 10<br />
--<br />
1.04<br />
10 7<br />
1.75<br />
10 10<br />
30<br />
min<br />
24 h<br />
-- -- --<br />
Na 3 0 0 51 2 0 >3 10 2 79 56 -- -- -- -- -- -- -- -- --<br />
R<br />
4.1<br />
10 5<br />
1.25<br />
10 7<br />
1.25<br />
10 7<br />
2.5<br />
10 4<br />
6.2<br />
10 5<br />
1.25<br />
10 7<br />
--<br />
1.6<br />
10 4<br />
2.2<br />
10 4<br />
-- -- -- -- -- -- -- -- --<br />
Na 250 240 0 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 69 0 0 112 140 2 >3 10 2 >3 10 2 40<br />
R<br />
5.6<br />
10 6<br />
5.8<br />
10 6<br />
1.4<br />
10 10<br />
-- -- -- -- -- --<br />
2<br />
10 7<br />
1.4<br />
10 10<br />
1.4<br />
10 10<br />
1.25<br />
10 7<br />
1<br />
10 7<br />
7<br />
10 8<br />
-- --<br />
Na 1 2 0 >3 10 2 20 4 >3 10 2 16 11 -- -- -- -- -- -- -- -- --<br />
R<br />
5.6<br />
10 6<br />
2.8<br />
10 6<br />
5.6<br />
10 7<br />
--<br />
2.8<br />
10 5<br />
1.4<br />
10 6<br />
--<br />
3.5<br />
10 5<br />
5.1<br />
10 5<br />
-- -- -- -- -- -- -- -- --<br />
Na 25 29 0 97 50 0 >3 10 2 200 110 80 0 0 98 2 0 200 53 29<br />
R<br />
2.8<br />
10 8<br />
2.41<br />
10 8<br />
7<br />
10 10<br />
7.2<br />
10 7<br />
1.4<br />
10 8<br />
7<br />
10 10<br />
--<br />
3.5<br />
10 7<br />
6.36<br />
10 7<br />
8.7<br />
10 7<br />
7<br />
10 10<br />
Produit formulé<br />
Concentration 9/1 4/5 1/9<br />
Temps 5 min 30 min 24 h 5 min 30 min 24 h 5 min 30 min 24 h<br />
Na >3 10 2 >3 10 2 24 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2 >3 10 2<br />
R -- -- 2.66 10 6 -- -- -- -- -- --<br />
7<br />
10 10<br />
7.1<br />
10 7<br />
3.5<br />
10 9<br />
7<br />
10 10<br />
3.5<br />
10 7<br />
1.32<br />
10 7<br />
3.5<br />
10 7<br />
2.4<br />
10 8
Page 22 sur 26<br />
Il ressort du tableau 3 que notre produit a une excellente activité <strong>antiseptique</strong> et<br />
répond bien à l’exigence <strong>de</strong> la norme (NF T 72-171) <strong>de</strong> réduction du nombre <strong>de</strong> germe <strong>de</strong> 5<br />
log.<br />
Il ressort du même tableau que le produit, en absence <strong>de</strong> substances interférentes, est<br />
efficace à la dose <strong>de</strong> 4/5, et perd un peu <strong>de</strong> son efficacité en leur présence.<br />
Il ressort du tableau 4, regroupant les résultats <strong>de</strong> l’effet <strong>antiseptique</strong> que malgré la<br />
présence <strong>de</strong> substances interférentes, notre produit est aussi efficace que le produit<br />
commercial Cytéal ® ,<br />
Notre produit formulé s’avère plus intéressant que le produit <strong>de</strong> référence utilisé<br />
surtout si on prend en considération les proportions <strong>de</strong> principes actifs incluses dans chacun<br />
d’eux (Principe actif « Cytéal ® »/ Principe actif formule =76,275).<br />
Même si on a enregistré dans le tableau 5 une légère baisse <strong>de</strong> l’activité <strong>antiseptique</strong><br />
<strong>de</strong> notre produit, qui prend plus <strong>de</strong> temps pour tuer les germes testés (on ne décèle l’activité<br />
qu’après 24 heures), ce déclin est mineur si on prend en considération la résistance connue<br />
d’Acinetobacter baumannii, aux antibiotiques et aux <strong>antiseptique</strong>s. Acinetobacter baumannii<br />
est une bactérie opportuniste responsable d’IN multi-résistantes, difficiles à traiter et souvent<br />
associées à une létalité élevée. Elle est une cause croissante <strong>de</strong> d’IN, notamment <strong>de</strong><br />
pneumopathies en réanimation. Sa transmission se fait à partir d’une source commune ou <strong>de</strong><br />
patient à patient et elle est facilitée par une colonisation im<strong>portant</strong>e <strong><strong>de</strong>s</strong> patients, la<br />
contamination <strong><strong>de</strong>s</strong> surfaces environnantes et une survie prolongée sur <strong><strong>de</strong>s</strong> surfaces sèches ou<br />
les mains [10].<br />
- Essai <strong>de</strong> l’efficacité du produit formulé pour le lavage hygiénique <strong><strong>de</strong>s</strong> mains<br />
conformément à la norme EN 1499 : Nous nous sommes référés à la norme EN 1499<br />
(Lavage Hygiénique Des Mains) et nous avons opéré comme suit :<br />
1. Dénombrement <strong><strong>de</strong>s</strong> germes sur mains contaminées artificiellement<br />
- Préparation d’une suspension d’Escherichia coli (ATCC 10536)<br />
- lavage <strong><strong>de</strong>s</strong> mains au savon<br />
- trempage <strong><strong>de</strong>s</strong> bouts <strong><strong>de</strong>s</strong> doigts dans cette suspension pendant 5 secon<strong><strong>de</strong>s</strong><br />
- 22 -
Page 23 sur 26<br />
- séchage <strong><strong>de</strong>s</strong> mains pendant 3 minutes<br />
- trempage <strong><strong>de</strong>s</strong> bouts <strong><strong>de</strong>s</strong> doigts dans un milieu <strong>de</strong> culture liqui<strong>de</strong><br />
- dénombrement <strong><strong>de</strong>s</strong> microorganismes<br />
2. Dénombrement <strong><strong>de</strong>s</strong> germes sur mains contaminées artificiellement (fait pour le produit<br />
<strong>antiseptique</strong> et un produit non bactérici<strong>de</strong>)<br />
- Préparation d’une suspension d’Escherichia coli (ATCC 10536)<br />
- lavage <strong><strong>de</strong>s</strong> mains au savon<br />
- trempage <strong><strong>de</strong>s</strong> bouts <strong><strong>de</strong>s</strong> doigts dans cette suspension pendant 5 secon<strong><strong>de</strong>s</strong><br />
- séchage <strong><strong>de</strong>s</strong> mains pendant 3 minutes<br />
- friction <strong><strong>de</strong>s</strong> mains avec le produit à tester et laisser agir 60 secon<strong><strong>de</strong>s</strong><br />
- trempage <strong><strong>de</strong>s</strong> bouts <strong><strong>de</strong>s</strong> doigts dans un milieu <strong>de</strong> culture liqui<strong>de</strong><br />
- dénombrement <strong><strong>de</strong>s</strong> microorganismes<br />
Pour qu’il soit considéré comme efficace, le produit doit réduire considérablement la<br />
contamination <strong><strong>de</strong>s</strong> mains.<br />
Tableau 6 : Résultats <strong>de</strong> l’essai <strong>de</strong> lavage hygiénique <strong><strong>de</strong>s</strong> mains (Phase 2, étape 2)<br />
Formule sans principe actif Formule avec principe actif<br />
Exp. Prè-traitement Post traitement Réduction Prè-traitement Post traitement Réduction<br />
1 1,5 10 8 1 ,3 10 6 1.15 10 2 1,5 10 8 4 10 4 0.38 10 4<br />
2 1,4 10 8 2,5 10 6 0.56 10 2 1,4 10 8 3,3 10 5 0.42 10 4<br />
3 6 10 8 5 10 6 1.2 10 2 6 10 8 9 10 4 0.66 10 4<br />
4 8,6 10 8 3 10 6 2.86 10 2 8,6 10 8 2 ,5 10 4 3.44 10 4<br />
Il ressort du tableau précé<strong>de</strong>nt que notre produit réduit la contamination <strong><strong>de</strong>s</strong> mains par<br />
Escherichia coli (ATCC 10536) <strong>de</strong> 4 log. Cette réduction confirme l’efficacité <strong>de</strong> notre<br />
produit et encourage son utilisation comme <strong>antiseptique</strong>.<br />
- 23 -
Page 24 sur 26<br />
REVENDICATIONS :<br />
1. La présente invention concerne <strong><strong>de</strong>s</strong> composés chimiques <strong>de</strong> <strong>citrates</strong> <strong>diaryl</strong> <strong>butènes</strong> dont la<br />
formule générale est la suivante :<br />
1 à 5.<br />
R<br />
- 24 -<br />
( )n<br />
( )n<br />
R peut être , , , . ,<br />
H<br />
H<br />
(CO)3<br />
,<br />
(CO)3 (CO)3 et n peut varier <strong>de</strong><br />
Dans la mesure où, dans les composés ci-<strong><strong>de</strong>s</strong>sus, le ferrocène intervient par son<br />
aromaticité, une approche i<strong>de</strong>ntique mais avec un groupe aryl purement organique ou autre<br />
groupe métallique, au lieu et à la place du ferrocène conduit à <strong><strong>de</strong>s</strong> résultats sensiblement<br />
équivalents, le reste <strong>de</strong> la structure <strong>de</strong>meurant inchangé.<br />
2. Les composés objets <strong>de</strong> notre brevet, sont actifs aussi bien contre les bactéries Gram+ et<br />
Gram- ainsi que les champignons pathogènes à l’Homme et fixés par les normes NFT 72-152<br />
et NF T 72-171.<br />
3. Les composés objets <strong>de</strong> notre brevet, ont une excellente activité <strong>antiseptique</strong> qui répond à<br />
l’exigence <strong>de</strong> réduction <strong>de</strong> 5 log fixée par les normes NFT 72-152 et NF T 72-171 (Phase 1 <strong>de</strong><br />
la procédure <strong>de</strong> validation <strong>de</strong> l’activité d’un <strong>antiseptique</strong>).
Page 25 sur 26<br />
4. Les composés objets <strong>de</strong> notre brevet, conservent leur activité <strong>antiseptique</strong> après formulation<br />
avec un composé tensioactif (Cocamidopropyl Betaine), d’un agent complexant (Aci<strong>de</strong><br />
Edétique) et d’un agent stabilisateur <strong>de</strong> mousse (Diéthanolami<strong>de</strong> <strong>de</strong> Coprah).<br />
5. Les composés objets <strong>de</strong> notre brevet, arrivent à tuer Acinetobacter baumannii réputée<br />
comme résistante aux antibiotiques. Ils répon<strong>de</strong>nt donc aux exigences <strong>de</strong> l’étape 1 <strong>de</strong> la phase<br />
2 <strong>de</strong> la procédure <strong>de</strong> validation <strong>de</strong> l’activité d’un <strong>antiseptique</strong>.<br />
6. Les composés objets <strong>de</strong> notre brevet, arrivent à réduire considérablement (4 log) la<br />
contamination artificielle <strong><strong>de</strong>s</strong> mains en 60 secon<strong><strong>de</strong>s</strong>. Ils répon<strong>de</strong>nt donc aux exigences <strong>de</strong><br />
l’étape 2 <strong>de</strong> la phase 2 <strong>de</strong> la procédure <strong>de</strong> validation <strong>de</strong> l’activité d’un <strong>antiseptique</strong>.<br />
7. Les composés objets <strong>de</strong> notre brevet, peuvent être formulés avec d’autres composés<br />
tensioactifs, d’autres agents complexant, d’autres agents stabilisateurs <strong>de</strong> mousse ou d’autres<br />
produits chimiques qui peuvent s’avérer nécessaires à leur activité et utilisation. Nous<br />
revendiquons, donc, toutes autres formulations possibles <strong>de</strong> nos composés.<br />
8. Les composés objets <strong>de</strong> notre brevet, sont donc utilisables en tant qu’<strong>antiseptique</strong>s,<br />
désinfectants ou détergents désinfectants. Nous revendiquons pour ces composés et les<br />
formulations qui en découlent les applications déjà citées.<br />
9. Les composés objets <strong>de</strong> notre brevet sont revendiqués pour une utilisation<br />
pharmacologique, vétérinaire ou industrielle.<br />
10. Les composés objets <strong>de</strong> notre brevet ont d’autre vertus : nous les revendiquons,<br />
également, toute autre application thérapeutique (antibiotique, chimiothérapie, …).<br />
- 25 -
Page 26 sur 26<br />
Références citées<br />
1. Mehdi El Arbi, Pascal Pigeon, Si<strong>de</strong>n Top, Ali Rhouma, Sami Aifa, Ahmed Rebai,<br />
Anne Vessières, Marie-Au<strong>de</strong> Plamont et Gérard Jaouen. Evaluation of bactericidal and<br />
fungicidal activity of ferrocenyl or phenyl <strong>de</strong>rivatives in the diphenyl butene series.<br />
Journal of Organometallic Chemistry 696 (2011) 1038-1048<br />
2. Enquête <strong>de</strong> prévalence <strong><strong>de</strong>s</strong> infections nosocomiales 2001, groupe Raisin, résultats<br />
publiés le 28/10/2003, www.invs.sante.fr/surveillance/raisin/.<br />
3. M. Grare, M. Mourer, J.-B. Regnouf <strong>de</strong> Vains, C. Finance, R.-E. Duval. Vers <strong>de</strong><br />
nouvelles molécules antibactériennes. Intérêt du para-guanidinoéthylcalix[4]arène.<br />
Pathologie Biologie 54 (2006) 470–476<br />
4. Antiseptiques et désinfectants. Centre <strong>de</strong> Coordination <strong>de</strong> la Lutte contre les Infections<br />
Nosocomiales <strong>de</strong> l’Interrégion Paris-Nord (C.CLIN Paris-Nord). Mai 2000<br />
5. NF T 72 101 (mars 1981) Antiseptiques et désinfectants Vocabulaire.<br />
6. Pharmacopée française. Hrsg. v. Agence française <strong>de</strong> sécurité sanitaire <strong><strong>de</strong>s</strong> produits <strong>de</strong><br />
santé. 10 ème édition.<br />
7. NF EN 1040 Indice <strong>de</strong> classement T 72-152 (avril 1997) Antiseptiques et<br />
désinfections chimiques Activité bactérici<strong>de</strong> <strong>de</strong> base Métho<strong>de</strong> d'essai et prescriptions<br />
(Phase 1).<br />
8. NF T 72-l71 (novembre 1988) Antiseptiques et désinfectants utilisés à l'état liqui<strong>de</strong>,<br />
miscibles à l'eau. Détermination <strong>de</strong> l'activité bactérici<strong>de</strong> en présence <strong>de</strong> substances<br />
interférences <strong>de</strong> référence (métho<strong>de</strong> par filtration sur membranes).<br />
9. NF EN 1499 / NF T 72-501 / lavage hygiénique <strong><strong>de</strong>s</strong> mains (test in vivo). Antiseptiques<br />
et désinfectants chimiques. Lavage hygiénique <strong><strong>de</strong>s</strong> mains. Métho<strong>de</strong> d'essai et<br />
prescriptions (phase 2 / étape 2). 20/06/1997<br />
10. Epidémie d’infection & colonisation à Acinetobacter baumannii BLSE. Région Nord<br />
Pas-<strong>de</strong>-Calais. Recommandations. C.CLIN Paris-Nord. Octobre 2003.<br />
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