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THESE DE DOCTORAT DE<br />
L’UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE ET DE l’UNIVERSITE DE SFAX<br />
Ecole Doctorale <strong>de</strong> Chimie Moléculaire<br />
Spécialité : Chimie Bioorganométallique<br />
Présentée par Mehdi EL ARBI<br />
Pour obtenir le gra<strong>de</strong> <strong>de</strong> Docteur <strong>de</strong> l’université Paris VI <strong>et</strong> <strong>de</strong> l’Université <strong>de</strong> Sfax<br />
<strong>Synthèse</strong> <strong>de</strong> <strong>composés</strong> <strong>organométalliques</strong> <strong>et</strong> <strong>évaluation</strong> <strong>de</strong> <strong>leurs</strong> <strong>activités</strong><br />
<strong>biologiques</strong> en phytopathologie <strong>et</strong> en thérapie<br />
Soutenue le 11/12/2010<br />
Devant le Jury composé <strong>de</strong> :<br />
Pr. Ali GARGOURI Prési<strong>de</strong>nt<br />
Dr. Radhouane GDOURA Rapporteur<br />
Dr. Christophe BIOT Rapporteur<br />
Dr. Anne VESSIERES Examinateur<br />
Dr. Si<strong>de</strong>n TOP Examinateur<br />
Dr. Ali RHOUMA Examinateur<br />
Pr. Gérard JAOUEN Co-Directeur<br />
Pr. Ahmed REBAI Co-Directeur<br />
Thèse préparée à l’Ecole Nationale Supérieure <strong>de</strong> Chimie <strong>de</strong> Paris (France)<br />
<strong>et</strong> à la Faculté <strong>de</strong>s Sciences <strong>de</strong> Sfax (Tunisie)
Résumé<br />
Les <strong>organométalliques</strong> ont acquis ces <strong>de</strong>rnières années une gran<strong>de</strong> importance grâce à<br />
<strong>leurs</strong> <strong>activités</strong> <strong>biologiques</strong> potentielles ou démontrées. Le Ferrocène est connu en tant<br />
que produit chimiquement <strong>et</strong> thermiquement stable dont son addition dans certaines<br />
drogues a augmenté <strong>leurs</strong> <strong>activités</strong> <strong>biologiques</strong> (antitumorale, tel que le ferrocifène ;<br />
antibiotiques, tel que le ferrocényl-penicilline <strong>et</strong> antifongique, tel que le ferrocène-<br />
fluconazole). Cependant, dans le mon<strong>de</strong> végétal, si l’utilisation du ferrocène a été brev<strong>et</strong>ée<br />
<strong>de</strong>puis 1977 comme fertilisant <strong>et</strong> pour la prévention <strong>et</strong> le traitement <strong>de</strong> la carence en fer, les<br />
produits qui en sont dérivés sont encore mal étudiés en agriculture.<br />
Partant <strong>de</strong> l’idée <strong>de</strong> l’existence d’une analogie entre le processus tumoral animal <strong>et</strong> végétal <strong>et</strong><br />
<strong>de</strong> la multifonctionnalité <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> thérapeutiques, c<strong>et</strong>te thèse avait pour objectifs la<br />
synthèse <strong>de</strong> divers <strong>composés</strong> <strong>organométalliques</strong> <strong>et</strong> la prospection <strong>de</strong> <strong>leurs</strong> eff<strong>et</strong>s <strong>biologiques</strong><br />
dans le règne végétal <strong>et</strong> animal. Ainsi, pour améliorer leur solubilité <strong>et</strong> faciliter <strong>leurs</strong><br />
utilisations, nous avons transformé ces <strong>composés</strong> en dérivés sucrés (pour les ferrociphénols)<br />
ou en sel citrate (pour les <strong>composés</strong> aminés).<br />
Les différents produits obtenus ont été testés contre les cellules tumorales MDA-MB-231, la<br />
galle du coll<strong>et</strong> ainsi que différents microorganismes pathogènes à l’Homme <strong>et</strong> aux végétaux.<br />
Nous avons montré que les <strong>composés</strong>, organiques <strong>et</strong> ferrocéniques, analogues au tamoxifène,<br />
portant <strong>de</strong>s chaînes aminées se sont avérés efficaces aussi bien contre les microorganismes <strong>et</strong><br />
les cellules cancéreuses. Ces produits ont également démontré une excellente activité<br />
phytosanitaire, meilleure que celles <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> <strong>de</strong> référence, contre les différents<br />
microorganismes pathogènes à l’olivier.<br />
Mots clés : Organométalliques, Ferrocène, Tamoxifène, MDA-MB-231, galle du coll<strong>et</strong>,<br />
activité antimicrobienne, activité antitumorale.
Summary<br />
Organom<strong>et</strong>allics have shown interesting applications during the last ten years, due to their<br />
multiple biological activities and their potential use as biological probes, green catalysis and<br />
therapeutic agents.<br />
Ferrocene is known to be stable chemically and thermally and its addition in many drugs has<br />
increased their biological activities (anti-tumourals such as ferrocifen, antibiotics such as<br />
ferrocenyl-penecillin, antifungals such as ferrocen-fluconazol).<br />
While the use of ferrocene is patented as a fertilizer and for the prevention and treatment of<br />
iron <strong>de</strong>ficiency in plants, only a few ferrocene <strong>de</strong>rivatives have been studied for their<br />
application in agriculture .<br />
Starting from the i<strong>de</strong>a of an analogy in tumour processes b<strong>et</strong>ween crops and animals and due<br />
to some multifunctional therapeutic compounds (anti-tumour, antibiotics, antifungal….), the<br />
aim of the present thesis was the synthesis of organom<strong>et</strong>allic molecules and their common<br />
use in plant and animal therapies. Moreover, in or<strong>de</strong>r to improve their solubility and facilitate<br />
their use, these synth<strong>et</strong>ic compounds were converted to sugar <strong>de</strong>rivatives (such as<br />
ferrociphenols) or salt citrate <strong>de</strong>rivatives (such as amino compounds).<br />
The different compounds obtained were assayed against the MDA-MB-231 tumour cell line,<br />
crown gall disease and against different pathogenic microbes affecting crops. We have shown<br />
that the amino-tamoxifen analogues, organic or ferrocenic, were efficient against both tumour<br />
and microbial cells. These compounds could be used in phytohealth monitoring due to their<br />
ramarquable activity against olive tree microbial pathogens compared to many other standard<br />
compounds.<br />
Key words: Organom<strong>et</strong>allics, Ferrocene, Tamoxifen, MDA-MB-231, crown gall,<br />
antimicrobial, antitumour.
Avant-propos<br />
Toute bonne chose a une fin, c’est maintenant pour moi le temps <strong>de</strong> j<strong>et</strong>er<br />
la servi<strong>et</strong>te <strong>et</strong> <strong>de</strong> terminer c<strong>et</strong>te trépidante aventure que fut le doctorat.<br />
Mon parcours fut parsemé d’émotions <strong>de</strong> toutes sortes : enthousiasme,<br />
excitation, fatigue, stress, lassitu<strong>de</strong>, toute la gamme y a passé dans l’ordre <strong>et</strong><br />
dans le désordre. À un certain moment donné, en début <strong>de</strong> parcours, incertain <strong>de</strong><br />
mon aptitu<strong>de</strong> à aller jusqu’au bout, j’ai même pensé tout abandonner. Plusieurs<br />
années d’incertitu<strong>de</strong> plus tard, j’en suis finalement là, en train <strong>de</strong> rédiger l’avant-<br />
propos <strong>de</strong> ma thèse, que je me suis réservé pour la toute fin <strong>de</strong> c<strong>et</strong>te <strong>de</strong>rnière<br />
partie <strong>de</strong> l’aventure mais non la moindre, la rédaction, que je ne suis pas<br />
fâchée <strong>de</strong> terminer. Je crois laisser pour la postérité un compte rendu <strong>de</strong><br />
qualité : j’y ai mis tout mon cœur ainsi que tout mon savoir-faire accumulé<br />
<strong>de</strong>puis 32 ans.<br />
J’en profite au passage pour remercier toutes les personnes qui ont<br />
contribué <strong>de</strong> près ou <strong>de</strong> loin à la réussite <strong>de</strong> mon aventure effectuée, dans le<br />
cadre d’une cotutelle entre l’Université Pierre <strong>et</strong> Marie Curie (Laboratoire<br />
« Charles Frie<strong>de</strong>l» à l’ENSCP) <strong>et</strong> l’Université <strong>de</strong> Sfax (Unité <strong>de</strong> recherche<br />
« Protection <strong>de</strong>s Plantes <strong>et</strong> Environnement » à l’Institut <strong>de</strong> l’olivier).<br />
Je remercie le Professeur Gérard JAOUEN pour m’avoir accueilli dans son<br />
laboratoire. Ce travail n’aurait pas pu se faire sans son ai<strong>de</strong> précieuse, sa<br />
gentillesse, ses compétences en chimie <strong>et</strong> son professionnalisme. Ses<br />
encouragements, associés aux moyens matériels dont j’ai disposés, m’ont permis<br />
<strong>de</strong> mener à bien la recherche présentée dans ce rapport. C’est pourquoi je lui<br />
exprime ma plus gran<strong>de</strong> gratitu<strong>de</strong> <strong>et</strong> j’espère que j’étais à la hauteur <strong>de</strong> la<br />
confiance qu’il m’a faite.
Je tiens tout particulièrement à exprimer le témoignage <strong>de</strong> toute ma<br />
gratitu<strong>de</strong> <strong>et</strong> l’expression <strong>de</strong> mes vifs remerciements au Professeur Ahmed<br />
REBAI qui a cru en moi <strong>et</strong> a accepté <strong>de</strong> diriger mes travaux <strong>de</strong> recherche. Je le<br />
prie <strong>de</strong> croire à ma respectueuse estime <strong>et</strong> à ma sincère reconnaissance pour ses<br />
conseils, ses critiques qui m’ont été très précieux <strong>et</strong> indispensables ainsi que<br />
pour toutes les ai<strong>de</strong>s qu’il m’a fournies tout le long <strong>de</strong> ma recherche.<br />
Je tiens, aussi, à exprimer le témoignage <strong>de</strong> toute ma gratitu<strong>de</strong> <strong>et</strong><br />
l’expression <strong>de</strong> mes vifs remerciements au Docteur Si<strong>de</strong>n TOP, qui a assuré<br />
l’encadrement <strong>de</strong> la partie chimique <strong>de</strong> mon travail. Je le remercie pour ses<br />
connaissances précieuses en chimie, pour sa gentillesse <strong>et</strong> pour sa patience à mon<br />
égard, <strong>de</strong>puis les procédures compliquées pour l’élaboration <strong>de</strong> la cotutelle en<br />
passant par les surprises administratives d’inscription <strong>et</strong> en finissant par<br />
l’adaptation <strong>de</strong>s pério<strong>de</strong>s <strong>de</strong> mon stage au laboratoire à mes possibilités <strong>de</strong><br />
désengagement professionnel. Je le remercie d’avoir su me gui<strong>de</strong>r dans ce<br />
travail, d’avoir été présent chaque fois que j’en avais besoin. Sa gran<strong>de</strong> culture<br />
<strong>de</strong> la chimie organométallique a été une source <strong>de</strong> solutions pour tous les<br />
problèmes rencontrés durant ma thèse. Merci Si<strong>de</strong>n pour votre disponibilité,<br />
dans les bons comme dans les mauvais moments.<br />
J’exprime mes vifs remerciements au Docteur Pascal PIGEON, Ingénieur<br />
<strong>de</strong> recherche, pour sa disponibilité, son soutien, son professionnalisme, ses<br />
connaissances en chimie <strong>et</strong> pour son extrême gentillesse. Les conversations que<br />
nous avons eues, furent extrêmement utiles ainsi qu’un plaisir que je n’oublierai<br />
jamais. Si je parviens aujourd’hui à m<strong>et</strong>tre fin à c<strong>et</strong>te aventure, c’est en gran<strong>de</strong><br />
partie grâce à vous. Mille mercis Pascal pour tout ce que vous avez fait pour moi.<br />
Je tiens, aussi, à exprimer le témoignage <strong>de</strong> toute ma gratitu<strong>de</strong> <strong>et</strong><br />
l’expression <strong>de</strong> mes vifs remerciements aux Docteurs Sami AIFA, maitre <strong>de</strong>
Conférences au centre <strong>de</strong> biotechnologie <strong>de</strong> Sfax <strong>et</strong> Ali RHOUMA, maître <strong>de</strong><br />
recherche à l’Institut <strong>de</strong> l’Olivier, qui m’ont également dirigé tout le long <strong>de</strong><br />
c<strong>et</strong>te aventure <strong>et</strong> étaient présents pour me prêter main forte, à chaque fois que<br />
j’en ai eu besoin. Vous étiez là, <strong>de</strong>puis le choix <strong>de</strong> ma thématique <strong>de</strong> recherche,<br />
pour la résolution <strong>de</strong>s difficultés que j’ai rencontrées tout au long <strong>de</strong> mon<br />
parcours <strong>et</strong> pour la correction <strong>de</strong> mon manuscrit <strong>et</strong> <strong>de</strong> mes publications. Je ne<br />
gar<strong>de</strong>rai <strong>de</strong> c<strong>et</strong>te expérience que <strong>de</strong> bon souvenir.<br />
Je remercie le Docteur Christophe BIOT (Université <strong>de</strong> Lille) ainsi que le<br />
Docteur Radhouane GDOURA (Faculté <strong>de</strong>s Sciences <strong>de</strong> Sfax) d’avoir accepté <strong>de</strong><br />
juger mon travail. Je remercie également le Professeur Ali GARGOURI (Centre<br />
<strong>de</strong> Biotechnologie <strong>de</strong> Sfax) <strong>et</strong> le Docteur Anne VESSIERES pour avoir accepté<br />
d’être membres <strong>de</strong> mon jury. C’est pour moi un honneur <strong>et</strong> un privilège <strong>de</strong> leur<br />
présenter mon travail <strong>de</strong> recherche. Je leur exprime ma plus gran<strong>de</strong> gratitu<strong>de</strong> <strong>et</strong><br />
mon plus profond respect.<br />
Je tiens aussi à adresser <strong>de</strong>s remerciements particuliers à Madame Anissa<br />
CHAARI, attachée <strong>de</strong> recherche à l’Institut <strong>de</strong> l’olivier pour avoir<br />
généreusement partagé avec moi son précieux savoir technique en culture<br />
cellulaires ainsi qu’à Ma<strong>de</strong>moiselle Marie Au<strong>de</strong> PLAMONT pour m’avoir accueilli<br />
<strong>et</strong> aidé, lors <strong>de</strong> la réalisation <strong>de</strong>s essais <strong>biologiques</strong>.<br />
J’adresse mes remerciements chaleureux à tous ceux que j’ai côtoyés,<br />
tout au long <strong>de</strong> ces quatre années, qui grâce à eux étaient fort agréables. A<br />
Méral GORMEN, Tesnim DALLEGI, Franck MARTIAL, Kelvin YONG LENG TAN,<br />
Didier hamels <strong>et</strong> jean-Philippe MONSERRAT au laboratoire Charle Frie<strong>de</strong>l pour<br />
leur ai<strong>de</strong> <strong>et</strong> leur bonne humeur. A Slim ZOUARI, Sonda CHERIF, Sondos HARIZ<br />
<strong>et</strong> Houcine BENDAOUD à l’ISET <strong>de</strong> Sfax pour <strong>leurs</strong> ai<strong>de</strong>s <strong>et</strong> <strong>leurs</strong><br />
encouragements. A Thab<strong>et</strong> YANGUI <strong>et</strong> Samira HAJTAYEB <strong>de</strong> l’Unité Protection
<strong>de</strong>s Plantes <strong>et</strong> Environnement pour leur ai<strong>de</strong>, leur disponibilité <strong>et</strong> les facilités<br />
qu’ils m’ont accordés le long <strong>de</strong> c<strong>et</strong>te aventure.<br />
D’autres compagnons m’ont également épaulé <strong>de</strong> différentes façons dans<br />
ma quête du doctorat <strong>et</strong> sans tous les nommer ici (je risquerai fâcheusement<br />
d’en oublier), je tiens à remercier : Collègues <strong>de</strong> travail complices, stagiaires<br />
maladroits mais bien intentionnés, amis <strong>de</strong> longue date espiègles ou fêtards, tous<br />
ceux à qui le chapeau semble adéquat, je vous le m<strong>et</strong>s chaleureusement.<br />
Je ne saurais oublier <strong>de</strong> remercier Monsieur Mohamed BELLAJ qui m’a<br />
accueilli chez lui, durant mes stages en France, Mon ami <strong>de</strong> toujours Karim<br />
AMMOUS avec qui j’ai cohabité lors <strong>de</strong> mes passages à Paris, Mon oncle Nizar <strong>et</strong><br />
sa femme Lobna, Ahmed BOURICHA <strong>et</strong> sa femme Salma, Sami EL ARBI ainsi que<br />
mes beaux parents, ma belle sœur Fatma <strong>et</strong> mon beau frère Mohamed qui ont<br />
pris soin, pendant mon absence, <strong>de</strong> ma famille. Tous étaient là pour m’ai<strong>de</strong>r, lors<br />
<strong>de</strong>s missions impossibles, <strong>et</strong> ma mission n’aurait pas abouti sans <strong>leurs</strong> ai<strong>de</strong>s<br />
précieuses.<br />
Je ne saurais clore ces remerciements sans exprimer mes immenses<br />
reconnaissances à mes parents qui m’ont soutenu tout le long <strong>de</strong> ma vie éducative.<br />
Je leur dois beaucoup. Qu’ils reçoivent ici ma profon<strong>de</strong> gratitu<strong>de</strong> pour <strong>leurs</strong><br />
innombrables sacrifices.<br />
Finalement, je n’aurais jamais pu réussir ma mission sans le support <strong>de</strong> ma<br />
femme. Merci Dorra pour tous les sacrifices que tu n’as cessés <strong>de</strong> faire le long<br />
<strong>de</strong> ces <strong>de</strong>rnières années. Je considère c<strong>et</strong>te thèse la tienne <strong>et</strong> celle <strong>de</strong> notre fils<br />
Mohamed que dieu nous le gar<strong>de</strong>.<br />
Mehdi El Arbi
Table <strong>de</strong>s matières<br />
INTRODUCTION GENERALE .................................................................................................................... 1<br />
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ……………………………………………….………………………………...3<br />
1. LA GALLE DU COLLET COMME EXEMPLE DE CANCER VEGETAL ET PROTECTION<br />
CHIMIQUE DES CULTURES .................................................................................................................... 3<br />
1.1. AGROBACTERIUM : AGENT CAUSAL DE LA GALLE DU COLLET ............................................................. 3<br />
1.1.1. Concepts généraux....................................................................................................................... 3<br />
1.1.1.1. Le T-DNA ..............................................................................................................................................4<br />
1.1.1.2. La prolifération cellulaire ........................................................................................................................4<br />
1.1.2. Processus d’infection................................................................................................................... 5<br />
1.1.2.1. Reconnaissance bactérie/hôte...................................................................................................................6<br />
1.1.2.2. Induction <strong>de</strong>s gènes vir............................................................................................................................7<br />
1.1.2.3. Transfert du T-DNA................................................................................................................................ 8<br />
1.1.2.3.1. Production du brin T........................................................................................................................8<br />
1.1.2.3.2. Le transporteur T.............................................................................................................................8<br />
1.1.2.3.3. Intégration dans le génome <strong>de</strong> l’hôte .............................................................................................. 10<br />
1.2. LA MORT CELLULAIRE PROGRAMMEE (PROGRAMMED CELL-DEATH « PCD ») CHEZ LES VEGETAUX ......... 12<br />
1.2.1. Effecteurs <strong>de</strong> la mort.................................................................................................................. 15<br />
1.2.1.1. Activité caspase <strong>et</strong> les métacaspases....................................................................................................... 15<br />
1.2.1.2. Autres protéases.................................................................................................................................... 17<br />
1.2.1.3. Nucléases.............................................................................................................................................. 18<br />
1.2.2. Signalisation, régulation <strong>et</strong> régulateurs .................................................................................... 19<br />
1.2.2.1. Signaux <strong>et</strong> sentiers <strong>de</strong> mort.................................................................................................................... 19<br />
1.2.2.2. Régulateurs........................................................................................................................................... 23<br />
1.3. LA LUTTE CONTRE AGROBACTERIUM TUMEFACIENS .......................................................................... 26<br />
1.3.1. Lutte culturale............................................................................................................................ 26<br />
1.3.2. Recherche <strong>de</strong> phénotypes génétiquement résistants .................................................................. 26<br />
1.3.3. La lutte biologique..................................................................................................................... 26<br />
1.3.4. Lutte chimique............................................................................................................................ 27<br />
1.4. LES FLEAUX DES CULTURES ET L’EXTENSION DE LA PROTECTION CHIMIQUE ..................................... 28<br />
2. LES COMPOSES ORGANOMETALLIQUES .................................................................................... 33<br />
2.1. INTRODUCTION ................................................................................................................................... 33<br />
2.2. HISTORIQUE........................................................................................................................................ 35<br />
2.2.1. Origine <strong>de</strong>s complexes <strong>organométalliques</strong> ................................................................................ 35<br />
2.2.2. Les premiers remè<strong>de</strong>s organométallique efficaces.................................................................... 36<br />
2.3. PROPRIETES MEDICINALES DES COMPOSES ORGANOMETALLIQUE ...................................................... 39<br />
2.4. LES COMPOSES ORGANOMETALLIQUES DERIVES DU FERROCENE ET LEUR UTILISATIONS ................... 45<br />
2.4.1. Utilisation <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> <strong>organométalliques</strong> dérivés du ferrocène .......................................... 45<br />
2.4.2. Importance du ligand................................................................................................................. 50<br />
2.5. LES DEFIS DE LA CHIMIE ORGANOMETALLIQUE .................................................................................. 53<br />
2.5.1. La toxicité .................................................................................................................................. 53<br />
2.5.2. Pallier la résistance aux médicaments ...................................................................................... 55<br />
2.5.3. Sélectivité................................................................................................................................... 56<br />
2.5.4. Composés <strong>organométalliques</strong> <strong>et</strong> solvants aqueux ..................................................................... 57<br />
2.6. CONCLUSION ...................................................................................................................................... 61<br />
RESULTATS ET DISCUSSION …………………………………………………………………………..…..62<br />
1. SYNTHESE CHIMIQUE ....................................................................................................................... 62<br />
1.1. SERIE 1 : COMPOSES PHENOLIQUES ET NON PHENOLIQUE DE LA SERIE DES DIARYL-FERROCENYL-<br />
BUTENES. ................................................................................................................................................... 62<br />
1.2. SERIE 2 : COMPLEXES DE FE, DE RU, DE RE ET DE MN DU DIPHENOL BUTENE.................................... 63<br />
1.3. SERIE 3 : AMIDES ANALOGUES DU FERROCIPHENOL ........................................................................... 64<br />
1.4. SERIE 4 : AMINES D’ARYL-FERROCENYL-BUTENE............................................................................... 67<br />
1.5. SERIE 5 : COMPOSES DIAMINES ORGANIQUES ET FERROCENIQUES...................................................... 68<br />
1.6. SERIE 6 : DERIVES DE �-GLUCOSE, DE �-MALTOSE ET DE �-CELLOBIOSE DU FERROCIPHENOL .......... 71<br />
1.7. SERIE 7 : SELS CITRIQUES DU FERROCIFENE ET D’UN PRODUIT DIAMINE ............................................ 74
1.8. ETUDE DE LA SOLUBILITE DANS L’EAU DES COMPOSES AMINES FERROCENIQUES ET DE LEURS SELS<br />
D’ACIDE CITRIQUE ..................................................................................................................................... 74<br />
1.9. CONCLUSION ...................................................................................................................................... 77<br />
1.10. PARTIE EXPERIMENTALE................................................................................................................... 77<br />
1.10.1. <strong>Synthèse</strong> du propionylferrocène, P8............................................................................................ 77<br />
1.10.2. <strong>Synthèse</strong> du (Z+E)-1-(4-hydroxyphényl)-1-phényl-2-ferrocényl-but-1-ène, P85 ........................... 78<br />
1.10.3. <strong>Synthèse</strong> du propionylcyclopentadiénylrhéniumtricarbonyle, P217.............................................. 79<br />
1.10.4. <strong>Synthèse</strong> du propionylruthénocène, P215.................................................................................... 79<br />
1.10.5. <strong>Synthèse</strong> du propiopnylcyclopentadiénylmanganès<strong>et</strong>ricarbonyle, P218 ....................................... 80<br />
1.10.6. <strong>Synthèse</strong> du 1,1-di(p-hydroxyphényl)-2-ruthénocényl-but-1-ène, P88 .......................................... 80<br />
1.10.7. <strong>Synthèse</strong> du 1,1-di(p-hydroxyphényl)-2-cyclopentadiénylrehniumtricarbonyl-but-1-ène, P89....... 81<br />
1.10.8. <strong>Synthèse</strong> du (Z+E)-1-(p-aminophényl)-1-phényl-2-ferrocényl-but-1-ène, P35.............................. 81<br />
1.10.9. <strong>Synthèse</strong> du (Z+E)-1-(p-propionylaminophényl)-1-phényl-2-ferrocényl-but-1-ène, P315 ............. 82<br />
1.10.10. <strong>Synthèse</strong> du (Z+E)-1-(p-isopropionylaminophényl)-1-phényl-2-ferrocényl-but-1-ène, P316....... 83<br />
1.10.11. <strong>Synthèse</strong> du (Z+E)-1-(p-t-butylamidophényl)-1-phényl-2-ferrocényl-but-1-ène, P317 ................ 84<br />
1.10.12. <strong>Synthèse</strong> du P312 ..................................................................................................................... 85<br />
1.10.13. Tentative <strong>de</strong> synthèse du P407 .................................................................................................. 86<br />
1.10.14. Tentative <strong>de</strong> synthèse du 2-(4-pyridinyl)-3-ferrocenylbut-2-ene, P321 ....................................... 86<br />
1.10.15. Tentative <strong>de</strong> synthèse du 2-(3-pyridinyl)-3-ferrocenylbut-2-ene, P322 ....................................... 87<br />
1.10.16. Tentative <strong>de</strong> synthèse du 1-(4-aminophenyl)-2-ferrocenylbut-1-ene, P323.................................. 88<br />
1.10.17. <strong>Synthèse</strong> du 2-(4-aminophenyl)-3-ferrocenylbut-2-ene, P371..................................................... 88<br />
1.10.18. <strong>Synthèse</strong> du 4,4’-bis(bromopropoxy)benzophenone, P477 ......................................................... 89<br />
1.10.19. <strong>Synthèse</strong> du 4,4’-bis(diméthylaminopropoxy)benzophenone, P490............................................. 90<br />
1.10.20. <strong>Synthèse</strong> du 4,4’-bis(pyrrolidinylpropoxy)benzophenone, P583 ................................................. 90<br />
1.10.21. <strong>Synthèse</strong> du 1,1-bis[4-(3-Diméthylaminopropoxy)phenyl]-2-ferrocenyl-but-1-ène, P116............ 91<br />
1.10.22. <strong>Synthèse</strong> du dérivé glycosylé P28.............................................................................................. 92<br />
1.10.23. <strong>Synthèse</strong> du dérivé glycosylé P29.............................................................................................. 93<br />
1.10.24. <strong>Synthèse</strong> <strong>de</strong>s dérivés P345 <strong>et</strong> P346............................................................................................ 94<br />
1.10.25. <strong>Synthèse</strong> du dérivé glycosylé P42.............................................................................................. 96<br />
1.10.26. <strong>Synthèse</strong> du citrate <strong>de</strong> 1-[4-(3-Hydrodiméthylamoniumpropoxy)phényl]-1-(4-hydroxyphényl)-2ferrocényl-but-1-ène,<br />
P514 .................................................................................................................... 97<br />
1.10.27. <strong>Synthèse</strong> du citrate <strong>de</strong> 1-[4-(3-Hydrodiméthylamoniumpropoxy)phényl]-[4-(3diméthylaminopropoxy)phényl]-12-ferrocényl-but-1-ène,<br />
P493 .............................................................. 98<br />
2. ESSAIS BIOLOGIQUES........................................................................................................................ 99<br />
2.1. ETUDE DE L’EFFET ANTIMICROBIEN ET ANTITUMORALE DES COMPOSES SYNTHETISES ...................... 99<br />
2.2. APPLICATION DES MEILLEURES PRODUITS SYNTHETISES A LA PHYTOPHARMACIE............................ 107<br />
2.2.1. Test <strong>de</strong> phytotoxicité................................................................................................................... 107<br />
2.2.2. Lutte contre la galle du coll<strong>et</strong> sur olivier..................................................................................... 107<br />
2.2.3. Lutte contre la tuberculose <strong>de</strong> l’olivier........................................................................................ 109<br />
2.2.4. Lutte contre la maladie causée par Fusarium solani ................................................................... 109<br />
2.3. PARTIE EXPERIMENTALE..................................................................................................................... 110<br />
2.3.1. Détermination du coefficient <strong>de</strong> partage ..................................................................................... 110<br />
2.3.2. Eff<strong>et</strong> antiprolifératif................................................................................................................... 111<br />
2.3.3. Estimation <strong>de</strong> l’eff<strong>et</strong> antimicrobien ............................................................................................. 114<br />
2.3.3.1. Détermination <strong>de</strong>s zones d’inhibition ................................................................................................... 114<br />
2.3.3.2. Détermination <strong>de</strong>s CMI <strong>et</strong> CMB .......................................................................................................... 114<br />
2.3.3.2.1. Souches microbiennes testées ...................................................................................................... 114<br />
2.3.3.2.2. Milieux <strong>de</strong> cultures utilisés .......................................................................................................... 115<br />
2.3.3.2.3. Préparation <strong>de</strong> l’inoculum............................................................................................................ 115<br />
2.3.3.2.4. Détermination <strong>de</strong> la CMI ............................................................................................................ 115<br />
2.3.3.2.5. Détermination <strong>de</strong> la CMB............................................................................................................ 116<br />
2.3.4. Estimation in vivo <strong>de</strong> l’eff<strong>et</strong> antimicrobien.................................................................................. 116<br />
2.3.4.1. Test <strong>de</strong> phytotoxicité ........................................................................................................................... 116<br />
2.3.4.2. Lutte contre la galle du coll<strong>et</strong> sur olivier............................................................................................... 117<br />
2.3.4.3. Lutte contre la tuberculose <strong>de</strong> l’olivier ................................................................................................. 117<br />
2.3.4.4. Lutte contre la maladie causée par Fusarium solani.............................................................................. 118
2.3.5. Estimation <strong>de</strong> l’eff<strong>et</strong> antitumoral sur cellules végétales ............................................................... 118<br />
2.3.5.1. Essai sur plants d’oliviers .................................................................................................................... 118<br />
2.3.5.1.1. Culture in vitro............................................................................................................................ 118<br />
2.3.5.1.2. Estimation <strong>de</strong> l’eff<strong>et</strong> antitumoral.................................................................................................. 118<br />
3. CANCERS VEGETAL ET ANIMAL.................................................................................................. 119<br />
3.1. PREMIERE OBSERVATION DE LA GALLE DU COLLET (MODELE VEGETAL DU CANCER) SUR OLIVIER . 119<br />
3.2. ANALOGIES ENTRE LE CANCER HUMAIN ET LE « CANCER » VEGETAL .............................................. 124<br />
3.3. ESSAI DE L’ESTIMATION DE L’EFFET ANTIPROLIFERATIF SUR DISQUES DE POMME DE TERRE ................... 129<br />
3.4. PARTIE EXPERIMENTALE................................................................................................................... 130<br />
3.4.1. Isolement <strong>et</strong> caractérisation <strong>de</strong>s isolats d’Agrobactérium tumefaciens......................................... 130<br />
3.4.1.1. Isolement <strong>de</strong> la bactérie ....................................................................................................................... 130<br />
3.4.1.2. I<strong>de</strong>ntification <strong>de</strong>s biovars..................................................................................................................... 130<br />
3.4.1.2.1. La coloration <strong>de</strong> GRAM .............................................................................................................. 130<br />
3.4.1.2.2. Test <strong>de</strong> l’uréase ........................................................................................................................... 131<br />
3.4.1.2.3. Test <strong>de</strong> l’hydrolyse <strong>de</strong> l’esculine .................................................................................................. 132<br />
3.4.1.2.4. Test <strong>de</strong> production du 3-cétolactose.............................................................................................. 133<br />
3.4.1.3. Test <strong>de</strong> pathogénie <strong>de</strong>s isolats.............................................................................................................. 134<br />
3.4.1.4. Détection <strong>de</strong> la pathogénie par PCR..................................................................................................... 134<br />
3.4.1.4.1. Extraction <strong>de</strong> l’ADN.................................................................................................................... 134<br />
3.4.1.4.2. Amplification.............................................................................................................................. 134<br />
3.4.1.4.3. Electrophorèse sur gel d’agarose.................................................................................................. 134<br />
3.4.1.4.4. Séquençage <strong>de</strong> l’ADN plasmidique (VIRB11 <strong>et</strong> VIR G15’) .......................................................... 135<br />
3.4.1.4.5. Analyse <strong>de</strong>s données <strong>de</strong>s séquences.............................................................................................. 135<br />
3.4.1.5. Sensibilité <strong>de</strong> l’olivier à la galle du coll<strong>et</strong> ............................................................................................. 135<br />
3.4.2. Etu<strong>de</strong> bioinformatique ............................................................................................................. 135<br />
3.4.2.1. Définitions.......................................................................................................................................... 136<br />
3.4.2.2. Récupération <strong>de</strong>s séquences protéiques ............................................................................................... 136<br />
3.4.2.3. Recherche <strong>de</strong>s séquences homologues.................................................................................................. 137<br />
3.4.2.4. Recherche <strong>de</strong>s domaines protéiques ..................................................................................................... 138<br />
3.4.2.4.1. Les fonctions cellulaires .............................................................................................................. 138<br />
3.4.2.4.2. Les fonctions biochimiques.......................................................................................................... 138<br />
3.4.2.5. Alignement <strong>de</strong>s séquences................................................................................................................ 139<br />
3.4.3. Essai sur disques <strong>de</strong> pomme <strong>de</strong> terre........................................................................................... 139<br />
4. DISCUSSION......................................................................................................................................... 141<br />
CONCLUSION GENERALE …………………………………………...……………………………………153
Liste <strong>de</strong>s abréviations<br />
Abréviation Définition Abréviation Définition<br />
A. Agrobacterium LRR Leucine-rich repeats<br />
P. Pseudomonas UV Ultraviol<strong>et</strong><br />
F. Fusarium PTP Protein tyrosine phosphatase<br />
S . Staphylococcus RE Réticulum endoplasmique<br />
C. Candida NADPH Nicotinami<strong>de</strong> adénine dinucléoti<strong>de</strong> phosphate<br />
Ti Tumour-inducing BI-1 Bax inhibitor-1<br />
Ri Root-inducing ADNc ADN complémentaire<br />
ADN Aci<strong>de</strong> désoxyribonucléique Banque d’EST banque d'Expressed Se- quence Tag<br />
T-DNA Transferred-DNA DD Dichloropropène dichloropropane<br />
RB Right Bor<strong>de</strong>r ACTA Association <strong>de</strong> Coordination Technique Agricole<br />
LB Left Bor<strong>de</strong>r AMM Autorisation <strong>de</strong> mise sur le marché<br />
Chv Chromosomal virulence MC Métal-carbone<br />
Région vir Région <strong>de</strong> virulence Ppm Partie par million<br />
ORF Open Reading Frame SERMs Selective Estrogen Receptor Modulators<br />
ME Membrane externe ER- Hormo-indépendant<br />
MI Membrane interne ER+ Hormo-dépendant<br />
PN Pore nucléaire Pta 1,3,5-triaza-7- phosphatricyclo [3.3.1.1] <strong>de</strong>cane<br />
PP Périplasme BAL British anti-lewisite<br />
NLS Nuclear Localisation Signal NAD + Nicotinami<strong>de</strong> a<strong>de</strong>nine dinucleoti<strong>de</strong><br />
Kda Kilodalton PCR Polymerase Chain Reaction<br />
ATP Adénosine triphosphate CFBP Collection Française <strong>de</strong> Bactéries Phytopathogènes<br />
GTP Guanosine triphosphate CDD Conserved Domain Database<br />
PCD Programmed cell-<strong>de</strong>ath THF Tétrahydrofurane<br />
ROS Reactive oxygen species DMF N,N-Diméthylformami<strong>de</strong><br />
HR Hypersensitive response RMN Résonance magnétique nucléaire<br />
gène R Gène <strong>de</strong> résistance HPLC High Pressure Liquid Chromatography<br />
Avr Gène d’« avirulence » DMSO Diméthylsulfoxy<strong>de</strong><br />
PARP Poly-(ADP-ribose) polymérase DMEM Dulbecco’s modified eagle medium<br />
TMV Tobacco mosaic virus ATCC American Type Culture Collection<br />
Dek1 Defective kernel PCA Plate Count Agar<br />
ADNg ADN génomique CMI Concentration minimale inhibitrice<br />
AIF Apoptosis Inducing Factor CMB Concentration minimale bactérici<strong>de</strong><br />
AS Aci<strong>de</strong> salicylique IG Indice <strong>de</strong> germination<br />
MAPK Mitogen-activated protein kinase BF3 Trifluorure <strong>de</strong> bore<br />
NB Nucléoti<strong>de</strong> binding Cp Cyclopentadiényle
Ce qui n’est pas entièrement achevé n’existe<br />
pas encore. Ce qui n’est pas achevé est moins<br />
avancé que ce qui n’est pas commencé.<br />
Paul Valéry
Introduction générale<br />
Introduction générale<br />
L’UMR 7223 s’intéresse <strong>de</strong>puis <strong>de</strong> nombreuses années à l’utilisation <strong>de</strong> <strong>composés</strong><br />
<strong>organométalliques</strong> dans le cadre <strong>de</strong> la recherche <strong>de</strong> nouvelles approches thérapeutiques. En<br />
eff<strong>et</strong>, leur potentiel cytotoxique ou radioactif, peut être bénéfique dans la lutte contre <strong>de</strong><br />
nombreuses maladies. Ce laboratoire s’inscrit précisément dans le domaine <strong>de</strong> la chimie bio-<br />
organométallique utilisée à <strong>de</strong>s fins thérapeutiques. Son objectif est <strong>de</strong> synthétiser <strong>de</strong>s<br />
analogues <strong>de</strong> molécules d’intérêt biologique comportant un groupe organométallique<br />
cytotoxique tel que le ferrocène, les complexes <strong>de</strong> manganèse, <strong>de</strong> rhénium, <strong>de</strong> technétium ou<br />
<strong>de</strong> rhodium. Ces molécules seraient susceptibles <strong>de</strong> traiter plusieurs formes <strong>de</strong> cancers<br />
hormono-dépendants ou non. Les cancers auxquels notre laboratoire s’intéresse sont parmi les<br />
plus répandus, tels que le cancer du sein <strong>et</strong> <strong>de</strong> la prostate.<br />
Le tamoxifène <strong>et</strong> son métabolite actif, le 4-hydroxytamoxifène (Figure 1), découvert par<br />
Harper <strong>et</strong> Walpole (Harper, M.J. <strong>et</strong> Walpole, A.L., 1966), est bien connu pour ses<br />
applications thérapeutiques contre le cancer du sein. Un tiers <strong>de</strong>s tumeurs hormono-<br />
dépendantes <strong>et</strong> toutes les tumeurs non hormono-dépendantes y résistent, pour lesquelles ne<br />
reste que les traitements lourds du type chimiothérapie (Singh, M.N. <strong>et</strong> al., 2007 ; Osborne,<br />
C.K., 1998 ; Lewis, J.S. <strong>et</strong> Jordan, V.C., 2005). Partant <strong>de</strong> c<strong>et</strong>te découverte, <strong>et</strong> dans<br />
l’optique <strong>de</strong> combler ce vi<strong>de</strong> thérapeutique évi<strong>de</strong>nt, l’UMR 7223 s’est intéressé, dès la fin <strong>de</strong>s<br />
années 80 aux mécanismes d’action du tamoxifène <strong>et</strong> à celui <strong>de</strong> complexes inorganiques, déjà<br />
utilisés contre d’autres cancers, <strong>et</strong> à la synthèse <strong>de</strong> dérivés ferrocéniques <strong>de</strong> ces molécules. En<br />
eff<strong>et</strong>, leur utilisation en chimie bio-organométallique perm<strong>et</strong> d’envisager <strong>de</strong>s molécules plus<br />
actives, le ferrocène entrant via <strong>de</strong>s mécanismes encore mal connus, menant à la <strong>de</strong>struction<br />
<strong>de</strong> cellules cancéreuses. L’ion ferricinium est probablement responsable <strong>de</strong> c<strong>et</strong>te activité<br />
cytotoxique (Köpf-Maier, P., 1994 ; Köpf-Maier, P. <strong>et</strong> Köpf, H., 1987 ; Mason, R.W. <strong>et</strong> al.,<br />
1999). De ces travaux sont nés en 1993 les premiers « ferrocifènes » dont les propriétés<br />
anticancéreuses ont pu être mises en évi<strong>de</strong>nce in vitro <strong>et</strong> les tests réalisés sur <strong>de</strong>s lignées<br />
cellulaires (cas <strong>de</strong>s cancers du sein résistants au tamoxifène) <strong>et</strong> <strong>leurs</strong> atouts rési<strong>de</strong>nt dans leur<br />
efficacité, leur sélectivité <strong>et</strong> leur faible toxicité. D’autres tests aussi prom<strong>et</strong>teurs ont par<br />
ail<strong>leurs</strong> débutés sur d’autres lignées cellulaires <strong>de</strong> cancer <strong>et</strong> mon travail consiste à la synthèse<br />
U.P.M.C./U.S. 1<br />
2010
Introduction générale<br />
<strong>de</strong> <strong>composés</strong> <strong>organométalliques</strong>, <strong>et</strong> <strong>de</strong> tester <strong>leurs</strong> eff<strong>et</strong>s <strong>biologiques</strong> aussi bien dans le mon<strong>de</strong><br />
animal que végétal (Eff<strong>et</strong> antiprolifératif, antibactérien, antifongique, …)<br />
Figure 1 : Antioestrogènes <strong>et</strong> leur analogue organométallique développé à l’UMR 7223<br />
L’unité <strong>de</strong> recherche « Protection <strong>de</strong>s plantes <strong>et</strong> environnement », qui fait partie <strong>de</strong> l’institut<br />
<strong>de</strong> l’olivier, s’intéresse à l’étu<strong>de</strong> <strong>de</strong>s différentes maladies (Bactériennes, fongiques, <strong>et</strong>c.) qui<br />
peuvent toucher les végétaux en général <strong>et</strong> l’olivier en particulier <strong>et</strong> à la recherche <strong>de</strong><br />
différentes solutions <strong>de</strong> traitements (Chimiques, <strong>biologiques</strong>, …..). La galle du coll<strong>et</strong>, causée<br />
par Agrobacterium tumefaciens, qui représente le modèle végétal du cancer, qui cause<br />
beaucoup <strong>de</strong> dégâts <strong>et</strong> pour laquelle il n’existe que <strong>de</strong>s mesures prophylactiques est l’un <strong>de</strong>s<br />
principaux axes <strong>de</strong> recherche <strong>de</strong> notre unité <strong>de</strong> recherche.<br />
Nous avons entamé noss travaux par la synthèse <strong>de</strong> différents <strong>composés</strong> <strong>organométalliques</strong><br />
que nous avons testé par la suite, avec d’autres produits synthétisés au laboratoire, contre la<br />
lignée du cancer <strong>de</strong> sein hormono-indépendante « MDA-MB231 » <strong>et</strong> <strong>de</strong>s microorganismes<br />
pathogènes à l’homme <strong>et</strong> aux végétaux.<br />
La <strong>de</strong>rnière partie <strong>de</strong> c<strong>et</strong>te thèse a été consacrée à une étu<strong>de</strong> bioinformatique visant à<br />
démontrer l’existence d’une analogie dans le développement <strong>de</strong> cancer dans les règnes animal<br />
<strong>et</strong> végétal, constatation qui justifiera notre prospection <strong>de</strong> l’eff<strong>et</strong> phytosanitaire <strong>de</strong> nos<br />
<strong>composés</strong> <strong>organométalliques</strong> contre la galle du coll<strong>et</strong>.<br />
U.P.M.C./U.S. 2<br />
2010
Il n’y a qu’une métho<strong>de</strong> pour inventer, qui est d’imiter. Il n’y a<br />
qu’une métho<strong>de</strong> pour bien penser, qui est <strong>de</strong> continuer quelques<br />
pensées anciennes <strong>et</strong> éprouvées.<br />
Alain (Emile-Auguste Chartier)
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
1. La galle du coll<strong>et</strong> comme exemple <strong>de</strong> cancer végétal <strong>et</strong> protection<br />
chimique <strong>de</strong>s cultures<br />
1.1. Agrobacterium : Agent causal <strong>de</strong> la galle du coll<strong>et</strong><br />
Le genre Agrobacterium appartient à la famille <strong>de</strong>s Rhizobiacées, bactéries du sol gram<br />
négatives. Les trois espèces les plus connues sont les bactéries phytopathogènes<br />
Agrobacterium tumefaciens, A. rhizogenes <strong>et</strong> A. vitis.<br />
Ces bactéries infectent principalement les plantes dicotylédones <strong>et</strong> entraînent une prolifération<br />
anormale <strong>de</strong>s cellules végétales qui se manifeste par la formation <strong>de</strong> tumeurs appelées galles<br />
du coll<strong>et</strong> (Crown Gall) dans le cas d’A. tumefaciens <strong>et</strong> d’A. vitis ou par l’apparition <strong>de</strong> racines<br />
adventices sur le lieu d’infection appelées chevelus racinaires (Hairy roots) dans le cas d’A.<br />
rhizogenes.<br />
Ces trois bactéries présentent un important problème agronomique car elles infectent les<br />
plantes blessées <strong>et</strong> notamment les plantes greffées, comme les arbres fruitiers ou encore les<br />
vignes (Smith, E.F.<strong>et</strong> Townsend, C.O., 1907 ; Kerr, A., 1969).<br />
Le mécanisme d’infection d’Agrobacterium est très particulier. En eff<strong>et</strong>, il s’agit d’un<br />
phénomène <strong>de</strong> transgénèse naturelle dans lequel la bactérie transforme génétiquement les<br />
cellules végétales infectées. C’est le seul cas décrit <strong>de</strong> transfert d’information génétique entre<br />
le règne bactérien <strong>et</strong> les eucaryotes.<br />
1.1.1. Concepts généraux<br />
Le processus <strong>de</strong> transgénèse est mis en place grâce à la présence d’un plasmi<strong>de</strong> <strong>de</strong> gran<strong>de</strong><br />
taille, environ 200 kilo bases (kb) (Zaenen, I. <strong>et</strong> al., 1974), appelé Ti (pour « Tumour-<br />
inducing ») dans le cas d’A. tumefaciens <strong>et</strong> A. vitis, ou Ri (pour « Root-inducing ») dans le cas<br />
d’A. rhizogenes (Moore, L. <strong>et</strong> al., 1979 ; White, F. <strong>et</strong> Nester, E., 1980). Ce plasmi<strong>de</strong> porte le<br />
fragment d’ADN qui est transféré dans la cellule végétale, appelé T-DNA (pour<br />
« Transferred-DNA ») (Chilton, M.D. <strong>et</strong> al., 1982 ; Spano, L. <strong>et</strong> Costantino, P., 1982 ; White,<br />
U.P.M.C./U.S. 3<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
F. <strong>et</strong> al., 1982 ; Byrne, M.C. <strong>et</strong> al., 1983 ; Lahners, K. <strong>et</strong> al., 1984), <strong>et</strong> les gènes vir (virulence)<br />
qui régissent l’intégration en trans du TDNA dans la cellule hôte. C<strong>et</strong>te caractéristique perm<strong>et</strong><br />
l’utilisation d’un plasmi<strong>de</strong> binaire portant le T-DNA sans les gènes vir lors <strong>de</strong> transformations<br />
<strong>de</strong> cellules <strong>de</strong> plantes par A. tumefaciens en biotechnologie.<br />
1.1.1.1. Le T-DNA<br />
Le T-DNA est une séquence <strong>de</strong> taille variable porté par les plasmi<strong>de</strong>s Ti ou Ri<br />
d’Agrobacterium qui peuvent porter un ou plusieurs T-DNAs, transférés par le même<br />
processus. Ces fragments sont bordés <strong>de</strong> séquences spécifiques bien définies qui perm<strong>et</strong>tent<br />
leur excision <strong>de</strong>s plasmi<strong>de</strong>s Ti ou Ri. Ces frontières appelées RB <strong>et</strong> LB pour « Right Bor<strong>de</strong>r »<br />
<strong>et</strong> « Left Bor<strong>de</strong>r » respectivement ont une taille <strong>de</strong> 25 pb <strong>et</strong> sont en répétition directe (Yadav,<br />
N.S. <strong>et</strong> al., 1982 ; Holsters, M. <strong>et</strong> al., 1983). La frontière droite est nécessaire <strong>et</strong> suffisante<br />
pour le transfert du fragment qui s’effectue <strong>de</strong> façon polaire, <strong>de</strong> la frontière droite vers la<br />
frontière gauche. Grâce à ces séquences, il est donc possible d’intégrer n’importe quel gène à<br />
la place <strong>de</strong> ceux contenus dans le T-DNA, <strong>et</strong> <strong>de</strong> les exprimer dans une cellule <strong>de</strong> plante avec<br />
l’assurance que le fragment ainsi inséré est transmis <strong>de</strong> manière mendélienne dans la<br />
<strong>de</strong>scendance <strong>de</strong> c<strong>et</strong>te plante (Otten, L. <strong>et</strong> al., 1981).<br />
Les T-DNAs comprennent un certain nombre <strong>de</strong> gènes dont <strong>de</strong>s gènes <strong>de</strong> synthèse<br />
d’hormones végétales comme l’auxine <strong>et</strong> la cytokinine ou les oncogènes qui vont perm<strong>et</strong>tre la<br />
prolifération cellulaire <strong>et</strong> ai<strong>de</strong>r à la formation <strong>de</strong>s tumeurs ou <strong>de</strong>s racines adventices, <strong>et</strong> les<br />
gènes <strong>de</strong> synthèse <strong>de</strong>s opines, p<strong>et</strong>ites molécules résultant <strong>de</strong> la con<strong>de</strong>nsation d’un sucre ou<br />
d’un aci<strong>de</strong> α-cétonique <strong>et</strong> d’un aci<strong>de</strong> aminé. Ces <strong>composés</strong> sont <strong>de</strong>s sources <strong>de</strong> carbone <strong>et</strong><br />
d’azote pour les bactéries <strong>et</strong> ne sont catabolisés que par elles. Les gènes du T-DNA<br />
perm<strong>et</strong>tent donc à la bactérie <strong>de</strong> se créer une niche écologique propre à son développement.<br />
1.1.1.2. La prolifération cellulaire<br />
L’expression <strong>de</strong>s gènes du T-DNA par la cellule va perm<strong>et</strong>tre la prolifération <strong>de</strong> c<strong>et</strong>te cellule,<br />
même si elle est quiescente, notamment grâce à la production d’hormones végétales, <strong>et</strong> la<br />
formation <strong>de</strong> tissus particuliers. Ainsi, Agrobacterium tumefaciens va entraîner la maladie <strong>de</strong><br />
la galle du coll<strong>et</strong> sur les plantes infectées <strong>et</strong> A. rhizogenes celle <strong>de</strong>s chevelus racinaires.<br />
U.P.M.C./U.S. 4<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
C<strong>et</strong>te maladie se manifeste par l’apparition d’excroissances sous forme <strong>de</strong> tumeurs au niveau<br />
d’une blessure <strong>de</strong> la plante <strong>et</strong> plus particulièrement à la jonction du greffon <strong>et</strong> du porte-greffe<br />
lors <strong>de</strong> greffes d’arbres fruitiers <strong>et</strong> <strong>de</strong> vignes.<br />
Elle représente un grave problème économique car on r<strong>et</strong>rouve <strong>de</strong>s tumeurs dans les vignes,<br />
sur les amandiers, les pruniers, les pommiers <strong>et</strong> les pêchers, c’est pourquoi les chercheurs ont<br />
rapi<strong>de</strong>ment entrepris <strong>de</strong> rechercher la cause <strong>de</strong> c<strong>et</strong>te maladie.<br />
Dès 1907, Smith <strong>et</strong> Townsend ont isolé une nouvelle bactérie à partir <strong>de</strong>s galles,<br />
Agrobacterium tumefaciens, <strong>et</strong> démontré qu’elle était responsable <strong>de</strong> la maladie. La bactérie<br />
r<strong>et</strong>rouvée dans les galles <strong>de</strong> vigne a été appelée Agrobacterium vitis.<br />
Le mécanisme d’induction <strong>de</strong> la formation <strong>de</strong> la tumeur n’est pas encore très bien connu, mais<br />
il semble principalement faire intervenir la production d’hormones végétales, une auxine <strong>et</strong><br />
une cytokinine, par les gènes du T-DNA dans la cellule infectée.<br />
1.1.2. Processus d’infection<br />
Le phénomène <strong>de</strong> transgénèse naturelle mis en place par Agrobacterium fait intervenir <strong>de</strong>ux<br />
groupes <strong>de</strong> gènes localisés à <strong>de</strong>s endroits différents <strong>et</strong> régulés <strong>de</strong> manière différente.<br />
L’ensemble <strong>de</strong>s gènes chv (chromosomal virulence) présents sur le chromosome bactérien<br />
perm<strong>et</strong> l’attachement <strong>de</strong> la bactérie à la cellule végétale. Ensuite entre en jeu la région vir<br />
(région <strong>de</strong> virulence) d’environ 30 à 40 kb, localisée sur les plasmi<strong>de</strong>s Ti <strong>et</strong> Ri <strong>et</strong> organisée en<br />
6 loci mono ou poly-cistroniques (virA ; 1 ORF (Open Reading Frame), virB ; 11 ORFs,<br />
virC ; 2 ORFs, virD ; 5 ORFs, virE ; 2 ORFs, virG ; 1 ORF) (Stachel, S.E. <strong>et</strong> Nester, E.W.,<br />
1986).<br />
Quelques souches d’Agrobacterium possè<strong>de</strong>nt <strong>de</strong>s gènes vir supplémentaires, comme virF<br />
(Hooykaas, P.J., 1984), virH (ou pinF) (Stachel, S.E. <strong>et</strong> Nester, E.W., 1986) ou encore tzs<br />
(Akiyoshi, D.E. <strong>et</strong> al., 1985), qui ne sont pas essentiels mais perm<strong>et</strong>tent une virulence accrue<br />
<strong>et</strong> un spectre d’hôte plus large à la souche qui les porte. Les gènes vir sont à l’origine du<br />
transfert du T-DNA dans le génome <strong>de</strong> la cellule hôte.<br />
U.P.M.C./U.S. 5<br />
2010
1.1.2.1. Reconnaissance bactérie/hôte<br />
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
Avant le transfert du T-DNA dans le génome <strong>de</strong> la cellule hôte, la bactérie reconnaît<br />
spécifiquement la cellule végétale <strong>et</strong> un contact physique s’établit alors entre elles (Figure 2,<br />
étape 1). La reconnaissance entre Agrobacterium <strong>et</strong> la cellule <strong>de</strong> plante est une étape très<br />
importante car l’abolition <strong>de</strong> c<strong>et</strong>te interaction provoque l’avirulence <strong>de</strong> la bactérie.<br />
Figure 2 : Représentation schématique d’une infection par Agrobacterium<br />
(Umber, M., 2004)<br />
(Schéma résumant les principales étapes du processus d’infection). Légen<strong>de</strong> : ME, membrane externe ; MI, membrane interne ; PN, pore<br />
nucléaire; PP, périplasme.<br />
1. : Attachement <strong>de</strong> la bactérie à la surface <strong>de</strong> la cellule hôte.<br />
2. : Induction <strong>de</strong>s gènes vir par <strong>de</strong>s signaux <strong>de</strong> la plante.<br />
3. : Production du brin T <strong>et</strong> assemblage du complexe T.<br />
4. : Exportation <strong>et</strong> transport vers le noyau <strong>de</strong> la cellule végétale.<br />
5. : Intégration du T-DNA dans un chromosome <strong>de</strong> l’hôte.<br />
U.P.M.C./U.S. 6<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
Les molécules <strong>de</strong> la cellule végétale reconnues par la bactérie sont localisées sur la paroi<br />
cellulaire <strong>et</strong> seraient apparentées à la vitronectine, protéine présente dans la matrice<br />
extracellulaire <strong>de</strong>s animaux <strong>et</strong> connue pour servir <strong>de</strong> récepteur à plusieurs bactéries.<br />
Ces protéines sont reconnues par un polysacchari<strong>de</strong> acylé dont la biosynthèse implique le<br />
locus attR du chromosome bactérien. L’interaction <strong>de</strong> ces <strong>de</strong>ux molécules entraîne la synthèse<br />
<strong>de</strong> filaments <strong>de</strong> type cellulose qui renforce l’attachement entre la bactérie <strong>et</strong> la cellule<br />
végétale.<br />
La stabilisation <strong>de</strong> la liaison bactérie/plante se fait grâce au locus pscA (ou exoC) <strong>et</strong> aux <strong>de</strong>ux<br />
loci liés chvA <strong>et</strong> chvB, qui perm<strong>et</strong>tent la synthèse <strong>et</strong> l’excrétion <strong>de</strong> polysacchari<strong>de</strong>s <strong>de</strong> type β-<br />
1-2 glucane, <strong>et</strong> aux fibrilles <strong>de</strong> cellulose impliquant le locus cel. Ces gènes <strong>de</strong> virulence<br />
chromosomiques sont exprimés constitutivement par la bactérie.<br />
1.1.2.2. Induction <strong>de</strong>s gènes vir<br />
Les gènes vir sont impliqués dans le transfert du T-DNA <strong>et</strong> 4 loci (virA, virB, virD <strong>et</strong> virG)<br />
sont nécessaires au processus quel que soit l’hôte. Quant à virE <strong>et</strong> virC, ils sont importants<br />
pour l’infection <strong>de</strong> certaines espèces <strong>de</strong> plante <strong>et</strong> perm<strong>et</strong>tent ainsi d’élargir le spectre d’hôte<br />
d’Agrobacterium.<br />
Contrairement aux gènes <strong>de</strong> virulence chromosomiques, les gènes <strong>de</strong> virulence plasmidiques<br />
d’Agrobacterium ont besoin d’être induits par la plante pour être exprimés (Figure 2, étape 2).<br />
En eff<strong>et</strong>, les gènes vir sont induits par l’exsudat <strong>de</strong>s cellules blessées qui a un pH aci<strong>de</strong> <strong>et</strong> est<br />
riche en sucres <strong>et</strong> en <strong>composés</strong> phénoliques appartenant à la famille <strong>de</strong>s phénylpropanoï<strong>de</strong>s,<br />
comme l’acétosyringone qui fut le premier découvert <strong>et</strong> qui est un excellent inducteur.<br />
On peut également citer l’aci<strong>de</strong> sinapinique, l’aci<strong>de</strong> parahydroxybenzoïque ou encore la<br />
vanilline. Ces <strong>composés</strong> sont reconnus avec l’ai<strong>de</strong> <strong>de</strong>s sucres par la protéine VirA, récepteur<br />
présent dans la membrane interne <strong>de</strong> la bactérie, qui possè<strong>de</strong> une activité kinase <strong>et</strong> une activité<br />
phospho-transférase.<br />
U.P.M.C./U.S. 7<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
VirA semble également contenir <strong>de</strong>s éléments importants dans la reconnaissance <strong>de</strong> l’hôte. La<br />
casca<strong>de</strong> <strong>de</strong> transduction du signal est alors déclenchée. La protéine VirA s’auto-phosphoryle<br />
après fixation du ligand puis phosphoryle la protéine régulatrice cytoplasmique VirG qui se<br />
fixe sur la boîte vir, p<strong>et</strong>ite séquence <strong>de</strong> 12 pb présente dans les promoteurs <strong>de</strong>s gènes vir, <strong>et</strong><br />
active ainsi la transcription <strong>de</strong> ceux-ci. Le processus <strong>de</strong> transfert <strong>de</strong> T-DNA est alors engagé.<br />
1.1.2.3. Transfert du T-DNA<br />
Même si le processus <strong>de</strong> transfert d’ADN par Agrobacterium est unique car il a lieu entre<br />
<strong>de</strong>ux organismes <strong>de</strong> règnes différents, la mise en place du transfert du T-DNA rappelle en <strong>de</strong><br />
nombreux points la conjugaison bactérienne.<br />
1.1.2.3.1. Production du brin T<br />
Les endonucléases VirD1 <strong>et</strong> VirD2 vont agir <strong>de</strong> concert pour couper le brin inférieur du T-<br />
DNA au niveau <strong>de</strong> la frontière droite.<br />
La protéine VirD1 se fixe sur la séquence <strong>de</strong> la bordure droite <strong>et</strong> perm<strong>et</strong> ainsi l’attachement <strong>de</strong><br />
la protéine VirD2 à c<strong>et</strong>te séquence spécifique en relâchant l’ADN plasmidique grâce à son<br />
activité hélicase.<br />
VirD2 coupe alors le T-DNA au niveau <strong>de</strong> la frontière droite <strong>et</strong> se fixe par formation d’une<br />
liaison covalente à l’extrémité 5’ du T-DNA <strong>et</strong> du brin coupé sur le plasmi<strong>de</strong> Ri ou Ti. C<strong>et</strong>te<br />
étape nécessite parfois l’intervention <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux autres protéines, VirC1 <strong>et</strong> VirC2, dont le rôle<br />
n’est pas encore très clair.<br />
Le simple brin se sépare ensuite du reste du plasmi<strong>de</strong> par déplacement <strong>de</strong> brin utilisant <strong>de</strong>s<br />
hélicases, <strong>de</strong>s enzymes <strong>de</strong> réparation <strong>de</strong> l’ADN <strong>et</strong> <strong>de</strong>s polymérases bactériennes. Le brin T est<br />
ainsi formé (Figure 2, étape 3).<br />
1.1.2.3.2. Le transporteur T<br />
Ensuite entrent en jeu les 11 protéines codées par l’opéron virB. Tout d’abord, la protéine<br />
VirB1 hydrolyse localement les peptidoglycanes <strong>de</strong> la membrane bactérienne, puis les autres<br />
U.P.M.C./U.S. 8<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
protéines, majoritairement hydrophobes, s’assemblent avec la protéine VirD4 au niveau <strong>de</strong> la<br />
membrane bactérienne pour former le transporteur T (Figure 2, étape 3) (Lai, E.M. <strong>et</strong> Kado,<br />
C.I., 2000).<br />
Ce complexe ressemble fortement à celui mis en place lors <strong>de</strong> la conjugaison bactérienne,<br />
avec une partie ‘core’ ancrée dans la paroi bactérienne <strong>et</strong> un pilus externe, appelé pilus T<br />
(Figure 3).<br />
Figure 3 : Modèle d’architecture du transporteur du complexe T<br />
Modèle présentant un arrangement hypothétique <strong>de</strong>s protéines VirB (d’après Lai <strong>et</strong> Kado, 2000). Ces protéines sont supposées pouvoir être<br />
arrangées en multimères associés à la membrane interne <strong>et</strong>/ou à la membrane externe, ou encore avançant dans le périplasme. Légen<strong>de</strong> : ME,<br />
membrane externe ; MI, membrane interne ; PP, périplasme. (Umber, M., 2004)<br />
U.P.M.C./U.S. 9<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
Le pilus T est composé principalement par la protéine VirB2 <strong>et</strong> les protéines VirB4, VirB11 <strong>et</strong><br />
VirD4 seraient <strong>de</strong>s ATPases qui fourniraient l’énergie nécessaire à l’assemblage du<br />
transporteur T <strong>et</strong> à sa translocation dans la membrane bactérienne. Le transporteur T forme<br />
alors un système <strong>de</strong> sécrétion <strong>de</strong> type IV.<br />
1.1.2.3.3. Intégration dans le génome <strong>de</strong> l’hôte<br />
A son entrée dans la cellule végétale, le brin T est recouvert <strong>de</strong> la protéine VirE2 qui protège<br />
l’ADN simple brin contre les nucléases <strong>de</strong> la cellule végétale en se fixant le long du brin T.<br />
C<strong>et</strong>te protéine est produite en gran<strong>de</strong> quantité dans la bactérie <strong>et</strong> possè<strong>de</strong> les propriétés<br />
classiques <strong>de</strong>s protéines SSB (Single Strand Binding), c’est-à-dire qu’elle comporte un<br />
domaine <strong>de</strong> fixation à l’ADN simple brin <strong>et</strong> qu’elle est riche en aci<strong>de</strong>s aminés basiques.<br />
Elle semble entrer dans la cellule hôte indépendamment du brin T à travers le transporteur T.<br />
Le brin T comprend à présent le T-DNA sous forme simple brin avec la protéine VirD2 à son<br />
extrémité 5’ <strong>et</strong> est recouvert <strong>de</strong>s protéines VirE2. VirD2 gui<strong>de</strong> ensuite le brin T dans la cellule<br />
végétale <strong>et</strong> sa séquence NLS (Nuclear Localisation Signal) ainsi que celles <strong>de</strong>s protéines<br />
VirE2 perm<strong>et</strong>tent l’entrée du brin T à l’intérieur du noyau (Figure 2, étape 4).<br />
En eff<strong>et</strong>, la séquence NLS fait passer les protéines <strong>de</strong> plus <strong>de</strong> 50 kDa dans le noyau via les<br />
pores nucléaires avec l’ai<strong>de</strong> <strong>de</strong> protéines appelées importines. Ce transport actif nécessite<br />
l’hydrolyse du GTP.<br />
L’intégration du fragment dans le génome reste encore obscure, mais elle semble faire<br />
intervenir VirD2, qui couperait l’ADN <strong>de</strong> la plante, ainsi que <strong>de</strong>s protéines cellulaires (Figure<br />
2, étape 5).<br />
Des recombinaisons illégitimes entraîneraient l’intégration du brin T <strong>et</strong> la synthèse du double<br />
brin aurait lieu grâce à <strong>de</strong>s protéines <strong>de</strong> réparation <strong>et</strong> <strong>de</strong> réplication végétales. Ce modèle<br />
pourrait expliquer la présence fréquente <strong>de</strong> plusieurs exemplaires dans un même locus.<br />
U.P.M.C./U.S. 10<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
Les lieux d’intégration ne montrent pas <strong>de</strong> séquences précises, au contraire <strong>de</strong> ceux <strong>de</strong>s<br />
transposons. Toutefois, ils sont souvent localisés dans <strong>de</strong>s zones transcrites car elles sont plus<br />
accessibles <strong>et</strong> sont riches en AT, ce qui perm<strong>et</strong>trait une ouverture plus facile <strong>de</strong> l’ADN.<br />
Les gènes portés par le T-DNA sont ensuite transcrits <strong>et</strong> traduits grâce à la machinerie<br />
cellulaire <strong>de</strong> l’hôte <strong>et</strong> leur régulation est fonction <strong>de</strong> leur propre promoteur.<br />
On pourrait penser que ces gènes, d’origine bactérienne, seraient exprimés constitutivement,<br />
mais il n’en est rien car <strong>leurs</strong> promoteurs ressemblent aux promoteurs eucaryotes (Slightom,<br />
J.L. <strong>et</strong> al., 1986), sont souvent régulés par les hormones végétales <strong>et</strong> perm<strong>et</strong>tent leur<br />
expression spécifique dans certains organes (Ooms, G. <strong>et</strong> al., 1986).<br />
Figure 4 : Structure <strong>de</strong> quatre opines communes<br />
Les opines résultent <strong>de</strong> la con<strong>de</strong>nsation entre un aci<strong>de</strong> aminé <strong>et</strong> un sucre ou un aci<strong>de</strong> �-cétonique (Umber, M., 2004)<br />
U.P.M.C./U.S. 11<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
1.2. La mort cellulaire programmée (Programmed cell-<strong>de</strong>ath « PCD ») chez les végétaux<br />
L’importance évolutive d’un équilibre entre la vie <strong>et</strong> la mort pour les végétaux est aussi<br />
reconnue <strong>de</strong>puis longtemps (Léopold, A.C., 1961) <strong>et</strong>, au début <strong>de</strong>s années 1970, plusieurs<br />
travaux <strong>de</strong> microscopie électronique ont décrit en détail les modifications morphologiques<br />
chez les cellules végétales en sénescence. Mais ce n’est qu’au cours <strong>de</strong>s années 1990, avec la<br />
frénésie <strong>de</strong> l’apoptose chez les animaux, que la théorie <strong>de</strong> la PCD végétale s’est unifiée <strong>et</strong> a<br />
connu un essor substantiel stimulé entre autres par <strong>de</strong>s intérêts agro-économiques comme la<br />
résistance <strong>de</strong>s cultures aux pathogènes <strong>et</strong> aux stress environnementaux, l’augmentation <strong>de</strong>s<br />
ren<strong>de</strong>ments <strong>et</strong> la conservation post-récolte.<br />
D’un point <strong>de</strong> vue plus fondamental, la découverte que le Bcl-2 humain fonctionne aussi chez<br />
C. elegans (Vaux, D.L. <strong>et</strong> al., 1992) a lancé l’engouement pour la conservation évolutive <strong>de</strong>s<br />
mécanismes <strong>de</strong> la PCD. Dès lors, on chercha à m<strong>et</strong>tre en évi<strong>de</strong>nce les similarités<br />
morphologiques <strong>et</strong> biochimiques <strong>de</strong> la mort survenant chez différents organismes <strong>et</strong> dans<br />
différentes circonstances, <strong>et</strong> c<strong>et</strong>te tendance s’est élargie aux plantes (Mittler, R. <strong>et</strong> Lam, E.,<br />
1996 ; Pennel, R.I. <strong>et</strong> Lamb, C., 1997).<br />
Si plusieurs similarités très générales entre l’apoptose <strong>et</strong> la PCD végétale peuvent être<br />
dégagées (comme la con<strong>de</strong>nsation du cytoplasme, l’activation <strong>de</strong> protéases <strong>et</strong> <strong>de</strong> nucléases, la<br />
dégradation <strong>de</strong> l’ADN nucléaire en gros fragments <strong>et</strong> l’implication du Ca 2+ <strong>et</strong> <strong>de</strong>s ROS), <strong>de</strong>s<br />
différences majeures chez les plantes (comme le rôle majeur <strong>de</strong> la vacuole <strong>et</strong> l’absence <strong>de</strong> la<br />
fragmentation du noyau, <strong>de</strong> la formation <strong>de</strong> corps apoptotiques engloutis par les cellules<br />
avoisinantes <strong>et</strong> dans plusieurs cas, <strong>de</strong> la dégradation internucléosomale <strong>de</strong> l’ADN produisant<br />
les fameuses échelles sur gel d’agarose) suggèrent que le processus <strong>de</strong> PCD chez les végétaux<br />
est différent <strong>de</strong> l’apoptose animale. C<strong>et</strong>te idée a été renforcée lorsqu’on réalisa, avec la<br />
disponibilité <strong>de</strong> génomes <strong>de</strong> plantes, que celles-ci ne possè<strong>de</strong>nt pas d’homologues <strong>de</strong><br />
séquence <strong>de</strong>s caspases ni <strong>de</strong>s membres la famille <strong>de</strong> Bcl-2. Et ce n’est que <strong>de</strong>puis quelques<br />
années qu’on s’intéresse d’un peu plus près aux caractéristiques particulières <strong>de</strong>s cellules<br />
végétales en PCD qui, plutôt que <strong>de</strong> s’avérer spécifiques, contribuent significativement à une<br />
théorie générale <strong>de</strong> la PCD <strong>et</strong> <strong>de</strong> l’évolution <strong>de</strong>s eucaryotes. L’impact <strong>de</strong> l’étu<strong>de</strong> <strong>de</strong> la PCD<br />
chez les plantes débor<strong>de</strong> donc largement du champ <strong>de</strong> la biologie végétale.<br />
U.P.M.C./U.S. 12<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
Tout au long <strong>de</strong> la vie <strong>de</strong>s végétaux, différents types cellulaires ou organes sont éliminés au<br />
moment approprié, au profit <strong>de</strong> l’organisme <strong>et</strong> <strong>de</strong> la population, <strong>et</strong> constituent <strong>de</strong>s modèles <strong>de</strong><br />
PCD désormais classiques (Figure 5). C<strong>et</strong>te section présente quelques effecteurs <strong>de</strong> la mort<br />
(voir 1.2.1) <strong>et</strong> <strong>de</strong>s sentiers <strong>et</strong> <strong>de</strong>s régulateurs impliqués (voir 1.2.2) en les comparants avec les<br />
concepts issus <strong>de</strong>s modèles animaux.<br />
Figure 5 : La PCD dans la vie <strong>de</strong>s angiospermes. Lors <strong>de</strong> la germination, l’aleurone (en bleu) ou les cotylédons<br />
fournissent l’énergie nécessaire. Les TE (pour le transport <strong>de</strong> l’eau <strong>de</strong>s racines aux feuilles) <strong>et</strong> la coiffe <strong>de</strong>s racines (protection contre<br />
l’abrasion) sont <strong>de</strong>s structures différenciées faites <strong>de</strong> cellules mortes. Le méristème apical floral peut donner naissance aux primordia <strong>de</strong>s<br />
étamines (mâles, région bleue) <strong>et</strong> du carpelle (femelle, zone orange); chez les espèces à f<strong>leurs</strong> unisexuelles comme le maïs, une <strong>de</strong>s <strong>de</strong>ux<br />
régions meurt pour produire l’organe <strong>de</strong> l’autre sexe. Chez la femelle (flèche orange), une mégaspore haploï<strong>de</strong> formera le gamétophyte, les<br />
trois autres meurent. Dans les anthères (mâle, flèche bleue), le tap<strong>et</strong>um dégénère pour compléter la formation du pollen <strong>et</strong> la mort du<br />
stomium le disperse. Au cours <strong>de</strong> la pollinisation, l’arrivée sur le pistil d’un pollen incompatible provoque la mort du tube pollinique, alors<br />
qu’un pollen compatible provoque la croissance du tube, facilitée par la mort <strong>de</strong>s tissus avoisinants (orange). Le tube pollinique entre dans<br />
l’ovule grâce à l’ouverture faite par la mort d’une <strong>de</strong>s <strong>de</strong>ux cellules qui l’entoure (rouge); suite à la fécondation, les cellules à l’opposé<br />
(orange) meurent aussi. La production <strong>de</strong> la graine implique la PCD massive <strong>de</strong> cellules <strong>de</strong> l’endosperme. Tout au long <strong>de</strong> leur vie (encadré<br />
du centre), les plantes utilisent aussi la PCD pour résister aux pathogènes ou s’adapter au manque <strong>de</strong> nutriments ou d’oxygène. (Wu,<br />
H.<strong>et</strong> Cheung, A.Y., 2000)<br />
U.P.M.C./U.S. 13<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
L’un <strong>de</strong>s cas <strong>de</strong> PCD les plus étudiés chez les végétaux est la réponse hypersensible (HR,<br />
hypersensitive response) (Heath, M.C., 2000 ; Lam, E. <strong>et</strong> al., 2001), qui survient chez les<br />
plantes résistantes à un pathogène viral, bactérien ou fongique.<br />
Les plantes possédant un gène <strong>de</strong> résistance R approprié développent <strong>de</strong>s zones <strong>de</strong> quelques<br />
cellules mortes aux sites d’attaque d’un pathogène, restreignant ainsi sa propagation. La<br />
résistance dépend d’une interaction <strong>de</strong> type « gène pour gène » entre le gène R <strong>de</strong> la plante <strong>et</strong><br />
un gène d’« avirulence » (avr chez les pathogènes bactériens ou fongiques).<br />
La HR déclenche parallèlement l’activation <strong>de</strong> mécanismes <strong>de</strong> défense moins spécifiques,<br />
comme ceux qui passent par l’aci<strong>de</strong> salicylique (Alvarez, M.E., 2000) ou les ROS<br />
(Delledonne, M. <strong>et</strong> al., 2002 ; Hancock, J.T. <strong>et</strong> al., 2002 ; Vranová, E. <strong>et</strong> al., 2002), qui<br />
ren<strong>de</strong>nt plus efficace la réponse à <strong>de</strong>s attaques subséquentes.<br />
Par ail<strong>leurs</strong>, la HR est une forme <strong>de</strong> PCD qui semble un peu particulière (Jones, A.M., 2001 ;<br />
Heath, M.C., 2000), comme le suggèrent certaines caractéristiques qui diffèrent quelque peu<br />
<strong>de</strong> celles généralement rencontrées dans la différentiation.<br />
Dans un premier temps, la mort par HR se doit d’être très rapi<strong>de</strong>, au détriment du recyclage<br />
<strong>de</strong>s nutriments (contrairement à la mort très lente lors <strong>de</strong> la sénescence); ainsi les organelles<br />
ne sont généralement pas digérées. Le cytoplasme se con<strong>de</strong>nse <strong>et</strong> les cellules <strong>de</strong>viennent<br />
autofluorescentes puis brunes, vraisemblablement à cause <strong>de</strong> l’accumulation <strong>et</strong> <strong>de</strong> l’oxydation<br />
<strong>de</strong> <strong>composés</strong> phénoliques. Les « cadavres » <strong>de</strong>s cellules ayant subi la HR ne disparaissent pas<br />
(comme par exemple lors <strong>de</strong> la formation <strong>de</strong> l’aérenchyme), mais sont plutôt simplement<br />
écrasés par l’expansion <strong>de</strong>s cellules avoisinantes. Ainsi, si les plantes ne possè<strong>de</strong>nt pas <strong>de</strong><br />
système immunitaire sophistiqué comme les animaux, elles ont quand même développé <strong>de</strong>s<br />
mécanismes <strong>de</strong> défense tout aussi subtils <strong>et</strong> efficaces parmi lesquels la HR est majeure.<br />
La PCD est donc notoire dans pratiquement tous les aspects <strong>de</strong> la physiologie <strong>de</strong>s plantes <strong>et</strong><br />
les modifications morphologiques <strong>et</strong> biochimiques qui y sont associées sont maintenant<br />
relativement bien connues. Mais les mécanismes moléculaires <strong>de</strong> la mort cellulaire chez les<br />
végétaux sont encore plus ou moins bien compris.<br />
U.P.M.C./U.S. 14<br />
2010
1.2.1. Effecteurs <strong>de</strong> la mort<br />
1.2.1.1. Activité caspase <strong>et</strong> les métacaspases<br />
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
Chez les végétaux, le démantèlement cellulaire implique l’activation d’une panoplie <strong>de</strong><br />
protéases. Étant donné l’importance <strong>de</strong>s caspases dans l’apoptose animale, il n’est pas<br />
étonnant que beaucoup d’efforts aient été consacrés à la recherche d’homologues structurels<br />
<strong>et</strong> fonctionnels <strong>de</strong> ces protéases chez les plantes.<br />
La disponibilité <strong>de</strong> génomes <strong>de</strong> plantes n’a pas permis <strong>de</strong> trouver d’homologues <strong>de</strong> séquence<br />
<strong>de</strong>s caspases selon les critères classiques chez les animaux, mais plusieurs arguments en<br />
faveur d’une « vraie activité caspase » jouant un rôle crucial dans la PCD chez les végétaux<br />
existent (Lam, E. <strong>et</strong> <strong>de</strong>l Pozo, O., 2000 ; Woltering, E.J. <strong>et</strong> al., 2002).<br />
Premièrement, différents inhibiteurs <strong>et</strong> substrats synthétiques plus ou moins spécifiques aux<br />
caspases <strong>de</strong>s mammifères sont reconnus par <strong>de</strong>s protéases associées à la PCD chez les<br />
végétaux. Ces inhibiteurs peuvent interférer avec le déroulement normal <strong>de</strong> la mort<br />
programmée dans différents modèles.<br />
Des macromolécules naturelles ont aussi été utilisées pour étudier l’activité caspase chez les<br />
plantes. La poly-(ADP-ribose) polymérase (PARP), impliquée dans la réparation <strong>de</strong> l’ADN<br />
chez les animaux, semble bien conservée structurellement <strong>et</strong> fonctionnellement entre les<br />
animaux <strong>et</strong> les plantes. Son clivage par la caspase-3 est un marqueur moléculaire <strong>de</strong><br />
l’apoptose animale très utilisé.<br />
Plusieurs cas où la PARP est clivée par <strong>de</strong>s protéases végétales, possiblement à un site <strong>de</strong><br />
reconnaissance <strong>de</strong>s caspases, ont été rapportés (Lam, E.<strong>et</strong> <strong>de</strong>l Pozo, O., 2000). De plus, <strong>de</strong>s<br />
inhibiteurs naturels <strong>de</strong>s caspases, comme les IAP viraux <strong>et</strong> notamment p35 du baculovirus,<br />
inhibent la PCD dans <strong>de</strong>s systèmes végétaux. p35 présente un intérêt particulier puisqu’il<br />
inhibe pratiquement toutes les caspases, mais n’interagit pas avec d’autres protéases (même<br />
celles avec un repliement semblable au « caspase-hémoglobinase » typique).<br />
Des mutants <strong>de</strong> p35 fonctionnellement handicapés ne parviennent pas, contrairement à la<br />
protéine fonctionnelle, à diminuer la HR chez <strong>de</strong>s lignées transgéniques <strong>de</strong> tabac résistants<br />
U.P.M.C./U.S. 15<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
attaqués par le TMV (Lam, E.<strong>et</strong> <strong>de</strong>l Pozo, O., 2000). Mais <strong>de</strong>s protéines avec une activité<br />
similaire aux caspases impliquées dans ces processus chez les végétaux n’ont pas encore été<br />
i<strong>de</strong>ntifiées.<br />
Par ail<strong>leurs</strong>, les métacaspases sont considérées par plusieurs comme <strong>de</strong>s candidats potentiels à<br />
l’exécution <strong>de</strong> la PCD chez les plantes. Les métacaspases sont divisées en <strong>de</strong>ux classes<br />
relativement bien définies.<br />
Le type I est caractérisé par un prodomaine contenant un motif répété riche en proline.<br />
Plusieurs métacaspases <strong>de</strong> type I végétales possè<strong>de</strong>nt aussi dans leur prodomaine <strong>de</strong>s motifs<br />
« doigt <strong>de</strong> zinc » ressemblant à ceux <strong>de</strong> la protéine LSD-1, un inhibiteur <strong>de</strong> la HR agissant<br />
possiblement comme facteur <strong>de</strong> transcription (Uren, A.G. <strong>et</strong> al., 2000 ; Di<strong>et</strong>rich, R.A. <strong>et</strong> al.,<br />
1997).<br />
Les métacaspases <strong>de</strong> type II, r<strong>et</strong>rouvées seulement chez les plantes, ne contiennent pas <strong>de</strong><br />
prodomaine mais plutôt une extension C-terminale d’environ 200 aci<strong>de</strong>s aminés.<br />
La modélisation <strong>de</strong> la structure tridimensionnelle <strong>de</strong>s métacaspases démontre une similarité<br />
significative à celle <strong>de</strong>s caspases (principalement le repliement « caspase-hémoglobinase »).<br />
Les caspases <strong>et</strong> les métacaspases appartiennent à une superfamille <strong>de</strong> protéases avec certaines<br />
similarités structurales (malgré une faible homologie <strong>de</strong> séquence) incluant les<br />
hémoglobinases, la gingipaïne bactérienne <strong>et</strong> légumaïnes.<br />
Les légumaïnes, <strong>de</strong>s cystéines protéinases présentes chez les humains <strong>et</strong> les plantes, ont une<br />
spécificité stricte pour un résidu Asn (<strong>et</strong> non un Asp) immédiatement en N-terminal du site <strong>de</strong><br />
clivage <strong>de</strong> leur substrat <strong>et</strong> ont un repliement similaire aux caspases (Chen, J.M. <strong>et</strong> al., 1998).<br />
Par contre, les premières données sur la fonction <strong>de</strong>s métacaspases d’eucaryotes unicellulaires<br />
(Szallies, A. <strong>et</strong> al., 1993 ; Ma<strong>de</strong>o, F. <strong>et</strong> al., 2002) suggèrent un rôle dans la régulation <strong>de</strong> la<br />
mort. Leur implication dans l’exécution <strong>de</strong> la PCD n’est pas exclue (<strong>et</strong> même souvent<br />
proposée ou assumée) (Ma<strong>de</strong>o, F. <strong>et</strong> al., 2002), mais n’a pas encore été démontrée <strong>de</strong> manière<br />
convaincante.<br />
U.P.M.C./U.S. 16<br />
2010
1.2.1.2. Autres protéases<br />
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
Plusieurs autres classes <strong>de</strong> protéases ont été associées à la PCD végétale <strong>et</strong> semblent pour<br />
l’instant <strong>de</strong> meil<strong>leurs</strong> candidats au démantèlement <strong>de</strong> la cellule, mais <strong>leurs</strong> rôles précis sont<br />
loin d’être compris (Beers, E.P. <strong>et</strong> al., 2000).<br />
Premièrement, <strong>de</strong>s cystéines protéases ont été associées à différents cas <strong>de</strong> PCD chez les<br />
végétaux. Notons ici la famille bien connue <strong>de</strong> la papaïne (Beers, E.P. <strong>et</strong> al., 2000) <strong>et</strong> les<br />
phytocalpaïnes, <strong>de</strong>s homologues aux calpaïnes animales (<strong>de</strong>s cystéines protéases dépendantes<br />
du calcium) récemment i<strong>de</strong>ntifiées.<br />
La première phytocalpaïne a été clonée grâce au mutant <strong>de</strong>k1 (pour <strong>de</strong>fective kernel) du maïs,<br />
qui présente <strong>de</strong>s défauts dans la différentiation <strong>de</strong> l’endosperme (Lid, S.E. <strong>et</strong> al., 2002). Des<br />
phytocalpaïnes ont aussi été trouvées chez plusieurs plantes différentes, incluant <strong>de</strong>s<br />
angiospermes <strong>et</strong> <strong>de</strong>s gymnospermes; mais à ce jour, une seule phytocalpaïne a été trouvée<br />
pour chacune (Lid, S.E. <strong>et</strong> al., 2002 ; Margis, R. <strong>et</strong> Margis-Pinheiro, M., 2003).<br />
Les phytocalpaïnes sont particulièrement intéressantes étant donné l’implication <strong>de</strong>s calpaïnes<br />
animales dans l’apoptose <strong>et</strong> l’importance du Ca 2+ dans la signalisation <strong>de</strong> la mort chez les<br />
<strong>de</strong>ux règnes.<br />
Ensuite, <strong>de</strong>s sérines protéases ont aussi été impliquées dans plusieurs modèles <strong>de</strong> PCD<br />
végétale (Beers, E.P. <strong>et</strong> al., 2000). Parmi celles-ci se trouvent <strong>de</strong>s enzymes avec une activité<br />
similaire à celle <strong>de</strong> la trypsine <strong>et</strong> la superfamille <strong>de</strong>s subtilisines, qui contient <strong>de</strong> nombreux<br />
membres chez Arabidopsis <strong>et</strong> Lycopersicon <strong>et</strong> plusieurs autres genres végétaux.<br />
La sérine protéase animale Omi/Htr2A, libérée <strong>de</strong> l’espace intermembranaire <strong>de</strong>s<br />
mitochondries, est évolutivement très ancienne <strong>et</strong> quelques homologues <strong>de</strong> séquence ont été<br />
trouvés chez les plantes (Koonin, E. <strong>et</strong> Aravind, L., 2002), quoique leur fonction n’a pas été<br />
vérifiée.<br />
Par ail<strong>leurs</strong>, les seules aspartate protéases associées à la PCD chez les végétaux sont les<br />
phytepsines, r<strong>et</strong>rouvées chez Hor<strong>de</strong>um vulgare, Oryza sativa, Arabidopsis thaliana <strong>et</strong><br />
Brassica sp. Elles sont synthétisées sous forme <strong>de</strong> prépropepti<strong>de</strong>s très similaires à <strong>de</strong>s<br />
U.P.M.C./U.S. 17<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
aspartate protéases bactériennes <strong>et</strong> à la cathepsine D, qui est associée à plusieurs exemples <strong>de</strong><br />
mort programmée chez les animaux (Beers, E.P. <strong>et</strong> al., 2000).<br />
Le protéasome, classé comme thréonine protéase, est maintenant reconnu pour son rôle dans<br />
la régulation <strong>et</strong> l’exécution <strong>de</strong> la PCD animale. Chez les plantes, plusieurs travaux ont aussi<br />
associé plus ou moins directement la régulation <strong>de</strong> la PCD au système ubiquitine-protéasome<br />
(Newbigin, E. <strong>et</strong> Vierstra, R.D., 2003 ; Beers, E.P. <strong>et</strong> al., 2000 ; Kim, M. <strong>et</strong> al., 2003 ;<br />
Vierstra, R.D., 2003), mais les mécanismes impliqués <strong>et</strong> <strong>leurs</strong> rôles physiologiques ne sont<br />
pas encore clairs.<br />
Finalement, considérant leur rôle dans l’apoptose animale, les métalloprotéinases constituent<br />
une <strong>de</strong>rnière classe <strong>de</strong> protéases possiblement impliquées dans la PCD végétale (Beers, E.P. <strong>et</strong><br />
al., 2000), mais c<strong>et</strong>te hypothèse n’a pas été vérifiée.<br />
1.2.1.3. Nucléases<br />
La dégradation du matériel génétique apparaît, philosophiquement, comme un signe majeur<br />
d’un suici<strong>de</strong> cellulaire. Ainsi, l’activation <strong>de</strong> nucléases <strong>et</strong> la digestion <strong>de</strong> l’ADNg sont <strong>de</strong>s<br />
caractéristiques classiques <strong>de</strong> la PCD, mais encore peu <strong>de</strong> données directes sont disponibles<br />
sur <strong>de</strong>s effecteurs <strong>et</strong> les mécanismes impliqués.<br />
Les endonucléases dépendantes du Zn 2+ <strong>et</strong> du Ca 2+ constituent <strong>de</strong>ux classes majeures <strong>de</strong><br />
DNAses végétales, <strong>et</strong> plusieurs d’entre elles voient leur expression majorée lors <strong>de</strong> différents<br />
cas <strong>de</strong> PCD (Sugiyama, M. <strong>et</strong> al., 2000). Notons ici les homologues BEN1 <strong>et</strong> ZEN1, qui<br />
dépen<strong>de</strong>nt du Zn 2+ <strong>et</strong> qui ont été clonés chez Hor<strong>de</strong>um <strong>et</strong> Zinnia, respectivement; d’autres<br />
homologues végétaux <strong>de</strong> ces protéines ont aussi été r<strong>et</strong>rouvés dans les banques <strong>de</strong> données.<br />
Récemment, il a été proposé que ZEN1, parmi d’autres DNAses, pourrait bien occuper un rôle<br />
central dans la fragmentation <strong>de</strong> l’ADN lors <strong>de</strong> la différentiation <strong>de</strong>s TE (Ito, J. <strong>et</strong> Fukuda, H.,<br />
2002). Il sera intéressant <strong>de</strong> voir si c’est aussi le cas dans d’autres modèles <strong>de</strong> PCD.<br />
Par ail<strong>leurs</strong>, l’endonucléase G <strong>et</strong> l’AIF sont relâchées <strong>de</strong> l’espace intermembranaire <strong>de</strong>s<br />
mitochondries chez les animaux <strong>et</strong> entraînent alors la dégradation <strong>de</strong> l’ADN,<br />
indépendamment <strong>de</strong>s caspases. Ces protéines sont conservées chez les végétaux <strong>et</strong> pourraient<br />
s’avérer être <strong>de</strong>s candidats intéressants.<br />
U.P.M.C./U.S. 18<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
Supportant c<strong>et</strong>te idée, une étu<strong>de</strong> démontre, à l’ai<strong>de</strong> d’un système acellulaire, <strong>de</strong>ux types<br />
d’activité DNAse nécessitant le Mg 2+ dans l’espace intermembranaire <strong>de</strong>s mitochondries<br />
(Balk, J. <strong>et</strong> al., 2003). La première génère rapi<strong>de</strong>ment <strong>de</strong> gros fragments d’environ 30 kpb <strong>et</strong><br />
ensuite la con<strong>de</strong>nsation <strong>de</strong> la chromatine; la secon<strong>de</strong> est beaucoup longue à se manifester, en<br />
plus <strong>de</strong> nécessiter la contribution d’un facteur cytosolique, <strong>et</strong> provoque la fragmentation<br />
internucléosomale <strong>de</strong> l’ADN.<br />
Ces caractéristiques rappellent celles <strong>de</strong>s AIF <strong>et</strong> endonucléase G <strong>de</strong>s animaux (Balk, J. <strong>et</strong> al.,<br />
2003), en plus <strong>de</strong> supporter l’idée que, comme chez les animaux, la fragmentation <strong>de</strong> l’ADN<br />
se produit en <strong>de</strong>ux étapes. Par contre, les fonctions <strong>de</strong>s homologues végétaux <strong>de</strong> ces protéines<br />
n’ont pas encore été étudiées directement.<br />
1.2.2. Signalisation, régulation <strong>et</strong> régulateurs<br />
Si, chez les animaux, on commence à avoir une bonne idée <strong>de</strong>s sentiers, <strong>de</strong>s régulateurs <strong>et</strong> <strong>de</strong>s<br />
mécanismes impliqués dans l’apoptose, le tableau n’est pas aussi clair chez les plantes.<br />
La recherche <strong>de</strong> similarités avec l’apoptose a permis <strong>de</strong> tirer plusieurs parallèles (parfois<br />
surprenants) au niveau <strong>de</strong>s sentiers <strong>de</strong> signalisation, mais la récolte d’homologues <strong>de</strong>s<br />
régulateurs animaux s’est avérée pauvre.<br />
Les particularités <strong>de</strong>s plantes ont aussi été exploitées : les fonctions <strong>de</strong>s phytohormones<br />
commencent à être mieux comprises <strong>et</strong> plusieurs mutants avec <strong>de</strong>s défauts <strong>de</strong> régulation <strong>de</strong> la<br />
PCD ont été caractérisés.<br />
1.2.2.1. Signaux <strong>et</strong> sentiers <strong>de</strong> mort<br />
Les phytohormones influencent <strong>et</strong> contrôlent pratiquement tous les aspects <strong>de</strong> la physiologie<br />
végétale, incluant la PCD (Raven, P.H. <strong>et</strong> al., 1999 ; Hoeberichts, F.A. <strong>et</strong> Woltering, E.J.,<br />
2002).<br />
La réponse aux différentes phytohormones est complexe <strong>et</strong> varie d’un type cellulaire à l’autre,<br />
notamment à cause <strong>de</strong> sensibilités différentes à chacune.<br />
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2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
Il est connu <strong>de</strong>puis longtemps que l’éthylène favorise la sénescence, le mûrissement, la<br />
maturation <strong>de</strong> l’endosperme, l’abscission <strong>et</strong> la différentiation <strong>de</strong> l’aérenchyme. Les<br />
cytokinines peuvent diminuer l’eff<strong>et</strong> <strong>de</strong> l’éthylène sur la sénescence. La mort <strong>de</strong> l’aleurone<br />
lors <strong>de</strong> la germination représente aussi un cas bien connu <strong>de</strong> contrôle hormonal <strong>de</strong> la PCD :<br />
l’aci<strong>de</strong> gibbérellique la favorise alors que l’aci<strong>de</strong> abscisique la r<strong>et</strong>ar<strong>de</strong>. Par ail<strong>leurs</strong>, l’aci<strong>de</strong><br />
salicylique (AS), un composé phénolique, semble jouer un rôle majeur dans les mécanismes<br />
<strong>de</strong> défense <strong>de</strong>s plantes (Alvarez, M.E., 2000 ; Hoeberichts, F.A. <strong>et</strong> Woltering, E.J., 2002).<br />
Lors <strong>de</strong> l’attaque par le TMV chez le tabac, l’AS s’accumule en gradient décroissant à partir<br />
<strong>de</strong> la lésion, ce qui suggère qu’une haute concentration d’AS stimule la mort alors qu’une plus<br />
faible semble protéger <strong>de</strong> la mort les cellules plus éloignées. L’AS peut déclencher la<br />
production <strong>de</strong> ROS <strong>et</strong> inversement (l’oxydation <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> phénoliques accompagne<br />
souvent la mort), en plus d’activer au moins une MAPK.<br />
Finalement, l’aci<strong>de</strong> jasmonique, une molécule volatile, a aussi été associé à l’activation <strong>de</strong>s<br />
mécanismes <strong>de</strong> défense (dont la HR) <strong>et</strong> peut même agir sur les plantes avoisinantes, comme<br />
pour les avertir <strong>de</strong> se préparer au danger. Mais les mécanismes moléculaires impliqués dans<br />
régulation <strong>de</strong> la PCD par les phytohormones sont encore obscurs. Par ail<strong>leurs</strong>, les produits <strong>de</strong>s<br />
gènes R sont aussi présumés être en amont <strong>de</strong> plusieurs sentiers <strong>de</strong> mort (Shirasu, K. <strong>et</strong><br />
Schulze-Lefert, P., 2000).<br />
Au cours <strong>de</strong> la <strong>de</strong>rnière décennie, le clonage <strong>et</strong> la caractérisation <strong>de</strong> gènes R ainsi que la<br />
disponibilité <strong>de</strong> génomes <strong>de</strong> plantes, ont permis <strong>de</strong> révéler leur structure générale<br />
étonnamment conservée, étant donnée la diversité <strong>de</strong>s pathogènes qu’ils reconnaissent<br />
(Shirasu, K. <strong>et</strong> Schulze-Lefert, P., 2000 ; Dangl, J.L. <strong>et</strong> Jones, J.D.G., 2001).<br />
La plus gran<strong>de</strong> <strong>de</strong>s familles <strong>de</strong> gènes R, nommée NB-LRR, co<strong>de</strong> pour <strong>de</strong>s protéines<br />
généralement cytoplasmiques composées d’un domaine <strong>de</strong> liaison <strong>de</strong> nucléoti<strong>de</strong> (NB,<br />
nucléoti<strong>de</strong> binding) <strong>et</strong> d’un domaine contenant <strong>de</strong>s répétitions riches en leucine (LRR,<br />
leucine-rich repeats).<br />
Fait intéressant, <strong>de</strong>s motifs (qui comprennent le NB) chez <strong>de</strong>s membres <strong>de</strong> la famille <strong>de</strong>s NB-<br />
LRR présentent <strong>de</strong>s similarités avec Apaf-1 (mammifères) <strong>et</strong> CED-4 (C. elegans); c<strong>et</strong>te région<br />
élargie est nommée domaine AP-ATPase <strong>et</strong> est aussi r<strong>et</strong>rouvée chez plusieurs procaryotes, ce<br />
U.P.M.C./U.S. 20<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
qui suggère une origine évolutive ancienne (Shirasu, K. <strong>et</strong> Schulze-Lefert, P., 2000 ; Dangl,<br />
J.L. <strong>et</strong> Jones, J.D.G., 2001; Aravind, L. <strong>et</strong> al., 1999 ; Koonin, E. <strong>et</strong> Aravind, L., 2002). Le<br />
génome d’Arabidopsis contient ~150 séquences avec une homologie aux NB-LRR dans une<br />
centaine <strong>de</strong> loci répartis sur tous les chromosomes.<br />
Par ail<strong>leurs</strong>, les MAPK végétales sont primordiales dans la transduction <strong>de</strong>s signaux induits<br />
par plusieurs stress, <strong>et</strong> ressemblent aussi à la JNK animale (Zhang, S. <strong>et</strong> Klessig, D.F., 2001).<br />
Des pathogènes (via les produits <strong>de</strong> gènes R ou d’éliciteurs non-spécifiques) ou <strong>de</strong>s stress<br />
abiotiques comme l’hypoxie, les ROS, les UV, les blessures ou les températures extrêmes,<br />
induisent <strong>de</strong>s casca<strong>de</strong>s <strong>de</strong> kinases chez les plantes. Ces casca<strong>de</strong>s aboutissent à l’activation <strong>de</strong><br />
facteurs <strong>de</strong> transcription <strong>et</strong> <strong>de</strong> gènes <strong>de</strong> défense, au déclenchement <strong>de</strong> la HR ou à la synthèse<br />
<strong>de</strong> phytohormones (comme l’aci<strong>de</strong> jasmonique <strong>et</strong> l’aci<strong>de</strong> salicylique) qui peuvent avoir un<br />
eff<strong>et</strong> rétroamplificateur. Mais beaucoup d’intermédiaires dans ces casca<strong>de</strong>s <strong>de</strong><br />
phosphorylation n’ont pas encore été i<strong>de</strong>ntifiés, tout comme les récepteurs qui les activent <strong>et</strong><br />
<strong>leurs</strong> cibles exactes.<br />
Les ROS sont aussi reconnus comme <strong>de</strong>s éléments importants <strong>de</strong> la signalisation dans<br />
plusieurs modèles <strong>de</strong> PCD chez les plantes (Rao, M.V. <strong>et</strong> al., 2000 ; Delledonne, M. <strong>et</strong> al.,<br />
2001 ; Fath, A. <strong>et</strong> al., 2002 ; Neill, S.<strong>et</strong> al., 2002), <strong>et</strong> ont beaucoup été étudiés dans le cadre <strong>de</strong><br />
la HR <strong>et</strong> chez <strong>de</strong>s cellules en culture.<br />
En temps normal, plusieurs mécanismes cellulaires limitent l’accumulation acci<strong>de</strong>ntelle <strong>et</strong> les<br />
eff<strong>et</strong>s nocifs <strong>de</strong>s ROS. Mais toute une gamme <strong>de</strong> stress biotiques ou abiotiques provoque<br />
l’augmentation <strong>de</strong> la production <strong>de</strong> H2O2. L’exposition au H2O2 provoque différentes<br />
réponses cellulaires, dont l’activation <strong>de</strong> MAPK, l’augmentation ou la répression <strong>de</strong> la<br />
transcription <strong>de</strong> plusieurs gènes, l’entrée <strong>de</strong> Ca 2+ dans la cellule, l’augmentation <strong>de</strong> la<br />
production <strong>de</strong> NO ainsi que l’accumulation d’aci<strong>de</strong> salicylique <strong>et</strong> d’éthylène. Ces eff<strong>et</strong>s<br />
semblent liés à la production <strong>de</strong> NO <strong>et</strong> dépen<strong>de</strong>nt <strong>de</strong> la dose (une faible concentration induit<br />
<strong>de</strong>s enzymes antioxydantes; une gran<strong>de</strong> mène à la mort). Par contre, les mécanismes<br />
impliqués ne sont pas clairs.<br />
Les ROS peuvent être produits lors du découplage <strong>de</strong>s chaînes <strong>de</strong> transport <strong>de</strong>s électrons <strong>de</strong> la<br />
respiration <strong>et</strong> <strong>de</strong> la photosynthèse, respectivement dans les mitochondries <strong>et</strong> les chloroplastes,<br />
<strong>et</strong> lors <strong>de</strong> la photorespiration dans les peroxisomes.<br />
U.P.M.C./U.S. 21<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
Par analogie au système animal, le relâchement du cytochrome c est observé dans plusieurs<br />
cas <strong>de</strong> PCD végétale (mais pas pendant la HR); mais on ignore encore si c<strong>et</strong> événement est<br />
significatif dans l’activation <strong>de</strong> sentiers d’exécution similaire à la formation <strong>de</strong> l’apoptosome.<br />
Dernièrement, le lien entre la mitochondrie, le H2O2 <strong>et</strong> la PCD a été clarifié. Chez <strong>de</strong>s cellules<br />
d’Arabidopsis en culture, l’exposition brève à une haute concentration <strong>de</strong> H2O2 ou plus<br />
prolongée à une faible concentration cause une production accrue <strong>de</strong> H2O2 via une<br />
accélération <strong>de</strong> la chaîne respiratoire, <strong>et</strong> résulte en l’épuisement <strong>de</strong> l’ATP, l’ouverture du PTP<br />
<strong>et</strong> finalement la mort (Tiwari, B.S. <strong>et</strong> al., 2002).<br />
Les ROS <strong>et</strong> la mitochondrie, comme chez les animaux, semblent donc jouer un rôle important<br />
dans la signalisation, l’intégration <strong>et</strong> l’amplification <strong>de</strong>s signaux <strong>de</strong> mort. Mais leur rôle chez<br />
les végétaux n’est pas clair <strong>et</strong> plusieurs points fondamentaux <strong>de</strong>meurent controversés.<br />
Le Ca 2+ est aussi un messager reconnu <strong>de</strong> la PCD végétale. Une élévation du Ca 2+ cytosolique<br />
a été observée dans la différentiation <strong>de</strong>s TE, la formation <strong>de</strong> l’aérenchyme, la maturation <strong>de</strong><br />
l’endosperme <strong>et</strong> la HR; les ROS provoquent aussi c<strong>et</strong> eff<strong>et</strong> dans plusieurs modèles, mais pas<br />
dans d’autres (comme la formation <strong>de</strong>s TE) (Fukuda, H., 2000).<br />
Le rôle du Ca 2+ dans la différentiation <strong>de</strong>s TE est étudié <strong>de</strong>puis relativement longtemps <strong>et</strong> un<br />
modèle proposé du déroulement <strong>de</strong> ce processus nécessite l’entrée massive <strong>de</strong> Ca 2+ dans la<br />
cellule pour initier les événements associés à la PCD (Fukuda, H., 2000).<br />
Le lanthanum, un bloqueur <strong>de</strong> canal à Ca 2+ <strong>de</strong> la membrane plasmique, inhibe la mort dans<br />
plusieurs cas, mais <strong>de</strong>meure sans eff<strong>et</strong> sur les mécanismes <strong>de</strong> défense plus généraux. Par<br />
ail<strong>leurs</strong>, le RE, un réservoir majeur <strong>de</strong> Ca 2+ intracellulaire, est aussi important dans le<br />
transport <strong>de</strong>s protéines hydrolytiques aux vacuoles <strong>et</strong> comme source <strong>de</strong> membranes lipidiques<br />
pour la formation <strong>de</strong> vésicules autophagiques (Toyooka, K. <strong>et</strong> al., 2001 ; Marty, F., 1999).<br />
Des développements récents dans la régulation <strong>de</strong> l’apoptose par la modulation <strong>de</strong>s flux <strong>de</strong><br />
calcium suggèrent un rôle central pour ce messager <strong>et</strong> le RE dans l’intégration <strong>et</strong> la<br />
signalisation <strong>de</strong> plusieurs stimuli (dont le H2O2). Il se pourrait bien que se soit aussi le cas<br />
chez les plantes, mais c<strong>et</strong>te hypothèse reste à être explorée dans c<strong>et</strong>te nouvelle perspective. De<br />
plus, le RE <strong>et</strong> le Ca 2+ semblent aussi liés à la mort <strong>de</strong> type autophagique (comme par exemple<br />
U.P.M.C./U.S. 22<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
la formation <strong>de</strong>s TE <strong>et</strong> la mobilisation <strong>de</strong>s réserves <strong>de</strong> l’aleurone, <strong>de</strong>s cotylédons ou <strong>de</strong>s autres<br />
feuilles) renforçant l’idée d’un rôle majeur <strong>et</strong> conservé du Ca 2+ dans la régulation <strong>et</strong> la<br />
signalisation <strong>de</strong> la mort.<br />
1.2.2.2. Régulateurs<br />
Un portrait global <strong>de</strong>s sentiers <strong>de</strong> signalisation <strong>de</strong> la PCD chez les végétaux semble donc sur<br />
le point d’émerger. Mais les régulateurs impliqués <strong>et</strong> leur influence sur ces sentiers sont mal<br />
connus.<br />
Plusieurs mutants présentant une PCD inappropriée ont été caractérisés, particulièrement dans<br />
le cadre <strong>de</strong> la HR (Heath, M.C., 2000 ; Shirasu, K. <strong>et</strong> Schulze-Lefert, P., 2000). Certaines<br />
modifications dans <strong>de</strong>s gènes R peuvent déclencher la HR sans présence <strong>de</strong> pathogène. Des<br />
mutants avec <strong>de</strong>s résistances accrues à <strong>de</strong>s pathogènes démontrent aussi la formation <strong>de</strong><br />
lésions spontanées dans diverses conditions.<br />
Par exemple, chez les mutants mlo <strong>de</strong> l’orge, <strong>de</strong>s lésions discrètes apparaissent sur les feuilles<br />
juste avant le début <strong>de</strong> la sénescence. Mlo est une protéine à sept hélices transmembranaires<br />
située dans la membrane plasmique qui confère une résistance au mildiou (Erysiphe graminis)<br />
qui ne dépend pas <strong>de</strong> l’espèce du pathogène; par contre, la suppression <strong>de</strong> la croissance du<br />
pathogène arrive avant la mort <strong>de</strong> cellules <strong>de</strong> l’hôte, <strong>et</strong> semble plutôt due au renforcement <strong>de</strong>s<br />
parois, lié à la présence <strong>de</strong> ROS.<br />
Fait intéressant, les mutants mlo sont plus susceptibles à un autre champignon, Magnaporthe<br />
grisea, un biotrophe facultatif qui peut sécréter <strong>de</strong>s toxines pour tuer les cellules pénétrées<br />
avant <strong>de</strong> poursuivre la colonisation <strong>et</strong> qui semble donc ainsi être avantagé par la mort<br />
cellulaire plus prompte chez les plantes mlo.<br />
Les mutants lsd d’Arabidopsis présentent aussi <strong>de</strong>s lésions spontanées <strong>et</strong> une résistance<br />
accrue. Par exemple, les plantes lsd1 présentent <strong>de</strong>s lésions grandissantes suite à l’exposition<br />
à divers stimuli (comme <strong>de</strong>s jours longs <strong>et</strong> les ROS) <strong>et</strong> une résistance accrue à différents<br />
pathogènes bactériens <strong>et</strong> fongiques.<br />
U.P.M.C./U.S. 23<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
C<strong>et</strong>te résistance, comme chez les mlo, intervient avant l’apparition <strong>de</strong>s lésions. Contrairement<br />
à certains mutants lsd qui requièrent l’action <strong>de</strong> l’aci<strong>de</strong> salicylique <strong>et</strong> induisent <strong>de</strong>s<br />
mécanismes <strong>de</strong> défense généraux, d’autres, dont lsd1, n’en n’ont pas besoin. Il a plutôt été<br />
suggéré que les plantes lsd1 sont plus sensibles aux ROS que les plantes sauvages <strong>et</strong> que leur<br />
phénotype dépend <strong>de</strong> c<strong>et</strong>te sensibilité.<br />
Plusieurs transgènes induisent aussi chez les végétaux le phénotype <strong>de</strong> la HR. Par exemple,<br />
l’expression <strong>de</strong> gènes d’avirulence ou d’éliciteurs non spécifiques provenant <strong>de</strong> pathogènes<br />
induit <strong>de</strong>s lésions similaires à la HR, tout comme <strong>de</strong>s antisens (qui inhibent la production)<br />
d’enzymes antioxydantes (Mittler, R. <strong>et</strong> Rizhsky, L., 2000).<br />
Les végétaux n’ont pas <strong>de</strong> membres <strong>de</strong> la famille <strong>de</strong> Bcl-2, mais plusieurs régulateurs <strong>de</strong> c<strong>et</strong>te<br />
famille ont démontré leur fonctionnalité chez les plantes. Des plantes <strong>de</strong> tabac exprimant les<br />
anti-apoptotiques Bcl-XL ou CED-9 sont résistantes à la PCD induite par les UV <strong>et</strong> le<br />
paraquat (Mitsuhara, I. <strong>et</strong> al., 1999) <strong>et</strong> leur progéniture est aussi plus résistante à <strong>de</strong>s stress<br />
causés par le sel, le froid <strong>et</strong> les blessures, possiblement grâce à une contribution <strong>de</strong> ces<br />
protéines au maintien <strong>de</strong> l’homéostasie <strong>de</strong>s organelles (Qiao, J. <strong>et</strong> al., 2002).<br />
Une autre équipe a aussi produit <strong>de</strong>s tabacs transgéniques exprimant Bcl-XL, CED-9 ou l’anti-<br />
apoptotique Op-IAP du baculovirus <strong>et</strong> a démontré leur résistance à différents pathogènes<br />
fongiques <strong>et</strong> viraux (Dickman, M.B. <strong>et</strong> al., 2001).<br />
Le pro-apoptotique Bax a aussi été exprimé transitoirement à l’ai<strong>de</strong> d’un vecteur viral chez<br />
<strong>de</strong>s feuilles <strong>de</strong> tabac, ce qui a causé l’apparition <strong>de</strong> lésions similaires à celles qui surviennent<br />
lors <strong>de</strong> la HR (Lacomme, C. <strong>et</strong> Santa Cruz, S., 1999).<br />
Des plantules d’Arabidopsis transformées pour exprimer Bax <strong>de</strong> manière inductible cessent <strong>de</strong><br />
croître <strong>et</strong> dégénèrent après induction (Kawai-Yamada, M. <strong>et</strong> al., 2001).<br />
La fonctionnalité <strong>de</strong> certains membres <strong>de</strong> la famille <strong>de</strong> Bcl-2 chez les plantes suggère une<br />
action au niveau <strong>de</strong> sentiers fondamentaux conservés entre les végétaux <strong>et</strong> les animaux. Par<br />
contre, très peu d’homologues <strong>de</strong> régulateurs <strong>de</strong> l’apoptose ont été i<strong>de</strong>ntifiés chez les<br />
végétaux. Par exemple, un homologue végétal <strong>de</strong> Rac, un <strong>de</strong>s facteurs cytosoliques du<br />
complexe NADPH oxydase <strong>de</strong>s animaux, active la production <strong>de</strong> ROS <strong>et</strong> la PCD chez le riz<br />
U.P.M.C./U.S. 24<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
(Kawasaki, T. <strong>et</strong> al., 1999). Un homologue <strong>de</strong> Rac a aussi été i<strong>de</strong>ntifié chez l’orge<br />
(Hückelhoven, R. <strong>et</strong> al., 2001). Une autre protéine qui a été impliquée dans la régulation <strong>de</strong><br />
l’apoptose, DAD1, est aussi bien conservée chez les plantes. DAD1 inhibe la PCD lors du<br />
développement <strong>de</strong> C. elegans <strong>et</strong> l’homologue d’Arabidopsis est aussi efficace que la protéine<br />
humaine dans la complémentation d’une lignée mutante <strong>de</strong> cellules <strong>de</strong> hamster (Gallois, P. <strong>et</strong><br />
al., 1997). DAD1 fait partie du complexe oligosaccharyl transférase <strong>de</strong>s mammifères,<br />
impliqué dans la glycosylation (Kelleher, D.J. <strong>et</strong> Gilmore, R., 1997).<br />
Rac <strong>et</strong> DAD1 sont impliqués dans <strong>de</strong>s sentiers métaboliques importants pour la cellule <strong>et</strong> <strong>leurs</strong><br />
rôles ne semblent donc pas exclusifs à la régulation <strong>de</strong> la PCD.<br />
La protéine BI-1 (Bax inhibitor-1) présente un intérêt particulier dans l’étu<strong>de</strong> <strong>de</strong> la régulation<br />
<strong>de</strong> la PCD végétale <strong>et</strong> <strong>de</strong> son évolution. I<strong>de</strong>ntifié dans une banque d’ADNc humains grâce à<br />
sa capacité à inhiber la mort induite par Bax chez la levure, le BI-1 humain empêche aussi<br />
l’apoptose déclenchée par la surexpression <strong>de</strong> Bax ou par différents autres stimuli<br />
apoptotiques chez les cellules humaines 293 (Xu, Q. <strong>et</strong> Reed, J.C., 1998).<br />
Le BI-1 humain est r<strong>et</strong>rouvé dans les membranes intracellulaires où il peut s’associer<br />
directement avec Bcl-2 <strong>et</strong> Bcl-XL, mais pas avec Bax ou Bak (Xu, Q. <strong>et</strong> Reed, J.C., 1998).<br />
Des homologues végétaux <strong>de</strong> BI-1 ont par la suite été clonés chez Arabidopsis (AtBI-1) <strong>et</strong> le<br />
riz (OsBI-1), <strong>et</strong> ont démontré pouvoir empêcher la PCD induite par Bax chez la levure<br />
(Kawai, M. <strong>et</strong> al., 1999 ; Sanchez, P. <strong>et</strong> al., 2000). Fait intéressant, <strong>de</strong>s plantes blessées<br />
mécaniquement ou attaquées par un pathogène (spécifique ou non) présentent une<br />
accumulation rapi<strong>de</strong> <strong>de</strong> l’ARNm codant pour AtBI-1 (Sanchez, P. <strong>et</strong> al., 2000).<br />
Un homologue a aussi été cloné chez l’orge <strong>et</strong> sa transcription est accrue lors <strong>de</strong> l’attaque par<br />
le mildiou (Hückelhoven, R. <strong>et</strong> al., 2001). L’homologue du pin est aussi relativement très<br />
abondant (approximativement 600 e sur 15000) dans une banque d’EST <strong>de</strong> xylème en<br />
formation, un procédé lors duquel le rôle <strong>de</strong> la PCD est reconnu (Kozela, C. <strong>et</strong> Regan, S.,<br />
2003).<br />
U.P.M.C./U.S. 25<br />
2010
1.3. La lutte contre Agrobacterium tumefaciens<br />
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
Au fil <strong>de</strong>s années, diverses métho<strong>de</strong>s <strong>de</strong> lutte ont été développées pour limiter les dégâts, à<br />
savoir, la lutte culturale, la lutte chimique <strong>et</strong> la lutte biologique.<br />
1.3.1. Lutte culturale<br />
Il s’agit d’éviter l’introduction dans les pépinières non infectées <strong>de</strong> tout matériel douteux. Le<br />
travail du sol est important pour l’élimination <strong>de</strong>s adventices capables d’héberger la bactérie<br />
qui peut persister longtemps dans le sol.<br />
Agrobacterium tumefaciens a été mis en évi<strong>de</strong>nce dans <strong>de</strong>s débris <strong>de</strong> tumeurs enfuis dans le<br />
sol <strong>de</strong>puis plus <strong>de</strong> trois ans. Par conséquent, les longues rotations sont souhaitables <strong>et</strong><br />
l’élimination impitoyable <strong>de</strong> tous les plants mala<strong>de</strong>s est impérative (Moore, L.W., 1977).<br />
1.3.2. Recherche <strong>de</strong> phénotypes génétiquement résistants<br />
Il est important <strong>de</strong> sélectionner <strong>de</strong>s variétés résistantes à la galle du coll<strong>et</strong> car les porte-greffes<br />
<strong>de</strong>s arbres fruitiers sont multipliés par <strong>de</strong>s métho<strong>de</strong>s traumatisantes (bouturage, marcottage) <strong>et</strong><br />
sont fréquemment soumis à <strong>de</strong>s risques <strong>de</strong> blessure.<br />
1.3.3. La lutte biologique<br />
Le rapport <strong>de</strong>s agrobactéries (pathogènes/non pathogènes) élevé au voisinage <strong>de</strong>s plants<br />
mala<strong>de</strong>s <strong>et</strong> faible au voisinage <strong>de</strong>s végétations saines est à l’origine <strong>de</strong> l’étu<strong>de</strong> <strong>de</strong>s interactions<br />
entres ces types d’isolats <strong>et</strong> la sélection d’un Agrobacterium radiobacter : la souche K84.<br />
Ce <strong>de</strong>rnier a témoigné dans certains pays d’une gran<strong>de</strong> efficacité dans la lutte biologique<br />
(Penyalver, R.<strong>et</strong> al., 2000). En plus <strong>de</strong> l’inhibition <strong>de</strong> la tumorisation par blocage physique <strong>de</strong>s<br />
sites spécifiques <strong>de</strong> fixation, la souche K84 agit aussi par l’intermédiaire d’antibiotiques qui<br />
sont l’agrocine 84 codé par le plasmi<strong>de</strong> pAgK84 (47,7 Kb), l’agrocine 434 codé par le<br />
plasmi<strong>de</strong> pAgK434 (>300Kb) <strong>et</strong> l’agrobactine 84 (ALS84) codé par un gène chromosomal<br />
(André, P. <strong>et</strong> Eyquard, J.P., 1993).<br />
U.P.M.C./U.S. 26<br />
2010
1.3.4. Lutte chimique<br />
Elle consiste en l’utilisation <strong>de</strong> différents produits :<br />
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
� Les antibiotiques : Seuls <strong>de</strong>ux antibiotiques, la streptomycine <strong>et</strong> l'oxytétracycline, sont<br />
enregistrés aux Etats-Unis, par l'Agence <strong>de</strong> la protection <strong>de</strong> l'environnement (United States<br />
Environment Protection Agency) pour être utilisé en agriculture (Kumar, K. <strong>et</strong> al., 2005).<br />
Selon les objectifs du traitement <strong>et</strong> la culture, la concentration recommandée se situe entre 50<br />
<strong>et</strong> 200 mg/l pour la streptomycine <strong>et</strong> entre 150 <strong>et</strong> 200 mg/l pour l'oxytétracycline (Vidaver,<br />
A.K., 2002). L’utilisation <strong>de</strong> la gentamicine, non autorisée aux Etats-Unis <strong>et</strong> pratique courante<br />
dans les pays <strong>de</strong> l’amérique latine, est préoccupante en raison <strong>de</strong> l'importance <strong>de</strong> c<strong>et</strong><br />
antibiotique en mé<strong>de</strong>cine humaine (Vidaver, A.K., 2002). La streptomycine <strong>et</strong><br />
l'oxytétracycline sont utilisées contre la galle du coll<strong>et</strong> chez les rosiers <strong>et</strong> il a été estimé que<br />
53.000 ha <strong>de</strong> fruits <strong>et</strong> légumes sont pulvérisés chaque année, aux Etats-Unis, avec <strong>de</strong>s<br />
antibiotiques (Kumar, K. <strong>et</strong> al., 2005).<br />
� Le souffre : Des pépiniéristes ayant épandu du souffre pour combattre l’oïdium sur semis<br />
<strong>de</strong> pommier, auraient remarqué une n<strong>et</strong>te diminution du crown gall dans <strong>leurs</strong> pépinières. Le<br />
souffre gênerait l’infection en acidifiant le milieu (Deep, I.W., 1968).<br />
� La désinfection du sol : En utilisant comme fumigants la chloropicrine, le dichloropropène<br />
dichloropropane (DD), le bromure <strong>de</strong> méthyle ou le bromure <strong>de</strong> propargyle, une inefficacité<br />
<strong>de</strong> la fumigation dans la lutte contre la galle du coll<strong>et</strong> a été remarqué (Moore, L.W. <strong>et</strong> Schroth,<br />
M.N., 1976). Cependant, le DD qui a été utilisé à Lansca<strong>de</strong> <strong>de</strong>puis 1964 pour lutter contre les<br />
némato<strong>de</strong>s, a permis la réduction du taux d’infestation par la maladie <strong>de</strong> 35 à 1% (Deep, I.W.,<br />
1968).<br />
� Mélange d’hydrocarbures : Les cellules <strong>de</strong>s tumeurs résultant <strong>de</strong> l’Agrobacteium<br />
tumefaciens sont tuées sélectivement par un mélange <strong>de</strong> cinq hydrocarbures aromatiques dans<br />
l’huile <strong>de</strong> paraffine, sans que les cellules saines adjacentes ne soient touchées (Moore, L.W.,<br />
1997). C<strong>et</strong>te émulsion continue à être utilisée en Californie pour éradiquer les galles sur les<br />
poiriers en pépinières <strong>et</strong> dans les vergers (Hay<strong>de</strong>r, N., 2002).<br />
U.P.M.C./U.S. 27<br />
2010
1.4. Les fléaux <strong>de</strong>s cultures <strong>et</strong> l’extension <strong>de</strong> la protection chimique<br />
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
Une succession d’évènements dramatiques survenus entre 1845 <strong>et</strong> 1920 <strong>de</strong>s <strong>de</strong>ux côtés <strong>de</strong><br />
l’Atlantique a complètement modifié la manière <strong>de</strong> protéger les cultures. Pour l’Europe, nous<br />
connaissons bien l’histoire <strong>de</strong>s fléaux successifs introduits du Nouveau Mon<strong>de</strong> : mildiou <strong>de</strong> la<br />
pomme <strong>de</strong> terre, oïdium, phylloxera, mildiou <strong>et</strong> black-rot <strong>de</strong> la vigne, puis doryphore. Ces<br />
calamités ont été à l’origine d’un effort considérable pour y remédier avec la proposition d’un<br />
nombre invraisemblable <strong>de</strong> métho<strong>de</strong>s <strong>de</strong> lutte, la plupart sans résultat tangible. La génétique<br />
sera couronnée <strong>de</strong> succès avec la création <strong>de</strong> vignes hybri<strong>de</strong>s résistant au mildiou ou/<strong>et</strong> au<br />
phylloxéra mais ces découvertes n’ont pas eu à ce jour <strong>de</strong> succès commercial en raison <strong>de</strong> la<br />
qualité discutable <strong>de</strong> <strong>leurs</strong> produits. Contre les maladies, la solution passera d’abord <strong>et</strong> pour<br />
plusieurs décennies par les fongici<strong>de</strong>s minéraux à base <strong>de</strong> soufre <strong>et</strong> <strong>de</strong> sels <strong>de</strong> cuivre… <strong>et</strong><br />
seuls <strong>de</strong>s insectici<strong>de</strong>s pourront contenir les pullulations du doryphore. Pour le phylloxéra, une<br />
protection rationnelle <strong>et</strong> durable ne sera pas obtenue par <strong>de</strong>s moyens chimiques ou<br />
<strong>biologiques</strong> mais par la sélection <strong>de</strong> porte-greffes résistants <strong>et</strong> la pratique du greffage<br />
(Bernard, J-L., 2008).<br />
En Amérique du Nord, le commerce transocéanique a eu les mêmes eff<strong>et</strong>s. Les introductions<br />
anciennes <strong>de</strong> la cécidomyie <strong>de</strong>structive (May<strong>et</strong>iola <strong>de</strong>structor) <strong>et</strong> du carpocapse <strong>de</strong>s pommes<br />
(Cydia pomonella) n’ont été que les prémices d’une immense vague d’arthropo<strong>de</strong>s ravageurs<br />
venus <strong>de</strong> l’Ancien Mon<strong>de</strong>. Comme le bombyx disparate (gypsy moth = Lymantria dispar),<br />
volontairement introduit <strong>de</strong> France en 1868 à <strong>de</strong>s fins <strong>de</strong> travaux scientifiques <strong>et</strong> qui <strong>de</strong>vient<br />
dès 1889 un fléau majeur <strong>de</strong>s forêts ; comme le Pou <strong>de</strong> San José (Aspidiotus perniciosus)<br />
apporté <strong>de</strong> Chine en Californie avec <strong>de</strong>s arbres fruitiers vers 1870 ; comme le coléoptère<br />
japonais Popillia japonica, ravageur polyvalent découvert en 1912 dans le New Jersey où le<br />
transport par bateau <strong>de</strong> rhizomes d’iris l’avait introduit…<strong>et</strong>c. Un <strong>de</strong>s exemples les plus<br />
célèbres est celui <strong>de</strong> la pyrale (Ostrinia nubilalis = european corn borer). Ce ravageur assez<br />
polyphage d’origine européenne est un lépidoptère qui a franchi l’océan vers 1910,<br />
vraisemblablement avec <strong>de</strong>s lots <strong>de</strong> paille à balais importée d’Italie ou <strong>de</strong> Hongrie. Observé<br />
près <strong>de</strong> Boston en 1917, il a atteint les Grands Lacs en 1931 avant d’envahir toutes les régions<br />
d’Amérique du Nord où la culture du maïs était pratiquée. Aux Etats-Unis, il est encore<br />
responsable chaque année <strong>de</strong> plus <strong>de</strong> 700 millions d’euros <strong>de</strong> dégâts dont plus <strong>de</strong> 200 millions<br />
pour le seul état <strong>de</strong> Minnesota en 1995. Mais le danger vient aussi du vaste continent<br />
américain lui-même. Avec le charançon du coton (cotton boll weevil = Anthonomus grandis)<br />
U.P.M.C./U.S. 28<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
qui, entré au Texas <strong>de</strong>puis le Mexique en 1892, atteint les domaines cotonniers d’Alabama en<br />
1915 ou il <strong>de</strong>vient le principal ravageur <strong>de</strong> la culture, contribuant à accentuer la situation<br />
dramatique <strong>de</strong>s agriculteurs du Sud à l’époque <strong>de</strong> la gran<strong>de</strong> dépression <strong>de</strong>s années 30. Sans<br />
oublier le célèbre doryphore qui, parti <strong>de</strong> régions reculées <strong>de</strong>s Montagnes Rocheuses, a suivi<br />
les plantations <strong>de</strong> pomme <strong>de</strong> terre le long du nouveau chemin <strong>de</strong> fer pour atteindre New York<br />
en 1874 d’où il gagne l’Europe <strong>et</strong> l’Asie. C<strong>et</strong>te liste est loin d’être limitative (Bernard, J-L.,<br />
2008).<br />
.<br />
La réponse à c<strong>et</strong>te marée montante <strong>de</strong>s problèmes – que l’on exige forcément rapi<strong>de</strong> – a été<br />
articulée <strong>de</strong> plusieurs manières :<br />
- Avec l’étu<strong>de</strong>, la mise au point <strong>et</strong> le développement d’une pharmacopée : centrée sur la<br />
chimie avec <strong>de</strong>s fongici<strong>de</strong>s minéraux en Europe <strong>et</strong> <strong>de</strong>s insectici<strong>de</strong>s huileux ou minéraux aux<br />
Etats-Unis ; en parallèle, d’autres agents insectici<strong>de</strong>s ont aussi été étudiées comme la bactérie<br />
Bacillus thuringiensis découverte au Japon dès 1901 puis en Allemagne en 1911, <strong>de</strong>s<br />
champignons antagonistes (ex : Beauveria sp.), <strong>de</strong>s extraits végétaux comme le pyrèthre, la<br />
nicotine… En sus <strong>de</strong> leur activité propre, un usage conséquent <strong>de</strong>s corps gras est fait au titre<br />
d’adjuvants, <strong>de</strong> mouillants… complément utile à diverses matières actives ;<br />
- Avec la recherche <strong>de</strong> macro-organismes, répresseurs naturels <strong>de</strong>s ravageurs envahissants, les<br />
« pests », dans leur pays d’origine ; après élevage <strong>et</strong> acclimatation, certains lâchers<br />
d’auxiliaires ont parfois été couronnés <strong>de</strong> succès. C’est le cas <strong>de</strong> coccinelles comme Rodolia<br />
(Novius) cardinalis, déterminante pour contenir la cochenille australienne ou d’hyménoptères<br />
comme Cales noaki contre l'aleuro<strong>de</strong> floconneux <strong>de</strong>s agrumes <strong>et</strong> Encarsia perniciosa contre<br />
le Pou <strong>de</strong> San José.<br />
- Avec un travail <strong>de</strong> sélection pour préciser les variétés les plus résistantes à l’action <strong>de</strong>s<br />
parasites : on connaît les fortunes diverses <strong>de</strong> l’hybridation en viticulture. Le travail pionnier<br />
<strong>de</strong> « sélection généalogique » que Louis <strong>de</strong> Vilmorin présente en 1856 <strong>de</strong>vant l’Académie<br />
d’Agriculture donne le coup d’envoi d’une activité au long cours visant à conférer aux plantes<br />
<strong>de</strong> gran<strong>de</strong> culture une moindre sensibilité aux rouilles, au piétin-verse… <strong>et</strong>c.<br />
- Avec la création <strong>de</strong> dispositifs <strong>de</strong> quarantaine, illustrée par l’entomologiste américain<br />
L.O.Howard, en mission pour son gouvernement, qui précisait <strong>de</strong>vant l’Académie<br />
d’Agriculture <strong>de</strong> France le 22 juin 1910 que « plus <strong>de</strong> 40 espèces d’insectes dangereux <strong>de</strong><br />
première importance, causant chacun, annuellement, plusieurs millions <strong>de</strong> dollars <strong>de</strong><br />
dommages aux récoltes, ont été introduits <strong>de</strong> pays étrangers, pour la plus gran<strong>de</strong> part<br />
U.P.M.C./U.S. 29<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
européens… » (Howard, L.O.,1910), dont récemment <strong>de</strong> France, le brown tail moth <strong>de</strong>s arbres<br />
fruitiers. L’encadrement réciproque <strong>de</strong>s échanges <strong>de</strong> végétaux afin d’éviter l’explosion <strong>de</strong>s<br />
contraintes liées à l’organisation <strong>de</strong>s luttes est un dispositif indispensable mais hélas non<br />
suffisant pour éviter <strong>de</strong> nouvelles introductions dommageables.<br />
En réponse à l’envahissement considérable <strong>de</strong>s « mauvaises herbes » consécutif à l’emploi<br />
accru <strong>de</strong>s matières fertilisantes, le désherbage chimique <strong>de</strong>s cultures a commencé avec les<br />
travaux <strong>de</strong> Louis Bonn<strong>et</strong> qui évalue les eff<strong>et</strong>s du sulfate <strong>de</strong> cuivre sur les dicotylédones<br />
adventices <strong>et</strong> sa sélectivité pour les céréales en 1896 (Bernard, J.-L., 1996). Mais jusqu’en<br />
1914, l’emploi <strong>de</strong> désherbants issus <strong>de</strong> la chimie se limitait à ces cultures <strong>et</strong> était bien loin <strong>de</strong><br />
sa banalisation. A c<strong>et</strong>te époque, la <strong>de</strong>struction <strong>de</strong>s moutar<strong>de</strong>s <strong>et</strong> autres dicotylédones dans les<br />
champs <strong>de</strong> céréales requiert <strong>de</strong>s quantités importantes <strong>de</strong> sels minéraux : <strong>de</strong> l’ordre <strong>de</strong> 400<br />
kg/ha pour le sulfate <strong>de</strong> fer anhydre, 40 kg/ha pour le sulfate <strong>de</strong> cuivre, 30 kg/ha pour le<br />
nitrate <strong>de</strong> cuivre. Les métho<strong>de</strong>s « mo<strong>de</strong>rnes » faisant appel à l’aci<strong>de</strong> sulfurique <strong>de</strong>man<strong>de</strong>nt 80<br />
à 120 litres d’aci<strong>de</strong> à 65° Baumé appliqués dans 1000 litres d’eau environ par ha. La<br />
compagnie St Gobain, qui livre ce produit à la <strong>de</strong>man<strong>de</strong> <strong>de</strong>s ach<strong>et</strong>eurs, en m<strong>et</strong> à disposition<br />
chaque année plusieurs milliers <strong>de</strong> tonnes pour le seul Midi <strong>de</strong> la France. La Compagnie<br />
Bor<strong>de</strong>laise qui ravitaille le sud-ouest aurait vendu en wagons-citernes <strong>et</strong> bonbonnes <strong>de</strong> cent<br />
litres une quantité <strong>de</strong> l’ordre <strong>de</strong> 3500 tonnes pour la vallée <strong>de</strong> Garonne en 1926-1927 (Rabate,<br />
E., 1927). L’aci<strong>de</strong> sulfurique sera l’herbici<strong>de</strong> le plus utilisé sur céréales en Europe avant 1940.<br />
Ainsi donc, avant la Première Guerre mondiale, les éléments constitutifs <strong>de</strong> la protection <strong>de</strong>s<br />
cultures mo<strong>de</strong>rne sont en place. Et c<strong>et</strong>te évolution se trouve être la même dans tous les pays<br />
développés où la science agronomique avance vers <strong>de</strong>s solutions en disposant déjà <strong>de</strong> toute la<br />
pal<strong>et</strong>te <strong>de</strong>s métho<strong>de</strong>s que nous utilisons aujourd’hui. Si la chimie y trouve une place<br />
importante malgré les coûts <strong>et</strong> les changements d’habitu<strong>de</strong>s induits, elle le doit surtout à <strong>de</strong>ux<br />
raisons. Tout d’abord sa relative rapidité à porter remè<strong>de</strong> à <strong>de</strong>s fléaux importés au<br />
développement explosif. Que l’on songe au cas <strong>de</strong> l’oïdium <strong>de</strong> la vigne (Bernard, J.-L., 2007).<br />
Ou encore au mildiou <strong>de</strong> la pomme <strong>de</strong> terre qui ravageait les cultures <strong>de</strong>puis plus d’un <strong>de</strong>mi-<br />
siècle lorsque la mise au point <strong>de</strong> la bouillie bor<strong>de</strong>laise amena enfin avec les traitements<br />
cupriques un début <strong>de</strong> réponse suite aux essais conduits par Prillieux <strong>et</strong> Girard au champ<br />
d'expérience <strong>de</strong> l'Institut Agronomique <strong>de</strong> Joinville-le-Pont en 1888 (Deherain, P.-P., 1898).<br />
Ensuite, au fait que bien souvent, elle constitue dans le moment une réponse économiquement<br />
rationnelle unique au problème posé. Le désherbage <strong>de</strong>s céréales à l’aci<strong>de</strong> sulfurique, si<br />
U.P.M.C./U.S. 30<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
contraignant <strong>et</strong> dangereux soit-il en est une illustration. L’emploi <strong>de</strong>s sels d’arsenic pour<br />
prévenir les dégâts du carpocapse <strong>de</strong>s pommes <strong>et</strong> <strong>de</strong> l’anthonome en est une autre.<br />
Dès ses origines, la pharmacopée présente une image <strong>de</strong> dangerosité qu’elle ne quittera guère<br />
par la suite. Elle fait en eff<strong>et</strong> très largement appel à <strong>de</strong>s substances porteuses <strong>de</strong> connotations<br />
objectives ou subjectives inquiétantes. Ainsi, le soufre à <strong>de</strong>s propriétés irritantes <strong>et</strong> traîne une<br />
réputation diabolique ; les polysulfures <strong>et</strong> l’aci<strong>de</strong> sulfurique attaquent <strong>et</strong> corro<strong>de</strong>nt le métal ;<br />
<strong>de</strong> nombreux sels <strong>de</strong> cuivre sont réputés toxiques (« vert-<strong>de</strong>-gris ») ; la nicotine, l’arsenic…<br />
sont connus comme <strong>de</strong> véritables poisons ; les goudrons <strong>de</strong> houille sont excessivement<br />
malodorants…<br />
Entre 1900 <strong>et</strong> 1945, l’agriculture a trouvé dans la chimie un début <strong>de</strong> réponse à <strong>de</strong>s questions<br />
séculaires. A c<strong>et</strong>te époque, l’armoire à pharmacie n’est pas bien garnie <strong>et</strong> nombre <strong>de</strong> rec<strong>et</strong>tes<br />
autour, par exemple, du pétrole <strong>et</strong> <strong>de</strong> ses dérivés, sont utilisées avec <strong>de</strong>s objectifs très variés.<br />
Dans ce contexte, l’arrivée <strong>de</strong> produits issus <strong>de</strong> la chimie <strong>de</strong> synthèse dès 1946<br />
(phytohormones) a été vécue comme une révolution. Pour les cultivateurs <strong>et</strong> les services<br />
officiels, elle laissait espérer <strong>de</strong>s solutions économiques à tous les problèmes. L’expérience a<br />
<strong>de</strong>puis prouvé qu’en protection <strong>de</strong>s cultures, les solutions simples n’existent guère <strong>et</strong> que<br />
chaque percée <strong>de</strong> l’innovation génère ses propres inconvénients (Bernard, J-L., 2008).<br />
Après la secon<strong>de</strong> guerre mondiale, si un nombre croissant <strong>de</strong> produits chimiques <strong>de</strong> synthèse a<br />
été proposé par la recherche aux agriculteurs, nous savons que ces solutions sont quelquefois<br />
<strong>de</strong>venues une réponse unique pour certains <strong>de</strong> <strong>leurs</strong> problèmes faute d’une approche<br />
cohérente du système <strong>de</strong> protection. D’où la mise en cause au début <strong>de</strong>s années 1960 <strong>de</strong><br />
certaines substances actives comme les fongici<strong>de</strong>s dérivés du mercure, les insectici<strong>de</strong>s<br />
organochlorés <strong>et</strong> organophosphorés, dans un temps ou la pharmacopée était en pleine pério<strong>de</strong><br />
d’innovation (Bernard, J-L., 2008).<br />
Sur la pério<strong>de</strong> entre 1965 <strong>et</strong> aujourd’hui, plus <strong>de</strong> 800 « solutions » ont été inscrites sur la liste<br />
<strong>de</strong>s moyens autorisés (In<strong>de</strong>x phytosanitaire <strong>de</strong> l’ACTA, 1965, 1970, 1980, 1990, 2000 <strong>et</strong><br />
2008). Toutes ces solutions ne sont pas <strong>de</strong>s substances phytopharmaceutiques classiques<br />
(herbici<strong>de</strong>s, fongici<strong>de</strong>s, insectici<strong>de</strong>s <strong>et</strong> acarici<strong>de</strong>s). On y trouve <strong>de</strong>s substances <strong>de</strong>stinées à<br />
l’hygiène <strong>de</strong>s élevages, à la désinfection <strong>de</strong>s locaux, à l’élimination <strong>de</strong> la mousse dans les<br />
pelouses, <strong>de</strong>s ro<strong>de</strong>ntici<strong>de</strong>s, <strong>de</strong>s répulsifs, <strong>de</strong>s produits pour la démoustication, <strong>de</strong>s régulateurs<br />
U.P.M.C./U.S. 31<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
<strong>de</strong> croissance, <strong>de</strong>s hormones <strong>de</strong> bouturage, <strong>de</strong>s phéromones pour la confusion sexuelle ou<br />
l’agrégation, <strong>de</strong>s phytoprotecteurs, ainsi qu’une quantité d’adjuvants extemporanés pour<br />
bouillies, <strong>de</strong>s mouillants, <strong>et</strong>c. Par ail<strong>leurs</strong>, les arthropo<strong>de</strong>s auxiliaires proposés à la vente ont<br />
été progressivement soumis à <strong>de</strong>s règles d’AMM <strong>et</strong> s’ajoutent à la liste… C<strong>et</strong>te diversité <strong>de</strong>s<br />
moyens nous conduira parfois à parler <strong>de</strong> « solutions » (produits chimiques <strong>et</strong> autres) ou à<br />
regrouper sous un même objectif (ex : protection contre les ravageurs) <strong>de</strong>s moyens chimiques<br />
ou <strong>biologiques</strong>.<br />
Pendant près <strong>de</strong> cinquante années, le nombre <strong>de</strong>s solutions chimiques ou <strong>biologiques</strong><br />
proposées aux agriculteurs a été constamment à la hausse en raison <strong>de</strong> la créativité <strong>de</strong>s<br />
laboratoires <strong>de</strong> recherche. Ce n’est plus aujourd’hui le cas en dépit du fait que <strong>de</strong> nombreux<br />
auxiliaires (plus <strong>de</strong> 60 en 2008) ont été introduits dans la liste <strong>de</strong>s solutions couvertes par une<br />
AMM (Barrie, E., 2005).<br />
Tableau 1 : Nombre <strong>de</strong> solutions proposées pour la protection <strong>de</strong>s plantes cultivées <strong>et</strong> <strong>de</strong>s<br />
<strong>de</strong>nrées stockées (source : In<strong>de</strong>x phytosanitaires <strong>de</strong>s années correspondantes. Les digressions<br />
sur 2010 prennent en compte <strong>de</strong>s données officielles publiées à ce jour.)<br />
1965 1970 1980 1990 2000 2008 2010<br />
183 250 330 463 570 506 +/- 400<br />
La pharmacopée française reste une <strong>de</strong>s plus mo<strong>de</strong>rnes du mon<strong>de</strong>. Si on considère par<br />
exemple la catégorie <strong>de</strong>s insectici<strong>de</strong>s <strong>et</strong> acarici<strong>de</strong>s, on constate que plus <strong>de</strong> la moitié <strong>de</strong>s<br />
solutions chimiques a été inscrite après 1990. Pour c<strong>et</strong>te catégorie, on peut prévoir que sur les<br />
70 molécules autorisées en 1965, il n’en subsistera plus que 4 ou 5 sur le marché en 2010 ; <strong>de</strong><br />
même, sur les 103 molécules autorisées en 1980, il n’en subsistera plus qu’une quinzaine à la<br />
même époque. Le renouvellement qui a concerné les produits <strong>de</strong> synthèse touche aussi les<br />
produits dits « naturels » puisque la nicotine <strong>et</strong> la roténone utilisés avant 1940 ont fait elles<br />
aussi l’obj<strong>et</strong> <strong>de</strong> mesures <strong>de</strong> r<strong>et</strong>rait. Ce rajeunissement est sensiblement le même dans l’univers<br />
<strong>de</strong>s herbici<strong>de</strong>s <strong>et</strong> dans celui <strong>de</strong>s fongici<strong>de</strong>s, malgré la place importante qu’occupent toujours<br />
les sels <strong>de</strong> cuivre <strong>et</strong> le soufre (Bernard, J-L., 2008).<br />
U.P.M.C./U.S. 32<br />
2010
2. Les <strong>composés</strong> <strong>organométalliques</strong><br />
2.1. Introduction<br />
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
Le terme « chimie bioorganom<strong>et</strong>allique » a été appliquée la première fois, en 1985, à la<br />
synthèse <strong>et</strong> à l'étu<strong>de</strong> <strong>de</strong>s espèces <strong>organométalliques</strong> d'intérêt biologique <strong>et</strong> médical<br />
(Jaouen, G. <strong>et</strong> Vessières, A., 1985 ; Top, S. <strong>et</strong> al., 1985).<br />
L'idée <strong>de</strong> combiner les composants <strong>organométalliques</strong> <strong>et</strong> <strong>biologiques</strong> naturellement s'était<br />
produite avant par un certain nombre <strong>de</strong> chercheurs, avec <strong>de</strong>s résultats variables. A c<strong>et</strong><br />
égard, il est remarquable qu'un <strong>de</strong>s facteurs menant à l'explosion du champ ait été<br />
l'arrangement augmenté du lien <strong>de</strong> métal-carbone (MC). Les résultats <strong>de</strong> toutes les étu<strong>de</strong>s<br />
faites jusqu’ici, y compris la structure <strong>de</strong> la vitamine B12, ne prennent en considération que<br />
les liaisons σ (Hodgkin, D. C., 1965 ; Lenhert, P. G., 1968 ; Kaim, W. <strong>et</strong> Schwe<strong>de</strong>rski, B.,<br />
1994). Cependant, suite à la découverte du ferrocène <strong>et</strong> <strong>de</strong> sa structure <strong>de</strong> sandwich (Kealy,<br />
T. J. <strong>et</strong> Pauson, P. L., 1951 ; Wilkinson, G. <strong>et</strong> al., 1952 ; Cotton, F. A., 2001), nous voyons<br />
l'établissement d'une base théorique pour l'arrangement <strong>de</strong> nouveaux types <strong>de</strong> liens <strong>de</strong> MC<br />
(σ, π <strong>et</strong> δ) comme, par exemple, ceux <strong>de</strong>s m<strong>et</strong>allocènes, <strong>de</strong>s carbonyles métalliques ou <strong>de</strong>s<br />
carbènes en métal.<br />
Figure 6 : Composés <strong>organométalliques</strong> <strong>de</strong> transition métallique (Jaouen, G. <strong>et</strong> al., 2006)<br />
U.P.M.C./U.S. 33<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
C<strong>et</strong>te diversité structurale a fourni une richesse <strong>de</strong> la nouvelle réactivité pour les<br />
chercheurs chimiques <strong>et</strong> a provoqué le développement <strong>de</strong> la chimie organométallique <strong>de</strong><br />
transition-métal généralement <strong>et</strong> plus tard à la chimie bioorganom<strong>et</strong>allique comme nous la<br />
connaissons aujourd'hui (Cotton, F. A. <strong>et</strong> Wilkinson, G., 1962 ; Crabtree, R. H., 1994 ;<br />
Elschenbroich, C. <strong>et</strong> Salzer, A., 1989).<br />
L'expansion récente a été rapi<strong>de</strong> <strong>et</strong> au moins cinq champs d'activité importants peuvent<br />
maintenant être i<strong>de</strong>ntifiés (Figure 7).<br />
Figure 7 : Les principaux axes <strong>de</strong> recherche dans la chimie bioorganométallique<br />
(Jaouen, G. <strong>et</strong> al., 2006)<br />
Bien que les <strong>composés</strong> <strong>organométalliques</strong> soient omniprésents dans la nature, <strong>de</strong>s<br />
<strong>composés</strong> <strong>organométalliques</strong> synthétiques sont généralement considérés toxiques ou non<br />
compatibles avec les systèmes <strong>biologiques</strong>. En dépit <strong>de</strong> c<strong>et</strong>te perception les propriétés<br />
médicinales <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> <strong>organométalliques</strong>, en particulier les <strong>composés</strong> en métal<br />
d'organo-transition, ont été sondés pendant longtemps <strong>et</strong> dans les <strong>de</strong>rnières années le<br />
secteur s'est développé considérablement. Dans ce qui suit, l’historique, les propriétés<br />
médicinales <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> <strong>organométalliques</strong> ainsi que les défis qu’ils rencontrent seront<br />
passés en revue, avec <strong>de</strong>s applications notables dans le traitement <strong>et</strong> le diagnostic du cancer<br />
<strong>et</strong> dans le traitement <strong>de</strong>s infections virales, fongiques, bactériennes <strong>et</strong> parasites.<br />
U.P.M.C./U.S. 34<br />
2010
2.2. Historique<br />
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
Les <strong>composés</strong> inorganiques (complexes en métal) ont été employés pour traiter diverses<br />
maladies pendant <strong>de</strong>s siècles. Il y a environ 5000 ans, les Egyptiens avaient l'habitu<strong>de</strong><br />
d’utiliser le cuivre pour stériliser l'eau. De l'or a été également employé pour <strong>de</strong>s<br />
raisons médicales en Arabie <strong>et</strong> en Chine, mais c<strong>et</strong>te pratique a émané <strong>de</strong> la valeur du<br />
métal pur plutôt que <strong>de</strong>s eff<strong>et</strong>s thérapeutiques connus. En revanche, l'introduction <strong>de</strong>s<br />
complexes inorganiques comme thérapies a été basée sur un eff<strong>et</strong> médicinal observé. Deux<br />
<strong>de</strong>s premiers remè<strong>de</strong>s inorganiques utilisés ont comporté l'utilisation du chlorure<br />
mercureux comme complexes diurétiques, <strong>et</strong> du fer comme complément minéral <strong>de</strong>puis<br />
environs 500 ans. Plus récemment, <strong>de</strong>s complexes d'or ont été employés comme antibactériens,<br />
en particulier pour le traitement <strong>de</strong> la tuberculose au début du 20ème siècle. D'autres drogues<br />
inorganiques traditionnelles incluent l'utilisation <strong>de</strong>s complexes arsenicaux, tels que<br />
l'arsephenamaine, pour traiter la syphilis (Albert, A., 1985) <strong>et</strong> l'antimoine pour le traitement<br />
<strong>de</strong> la leishmaniose.<br />
2.2.1. Origine <strong>de</strong>s complexes <strong>organométalliques</strong><br />
L'industrie pharmaceutique est à l'heure actuelle dans une accalmie relative dans sa recherche<br />
continue <strong>de</strong> molécules véritablement innovatrices <strong>et</strong> thérapeutiquement utiles. Après le<br />
témoignage du succès incroyable <strong>de</strong>s antibiotiques, <strong>et</strong> en attendant l'accomplissement <strong>de</strong>s<br />
espoirs placés sur la thérapie génique, il est important <strong>de</strong> continuer la recherche <strong>de</strong><br />
concepts innovateurs. L'étu<strong>de</strong> <strong>de</strong>s utilisations <strong>de</strong>s complexes <strong>organométalliques</strong> dans la<br />
mé<strong>de</strong>cine est l'une <strong>de</strong> ces approches innovatrices, dûe à la réactivité peu commune <strong>de</strong> ces<br />
entités. Vue <strong>de</strong> c<strong>et</strong> angle, la chimie organométallique a eu une genèse appropriée, résultant <strong>de</strong><br />
l'esprit d'un pharmacien distingué <strong>de</strong> l'éclaircissement, contemporain <strong>de</strong> Priestley <strong>et</strong> <strong>de</strong><br />
Lavoisier.<br />
Louis-Clau<strong>de</strong> Ca<strong>de</strong>t <strong>de</strong> Gassicourt (1713-1799) ne saura jamais qu’il est maintenant<br />
considéré comme le père <strong>de</strong> la chimie organométallique. Le 27 août 1758, il a soumis un<br />
papier à l'Académie Royale <strong>de</strong>s Sciences qui traitait « le liqui<strong>de</strong> <strong>de</strong> Ca<strong>de</strong>t ém<strong>et</strong>tant <strong>de</strong> la<br />
vapeur » (Ca<strong>de</strong>t’s fuming liquid), <strong>et</strong> qui a été édité en 1760. Ce liqui<strong>de</strong> brun lourd est<br />
fortement toxique, sent fortement <strong>de</strong> l'ail, <strong>et</strong> s’enflamme spontanément une fois exposé à<br />
l'air. Il comprend principalement l'oxy<strong>de</strong> <strong>de</strong> cacodyl (Me2As)2O, mais contient<br />
U.P.M.C./U.S. 35<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
également d'autres <strong>composés</strong> <strong>de</strong> cacodyl, tels que le dicacodyl (Me2As)2. Pour <strong>de</strong>s raisons<br />
personnelles, ca<strong>de</strong>t n’est jamais revenu à ce travail séminal.<br />
Figure 8 : Réaction <strong>de</strong> Ca<strong>de</strong>t (Jaouen, G. <strong>et</strong> al., 2006)<br />
Aux jours <strong>de</strong> Ca<strong>de</strong>t il n'y avait aucune manière d'expliquer c<strong>et</strong>te réaction, obtenue en distillant<br />
un mélange d'oxy<strong>de</strong> d’arsenic <strong>et</strong> d’acétate <strong>de</strong> potassium, dans le cadre d'une étu<strong>de</strong> sur les<br />
encres invisibles. En fait, ce n’est que presque 80 ans après, avec le travail <strong>de</strong> Bunsen (1811-<br />
1899), que l'explication était trouvée : Les conditions <strong>de</strong> réaction ont mené à la production<br />
<strong>de</strong>s « Cacodyls » (Thayer, J.S., 1975 ; Torau<strong>de</strong>, L.G., 1920). Cacodyl est dérivé du grecque<br />
« Kako<strong>de</strong>s » <strong>et</strong> signifiant « o<strong>de</strong>ur désagréable ». En 1834, l'administration <strong>de</strong> l'Ecole<br />
Polytechnique, située au centre <strong>de</strong> Paris, a interdit à J.B. Dumas, <strong>de</strong> poursuivre ses<br />
recherches sur le liqui<strong>de</strong> ém<strong>et</strong>tant <strong>de</strong> la vapeur. L'université <strong>de</strong> Marburg était<br />
légèrement plus serviable <strong>et</strong> a permis à Bunsen d'employer une cabine <strong>de</strong> chasse au milieu<br />
<strong>de</strong>s bois pour étudier ces espèces <strong>de</strong> cacodyl <strong>de</strong> 1837 à 1842, <strong>et</strong> ainsi i<strong>de</strong>ntifier leur nature<br />
organométallique, c-à-d la présence d’un lien direct <strong>de</strong> M-C (Thayer, J.S., 1975 ; Bunsen,<br />
R.W., 1842 ; Cullen, W.R., 1966 ; Dumas, J.B., 1882).<br />
Plus tard, un certain nombre <strong>de</strong> dérivés <strong>de</strong> cacodyl ont été découverts, notamment, les cacodylates<br />
utilisés dans la première moitié du 20 ème siècle comme tonifiants <strong>et</strong> fortifiants pour les cas où il<br />
y a un abaissement <strong>de</strong>s niveaux d'hémoglobine (tuberculose, sclérose en plaques,<br />
paludisme, <strong>et</strong>c.) (Torau<strong>de</strong>, L.G., 1920).<br />
2.2.2. Les premiers remè<strong>de</strong>s organométallique efficaces<br />
Les eff<strong>et</strong>s négatifs <strong>de</strong> l'arsenic ont été connus à travers l'histoire. Au 17 ème siècle, l'arsenic<br />
blanc (As2O3), a acquis en France le nom <strong>de</strong> « poudre <strong>de</strong> succession ». Des avances en chimie<br />
organométallique ont été faites tout au long du 19 ème siècle en Europe. Par exemple, Bunsen <strong>et</strong><br />
Frankland ont décrit <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> alcoylés d’arisines <strong>et</strong> <strong>de</strong> mercure, Löwig a synthétisé<br />
(C2H5)4Pb, Frie<strong>de</strong>l <strong>et</strong> Crafts ont étudié les organochlorosilanes, <strong>et</strong> Schützenberger a préparé<br />
[Pt(CO)Cl2] 2.. Ces rapports ont mené Ehrlich (1854-1915) <strong>et</strong> d'autres à se rendre compte que<br />
les <strong>composés</strong> <strong>organométalliques</strong> <strong>de</strong> l'arsenic pourraient être moins toxiques, <strong>et</strong> plus facile à<br />
U.P.M.C./U.S. 36<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
manœuvrer, que <strong>leurs</strong> analogues inorganiques. L'idée était originale <strong>et</strong> son exécution a exigé<br />
la collaboration d'un chimiste, Bertheim, <strong>et</strong> d’un biologiste, Sacachiro Hata. L'application<br />
médicale systématique <strong>de</strong>s organoarsenicaux en tant qu'agents antiparasitaires était due à la<br />
persévérance <strong>de</strong> Paul Ehrlich, auquel a été attribué le prix Nobel en 1908 (Himmelweit, F.,<br />
1960 ; Mann, J., 1999 ; Moore, J.E., 1941 ; Raiziss, G.W. <strong>et</strong> Gavron, J.L., 1923).<br />
De tous les <strong>composés</strong> préparé avant 1909, un produit s’est avéré être particulièrement<br />
efficace contre la syphilis <strong>et</strong> a été commercialisé comme Salvarsan® en Europe <strong>et</strong> connu sur<br />
le marché comme Arsphenamine aux Etats-Unis. (Figure 9)<br />
Figure 9 : Structure chimique du Salvarsan2, NeoSalvarsan3, Mapharsen4 <strong>et</strong> Melarsoprol5<br />
(Jaouen, G. <strong>et</strong> al., 2006)<br />
Salvarsan (2) est rapi<strong>de</strong>ment <strong>de</strong>venu le médicament <strong>de</strong> choix pour le traitement <strong>de</strong> la syphilis,<br />
dont les ravages à ce moment-là pourraient être comparés à ceux du SIDA aujourd'hui.<br />
Salvarsan n'est pas facilement soluble dans l’eau <strong>et</strong> son chlorhydrate s’est avéré aussi toxique<br />
pour l'usage médical. Salvarsan a été donc dissous dans une solution basique <strong>et</strong> administré<br />
sous c<strong>et</strong>te forme (Moore, J.E., 1941). Un peu plus tard, NeoSalvarsan® (le<br />
neoarsphenamine 3), un dérivé hydrosoluble, a résolu c<strong>et</strong>te difficulté (Moore, J.E., 1941).<br />
Cependant, Salvarsan <strong>et</strong> NeoSalvarsan s'oxy<strong>de</strong>nt dans l’air, <strong>et</strong> doivent être stockés dans <strong>de</strong>s<br />
ampoules scellées sous une atmosphère d'azote.<br />
Après la mort d'Ehrlich en 1915, les recherches sur les organoarsenicaux se sont<br />
poursuivies, <strong>et</strong> on a découvert que dans le corps, Salvarsan s’oxy<strong>de</strong> en chlorhydrate<br />
U.P.M.C./U.S. 37<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
d’oxophenarsine (4) (mis sur le marché comme Mapharsen®). Puisque ce composé était<br />
stable dans l’air, il a graduellement remplacé Salvarsan pour l'usage thérapeutique, au point<br />
où il est <strong>de</strong>venu le médicament organoarsenique prédominant pendant les années 30.<br />
Mapharsen <strong>et</strong> d'autres analogues arsenicaux ont servi à l'utilisation thérapeutique tout au<br />
long <strong>de</strong>s années 40 mais ont été graduellement remplacés par la pénicilline sans disparaître<br />
complètement du marché. En eff<strong>et</strong>, ils sont toujours utilisés en mé<strong>de</strong>cine vétérinaire pour<br />
<strong>leurs</strong> propriétés antiparasitaires <strong>et</strong> leur activité antivirale a été récemment étudiée (Jaouen,<br />
G. <strong>et</strong> al., 2006).<br />
Un autre composé notable, le Melarsoprol 5 (Arsobal®), est utilisé dans le traitement <strong>de</strong> la<br />
maladie du sommeil (Robertson, D.W., 1963 ; Schmid, B. <strong>et</strong> al., 2004), <strong>et</strong> avec d'autres<br />
<strong>composés</strong> <strong>de</strong> la même série sont également efficaces dans le traitement <strong>de</strong> la leucémie<br />
aigue réfractaire (Astier, A. <strong>et</strong> Gibaud, S., 2003 ; Konig, A. <strong>et</strong> al., 1997 ; Wang, Z.G. <strong>et</strong> al.,<br />
1998).<br />
Le Mercure a été employé dans la mé<strong>de</strong>cine <strong>de</strong>puis l'époque <strong>de</strong>s anciens Grecs, <strong>et</strong> il est<br />
décrit par Avicenne dans les Moyens Âges (980-1037) comme traitement contre les poux <strong>et</strong><br />
les scabies. Même dans ces pério<strong>de</strong>s, la toxicité à long terme du mercure a été connue<br />
(Carraher, C.E. <strong>et</strong> Pittman, C.U., 2004), dans la mesure où l'espérance <strong>de</strong> vie <strong>de</strong>s criminels<br />
employés dans les mines <strong>de</strong> cinabre <strong>de</strong> l'Espagne par les Romains était très réduite.<br />
Les idées <strong>de</strong> Paracelsus (1493-1541) exprimées à l'université <strong>de</strong> Bâle, sont souvent citées au<br />
suj<strong>et</strong> <strong>de</strong> la nature <strong>de</strong> la toxicité : Paracelsus a écrit, « Alle Ding sind Gift und nichts ohn Gift;<br />
alein die Dosis macht das ein Ding kein Gift ist » [Rien n’est poison, tout est poison, c’est la<br />
dose qui fait le poison]. Ainsi, toute nourriture <strong>et</strong> toute boisson est un poison si elle est<br />
consommée dans <strong>de</strong>s quantités au <strong>de</strong>là <strong>de</strong> l'utilisation normale. » (Carraher, C.E. <strong>et</strong> Pittman,<br />
C.U., 2004 ; Holmstedt, B. <strong>et</strong> Liljestrand, G., 1981). Sur c<strong>et</strong>te base, il a recommandé<br />
l'utilisation <strong>de</strong>s complexes inorganiques en métal pour <strong>de</strong>s buts médicaux, y compris les<br />
<strong>composés</strong> d'arsenic <strong>et</strong> <strong>de</strong> mercure.<br />
Il y a un parallèle historique entre les <strong>composés</strong> <strong>de</strong> mercure <strong>et</strong> ceux <strong>de</strong> l'arsenic, <strong>et</strong> ce en<br />
termes du changement progressif <strong>de</strong> l'approche inorganique à la chimie organométallique,<br />
<strong>et</strong> à l'utilisation <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> 6 <strong>et</strong> 7 comme médicaments (Figure 10).<br />
U.P.M.C./U.S. 38<br />
2010
Figure 10 : Structure chimique du mercurochrome 6 <strong>et</strong> du merthiolate 7<br />
(Jaouen, G. <strong>et</strong> al., 2006)<br />
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
Les <strong>composés</strong> organomercureux sont considérés, aujourd’hui, <strong>de</strong> peu d'intérêt thérapeutique,<br />
bien que le mercurochrome <strong>et</strong> le merthiolate soient encore employés en tant qu'antiseptiques<br />
locaux doux. La tendance commune pour les <strong>composés</strong> <strong>de</strong> ce type est leur prescription en<br />
tant qu'antibiotiques externes plutôt que pour l'usage interne.<br />
2.3. Propriétés médicinales <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> organométallique<br />
En plus <strong>de</strong> l'explosion dans le potentiel synthétique donné à la chimie organométallique par<br />
l'éventail <strong>de</strong> nouveaux groupes fonctionnels découverts dans la <strong>de</strong>uxième moitié du 20 ème<br />
siècle (Figure 6), l'autre événement fondamental qui a relancé le champ <strong>de</strong>s médicaments<br />
basés sur les métaux est directement attribuable à Rosenberg. Il a découvert l’eff<strong>et</strong> antitumoral<br />
du cisplatine (8), qui est une drogue véritablement remarquable <strong>et</strong> qui pendant les trente<br />
<strong>de</strong>rnières années a été utilisée pour soigner plus <strong>de</strong> 70% <strong>de</strong> tous les mala<strong>de</strong>s du cancer. Il<br />
est toujours utilisé, particulièrement pour le traitement <strong>de</strong>s carcinomes testiculaires,<br />
ovariens, oro-pharyngés, bronchogénique, du lymphome <strong>et</strong> du mélanome (Reedijk, J., 1996 ;<br />
Wong, E. <strong>et</strong> Giandomenico, C.M., 1999). Le composé avait été synthétisé en 1844 par<br />
Peyrone (Peyrone, M., 1844) <strong>et</strong> ce n’est que 120 ans après que Rosenberg a révélé ses<br />
propriétés (Rosenberg, B. <strong>et</strong> al., 1965 ; Rosenberg, B. <strong>et</strong> al., 1969). Jusqu'ici, environ 20000<br />
articles sur <strong>de</strong>s complexes <strong>de</strong> platine ont été édités <strong>et</strong> en dépit <strong>de</strong> c<strong>et</strong> énorme volume <strong>de</strong><br />
travail, les seuls complexes inorganiques approuvés pour l'usage clinique en tant que drogues<br />
antitumorales sont cisplatine (8), carboplatine (9), nedaplatine (10), <strong>et</strong> oxaliplatine (11)<br />
(cancer colorectal) (Figure 11).<br />
U.P.M.C./U.S. 39<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
Figure 11 : Structure chimique du Cisplatine8, Carboplatine9, Nedaplatine10, Oxaplatine11<br />
(Jaouen, G. <strong>et</strong> al., 2006)<br />
Bien qu'efficace, il y a un certain nombre <strong>de</strong> problèmes liés au cisplatine, tel que sa<br />
toxicité générale élevée qui a comme conséquence beaucoup d'eff<strong>et</strong>s secondaires non<br />
désirés <strong>et</strong> son inefficacité à l’égard <strong>de</strong> plusieurs malignités communes telles que les<br />
carcinomes <strong>de</strong> poumon <strong>et</strong> les adénocarcinomes <strong>de</strong>s <strong>de</strong>ux points <strong>et</strong> du rectum (Sava, G., 1999).<br />
La résistance au médicament acquise est également un problème, <strong>et</strong> les cancers résistants<br />
à la cisplatine sont souvent responsables <strong>de</strong> la mortalité par cancer. Tous ces problèmes,<br />
liés à l'utilisation <strong>de</strong> la cisplatine ont conduit le développement <strong>de</strong> nouvelles thérapies<br />
inorganiques anticancéreuses.<br />
En dépit d'un effort massif <strong>de</strong> recherches, les détails exacts du mécanisme <strong>de</strong> l'activité <strong>de</strong> la<br />
cisplatine est une question <strong>de</strong> discussion, mais l'ADN est largement accepté pour être la<br />
cible <strong>de</strong> c<strong>et</strong>te drogue <strong>et</strong> <strong>de</strong> l'ADN platiné a été isolée dans les biopsies <strong>de</strong> tumeur <strong>de</strong><br />
patients soignés.<br />
En plus <strong>de</strong> l'affinité <strong>de</strong> la cisplatine à se lier à l'ADN, c<strong>et</strong>te drogue se lie également<br />
réversiblement aux groupes <strong>de</strong> thiol <strong>de</strong>s protéines. En eff<strong>et</strong>, ce type d'interaction est<br />
susceptible <strong>de</strong> se produire dans le sang, où les protéines comme la transferrine <strong>et</strong><br />
l'albumine peuvent transporter la drogue sous une forme soluble.<br />
Puisque la cisplatine a été une drogue si réussie, beaucoup <strong>de</strong> chercheurs avaient l'habitu<strong>de</strong><br />
<strong>de</strong> prendre c<strong>et</strong>te molécule comme point <strong>de</strong> départ pour concevoir <strong>de</strong> nouvelles thérapies. En<br />
conséquence, les premiers remè<strong>de</strong>s alternatifs à la cisplatine ont étroitement ressemblé à la<br />
molécule, avec les groupes coordonnés d'amine dans une géométrie cis <strong>et</strong> le platine dans<br />
l'état d'oxydation <strong>de</strong> +II, provoquant les analogues <strong>de</strong> cisplatine <strong>de</strong> <strong>de</strong>uxième génération<br />
U.P.M.C./U.S. 40<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
utilisés maintenant cliniquement, qui incluent le carboplatine, le nedaplatine <strong>et</strong> l'oxaliplatine<br />
(Figure 11 9-11, respectivement).<br />
La découverte <strong>de</strong> nouvelles thérapies <strong>de</strong> cancer a été conduite pour surmonter le problème<br />
<strong>de</strong> la résistance aux drogues <strong>et</strong> réduire la toxicité élevée <strong>de</strong>s traitements existants. Des<br />
efforts semblables ont été appliqués à d'autres secteurs <strong>de</strong> chimie inorganique médicinale. Par<br />
exemple, la résistance du parasite qui cause le paludisme, Plasmodium falciparum, à la<br />
chloroquine a mené au développement <strong>de</strong>s dérivés inorganique <strong>de</strong> chloroquine, y compris<br />
le complexe <strong>de</strong> chloroquine, triphenylphosphinegold (I) qui a une activité thérapeutique<br />
neuf fois plus élevée contre les souches humaines <strong>de</strong> Plasmodium résistantes à la<br />
chloroquine que le diphosphate <strong>de</strong> chloroquine (Navarro, M. <strong>et</strong> al., 1937). Des stratégies<br />
semblables ont été employées pour reconstituer l'activité d'autres drogues antiparasitaires<br />
<strong>et</strong> antibiotiques où la résistance est maintenant un problème.<br />
Quelques applications thérapeutiques ou <strong>de</strong> diagnostiques <strong>de</strong>s complexes métalliques sont<br />
énumérées dans le tableau 2. Il faut noter qu'aucun <strong>de</strong>s complexes basés sur les métaux<br />
énumérés dans le tableau 2 n'est un composé organométallique, c-à-d., avec un lien direct<br />
métal-carbone. Nous nous rendons compte qu'à l’exception <strong>de</strong> la ferrocérone qui a été<br />
utilisée en URSS pour traiter les anémies en fer, aucun composé en métal d'organo-<br />
transition n’est actuellement employé cliniquement ; cependant, il y a un intérêt<br />
considérable <strong>et</strong> croissant pour les propriétés médicinales <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> <strong>organométalliques</strong> <strong>et</strong><br />
plusieurs résultats <strong>de</strong> tests cliniques sont prom<strong>et</strong>teurs. Les réactions catalysées par le<br />
palladium sont employées couramment dans la fabrication <strong>de</strong>s produits pharmaceutiques, <strong>et</strong><br />
tandis que le palladium résiduel doit être très bas, <strong>de</strong>s traces moindres que 5 ppm sont souvent<br />
présentes, certaines entre elles sont susceptibles d'être <strong>de</strong>s intermédiaires d’organo-palladium<br />
(Garr<strong>et</strong>t, C.E. <strong>et</strong> Prasad, K., 2004). Cependant, ces impur<strong>et</strong>és sont non désirées <strong>et</strong> en<br />
général les <strong>composés</strong> <strong>organométalliques</strong> sont perçus comme toxiques <strong>et</strong> n'ayant pas <strong>de</strong><br />
propriétés médicinales utiles. En dépit <strong>de</strong> c<strong>et</strong>te fausse idée, <strong>de</strong>s espèces <strong>organométalliques</strong><br />
sont souvent formées pendant les processus <strong>biologiques</strong> impliquant <strong>de</strong>s métaux lourds. Dans<br />
le cas du mercure <strong>et</strong> <strong>de</strong> l’étain, les espèces <strong>organométalliques</strong> sont plus toxiques que les<br />
formes inorganiques, tandis que pour l'arsenic <strong>et</strong> le sélénium, les espèces <strong>organométalliques</strong><br />
sont plus aisément éliminées du corps (Templ<strong>et</strong>on, D.M. <strong>et</strong> Fresen, J., 1999). Par<br />
conséquent les drogues <strong>organométalliques</strong> peuvent être moins toxiques <strong>et</strong> plus aisément<br />
traités par le corps que les complexes inorganiques <strong>de</strong> coordination.<br />
U.P.M.C./U.S. 41<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
Tableau 2 : Métaux avec ou potentielle application biomédicinale (Martell, A.E. <strong>et</strong> Hancock,<br />
R.D., 1996 ; Howard-Lock, H.H. <strong>et</strong> Lock, C.J.L., 1987 ; Hughes, M.N.,1987 ; Bertini, I. <strong>et</strong> al.,<br />
1994)<br />
Métal Applications<br />
Arsenic Syphilis, ulcères, maladies parasitaires, Leucémie Aiguë Promyélocytaire<br />
Aluminium Antiaci<strong>de</strong>, <strong>de</strong>rmatologie, hyperphosphatémie<br />
Antimoine Leishmaniase<br />
Baryum Agents <strong>de</strong> diagnostic<br />
Bismuth Désordres gastro-intestinaux, syphilis, angine, a<strong>de</strong>notonsillectomie<br />
Cuivre<br />
Agents <strong>de</strong> diagnostic <strong>et</strong> d’imagerie, produits radiopharmaceutiques,<br />
thérapie photodynamique, la maladie <strong>de</strong> Menkès<br />
Chrome Agent <strong>de</strong> diagnostique, diabète<br />
Calcium Hyperphosphatémie<br />
Cobalt Agents <strong>de</strong> diagnostic <strong>et</strong> d’imagerie, thérapie photodynamique<br />
Fer thérapie photodynamique, hypotension, Hyperphosphatémie<br />
Gadolinium Agents <strong>de</strong> diagnostic <strong>et</strong> d’imagerie<br />
Gallium Agents <strong>de</strong> diagnostic <strong>et</strong> d’imagerie, cancer<br />
Germanium Cancer<br />
Or<br />
Rhumatisme articulaire, asthme bronchique, paludisme,<br />
bactériennes, cancer, infections virales incluant le SIDAS<br />
infections<br />
Holmium Produits radiopharmaceutiques<br />
Indium Agents <strong>de</strong> diagnostic <strong>et</strong> d’imagerie<br />
Plomb Traitement d'ulcère<br />
Lithium Psychoses dépressives maniaques <strong>et</strong> infections virales incluant le SIDA<br />
Magnésium Antiaci<strong>de</strong>, laxatif, Hyperparathyroïdie<br />
Manganèse Thérapie photodynamique<br />
Mercure Diurétique, infections microbiennes, <strong>de</strong>rmatologie (syphilis), arrêt du cœur<br />
Molybdène La maladie <strong>de</strong> Menkès<br />
Palladium Thérapie photodynamique, cancer, HIV<br />
Platine<br />
Cancer, thérapie photodynamique, infections microbiennes, infections<br />
virales incluant le SIDA<br />
Rhodium Leishmaniase, radiothérapie, infections bactériennes<br />
Ruthénium<br />
paludisme, cancer, maladie <strong>de</strong> Chagas, infections bactériennes, choc<br />
septique, HIV<br />
Rhénium Agents <strong>de</strong> diagnostic <strong>et</strong> d’imagerie, radiothérapie<br />
Argent<br />
Strontium,<br />
Radium,<br />
Plutonium,<br />
Samarium<br />
infections bactériennes, infections fongiques, <strong>de</strong>rmatologie, Agents <strong>de</strong><br />
diagnostic <strong>et</strong> d’imagerie<br />
Produits radiopharmaceutiques<br />
Etain Produits radiopharmaceutiques, thérapie photodynamique<br />
Thallium Agents <strong>de</strong> diagnostic <strong>et</strong> d’imagerie<br />
Technétium Agents <strong>de</strong> diagnostic <strong>et</strong> d’imagerie<br />
Vanadium Imitateurs d'insuline<br />
Yttrium Agents <strong>de</strong> diagnostic <strong>et</strong> d’imagerie, radio-immunothérapie<br />
Zinc Thérapie photodynamique, la maladie <strong>de</strong> Menkès, <strong>de</strong>rmatologie, HIV<br />
U.P.M.C./U.S. 42<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
L'impulsion pour rechercher <strong>de</strong>s complexes anticancéreux autres que ceux du platine<br />
provient <strong>de</strong> ses divers inconvénients, y compris la résistance cellulaire au platine qui<br />
s’observe parfois lors <strong>de</strong> son utilisation clinique, les eff<strong>et</strong>s secondaires toxiques <strong>de</strong> la<br />
cisplatine 8, qui peuvent être graves <strong>et</strong> son spectre limité d'activité contre certains types <strong>de</strong><br />
cancer (Lippert, B., 1999). Afin d'essayer <strong>de</strong> surmonter ces difficultés, en particulier celles<br />
liées à la toxicité générale, la possibilité d'employer les complexes inorganiques d'autres<br />
métaux a été explorées. A c<strong>et</strong>te fin, les complexes <strong>de</strong> ruthénium, un métal avec <strong>de</strong>s propriétés<br />
semblables au fer, semblent particulièrement attrayants. Par exemple, le sel <strong>de</strong> ruthénium<br />
(III), 12 (NAMI-A), [ImH] + [trans-RuCl4(dmso)Im] – , imidazolium trans-<br />
imidazole(dim<strong>et</strong>hylsulfoxi<strong>de</strong>)t<strong>et</strong>rachlororuthenate (Figure 12), a démontré une activité<br />
antim<strong>et</strong>astatique intéressante tout en possédant une basse toxicité in vivo (Carmona, D. <strong>et</strong> al.,<br />
2002 ; Vel<strong>de</strong>rs, A.H. <strong>et</strong> al., 2004). Les tests cliniques <strong>de</strong> la phase I indiquent qu'elle est bien<br />
tolérée par les suj<strong>et</strong>s humains (Bergamo, A. <strong>et</strong> al., 2004).<br />
Figure 12 : Structure chimique <strong>de</strong> NAMI-A, 12 <strong>et</strong> du dichlorure <strong>de</strong> Titanocene, 13<br />
(Jaouen, G. <strong>et</strong> al., 2006)<br />
Parallèlement aux étu<strong>de</strong>s effectuées en chimie <strong>de</strong> coordination, les complexes<br />
<strong>organométalliques</strong> du même type ont également été l’obj<strong>et</strong> d'effort considérable, en<br />
particulier ceux <strong>de</strong> la série <strong>de</strong> m<strong>et</strong>allocène avec <strong>de</strong>s métaux tels que le Ti, Fe, Mo, V, Re, Co<br />
<strong>et</strong> Ru. Le dichlorure <strong>de</strong> titanocène, 13, est un analogue structural <strong>de</strong> la cisplatine 8.. Ce<br />
U.P.M.C./U.S. 43<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
complexe organométallique 13 a été testé cliniquement <strong>et</strong> était censé réagir avec <strong>de</strong> l'ADN<br />
d'une façon semblable à la cisplatine. Cependant il est difficile <strong>de</strong> formuler ce complexe<br />
pour l'administration en raison <strong>de</strong> son hydrolyse rapi<strong>de</strong>. Les tests cliniques n’étaient pas<br />
encourageants <strong>et</strong> les essais ont été abandonnés. Il est à noter également que les produits Ti<br />
(IV) résultant du procédé d'hydrolyse montrent un fort eff<strong>et</strong> prolifératif dans les cancers du<br />
sein hormono-dépendants (Top, S. <strong>et</strong> al., 2002). La recherche continue, cependant, en<br />
utilisant <strong>de</strong>s complexes titaniques à ligands particulièrement robustes (Tacke (a), M. <strong>et</strong> al.,<br />
2004 ; Tacke (b), M. <strong>et</strong> al., 2004). Une approche courante, dans le but d'abaisser la toxicité <strong>de</strong><br />
ces drogues métalliques, est basée sur le changement du métal central. Les complexes<br />
<strong>organométalliques</strong> du « Ru » confirment <strong>leurs</strong> premiers résultats prom<strong>et</strong>teurs. En<br />
particulier, les complexes en moitié-sandwich, tels que les systèmes (η6-arene)Ru (II) 14<br />
<strong>et</strong> 15 montrés dans la figure 13, montrent seulement une basse toxicité générale (Allardyce, C.<br />
S. <strong>et</strong> al., 2001 ; Wand, F. <strong>et</strong> al., 2002).<br />
Figure 13 : Complexes <strong>organométalliques</strong> <strong>de</strong> ruthenium (Jaouen, G. <strong>et</strong> al., 2006)<br />
Le complexe 14 montre une activité anticancéreuse prom<strong>et</strong>teuse in vitro <strong>et</strong> in vivo, y<br />
compris contre les lignées cellulaires résistantes à la cisplatine (Allardyce, C.S. <strong>et</strong> al., 2001).<br />
De tels complexes <strong>organométalliques</strong> offrent beaucoup <strong>de</strong> possibilités pour l'optimisation <strong>de</strong><br />
l'activité biologique en changeant l'arène coordonné, le ligand chélaté <strong>et</strong> le chlorure<br />
partant du groupe. La molécule 15 montre <strong>de</strong>s propriétés antimicrobiennes <strong>et</strong> <strong>de</strong>s propriétés<br />
<strong>de</strong> liage dépendant du pH (Allardyce, C.S. <strong>et</strong> al., 2003).<br />
Une revue sur l’utilisation <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> <strong>organométalliques</strong> en chimiothérapie a été<br />
récemment publiée par Chavain <strong>et</strong> Biot (Chavain, N. <strong>et</strong> Biot, C., 2010).<br />
U.P.M.C./U.S. 44<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
2.4. Les <strong>composés</strong> <strong>organométalliques</strong> dérivés du férrocène <strong>et</strong> leur utilisations<br />
2.4.1. Utilisation <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> <strong>organométalliques</strong> dérivés du ferrocène<br />
Pendant les quatre <strong>de</strong>rnières décennies, l’activité médicinale <strong>de</strong> milliers <strong>de</strong> drogues<br />
inorganiques a été examinée sur diverses maladies, mais seulement une poignée a passé à<br />
l’utilisation clinique. Pendant le processus <strong>de</strong> dépistage il est ressorti que les p<strong>et</strong>ites<br />
différences structurales peuvent n<strong>et</strong>tement changer les propriétés médicinales d'une<br />
potentielle drogue. La raison <strong>de</strong> telles différences est souvent mal comprise, bien que, ces<br />
<strong>de</strong>rnières années, beaucoup <strong>de</strong> progrès ont été accompli. Il est également clairement<br />
apparu que les opportunités qu’offrent les ligands <strong>organométalliques</strong> ne sont pas toujours<br />
possibles avec les drogues basées sur les complexes traditionnels <strong>de</strong> coordination. En<br />
particulier, les complexes <strong>organométalliques</strong> se sont montrés prom<strong>et</strong>teurs en surmontant<br />
différents types <strong>de</strong> résistance aux médicaments, en optimisant la spécificité <strong>de</strong>s médicaments <strong>et</strong><br />
<strong>de</strong> <strong>leurs</strong> cibles <strong>et</strong> en réduisant <strong>de</strong> ce fait les eff<strong>et</strong>s secondaires liés à la chimiothérapie.<br />
Une <strong>de</strong>s façons pour reconstituer l'activité <strong>de</strong>s drogues organiques, pour lesquelles la<br />
résistance a émergé, est <strong>de</strong> modifier sa structure pour contenir un métal, <strong>et</strong> certains <strong>de</strong> ces<br />
<strong>composés</strong> sont <strong>organométalliques</strong>. Dès 1975, on a constaté que la substitution <strong>de</strong>s<br />
groupes aromatiques dans les antibiotiques pénicillines <strong>et</strong> cephalosporine par le<br />
ferrocenyl (Figure 14 a <strong>et</strong> b) donne <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> à activité antibactérienne moins<br />
importante (Edwards, E.I. <strong>et</strong> al., 1975). Le ferrocenyl-pénicilline a montré une activité,<br />
contre diverses souches <strong>de</strong> Staphlococcus dorées, comparable à la benzylpénicilline <strong>et</strong> a<br />
également inhibé la β-lactamase, enzyme responsable <strong>de</strong> la résistance bactérienne à la<br />
pénicilline.<br />
Des dérivés <strong>organométalliques</strong> <strong>de</strong> drogues organiques antiprolifératives ont été employés<br />
pour surmonter la résistance aux médicaments antiparasitaires <strong>et</strong> ce surtout pour les<br />
antipaludiques qui étaient particulièrement bien étudiés puisque presque la moitié <strong>de</strong> la<br />
population mondiale vit sous la menace continue <strong>de</strong> le paludisme (Sturchler, D., 1989). Le<br />
paludisme est une maladie parasitaire provoquée par une <strong>de</strong>s quatre espèces <strong>de</strong> plasmodium<br />
dont le plus grave est le plasmodium falciparum. Il y a <strong>de</strong>ux groupes importants <strong>de</strong><br />
thérapies dont le premier semble viser la synthèse <strong>de</strong> l’aci<strong>de</strong> folinique qui inclut <strong>de</strong>s<br />
<strong>composés</strong> tels que le chloroguani<strong>de</strong>, la pyriméthamine, <strong>et</strong> les sulfonami<strong>de</strong>s. Cependant,<br />
U.P.M.C./U.S. 45<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
ces médicaments nécessitent <strong>de</strong> longues pério<strong>de</strong>s pour montrer un eff<strong>et</strong> ou une résistance<br />
due à la mutation dans les enzymes cible. Le <strong>de</strong>uxième groupe <strong>de</strong> <strong>composés</strong> inclue la<br />
chloroquine, la primaquine, la quinine <strong>et</strong> <strong>leurs</strong> analogues (Muller, R. <strong>et</strong> Baker, J.R., 1990).<br />
Ces drogues montrent une réponse plus rapi<strong>de</strong> comparée au premier groupe <strong>et</strong> seraient<br />
accumulées dans le parasite (Veignie, E. <strong>et</strong> Moreau, S., 1991 ; Krogstad (a <strong>et</strong> b), D.J. <strong>et</strong> al.,<br />
1987), interférant avec la manière dont celui-ci métabolise l’hémoglobine en bloquant la<br />
polymérisation <strong>de</strong> l’hème en hèmozine. L'inhibition <strong>de</strong> ce processus a comme conséquence<br />
l'accumulation <strong>de</strong>s monomères toxiques <strong>de</strong> l’hème qui empoisonnent le parasite (Slater, A.<br />
<strong>et</strong> al., 1991 ; Ling, V. <strong>et</strong> Thompson, L.H., 1974 ; Slater, A.F. <strong>et</strong> Cerami, A., 1992 ; Bendrat,<br />
K. <strong>et</strong> al., 1995 ; Ridley, R. <strong>et</strong> al., 1995). Ces drogues peuvent également changer le pH dans<br />
la vacuole digestive <strong>et</strong> perturber les fonctions enzymatiques (Wernsdorfer, W. <strong>et</strong> McGregor,<br />
I., 1988 ; Fitch, C. <strong>et</strong> al., 1982).<br />
Figure 14 : Composés organométallique d’agents organiques antiprolifératifs connus conçu<br />
pour surmonter la résistance aux médicaments (a ferrocenyl-penicillin <strong>de</strong>rivatives; b ferrocenyl-<br />
cephalosporin <strong>de</strong>rivatives; c rhodium chloroquine complex; d ferrocenyl-chloroquine <strong>de</strong>rivative; e iridium-<br />
COD-pentamidine complex) (Allardyce, C.S. <strong>et</strong> Dyson, P.J., 2006)<br />
U.P.M.C./U.S. 46<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
Les drogues organiques telles que la chloroquine offrent un soulagement rapi<strong>de</strong> contre le<br />
parasite du paludisme. Cependant, la résistance à la chloroquine, qui implique le<br />
mécanisme <strong>de</strong> prise (Sanchez, C. <strong>et</strong> al., 1997) <strong>et</strong> du flux <strong>de</strong> la drogue (Krogstad (a <strong>et</strong> b), D.J. <strong>et</strong><br />
al., 1987), <strong>de</strong>vient <strong>de</strong> plus en plus fréquente. Le taux <strong>de</strong> flux <strong>de</strong> chloroquine est 40 fois plus<br />
haut dans les parasites résistants comparés aux sensibles (Krogstad (a <strong>et</strong> b), D.J. <strong>et</strong> al., 1987).<br />
Plusieurs <strong>de</strong>s traitements conventionnels du paludisme sont maintenant inefficaces ce qui<br />
pousse vers la recherche <strong>de</strong> nouvelles thérapies.<br />
La fixation sur la chloroquine d’un métal, par coordination directe ou par liaison covalente,<br />
s’est montrée efficace pour surmonter la résistance à c<strong>et</strong>te drogue, avec les complexes organo-<br />
rhodium (Figure 14 c) (Sanchez-Delgado, R.A. <strong>et</strong> al., 1996) <strong>et</strong> organo-fer (Figure 14 d) (Biot,<br />
C. <strong>et</strong> al., 1997 ; Domarle, O. <strong>et</strong> al., 1998), démontrent une activité antipaludique élevée.<br />
Cependant, seulement le composé d'organo-fer, un dérivé <strong>de</strong> ferrocène, restore totalement<br />
l'activité <strong>de</strong> la chloroquine sur les souches qui lui sont résistantes (Biot, C. <strong>et</strong> al., 1997)<br />
alors que le ferrocène ne montre, seul, aucune activité antipaludique (Domarle, O. <strong>et</strong> al.,<br />
1998). La substitution <strong>de</strong> la chaîne <strong>de</strong> carbone <strong>de</strong> la chloroquine avec un groupe<br />
ferrocènyl hydrophobe tout en maintenant les positions <strong>de</strong>s <strong>de</strong>ux atomes exocycliques<br />
d'azote <strong>de</strong> la chloroquine produit une puissante drogue antipaludique.<br />
L'approche décrite ci-<strong>de</strong>ssous est différente <strong>et</strong> prom<strong>et</strong>teuse : elle est basée sur la<br />
modification par l'intermédiaire <strong>de</strong> la chimie organométallique d'un bioligand connu<br />
(tamoxifène, chloroquine) <strong>de</strong> façon à optimiser ses eff<strong>et</strong>s. C<strong>et</strong>te optimisation sélective vise à<br />
augmenter l'efficacité par l'intermédiaire <strong>de</strong> la fonctionnalité organométallique, peut-être<br />
impliquant la formation d’espèces oxydées proches du site actif (Jaouen, G. <strong>et</strong> al., 1994 ;<br />
Top, S. <strong>et</strong> al., 1996 ; Top, S. <strong>et</strong> al., 2003 ; Jaouen, G. <strong>et</strong> al., 2004 ; Brocard, J. <strong>et</strong> al., 1996 ;<br />
Biot, C. <strong>et</strong> al., 1997 ; Biot, C. <strong>et</strong> al., 1999).<br />
Les SERMs (Selective Estrogen Receptor Modulators) (Figure 15), dont le tamoxifène 16<br />
(métabolite actif hydroxytamoxifène, OHTam, 17) est l’exemple d’une avancée<br />
significative dans le traitement du cancer du sein hormo-dépendant (ER+). Pour surmonter<br />
le problème <strong>de</strong>s tumeurs hormo-indépendantes (ER-), l’hydroxyferrocifène (OH-<br />
ferrocifen, 18) a été préparé. C<strong>et</strong>te molécule a démontré un eff<strong>et</strong> antiprolifératif sur les<br />
cellules <strong>de</strong> cancer du sein ER (+) ou ER (-). Ceci est dû aux propriétés particulières du<br />
U.P.M.C./U.S. 47<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
ferrocifène qui dans un environnement d’oxydation conduit à l’apoptose (Top, S. <strong>et</strong> al.,<br />
1996 ; Top, S. <strong>et</strong> al., 2003 ; Jaouen, G. <strong>et</strong> al., 2004).<br />
Figure 15 : L’antioestrogène « tamoxifène » (16) <strong>et</strong> ses métabolites actifs « hydroxy<br />
tamoxifène » (17) <strong>et</strong> « hydroxy ferrocifène » (18) (Jaouen, G. <strong>et</strong> al., 2006)<br />
L'autre exemple courant implique le paludisme. La chloroquine, 19, un <strong>de</strong>s antipaludiques<br />
actuellement prescrits, est suj<strong>et</strong>te à <strong>de</strong>s phénomènes <strong>de</strong> résistance, alors que la ferroquine<br />
20, n'a pas ce problème <strong>et</strong> est actuellement en essai clinique par Sanofi-Aventis (Biot, C.,<br />
2004).<br />
Figure 16 : Structure chimique <strong>de</strong> la chloroquine (19) <strong>et</strong> <strong>de</strong> la ferroquine (20)<br />
(Jaouen, G. <strong>et</strong> al., 2006)<br />
U.P.M.C./U.S. 48<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
Des complexes hétérobimétalliques du type R2Si(HL)Cl2 <strong>et</strong> R2SiL2 (où R = Me,<br />
Et, Ph <strong>et</strong> L = ferrocenyl aroylhydrazone) (Figure 17) ont été synthétisés <strong>et</strong> leur<br />
activité antimicrobienne a été évaluée in vitro contre les champignons Alternaria<br />
alternata, Fusarium oxysporum <strong>et</strong> Rhizoctonia solani ainsi que les bactéries<br />
Escherichia coli <strong>et</strong> Bacillus subtilis. Certains <strong>composés</strong> ont démontré une toxicité<br />
contre Rhizoctonia solani <strong>et</strong> Alternaria alternata proche <strong>de</strong> celle <strong>de</strong>s fongici<strong>de</strong>s<br />
conventionnels (bavistine <strong>et</strong> streptopenicilline) (Malhotra, R. <strong>et</strong> al., 2007).<br />
Figure 17 : Complexes hétérobimétalliques du type R2Si(HL)Cl2 <strong>et</strong> R2SiL2<br />
(Malhotra, R. <strong>et</strong> al., 2007)<br />
L'analyse d'induction <strong>de</strong> tumeur sur disque <strong>de</strong> pomme <strong>de</strong> terre est un essai fiable pour<br />
la détection <strong>de</strong>s agents antitumoraux (Ullah, A. <strong>et</strong> al., 2007 ; Inaytullah, S. <strong>et</strong> al., 2007 ;<br />
Ahmad, M.S. <strong>et</strong> al., 2007 ; Hanif, M. <strong>et</strong> al., 2007). Il a été déjà rapporté que les<br />
mécanismes d’induction <strong>de</strong> tumeur, chez les animaux <strong>et</strong> les végétaux, sont semblables <strong>et</strong><br />
que l’essai d'induction <strong>de</strong> tumeur sur disque <strong>de</strong> pomme <strong>de</strong> terre avaient montré une<br />
bonne corrélation dans les résultats avec les analyses <strong>de</strong> criblage antitumoral les plus<br />
utilisées (Braun, A.C., 1972). L’étu<strong>de</strong> <strong>de</strong> l’eff<strong>et</strong> antitumoral <strong>de</strong> quelques bases <strong>de</strong><br />
Schiff <strong>et</strong> <strong>leurs</strong> analogues ferrocénique a été effectuée sur <strong>de</strong>s disques <strong>de</strong> pomme <strong>de</strong> terre<br />
U.P.M.C./U.S. 49<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
inoculés avec une souche d’Agrobacterium tumefaciens. La base <strong>de</strong> Schiff du ferrocène<br />
(FA2.1) <strong>et</strong> (FA1.1) ont montré les meilleures <strong>activités</strong> antitumorales avec, respectivement<br />
71% <strong>et</strong> 58% d’inhibition à la concentration <strong>de</strong> 1000 µg/ml (Nawaz, H. <strong>et</strong> al., 2009).<br />
Figure 18 : Base <strong>de</strong> Schiff du ferrocène (Nawaz, H. <strong>et</strong> al., 2009)<br />
2.4.2. Importance du ligand<br />
Comme indiqué précé<strong>de</strong>mment, les ligands organiques biologiquement actifs coordonnés<br />
aux métaux peuvent produire <strong>de</strong>s drogues avec <strong>de</strong>s <strong>activités</strong> <strong>biologiques</strong> originales <strong>et</strong> qui<br />
peuvent être employées pour surmonter la résistance aux médicaments ou pour améliorer les<br />
propriétés <strong>de</strong>s molécules organiques. Cependant, il n'est pas étonnant que presque toutes<br />
les substitutions <strong>de</strong> ligand puissent affecter les propriétés <strong>biologiques</strong> <strong>de</strong>s drogues<br />
putatives. Des excellents changements dans l'activité <strong>et</strong> la spécificité <strong>de</strong>s drogues, par <strong>de</strong>s<br />
modifications <strong>de</strong> ligand, ont été observés avec du rhodium, du ruthénium, d'iridium <strong>et</strong> <strong>de</strong>s<br />
complexes d'or (Sülü, M. <strong>et</strong> al., 1998 ; Ç<strong>et</strong>inkaya, B. <strong>et</strong> al., 1999 ; Ç<strong>et</strong>inkaya, B. <strong>et</strong> al., 1996 ;<br />
Öz<strong>de</strong>mir, I. <strong>et</strong> al., 2004).<br />
U.P.M.C./U.S. 50<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
Les complexes <strong>de</strong> rhodium <strong>et</strong> <strong>de</strong> ruthenium-carbène (Figure 19 b) (Ç<strong>et</strong>inkaya, B. <strong>et</strong> al.,<br />
1996), <strong>et</strong> les complexes tripodal <strong>de</strong> phosphine <strong>de</strong> rhodium, d'iridium <strong>et</strong> <strong>de</strong> ruthénium<br />
(Figure 19 c) (Sülü, M. <strong>et</strong> al., 1998), ont montré une plus gran<strong>de</strong> sélectivité envers les<br />
bactéries gram(+) comparée aux bactéries gram(-), probablement due à leur prise facilitée<br />
dans ces organismes, empêchant la croissance à <strong>de</strong>s concentrations micromolaires.<br />
La spécificité dépendante du ligand a été montrée avec une série <strong>de</strong> complexes d'or<br />
basés sur le ligand <strong>de</strong> chlorure [1,3-(dimesitylm<strong>et</strong>hylimidazolinium)] chlori<strong>de</strong> ligand<br />
(Figure 19 d) (Öz<strong>de</strong>mir, I. <strong>et</strong> al., 2004). Par exemple, quand R = p-Me2NC6H4CH2, la<br />
drogue inhibe la croissance d'Escherichia coli (ATCC 25922) à la plus basse concentration<br />
testée, avec peu d'eff<strong>et</strong> sur la croissance <strong>de</strong>s autres bactéries gram(-), les bactéries gram(+)<br />
ou les levures. En revanche, quand R = C5H9, le complexe empêche la croissance <strong>de</strong><br />
Staphylococcus aureus, avec peu d'eff<strong>et</strong> sur les microorganismes testés.<br />
Les complexes [Ru(arene)(L)X2] (Figure 19 a) ont montrés <strong>de</strong>s propriétés antibactériennes<br />
<strong>et</strong> anticancéreuses dont l'activité <strong>et</strong> la spécificité sont liées au type <strong>de</strong> métal <strong>et</strong> <strong>de</strong><br />
ligand. Par exemple, le [Ru(η 6 -p-cymene)Cl2 (4-vinylpyridine)] démontre seulement une<br />
activité antifongique modérée, mais une sélectivité élevée pour l'inhibition <strong>de</strong> la<br />
croissance fongique. Dans la série [Ru(arene)(pta)X2] (pta = 1,3,5-triaza-7-<br />
phosphatricyclo [3.3.1.1] <strong>de</strong>cane), le ligand « X » détermine la sélectivité entre les cellules<br />
bactériennes, fongiques <strong>et</strong> <strong>de</strong> levure. Avec <strong>de</strong>s ligands <strong>de</strong> chlorure les produits sont sélectifs<br />
pour Cladosporium resinae, avec <strong>de</strong>s ligands d'iodure ils sont sélectifs pour Bacillus<br />
subtilis <strong>et</strong> pour <strong>de</strong>s ligands <strong>de</strong> NCS ils sont sélectifs pour Trichrophyton mentagrophytes<br />
(Allardyce, C.S. <strong>et</strong> al., 2003).<br />
Les nucléosi<strong>de</strong>s kinases se sont avérées <strong>de</strong>s cibles importantes pour les drogues antivirales<br />
<strong>et</strong> anticancéreuses. L'expression <strong>de</strong> la thymidine kinase est augmentée dans les cellules en<br />
prolifération, <strong>et</strong> en plus d'agir en tant qu'une cible directe, son gène pourrait être employé<br />
pour le diagnostic <strong>de</strong>s tumeurs. Dans le cas <strong>de</strong> l'ofaminothymidine, dérivé en métal du<br />
carboxami<strong>de</strong> (Figure 19 e), la capacité d'inhibition du composé en ce qui concerne la kinase<br />
humaine <strong>de</strong> thymidine a augmenté avec la longueur du ligand (Schibli, R. <strong>et</strong> al., 2003).<br />
U.P.M.C./U.S. 51<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
Figure 19 : a ruthenium(II)-arene complexes; b rhodium and ruthenium carbene com-<br />
plexes; c rhodium, iridium and ruthenium tripodal phosphine complexes; d gold [1,3-<br />
(dimesitylm<strong>et</strong>hylimidazolinium)] chlori<strong>de</strong> complexes; e m<strong>et</strong>al carboxami<strong>de</strong> <strong>de</strong>rivatives<br />
(Allardyce, C.S. <strong>et</strong> Dyson, P.J., 2006)<br />
Une étu<strong>de</strong> plus étendue <strong>de</strong> l'eff<strong>et</strong> <strong>de</strong> la modification du ligand sur l'activité biologique a été<br />
réalisée avec <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> métallocènes. Les complexes <strong>de</strong> ferrocène ont diverses<br />
applications biomédicales en raison <strong>de</strong> leur stabilité, leur nature relativement non-toxique <strong>et</strong><br />
leur dérivatisation étendue. Plusieurs exemples <strong>de</strong> dérivés <strong>de</strong> ferrocène <strong>de</strong> drogues organiques<br />
ont été développés pour surmonter la résistance aux médicaments. En plus <strong>de</strong> fournir un<br />
échafaudage organométallique sur lequel <strong>de</strong>s drogues organiques avec une activité prouvée<br />
peuvent être greffées, quelques <strong>composés</strong> originaux <strong>de</strong> ferrocènyl ont également montré leur<br />
possession d'activité clinique intéressante. Le complexe bis-1,1'- disubstituted-ferrocenyl<br />
U.P.M.C./U.S. 52<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
carbohydrazone (figure 20 a) empêchent la croissance <strong>de</strong> cinq types <strong>de</strong> bactéries (Chohan,<br />
Z.H. <strong>et</strong> al., 2004), montrant environ la moitié <strong>de</strong> l'activité <strong>de</strong> l’imipenum utilisé comme<br />
référence. La chélation <strong>de</strong>s complexes avec <strong>de</strong>s ions en métal donne la structure montrée<br />
dans la figure (20 b) <strong>et</strong> augmente l'activité jusqu'à cinquante pour cent. Des résultats<br />
similaires ont été obtenus après l'<strong>évaluation</strong> <strong>de</strong>s propriétés antifongiques <strong>de</strong> ces <strong>composés</strong><br />
contre six souches fongiques <strong>et</strong> l'activité antifongique a été augmentée jusqu'à 42%. Dans le<br />
cas <strong>de</strong> l'activité antifongique <strong>de</strong> ces drogues, l'activité <strong>de</strong>s complexes <strong>de</strong> chélate a étroitement<br />
approché celle du miconazole utilisé comme drogue <strong>de</strong> référence.<br />
Figure 20 : Structures of (ferrocenyl)carbohydrazone complexes: a bis-1,1'-disubstituted fer-<br />
rocenylcarbohydrazone complexes; b and subsequent chelation <strong>de</strong>rivatives (Allardyce, C.S.<br />
<strong>et</strong> Dyson, P.J., 2006)<br />
2.5. Les défis <strong>de</strong> la chimie organométallique<br />
2.5.1. La toxicité<br />
Les problèmes toxicologiques <strong>et</strong> écologiques liés à l'utilisation <strong>de</strong>s <strong>organométalliques</strong> ont été<br />
intensivement couverts dans les livres par Thayer (Thayer, J.S., 1984) <strong>et</strong> Craig (Craig, P.J.,<br />
2003). Il vaut <strong>de</strong> noter que la toxicité <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> <strong>organométalliques</strong>, par exemple Ni(CO)4,<br />
a été i<strong>de</strong>ntifiée <strong>de</strong>puis <strong>leurs</strong> découvertes. Pour la mémoire, <strong>et</strong> comme illustration, quelques<br />
inci<strong>de</strong>nts historiques seront brièvement décrits.<br />
U.P.M.C./U.S. 53<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
La maladie <strong>de</strong> Minamata était le nom donné à l'empoisonnement dont les habitants <strong>de</strong> c<strong>et</strong>te<br />
région Japonaise ont été victime en 1953. La toxine était CH3-Hg-SCH3 (Tsubaki, T. <strong>et</strong><br />
Irukayama, K., 1977), <strong>de</strong> mollusques <strong>et</strong> crustacés pêchés en aval d'une usine préparant <strong>de</strong><br />
l'acétaldéhy<strong>de</strong> (D’Itric, P.A. <strong>et</strong> D’Itric, F.M., 1997). En raison <strong>de</strong> ces sérieux problèmes<br />
toxicologiques, la biologie du chlorure mercurique méthylique est la plus étudiée <strong>de</strong> tous<br />
les <strong>organométalliques</strong> (Thayer, J.S., 1984).<br />
Les organoarseniques ont été utilisés comme gaz toxique pendant la première guerre mondiale<br />
<strong>et</strong> le plus connu parmi eux est lewisite (ClCH=CHAs Cl2) (Jackson, K. E. <strong>et</strong> Jackson, M. A.,<br />
1935). La recherche <strong>de</strong> gaz toxique a mené au développement <strong>de</strong>s antidotes, dont le plus<br />
couramment employé était le 2,3-dimercaptopropanol [HSCH2CH(SH)-CH2OH], connu sous<br />
le nom <strong>de</strong> mercaprol ou BAL (British anti-lewisite) qui fonctionne en se liant à côté <strong>de</strong><br />
l'atome arsenical pour former un complexe hydrosoluble excrété par le corps (Oehme, F.W.,<br />
1972 ; P<strong>et</strong>ers, R.A. <strong>et</strong> al., 1945).<br />
L'histoire malheureuse <strong>de</strong> « Stalinon » était très nocive au développement biologique <strong>de</strong>s<br />
<strong>composés</strong> <strong>organométalliques</strong> basés sur l’étain. Comme la maladie <strong>de</strong> Minamata, elle a<br />
sévèrement r<strong>et</strong>ardé l’application thérapeutique <strong>de</strong>s <strong>organométalliques</strong>. En 1954, 4 millions <strong>de</strong><br />
capsules, préparées pour le traitement <strong>de</strong>s infections staphylococciques <strong>et</strong> censées contenir le<br />
diiodi<strong>de</strong> <strong>de</strong> di<strong>et</strong>hyltine, ont été distribuées en France sous le nom <strong>de</strong> « Stalinon ». C'était un<br />
cas où le traitement <strong>de</strong>vient plus mauvais que la maladie ; 102 personnes sont mortes <strong>et</strong><br />
autant d’autres ont été affectés par divers désordres neurologiques. Il s’est avéré, plus<br />
tard, que (C2H5)2SnI2, <strong>et</strong> encore plus (C2H5)3SnI (présent comme impur<strong>et</strong>é), étaient <strong>de</strong><br />
puissants agents neurotoxiques (Alojouanine, T. <strong>et</strong> al., 1958 ; Gruner, J.E., 1958).<br />
C<strong>et</strong>te réputation pour la toxicité n'a pas été avantageuse pour le développement thérapeutique<br />
<strong>de</strong>s <strong>composés</strong> <strong>organométalliques</strong>, bien qu'il existe une tendance plus favorable pour les dérivés<br />
du silicium, du phosphore ou du germanium (Fessen<strong>de</strong>n, R.J. <strong>et</strong> Fessen<strong>de</strong>n, J.S., 1980 ;<br />
Growe, A.J., 1983 ; Tsutsui, M. <strong>et</strong> al., 1976). Cependant, il faut noter que la fixation directe<br />
<strong>de</strong>s groupes organiques au métal n’augmente pas toujours la toxicité du produit. D’ail<strong>leurs</strong>, il<br />
a été noté, <strong>de</strong>puis longtemps, que les <strong>composés</strong> organiques <strong>de</strong> l'arsenic sont moins toxiques<br />
que <strong>leurs</strong> analogues inorganiques, observation qui a mené au travail pilote d'Ehrlich sur la<br />
chimiothérapie.<br />
U.P.M.C./U.S. 54<br />
2010
2.5.2. Pallier la résistance aux médicaments<br />
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
Les raisons du succès <strong>de</strong>s dérivés <strong>organométalliques</strong> à surmonter la résistance aux thérapies<br />
organiques dépen<strong>de</strong>nt du mécanisme <strong>de</strong> la résistance aux drogues. Là où la résistance est<br />
due à une défaillance <strong>de</strong> l’accès du médicament, le dérivé organométallique peut fournir<br />
une nouvelle manière d'entrée dans la cellule. Par exemple, les complexes d'organo-fer<br />
peuvent exploiter la voie d’approvisionnement par le fer facilité par la transferrine, <strong>et</strong><br />
puisque le fer est un aliment essentiel, il est peu susceptible <strong>de</strong> se produire une résistance<br />
aux médicaments par ce type <strong>de</strong> système <strong>de</strong> livraison <strong>de</strong>s drogues. L’addition <strong>de</strong>s agents<br />
connus tels que le sulfam<strong>et</strong>hoxydiazine, le dithiocarbamate ou le diphényl-<br />
dithiocarbamate au fragment rhodium-dicarbonyl « Rh(CO)2 » donne <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> qui<br />
surmontent la résistance aux drogues due aux mécanismes <strong>de</strong> prise (Craciunescu, D.G. <strong>et</strong><br />
al., 1991 ; Craciunescu, G. <strong>et</strong> al., 1989).<br />
La protéine <strong>de</strong> multirésistance aux drogues est une pompe générale <strong>de</strong> flux, <strong>et</strong> son<br />
surexpression a été liée à la résistance aux médicaments. D'autres pompes semblables<br />
existent, comme la P-glycoprotéine, qui accélèrent également le taux <strong>de</strong> flux <strong>de</strong> drogue<br />
<strong>de</strong>s cellules, réduisant <strong>de</strong> ce fait l'activité thérapeutique <strong>de</strong>s drogues dans les cellules<br />
correspondantes. Il y a plusieurs agents connus pour bloquer ces pompes, telles que le<br />
vérapamil <strong>et</strong> le daunorubicine, qui reconstituent l'activité d'une gamme <strong>de</strong> drogues<br />
comprenant ceux utilisés pour le traitement du cancer <strong>et</strong> du paludisme. Par exemple,<br />
l’accumulation <strong>de</strong> plusieurs complexes d'organo-technétium a augmenté dans diverses<br />
cellules résistantes aux drogues quand ils sont co-administrés avec les agents qui bloquent<br />
les pompes <strong>de</strong> flux (Piwnicaworms, D. <strong>et</strong> al., 1995 ; Rao, V.V. <strong>et</strong> al., 1998).<br />
Une résistance plus spécifique se produit avec certaines drogues quand les mécanismes<br />
biomoléculaires cibles ou <strong>de</strong> réparation dans les cellules changent <strong>de</strong> sorte que la drogue<br />
ne soit plus efficace. Dans le cas <strong>de</strong>s cibles protéiques, le changement peut être une<br />
mutation qui bloque l'interaction entre la drogue <strong>et</strong> la cible. Les dérivés <strong>organométalliques</strong><br />
<strong>de</strong> ces drogues peuvent surmonter la résistance en fournissant l'attache alternative ou<br />
l'inactivation d'enzymes par la drogue organique. Les centres en métal dans les complexes<br />
<strong>organométalliques</strong> peuvent se lier aux groupes fonctionnels <strong>de</strong> thiol, d'amine ou d'hydroxyle<br />
<strong>de</strong> la protéine du site accepteur <strong>de</strong> la drogue, ayant pour résultat une interaction plus forte<br />
que l'association non-covalente <strong>de</strong> la drogue organique seule. Les centres en métal peuvent<br />
U.P.M.C./U.S. 55<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
également ai<strong>de</strong>r à déplacer les ions en métal <strong>de</strong> la protéine qui sont importants pour la<br />
fonction <strong>et</strong> la stabilité, causant une inactivation plus efficace <strong>de</strong> la fonction <strong>de</strong> protéine.<br />
Quand l'ADN est la cible biomoléculaire, la résistance aux drogues est habituellement due<br />
aux changements <strong>de</strong>s protéines qui i<strong>de</strong>ntifient <strong>et</strong> réparent les lésions <strong>de</strong> l'ADN. Dans le cas<br />
<strong>de</strong>s <strong>composés</strong> anticancéreux à base <strong>de</strong> platine, la résistance à la cisplatine peut être due à<br />
l'excision <strong>et</strong> à la réparation accélérées <strong>de</strong>s réticulations intramoléculaires d'ADN qui sont<br />
préférentiellement constituées par c<strong>et</strong>te drogue.<br />
2.5.3. Sélectivité<br />
Le but du traitement contre le cancer est <strong>de</strong> tuer les cellules cancéreuses sans nuire aux<br />
cellules saines environnantes. Le traitement <strong>de</strong>s infections bactériennes, parasitaires,<br />
fongiques ou virales a également le même but, c'est-à-dire tuer l'organisme envahisseur sans<br />
causer du mal à l’organisme hôte. Ainsi, il y a <strong>de</strong>s similitu<strong>de</strong>s dans la conception efficace <strong>de</strong><br />
drogue pour le traitement du cancer <strong>et</strong> <strong>de</strong>s infections, la différence principale étant que, afin<br />
d'être efficaces, les drogues doivent avoir <strong>de</strong> la sélectivité pour les cellules mala<strong>de</strong>s, exploitant<br />
les différences dans les biomolécules <strong>et</strong> <strong>de</strong>s voies métaboliques qui sont présents dans les<br />
cellules mala<strong>de</strong>s <strong>et</strong> saines afin d’endommager les cellules saines au minimum. Le Cancer <strong>et</strong><br />
les infections, indépendamment si elles sont parasitaires, bactériennes, fongiques ou<br />
virales, sont reliés <strong>et</strong> en conséquence, quelques drogues qui ont une activité contre le<br />
cancer peuvent également être actives contre <strong>de</strong>s infections <strong>et</strong> vice versa. En eff<strong>et</strong>, la<br />
cisplatine, qui est indiscutablement la drogue anticancéreuse la plus réussie <strong>de</strong> tout les<br />
temps, empêche également la croissance <strong>de</strong>s cellules bactériennes.<br />
En plus <strong>de</strong>s différences spécifiques entre les cellules saines <strong>et</strong> certains types <strong>de</strong> cellules<br />
mala<strong>de</strong>s, il y a <strong>de</strong>s changements généraux qui résultent <strong>de</strong> l'infection ou <strong>de</strong>s mutations, qui<br />
causent la maladie. Les cellules mala<strong>de</strong>s se développent généralement beaucoup plus<br />
rapi<strong>de</strong>ment que les cellules saines ce qui peut causer <strong>de</strong>s changements subtils, par<br />
exemple, dans les besoins nutritifs <strong>et</strong> du pH cytosolique, donnant une poignée par laquelle<br />
les cibles <strong>de</strong>s drogues ou leur activation spécifique peut se faire. En raison <strong>de</strong>s similitu<strong>de</strong>s<br />
entre toutes les cellules qui prolifèrent rapi<strong>de</strong>ment, le transport nutritif comme mécanisme<br />
cible peut être employé comme outil pour s'assurer <strong>de</strong> l’accumulation spécifique <strong>de</strong>s drogue<br />
dans les cellules infectées par <strong>de</strong>s bactéries, champignons, parasites <strong>et</strong> virus aussi bien que<br />
U.P.M.C./U.S. 56<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
dans les cellules cancéreuses. En conséquence, beaucoup <strong>de</strong> drogues qui sont actives<br />
contre une <strong>de</strong> ces maladies peuvent également l’être contre d'autres.<br />
Les drogues peuvent être actives contre plusieurs maladies en bloquant les mêmes voies<br />
biochimiques servant <strong>de</strong> cibles à la chimiothérapie. La synthèse folique est une cible<br />
médicamenteuse au traitant du paludisme <strong>et</strong> du cancer. Traditionnellement <strong>de</strong>s drogues<br />
telles que le chloroguani<strong>de</strong>, la pyriméthamine, <strong>et</strong> les sulfonami<strong>de</strong>s sont employées comme<br />
antipaludiques, <strong>et</strong> le m<strong>et</strong>hotrexate comme équivalent anticancéreux, bien que tous ces<br />
<strong>composés</strong> visent la même voie biologique.<br />
Les mêmes drogues peuvent même être employées pour traiter différents types <strong>de</strong><br />
maladies. Par exemple, plusieurs complexes connus pour leur activité antiproliférative<br />
contre les cellules tumorales ont été également testés contre les maladies parasitaires<br />
(Mesa Valle, C.M. <strong>et</strong> al., 1993), <strong>et</strong> certaines drogues i<strong>de</strong>ntifiées pour leur activité<br />
antibactérienne montrent une activité anticancéreuse prom<strong>et</strong>teuse (Buckley, R.G. <strong>et</strong> al.,<br />
1996 ; Parish, R.V. <strong>et</strong> al., 1996).<br />
2.5.4. Composés <strong>organométalliques</strong> <strong>et</strong> solvants aqueux<br />
La compatibilité <strong>de</strong>s espèces <strong>organométalliques</strong> avec l'eau, l’essentiel dissolvant biologique,<br />
est l'une <strong>de</strong>s conditions nécessaires pour l'avancement <strong>de</strong> la chimie bioorganométallique.<br />
Ainsi, la chimie organométallique aqueuse (Koelle, U., 1994) est un défi qui s'étend <strong>de</strong>s<br />
sciences <strong>de</strong> la vie à la catalyse (Alberto, R., 2003).<br />
En ce qui concerne les aci<strong>de</strong>s aminés <strong>organométalliques</strong>, les pepti<strong>de</strong>s modifiés avec eux, <strong>et</strong><br />
certainement les protéines <strong>et</strong> les hydrates <strong>de</strong> carbone, leur solubilité dans l'eau est une<br />
caractéristique essentielle pour leur utilisation.<br />
Le premier complexe organométallique avec un α-amino acid, Fe(CO)2(cysteinate)2 a été<br />
rapporté en 1929 par Cremer (Cremer, W., 1929), <strong>et</strong> caractérisé par Schubert (Schubert,<br />
M.P., 1933).<br />
*<br />
Le premier aci<strong>de</strong> aminé contenant le ferrocène a été rapporté <strong>de</strong>puis 1957 par Schlögl<br />
(Schlögl, K., 1957), <strong>et</strong> Pauson (Osgerby, J.M. <strong>et</strong> Pauson, P.L., 1958). Le travail pilote <strong>de</strong><br />
U.P.M.C./U.S. 57<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
Schlögl a été développé plus tard par Sergheraert <strong>et</strong> Tartar (Cuingn<strong>et</strong>, E. <strong>et</strong> al., 1960) <strong>et</strong><br />
d'autres (Severin, K. <strong>et</strong> al., 1998 ; Severin, K., 2002).<br />
Hieber <strong>et</strong> ses collaborateurs (Hieber, W. <strong>et</strong> al., 1971) a employé le complexe [M(NO)2Br]2<br />
avec <strong>de</strong>s aci<strong>de</strong>s aminés pour la synthèse du N,O-aminocarboxylates correspondant. Les<br />
complexes <strong>de</strong> palladium (allyl)Pd(NH2CHRCO2) <strong>et</strong> <strong>de</strong> platine<br />
[Pt(Cl)(NH2CHRCO2)(olefin)] étaient parmi les premiers complexes <strong>organométalliques</strong><br />
<strong>de</strong>s aci<strong>de</strong>s α-aminés (Ben<strong>et</strong>ti, E. <strong>et</strong> al., 1973).<br />
Sheldrick <strong>et</strong> Heeb (Sheldrick, W.S. <strong>et</strong> Heeb, S., 1989), ont préparés <strong>et</strong> caractérisés la<br />
structure en moitié-sandwich <strong>de</strong>s α-aminoacidates <strong>et</strong> <strong>de</strong>s p<strong>et</strong>its pepti<strong>de</strong>s (Figure 21).<br />
Figure 21 : Formation <strong>de</strong> trimères <strong>de</strong> complexes <strong>de</strong> métaux <strong>et</strong> d’aci<strong>de</strong>s aminés<br />
(Jaouen, G. <strong>et</strong> al., 2006)<br />
Les complexes carbonylique en métal qui contiennent <strong>de</strong>s ligands d'origine biologique<br />
(bases nucléiques, aci<strong>de</strong>s aminés) qui ont été décrits avant 1985 ont été revus par Ioganson<br />
(Ioganson, A.A., 1985), <strong>et</strong> la chimie organométallique <strong>de</strong>s aci<strong>de</strong>s aminés <strong>et</strong> <strong>de</strong>s p<strong>et</strong>its<br />
pepti<strong>de</strong>s a été récapitulée par Beck, Bergs <strong>et</strong> Severin (Severin, K. <strong>et</strong> al., 1998). Le groupe<br />
Beck à Munich a édité plus <strong>de</strong> 150 papiers dans ce domaine <strong>et</strong> un exemple est illustré sur<br />
la figure 22.<br />
U.P.M.C./U.S. 58<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
Figure 22 : Formation <strong>de</strong> complexes <strong>organométalliques</strong> <strong>de</strong> Di <strong>et</strong> Triglycine<br />
(Jaouen, G. <strong>et</strong> al., 2006)<br />
Les premiers complexes <strong>organométalliques</strong> avec <strong>de</strong>s bases nucléiques était une série <strong>de</strong><br />
complexes métallique <strong>de</strong> carbonyle avec ces bioligands (Abbott, D.W. <strong>et</strong> Watts, C., 1983 ;<br />
Beck, W. <strong>et</strong> Kottmair, K., 1976 ; Singh, M.M. <strong>et</strong> al., 1983) <strong>et</strong> Sheldrick (Sheldrick, W.S. <strong>et</strong><br />
Guenther, B.,1988), a obtenu une série <strong>de</strong> complexes <strong>de</strong> ruthénium avec <strong>de</strong>s nucleobases<br />
(Figure 23) (Annen, P. <strong>et</strong> al., 2000 ; Herebian, D. <strong>et</strong> Sheldrick, W.S., 2002 ; Korn, S. <strong>et</strong><br />
Sheldrick, W.S., 1997).<br />
Figure 23 : Formation <strong>de</strong> trimères <strong>de</strong> complexes <strong>de</strong> bases nucléiques<br />
(Jaouen, G. <strong>et</strong> al., 2006)<br />
La plupart <strong>de</strong> ces premières étu<strong>de</strong>s avec <strong>de</strong>s bioligands étaient principalement synthétiques<br />
dans leur but <strong>et</strong> exemptes d'applications <strong>biologiques</strong>. Cependant, ils ont préparé le terrain pour <strong>de</strong>s<br />
investigations postérieures. Les complexes ioniques d'aci<strong>de</strong>s aminés <strong>de</strong> titanocène<br />
[Cp2Ti(NH2CHRCO2)2] + ont démontré une moindre activité antitumorale (Köpf-Maier, P. <strong>et</strong><br />
Köpf, H., 1994 ; Köpf-Maier, P., 1996) que Cp2TiCl2 (Köpf-Maier, P. <strong>et</strong> Köpf, H.,1994).<br />
Récemment, Sadler (Wang, F. <strong>et</strong> al., 2003) a étudié l'activité antitumorale <strong>de</strong>s complexes<br />
<strong>organométalliques</strong> <strong>de</strong> ruthénium qui avaient été déjà observés par Sheldrick (Sheldrick, W.S.<br />
<strong>et</strong> Heeb, S., 1990).<br />
U.P.M.C./U.S. 59<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
Parmi les premiers complexes en métal <strong>de</strong> transition (à l'exception <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> <strong>de</strong> mercure)<br />
avec une liaison σ métal-carbone aux carbohydrates étaient le carbonyl cobalt <strong>et</strong> les<br />
complexes Cp(OC)2Fe (Baer, H.H. <strong>et</strong> Hanna, H.R., 1982 ; Beau, J.M. <strong>et</strong> Gallagher, T., 1997 ;<br />
Rosenthal, A. <strong>et</strong> Koch, H.J., 1967 ; Trainor, G.L., 1985). Plus tard, <strong>de</strong>s complexes <strong>de</strong><br />
carbohydrates <strong>de</strong> carbène en métal ont été synthétisés (Aumann, R., 1992 ; Aumann, R.,<br />
1994 ; Fischer, H. <strong>et</strong> al., 1995 ; Krawielitzki, S. <strong>et</strong> Beck, W., 1997 ; Pill, T. <strong>et</strong> al., 1990). Dans<br />
une série <strong>de</strong> papiers, Dötz <strong>et</strong> ses collaborateurs (Dötz, K.H. <strong>et</strong> al., 2001 ; Dötz, K.H. <strong>et</strong><br />
Gomes <strong>de</strong> Silva, E., 2003) ont présenté le « Fischer-type carbene functionality » dans <strong>de</strong>s<br />
carbohydrates en employant différentes méthodologies synthétiques ; ces complexes peuvent<br />
être employés pour la modification <strong>de</strong>s sucres.<br />
Les complexes <strong>de</strong> Cyclopentadienyl-titane avec les ligands chiraux σ-coordonnés dérivés<br />
du glucose sont <strong>de</strong>s réactifs stéréosélectifs dans la synthèse organique (Duthaler, R.O. <strong>et</strong> al.,<br />
1992 ; Riediker, M. <strong>et</strong> Duthaler, R.O. 1989). Un grand nombre <strong>de</strong> ligands chiraux dérivés <strong>de</strong><br />
carbohydrates, principalement la phosphine, sont employés dans la catalyse asymétrique<br />
(Diéguez, M. <strong>et</strong> al., 2004 ; Junicke, H. <strong>et</strong> Steinborn, D., 2003 ; Steinborn, D. <strong>et</strong> Junicke, H.,<br />
2000). Le cation <strong>de</strong> trim<strong>et</strong>hylplatinum (IV) s'est avéré approprié à la coordination <strong>de</strong>s<br />
monosacchari<strong>de</strong>s non protégés (Figure 24) (Steinborn, D. <strong>et</strong> Junicke, H., 2000).<br />
Figure 24 : Complexe carbohydrate <strong>de</strong> platinium (Jaouen, G. <strong>et</strong> al., 2006)<br />
Un autre thème se rapportant à l'eau <strong>et</strong> aux <strong>organométalliques</strong> a été développés par Fish. En<br />
particulier, Fish a essayé <strong>de</strong> surmonter le problème <strong>de</strong> la régénération <strong>de</strong> cofacteur dans la<br />
biocatalyse. Au moins un tiers <strong>de</strong> toutes les enzymes connues exigent l'utilisation <strong>de</strong><br />
cofacteurs tels que NAD + (nicotinami<strong>de</strong> a<strong>de</strong>nine dinucleoti<strong>de</strong>) <strong>et</strong> sa forme réduite, 1,4-NADH,<br />
pour effectuer <strong>de</strong>s oxydations ou <strong>de</strong>s réductions. Cependant, ces cofacteurs sont <strong>de</strong>s molécules<br />
U.P.M.C./U.S. 60<br />
2010
Etu<strong>de</strong> bibliographique<br />
chères <strong>et</strong> assez compliquées. Il a été démontré que, dans une solution aqueuse, quelques<br />
modèles <strong>organométalliques</strong> biomimétiques se comportent chimiquement comme NAD + <strong>et</strong><br />
peuvent soustraire un ion d'hydrure (Lo, H.C. <strong>et</strong> al., 2001). Dans l’exemple suivant, l'hydrure<br />
33 réduit 31 en 34 (Figure 25).<br />
Figure 25 : Modèle organométallique <strong>de</strong> cofacteurs (Jaouen, G. <strong>et</strong> al., 2006)<br />
2.6. Conclusion<br />
Généralement <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> <strong>organométalliques</strong> sont considérés comme fortement<br />
toxiques, sensibles à l’air <strong>et</strong> incompatibles avec l’environnement aqueux. En dépit <strong>de</strong> ces<br />
idées perçues, beaucoup <strong>de</strong> <strong>composés</strong> <strong>organométalliques</strong> se sont avérés bien adaptés à<br />
l'environnement physiologique <strong>et</strong> ont trouvés <strong>de</strong>s applications dans la mé<strong>de</strong>cine <strong>et</strong> le<br />
diagnostic.<br />
En particulier, il s'est avéré que l’intégration <strong>de</strong> fragments <strong>organométalliques</strong> sur <strong>de</strong>s<br />
drogues organiques connues peut améliorer leur activité <strong>et</strong>, dans certains cas, peut restituer<br />
leur activité s’il y a développement <strong>de</strong> résistance pour le composé organique.<br />
La compréhension <strong>de</strong> la base moléculaire pour <strong>de</strong> telles observations exigera <strong>de</strong>s efforts<br />
considérables <strong>de</strong> recherches à l'interface <strong>de</strong> la chimie organométallique, <strong>de</strong> la biochimie <strong>et</strong><br />
<strong>de</strong> la physiologie <strong>et</strong> <strong>de</strong>vrait finalement mener à <strong>de</strong>s drogues meilleures que celles utilisées<br />
actuellement.<br />
U.P.M.C./U.S. 61<br />
2010
La loi suprême <strong>de</strong> l’invention humaine<br />
est que l’on n’invente qu’en travaillant.<br />
Alain (Emile-Auguste Chartier)
1. <strong>Synthèse</strong> chimique<br />
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
La majorité <strong>de</strong>s produits utilisés pour les tests d’<strong>activités</strong> antitumorales, bactérici<strong>de</strong> ou<br />
fongici<strong>de</strong> sont présentés dans ce chapitre. Ces produits sont <strong>de</strong>s dérivés ou <strong>de</strong>s analogues du<br />
ferrocifen. Ils se différencient, d’une part, par la nature <strong>de</strong>s substituants greffés, <strong>et</strong> d’autre<br />
part, par la nature <strong>de</strong> substituant greffé sur les cycles aromatiques. On dispose ainsi une<br />
gamme <strong>de</strong> produits perm<strong>et</strong>tant d’évaluer l’impact du métal <strong>et</strong> <strong>de</strong> la nature <strong>de</strong> la fonction<br />
chimique sur les eff<strong>et</strong>s <strong>biologiques</strong>. Plusieurs produits ont déjà été synthétisés <strong>et</strong> étudiés pour<br />
leur propriété antiproliférative contre le cancer du sein. Certains <strong>de</strong> ces produits ont été <strong>de</strong><br />
nouveau synthétisés pour la présente étu<strong>de</strong> <strong>et</strong> d’autres sont <strong>de</strong> nouveaux <strong>composés</strong> synthétisés<br />
pour la première fois.<br />
Les <strong>composés</strong> sont classés dans sept catégories différentes:<br />
� Série 1 : Composés phénoliques <strong>et</strong> non phénoliques <strong>de</strong> la série <strong>de</strong>s diaryl-ferrocényl-<br />
butènes.<br />
� Série 2 : Complexes <strong>de</strong> Fe, <strong>de</strong> Ru, <strong>de</strong> Re <strong>et</strong> <strong>de</strong> Mn du diphénol butène<br />
� Série 3 : Ami<strong>de</strong>s analogues du ferrociphénol<br />
� Série 4 : Amines d’aryl-ferrocényl-butène<br />
� Série 5 : Composés diaminés organiques <strong>et</strong> ferrocéniques<br />
� Série 6 : Dérivés <strong>de</strong> �-glucose, <strong>de</strong> �-maltose <strong>et</strong> <strong>de</strong> �-cellobiose du ferrociphénol<br />
� Série 7 : Sels citriques du ferrocifène <strong>et</strong> d’un dérivé diaminé<br />
1.1. Série 1 : Composés phénoliques <strong>et</strong> non phénolique <strong>de</strong> la série <strong>de</strong>s diaryl-<br />
ferrocényl-butènes.<br />
Ce sont <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> P41 (Hillard, E. A (b). <strong>et</strong> al., 2007), P85 (Top, S. <strong>et</strong> al., 2001) <strong>et</strong> P5<br />
(Jaouen, G. <strong>et</strong> al., 2000) (Figure 26).<br />
U.P.M.C./U.S. 62<br />
2010
Fe<br />
P41<br />
Fe<br />
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
U.P.M.C./U.S. 63<br />
2010<br />
OH<br />
Fe<br />
OH<br />
OH<br />
P85 P5 (Ferrociphénol)<br />
Figure 26 : Composés phénoliques <strong>et</strong> non phénoliques (série <strong>de</strong>s diaryl-ferrocényl-butènes)<br />
Les <strong>composés</strong> <strong>de</strong> c<strong>et</strong>te série ont été synthétisés selon le schéma 1. La métho<strong>de</strong> consiste<br />
d’abord à préparer le propionylferrocène par la réaction <strong>de</strong> Frie<strong>de</strong>l <strong>et</strong> Crafts entre le ferrocène<br />
<strong>et</strong> le chlorure <strong>de</strong> propionyle. On effectue ensuite la réaction <strong>de</strong> couplage <strong>de</strong> McMurry entre le<br />
propionylferrocène <strong>et</strong> la benzophénone appropriée.<br />
Fe<br />
Fe<br />
O<br />
O<br />
Cl<br />
O<br />
R 2<br />
R 1<br />
AlCl 3<br />
CH 2Cl 2<br />
TiCl 4/Zn<br />
THF<br />
Schéma 1 : <strong>Synthèse</strong> <strong>de</strong> la série 1<br />
Fe<br />
Fe<br />
O<br />
R 1 , R 2 = H, OH<br />
Les <strong>composés</strong> P41, P5 (ferrociphénol) <strong>et</strong> P85 ont été dèjà synthétisé au laboratoire. Seul le<br />
P85 a été resynthétisé.<br />
1.2. Série 2 : Complexes <strong>de</strong> Fe, <strong>de</strong> Ru, <strong>de</strong> Re <strong>et</strong> <strong>de</strong> Mn du diphénol butène<br />
La <strong>de</strong>uxième catégorie concerne les complexes P5, P88 (Hillard, E. A (a). <strong>et</strong> al., 2007), P89<br />
(Hillard, E. A (a). <strong>et</strong> al., 2007) <strong>et</strong> P90 (Hillard, E. A (a). <strong>et</strong> al., 2007) (Figure 27).<br />
R 2<br />
R 1
Fe<br />
OH<br />
OH<br />
P5 (Ferrociphénol)<br />
Ru<br />
P88<br />
OH<br />
OH<br />
Re(CO)3 OH<br />
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
U.P.M.C./U.S. 64<br />
2010<br />
P89<br />
OH<br />
OH<br />
Mn(CO)3 OH<br />
Figure 27 : Complexes <strong>de</strong> Fe, <strong>de</strong> Ru, <strong>de</strong> Re <strong>et</strong> <strong>de</strong> Mn du diphénol butène<br />
Le composé P5 (ferrociphénol) fait aussi partie <strong>de</strong> c<strong>et</strong>te série. Les autres <strong>composés</strong> ont été<br />
préparés selon une procédure similaire à celui du P5 (schéma 2).<br />
ML<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
TiCl 4/Zn<br />
THF<br />
Schéma 2 : <strong>Synthèse</strong> <strong>de</strong> la série 2<br />
Les <strong>composés</strong> P88 <strong>et</strong> P89 ont été <strong>de</strong> nouveau synthétisés.<br />
1.3. Série 3 : Ami<strong>de</strong>s analogues du ferrociphénol<br />
OH<br />
ML OH<br />
P90<br />
ML = RuCp, Re(CO) 3, Mn(CO) 3<br />
La troisième catégorie concerne les ami<strong>de</strong>s analogues du ferrociphénol P314, P315, P316,<br />
P317 <strong>et</strong> P407. L’ami<strong>de</strong> P314 a été déjà synthétisé (Pigeon, P. <strong>et</strong> al., 2009), les autres ami<strong>de</strong>s<br />
sont <strong>de</strong> nouveaux <strong>composés</strong> (Figure 28).
Fe<br />
P314<br />
HN<br />
O<br />
Fe<br />
P315<br />
HN<br />
O<br />
Fe<br />
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
U.P.M.C./U.S. 65<br />
2010<br />
HN<br />
O<br />
Fe<br />
HN<br />
O<br />
Fe<br />
P316 P317 P407<br />
Figure 28 : Ami<strong>de</strong>s analogues du ferrociphénol<br />
Les ami<strong>de</strong>s P314, P315, P316, <strong>et</strong> P317 ont été préparés par la réaction <strong>de</strong> chlorure d’aci<strong>de</strong><br />
approprié sur le 1-para-aminophényl-2-ferrocényl-but-1-ène P35 (schéma 3).<br />
Fe<br />
P35<br />
NH 2<br />
RCOCl, pyridine<br />
THF<br />
Fe<br />
Schéma 3 : <strong>Synthèse</strong> <strong>de</strong> la série 3<br />
Les <strong>composés</strong> P35 <strong>et</strong> P314 sont déjà connus mais ont été resynthétisés.<br />
.<br />
HN<br />
O<br />
R<br />
P314<br />
P315<br />
P316<br />
P317<br />
R = Me<br />
R = Et<br />
R = iPr<br />
R = tBu<br />
Pour la synthèse du composé P407, nous avons d’abord préparé la cétone P312 en faisant<br />
réagir la 3,4-dihydro-2(1H)-quinolinone avec le chlorure <strong>de</strong> benzoyle en présence d’AlCl3<br />
(Martinez, G.R. <strong>et</strong> al., 1992) (schéma 4).<br />
HN<br />
O
Fe<br />
HN<br />
O<br />
O<br />
O<br />
PhCOCl, AlCl 3<br />
CH 2Cl 2<br />
HN<br />
P312<br />
O<br />
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
U.P.M.C./U.S. 66<br />
2010<br />
O<br />
TiCl 4/Zn<br />
THF<br />
HN<br />
O<br />
Fe<br />
P312<br />
P407<br />
Schéma 4 : <strong>Synthèse</strong> du P312 <strong>et</strong> essai <strong>de</strong> synthèse du P407<br />
La réaction <strong>de</strong> McMurry entre la cétone P312 <strong>et</strong> le propionylferrocène P8 n’a pas abouti au<br />
produit P407. Cela semble être dû au fait que la fonction ami<strong>de</strong> désactive le réactif <strong>de</strong><br />
McMurry. En eff<strong>et</strong>, P8 est une cétone ferrocénique très réactive en McMurry. Quand on lui<br />
oppose une cétone peu réactive, P8 préfère réagir sur elle-même très rapi<strong>de</strong>ment pour donner<br />
un composé d’homocouplage plutôt que <strong>de</strong> réagir avec l’autre cétone. Ainsi en moins <strong>de</strong> 2<br />
heures, P8 ayant totalement disparut, ce phénomène explique la plupart <strong>de</strong>s échecs <strong>de</strong>s<br />
réactions <strong>de</strong> McMurry.<br />
Cependant, ce n’est pas le cas ici. La réaction a été refaite pendant 6 jours au lieu <strong>de</strong>s 2 heures<br />
habituels <strong>et</strong> nous avons récupéré la plus gran<strong>de</strong> partie du P8 mis en jeu. Ceci est une preuve<br />
d’empoisonnement du réactif <strong>de</strong> McMurry par P312, car même la réaction très rapi<strong>de</strong> <strong>de</strong><br />
formation <strong>de</strong> P426 par disparition en moins <strong>de</strong> 2 heures <strong>de</strong> P8 n’aboutit pas (en réalité, nous<br />
avons obtenu une faible quantité <strong>de</strong> P426, là ou le ren<strong>de</strong>ment aurait dû être presque<br />
quantitatif). Notons que ce phénomène a été constaté dans le laboratoire dans d’autres<br />
McMurry m<strong>et</strong>tant en jeu <strong>de</strong>s cétones porteuses <strong>de</strong> groupes amine ou ami<strong>de</strong>.<br />
HN<br />
O
Fe Fe<br />
P426<br />
Figure 29 : Produit d’homocouplage P426<br />
1.4. Série 4 : Amines d’aryl-ferrocényl-butène<br />
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
La quatrième catégorie concerne les amines d’aryl-ferrocényl-butène P323, P371, P322 <strong>et</strong><br />
P321 (Figure 30).<br />
Fe<br />
P321<br />
N<br />
Fe<br />
P322<br />
N<br />
U.P.M.C./U.S. 67<br />
2010<br />
Fe<br />
H<br />
P323<br />
NH 2<br />
Figure 30 : Amines d’aryl-ferrocényl-butène<br />
La réaction <strong>de</strong> couplage <strong>de</strong> McMurry entre le propionylferrocène <strong>et</strong> la cétone appropriée a été<br />
Fe<br />
P371<br />
utilisée pour la synthèse <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> P323, P371, P322 <strong>et</strong> P321 (schéma 5).<br />
NH 2
Fe<br />
O<br />
P8<br />
O<br />
Ar<br />
R 1<br />
R 1 = CH 3 ; Ar = N<br />
R 1 = CH 3 ; Ar =<br />
R 1 = H; Ar = NH2<br />
R 1 = CH 3 ; Ar = NH2<br />
N<br />
TiCl 4 /Zn<br />
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
U.P.M.C./U.S. 68<br />
2010<br />
THF<br />
Fe<br />
Ar<br />
R 1<br />
P321 : pas <strong>de</strong> f ormation<br />
P322 : pas <strong>de</strong> f ormation<br />
P323 : pas <strong>de</strong> f ormation<br />
P371 : 10%<br />
Schéma 5 : <strong>Synthèse</strong> <strong>de</strong> la série 4<br />
C<strong>et</strong>te réaction <strong>de</strong> couplage n’a pas fourni les <strong>composés</strong> P323, P322 <strong>et</strong> P321. Seul le composé<br />
P371 a été obtenu avec un ren<strong>de</strong>ment <strong>de</strong> 10%.<br />
Dans tous les cas nous avons obtenu principalement l’homocouplage conduisant à P426.<br />
Pour les <strong>composés</strong> dérivés <strong>de</strong> la pyridine P321 <strong>et</strong> P322, c’est le cas fréquent d’échec dû à la<br />
trop gran<strong>de</strong> réactivité <strong>de</strong> P8 qui est responsable (pas <strong>de</strong> trace <strong>de</strong> P8 en 2 heures).<br />
Par contre, pour les amines P323 <strong>et</strong> P371, c’est plutôt le phénomène d’empoisonnement du<br />
réactif <strong>de</strong> McMurry qui est responsable <strong>de</strong> l’échec ou du mauvais ren<strong>de</strong>ment (reste d’une<br />
certaine quantité <strong>de</strong> P8 au-<strong>de</strong>là <strong>de</strong> 2 heures).<br />
1.5. Série 5 : Composés diaminés organiques <strong>et</strong> ferrocéniques<br />
La cinquième catégorie concerne les <strong>composés</strong> diaminés organiques <strong>et</strong> ferrocéniques P490,<br />
P305, P116, P283 <strong>et</strong> P15 (ferrocifène) (Top, S. <strong>et</strong> al., 2003) (Figure 31). Les <strong>composés</strong> P305<br />
<strong>et</strong> P15 (ferrocifène) ont été disponibles au laboratoire alors que le composé P283 a été<br />
synthétisé par Meral Görmen du Laboratoire.
O<br />
O(CH 2 ) 3 NMe 2<br />
O(CH 2 ) 3 NMe 2<br />
P490 P305<br />
Fe<br />
P15<br />
OH<br />
O(CH 2) 3NMe 2<br />
O(CH 2) 3NMe 2<br />
O(CH 2) 3NMe 2<br />
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
U.P.M.C./U.S. 69<br />
2010<br />
Fe<br />
Fe<br />
P283<br />
P116<br />
O(CH 2) 3NMe 2<br />
O(CH 2) 3NMe 2<br />
O(CH 2 ) 3 NMe 2<br />
O(CH 2 ) 3 NMe 2<br />
Figure 31 : Composés diaminés organiques <strong>et</strong> ferrocéniques<br />
La cétone 4,4’-bis-diméthylaminopropoxy-benzophénone P490 a été préparée avec un<br />
ren<strong>de</strong>ment <strong>de</strong> 88% par réaction <strong>de</strong> la diméthylamine sur le composé dibromé P477, lequel est<br />
obtenu par alkylation <strong>de</strong> la 4,4’-bis-dihydroxybenzophénone, par le dibromopropane (schéma<br />
6).<br />
Le composé bromé a été préparé en m<strong>et</strong>tant en jeu un excès <strong>de</strong> base (2 équivalents) en plus <strong>de</strong><br />
l’excès <strong>de</strong> dibromopropane (5 équivalents), par rapport au mo<strong>de</strong> opératoire initialement prévu<br />
pour synthétiser le composé monobromé (1 équivalent) (Top, S. <strong>et</strong> al., 2004).<br />
Le composé dibromé P477 est placé dans un tube à pression avec une solution <strong>de</strong><br />
diméthylamine 2 M dans le méthanol <strong>et</strong> chauffé 24 H à 60°C. On obtient la cétone diaminée<br />
P490 avec un ren<strong>de</strong>ment <strong>de</strong> 88%. En remplaçant la diméthylamine par la pyrrolidine, on obtient<br />
la cétoné diaminée P583 avec un ren<strong>de</strong>ment presque quantitatif.
O<br />
OH<br />
OH<br />
1) KH, THF/DMF<br />
O<br />
2) Br<br />
Br<br />
3<br />
4,4'-bis-hydroxybenzophénone<br />
O<br />
P490<br />
O(CH 2 ) 3 NMe 2<br />
O(CH 2 ) 3 NMe 2<br />
O(CH2 ) 3Br P196<br />
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
U.P.M.C./U.S. 70<br />
2010<br />
OH<br />
O<br />
HNMe 2<br />
MeOH<br />
O(CH 2 ) 3 Br<br />
O(CH2 ) 3Br P477<br />
MeOH<br />
O(CH 2 ) 3 N<br />
O(CH 2 ) 3 N<br />
Schéma 6 : <strong>Synthèse</strong> <strong>de</strong>s cétones 4,4’-bis-diméthylaminopropoxy-benzophénone P490 <strong>et</strong> 4,4’-<br />
O<br />
P583<br />
bis-pyrrolidinopropoxy-benzophénone P583<br />
Pour synthétiser le composé P116, nous aurions pu envisager <strong>de</strong> faire une réaction <strong>de</strong><br />
McMurry entre la cétone P490 précé<strong>de</strong>mment préparée <strong>et</strong> le propionylferrocene (P8) (voie 1).<br />
C<strong>et</strong>te voie n’a pas été tentée car, en plus <strong>de</strong>s problèmes causés par les fonctions amine lors du<br />
McMurry (que nous avons vus précé<strong>de</strong>mment), s’ajoute un problème <strong>de</strong> forte polarité <strong>de</strong>s<br />
produits provoqué par celle-ci rendant la purification plus difficile (utilisation <strong>de</strong><br />
triéthylamine).<br />
On avait cependant tenté <strong>de</strong> synthétiser le composé P476 en faisant une réaction <strong>de</strong> McMurry<br />
entre P477 <strong>et</strong> P8 (voie 2) mais, bien que la réaction aboutit, le mélange <strong>de</strong>s trois produits <strong>de</strong><br />
réaction (P476 <strong>et</strong> les <strong>de</strong>ux produits d’homocouplage, dont P426) est très difficilement<br />
séparable par chromatographie (polarités proches dues à l’absence <strong>de</strong> groupe polaire). On a dû<br />
utiliser une troisième voie.<br />
En utilisant la même procédure, que pour la synthèse <strong>de</strong> P490, le dérivé ferrocénique P116 a<br />
été préparé à partir <strong>de</strong> 1,1-(di-p-hydroxyphényl)-2-ferrocényl-but-1-ène, P5 (Schéma 7).<br />
NH
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
Le diphénol P5 à tout d’abord été alkylé par le dibromopropane. C<strong>et</strong>te fois, lors <strong>de</strong> la réaction<br />
<strong>de</strong> formation du composé dibromé P476, le composé monobromé P193 ainsi que <strong>de</strong>s traces <strong>de</strong><br />
produit <strong>de</strong> départ P5 ont été facilement éliminés par chromatographie grâce à la présence <strong>de</strong><br />
zéro, un <strong>et</strong> <strong>de</strong>ux groupes phénol rendant les produits très différents du point <strong>de</strong> vu polarité<br />
(contrairement à la voie 2). Cependant, le produit P476 est contaminé par 2 produits en<br />
quantité faible <strong>et</strong> inséparables correspondant aux <strong>composés</strong> <strong>de</strong> mono <strong>et</strong> di<br />
déshydrohalogénation. Le composé P476 est utilisé sans autre purification lors <strong>de</strong> la <strong>de</strong>uxième<br />
étape. En eff<strong>et</strong>, le produit diaminé P116 est très polaire <strong>et</strong> facilement séparable <strong>de</strong>s <strong>de</strong>ux<br />
impur<strong>et</strong>és par chromatographie avec comme éluant une solution d’acétone avec 20 % <strong>de</strong><br />
triéthylamine.<br />
Fe<br />
P5<br />
OH<br />
OH<br />
1) NaH, THF/DMF<br />
2)<br />
Br<br />
Br<br />
3<br />
Fe<br />
P193<br />
OH<br />
O(CH 2) 3Br<br />
U.P.M.C./U.S. 71<br />
2010<br />
Fe<br />
Fe<br />
P476<br />
HNMe 2<br />
MeOH<br />
P116<br />
Schéma 7 : <strong>Synthèse</strong> du dérivé ferrocénique P116<br />
O(CH2)3Br<br />
O(CH 2 ) 3 Br<br />
O(CH2)3NMe2<br />
O(CH 2) 3NMe 2<br />
1.6. Série 6 : Dérivés <strong>de</strong> �-glucose, <strong>de</strong> �-maltose <strong>et</strong> <strong>de</strong> �-cellobiose du ferrociphénol<br />
La sixième catégorie concerne les analogues du ferrociphénol protégés par un sucre P29,<br />
P346, P28, P347, P27, P345, P350 <strong>et</strong> P42 (Figure 32). La transformation du ferrociphénol en<br />
dérivés sucrés a pour but <strong>de</strong> le rendre soluble dans l’eau pour faciliter son utilisation<br />
thérapeutique.
Fe<br />
Fe<br />
AcO OAc<br />
OAc<br />
AcO<br />
O<br />
O<br />
P28<br />
AcO OAc<br />
OAc<br />
AcO<br />
O<br />
O<br />
P27<br />
OH<br />
Fe<br />
P346<br />
OAc<br />
O<br />
O<br />
O<br />
Fe<br />
Fe<br />
P29<br />
OAc<br />
O<br />
O<br />
OAc<br />
OAc<br />
OAc<br />
O<br />
AcO OAc<br />
OAc<br />
AcO<br />
O<br />
O<br />
OAc<br />
O<br />
OAc<br />
O<br />
O<br />
O<br />
P347<br />
OAc<br />
O<br />
OAc<br />
OAc<br />
OAc<br />
OAc<br />
OAc<br />
OAc<br />
OAc<br />
OAc<br />
OAc<br />
OAc<br />
OAc<br />
O<br />
O<br />
OAc<br />
OAc<br />
OAc<br />
OAc<br />
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
U.P.M.C./U.S. 72<br />
2010<br />
O<br />
OAc<br />
OAc<br />
Fe<br />
Fe<br />
Fe<br />
HO OH<br />
OH<br />
HO<br />
O<br />
O<br />
P42<br />
OAc<br />
O<br />
P350<br />
OAc<br />
O<br />
P345<br />
OAc<br />
OAc<br />
O<br />
O<br />
O<br />
OAc<br />
OAc<br />
O<br />
Figure 32 : Analogues <strong>de</strong> ferrociphénol protégés par un sucre<br />
OH<br />
O<br />
OAc<br />
OAc<br />
OAc<br />
OAc<br />
OAc<br />
OAc<br />
O<br />
OAc<br />
OAc
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
Ces <strong>composés</strong> ont été préparés par la réaction <strong>de</strong> sucre sur les dérivés ferrocénique en<br />
présence <strong>de</strong> BF3 dans du dichlorométhane (Schéma 8).<br />
Fe<br />
R 2<br />
R 1<br />
R 1 , R 2 = H, OH<br />
AcOR 3<br />
BF 3.Et 2O<br />
CH 2Cl 2<br />
U.P.M.C./U.S. 73<br />
2010<br />
Fe<br />
O<br />
R 1<br />
R 3<br />
ou<br />
R 1 = H, OH<br />
Schéma 8 : <strong>Synthèse</strong> <strong>de</strong> la série 6<br />
Les <strong>composés</strong> P28 <strong>et</strong> P29 (dérivés <strong>de</strong> �-glucose) ont été obtenus avec un ren<strong>de</strong>ment <strong>de</strong> 16%<br />
<strong>et</strong> 19% respectivement. Le composé P27 qui aurait dû être obtenu en même temps que P29<br />
n’a pas été observé. Les <strong>composés</strong> P347 (dérivé <strong>de</strong> �-maltose) <strong>et</strong> P350 (dérivé <strong>de</strong> �-<br />
cellobiose) ne se sont pas formés selon c<strong>et</strong>te voie <strong>de</strong> synthèse. Les <strong>composés</strong> P345 <strong>et</strong> P346<br />
(dérivés <strong>de</strong> �-maltose) ont été obtenu avec <strong>de</strong>s ren<strong>de</strong>ments <strong>de</strong> 12% <strong>et</strong> 4%, respectivement.<br />
Fe<br />
AcO OAc<br />
OAc<br />
AcO<br />
O<br />
O<br />
P28<br />
Na, MeOH<br />
amberlite<br />
Fe<br />
Schéma 9 : <strong>Synthèse</strong> du composé P42<br />
HO<br />
P42<br />
Fe<br />
HO OH<br />
La déprotection du composé P28 avec méthanolate <strong>et</strong> amberlite produit le composé P42<br />
(schéma 9). P42 est le seul composé déprotégé dans c<strong>et</strong>te étu<strong>de</strong>.<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
R 3<br />
R 3
1.7. Série 7 : Sels citriques du ferrocifène <strong>et</strong> d’un produit diaminé<br />
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
Dans le même but que pour les <strong>composés</strong> glycosilés, le ferrocifène P15 <strong>et</strong> le dérivé diaminé<br />
P116 ont été transformés en sels <strong>de</strong> citrates. L’addition <strong>de</strong> l’aci<strong>de</strong> citrique dissous dans du<br />
THF à la solution <strong>de</strong> P15 ou P116 dissous dans du mélange éther éthylique/THF produit<br />
immédiatement le sel <strong>de</strong> citrate <strong>de</strong> P514 ou <strong>de</strong> P493 qui précipite (Schéma 10).<br />
Fe<br />
Fe<br />
P15<br />
OH<br />
O(CH 2 ) 3 NMe 2<br />
HO<br />
HOOC<br />
OH<br />
COOH<br />
COOH<br />
HO<br />
OOC<br />
O(CH 2) 3NMe 2H<br />
COOH<br />
COOH<br />
P514 P493<br />
U.P.M.C./U.S. 74<br />
2010<br />
Fe<br />
Fe<br />
P116<br />
HO<br />
HOOC<br />
O(CH 2 ) 3 NMe 2<br />
O(CH 2) 3NMe 2<br />
COOH<br />
COOH<br />
O(CH 2) 3NMe 2H<br />
O(CH 2 ) 3 NMe 2 H<br />
OOC<br />
OOC<br />
Schéma 10 : <strong>Synthèse</strong> <strong>de</strong>s sels citriques du P15 <strong>et</strong> du P116<br />
OH<br />
COOH<br />
1.8. Etu<strong>de</strong> <strong>de</strong> la solubilité dans l’eau <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> aminés ferrocéniques <strong>et</strong> <strong>de</strong> <strong>leurs</strong><br />
sels d’aci<strong>de</strong> citrique<br />
Nous avons mené une étu<strong>de</strong> <strong>de</strong> solubilité dans l’eau <strong>et</strong> dans l’éthanol du P116, P15 <strong>et</strong> <strong>de</strong> <strong>leurs</strong><br />
sels d’aci<strong>de</strong> citrique P493 <strong>et</strong> P514. Pour ce faire, 6,21 µmol <strong>de</strong> chaque produit sont placés<br />
dans un tube à essai. 0.5 mL d’eau ou d’éthanol est ajouté dans chaque tube. Ensuite 0.5 mL<br />
d’eau, d’éthanol ou <strong>de</strong> HCl (N/10) <strong>et</strong> 4 mL d’eau sont successivement ajoutés dans chaque<br />
tube. Le tableau 3, résume les différentes opérations effectuées.<br />
On voit clairement que le citrate P493 est très soluble dans l’eau, il se dissout complètement.<br />
Par contre il est seulement partiellement soluble dans l’éthanol. Au contraire du P493, le
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
citrate P514 est plus soluble dans l’éthanol que dans l’eau. Le ferrocifène P15 qui est<br />
insoluble dans l’eau est presque entièrement soluble dans l’éthanol.<br />
L’addition <strong>de</strong> 0,5 mL d’eau dans le tube contenant le P493 préalablement partiellement<br />
solubilisé dans 0,5 mL d’éthanol, rend le produit soluble dans la solution.<br />
Le composé P514 reste toujours insoluble dans l’eau après addition supplémentaire <strong>de</strong> 0,5 mL<br />
d’eau <strong>et</strong> un léger trouble se forme dans le tube contenant le P514 préalablement dissout dans<br />
<strong>de</strong> l’éthanol. Quant au P15 <strong>et</strong> P116, préalablement dissout dans l’éthanol, il reste encore<br />
soluble après addition <strong>de</strong> l’eau <strong>et</strong> se solubilise. Pour ces produits, l’addition <strong>de</strong> 0,5 mL <strong>de</strong> HCl<br />
a permis <strong>de</strong> solubiliser totalement le P116 <strong>et</strong> partiellement le P15.<br />
4 mL d’eau supplémentaire sont ajoutés à chaque tube. Comme attendu, l’augmentation <strong>de</strong> la<br />
quantité d’eau favorise la solubilité du composé P493. Le composé P514 reste insoluble <strong>et</strong> il<br />
commence à se précipiter dans le tube où il était initialement dissout dans l’éthanol. Le<br />
trouble <strong>de</strong>vient évi<strong>de</strong>nt pour le tube contenant les produits P15 <strong>et</strong> P116, préalablement dissout<br />
dans l’éthanol.<br />
Après un mois, pendant lequel les différents tubes ont été laissés décanter, tous les tubes sont<br />
restés colorés prouvant qu’une partie <strong>de</strong> produit reste encore soluble dans la solution. Le tube<br />
contenant le composé P493 est limpi<strong>de</strong> alors que dans les tubes contenant les <strong>composés</strong> P116,<br />
P15 <strong>et</strong> P514, une huile orange apparaît au fond du tube. Cependant, il est à noter que les<br />
tubes <strong>de</strong>s produits P15 <strong>et</strong> P116, préalablement additionnés <strong>de</strong> HCl restent plus solubles que<br />
ceux auxquels on n’a pas fait c<strong>et</strong> ajout.<br />
Ce test prouve que le sel citrique P493 est le composé le plus soluble dans l’eau. La<br />
transformation du composé en sel citrique facilite la solubilité du produit dans l’eau ce qui<br />
améliore donc en principe sa biodisponibilité. En ce qui concerne le ferrocifène P15,<br />
visuellement sa transformation en sel citrique améliore aussi sa solubilité dans l’eau mais c<strong>et</strong><br />
eff<strong>et</strong> est similaire celui apporté par le chlorhydrate.<br />
La gran<strong>de</strong> solubilité <strong>de</strong> P493 dans l’eau semble indiquer que les <strong>de</strong>ux fonctions amine sont<br />
protonées, ce qui en fait un disel plus hydrophile. La RMN semble confirmer c<strong>et</strong>te théorie car<br />
U.P.M.C./U.S. 75<br />
2010
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
les méthylènes à côté <strong>de</strong>s atomes d’azote semblent être à peu près équivalents (ce qui ne serait<br />
pas le cas si une fonction amine était protonée <strong>et</strong> pas l’autre).<br />
Tableau 3 : Solubilité dans l’eau <strong>et</strong> dans l’éthanol <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> aminés ferrocéniques <strong>et</strong> <strong>de</strong><br />
<strong>leurs</strong> sels d’aci<strong>de</strong> citrique<br />
Produits<br />
Etape<br />
1<br />
Etape<br />
2<br />
Etape<br />
3<br />
Etape<br />
4<br />
P116<br />
0,5 ml<br />
H20<br />
0,5 ml<br />
HCl<br />
4 ml<br />
H2O<br />
P116<br />
0,5 ml<br />
Ethanol<br />
0,5 ml<br />
Ethanol<br />
4 ml<br />
H2O<br />
P493<br />
0,5 ml<br />
H2O<br />
0,5 ml<br />
H2O<br />
4 ml<br />
H2O<br />
P493<br />
0,5 ml<br />
Ethanol<br />
0,5 ml<br />
H2O<br />
4 ml<br />
H2O<br />
U.P.M.C./U.S. 76<br />
2010<br />
P15<br />
0,5 ml<br />
H20<br />
0,5 ml<br />
HCl<br />
4 ml<br />
H2O<br />
Décantation (1 mois)<br />
P15<br />
0,5 ml<br />
Ethanol<br />
0,5 ml<br />
Ethanol<br />
4 ml<br />
H2O<br />
P514<br />
0,5 ml<br />
H2O<br />
0,5 ml<br />
H2O<br />
4 ml<br />
H2O<br />
P514<br />
0,5 ml<br />
Ethanol<br />
0,5 ml<br />
H2O<br />
4 ml<br />
H2O
1.9. Conclusion<br />
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
Ce chapitre décrit les différents dérivés <strong>organométalliques</strong> <strong>de</strong> la série du tamoxifène,<br />
médicament actuellement utilisé pour le traitement du cancer du sein. La majorité <strong>de</strong>s produits<br />
ont été déjà étudiés pour leur activité antitumorale. Certains produits ont été synthétisés <strong>de</strong><br />
nouveau pour la présente étu<strong>de</strong> <strong>et</strong> d’autres sont <strong>de</strong> nouveaux <strong>composés</strong> synthétisés pour la<br />
première fois.<br />
Certains dérivés <strong>de</strong> la pyridine, <strong>de</strong> l’aniline ou <strong>de</strong>s sels <strong>de</strong> sucre n’ont pas pu être synthétisés.<br />
Ces différents produits ont été testés pour leur activité bactérici<strong>de</strong> ou/<strong>et</strong> fongici<strong>de</strong>. Les<br />
résultats <strong>de</strong> ces tests seront décrits dans le chapitre suivant.<br />
1.10. Partie expérimentale<br />
Certaines réactions ont été effectuées sous atmosphère d’argon. Le THF a été distillé sur<br />
sodium/benzophénone. Le dichlorométhane a été distillé sur P2O5. Les autres réactifs <strong>et</strong><br />
solvants utilisés, sont <strong>de</strong>s produits commerciaux. Les chromatographies sur colonne ont été<br />
réalisées sur gel <strong>de</strong> silice Merck 60. Les points <strong>de</strong> fusion <strong>de</strong>s produits ont été mesurés à l’ai<strong>de</strong><br />
d’un banc Köfler. Les spectres infrarouges ont été enregistrés sur un spectromètre IR-FT<br />
BOMEM Michelson-100. Les analyses RMN 1 H <strong>et</strong> 13 C ont été effectuées sur un appareil<br />
Bruker 300 MHz. Les déplacements chimiques (�) sont mesurés en parties par millions (ppm)<br />
<strong>et</strong> les constantes <strong>de</strong> couplage (J) sont calculées en Hertz (Hz). Les analyses élémentaires <strong>de</strong>s<br />
nouveaux produits ont été effectuées au Service <strong>de</strong> Microanalyse <strong>de</strong> l’I.C.S.N. à Gif sur<br />
Yv<strong>et</strong>te.<br />
1.10.1. <strong>Synthèse</strong> du propionylferrocène, P8<br />
Fe<br />
Cl<br />
O<br />
U.P.M.C./U.S. 77<br />
2010<br />
AlCl 3<br />
CH 2Cl 2<br />
Schéma 11 : <strong>Synthèse</strong> du Propionylferrocène<br />
Fe<br />
O
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
A une solution <strong>de</strong> ferrocène (55,81 g ; 300 mmol ; 1,5 eq) dans 500 mL <strong>de</strong> CH2Cl2, est ajouté<br />
goutte-à-goutte le chlorure <strong>de</strong> propionyle (18,50 g ; 17 mL ; 200 mmol). AlCl3 (53,33 g ; 400<br />
mmol ; 2eq) est ensuite additionné progressivement <strong>et</strong> le mélange réactionnel est mis à agiter<br />
pendant 3 heures. Le mélange réactionnel est hydrolysé avec 100 mL d’eau. La phase aqueuse<br />
est extraite avec 4 x 100 mL <strong>de</strong> dichlorométhane. Les phases organiques sont rassemblées,<br />
séchées sur MgSO4 <strong>et</strong> concentrées sous vi<strong>de</strong>. Après évaporation du solvant, le produit obtenu<br />
est i<strong>de</strong>ntifié par RMN <strong>et</strong> servira à la suite <strong>de</strong> la synthèse (Modification du mo<strong>de</strong> opératoire <strong>de</strong><br />
Top, S. <strong>et</strong> al., 1997).<br />
1.10.2. <strong>Synthèse</strong> du (Z+E)-1-(4-hydroxyphényl)-1-phényl-2-ferrocényl-but-1-ène, P85<br />
Fe<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
TiCl 4/Zn<br />
Schéma 12 : <strong>Synthèse</strong> du (Z+E)-1-(4-hydroxyphényl)-1-phényl-2-ferrocényl-but-1-ène<br />
A à une suspension <strong>de</strong> Zn (7,84 g; 120 mmol ; 10,6 eq) dans 200 mL <strong>de</strong> THF, est ajouté à<br />
froid <strong>et</strong> goutte-à-goutte le tétrachlorure <strong>de</strong> titane (15,18 g ; 8,79 mL ; 80 mmol ; 7,1 eq). Le<br />
mélange obtenu est mis au reflux pendant 2 heures. On laisse revenir à la température<br />
ambiante avant d’additionner le mélange <strong>de</strong> 4-hydroxybenzophénone (2,24 g ; 11,3 mmol) <strong>et</strong><br />
le propionylferrocène (2,74 g ; 11,3 mmol) préalablement dissous dans 50 mL <strong>de</strong> THF.<br />
Après <strong>de</strong>ux heures <strong>de</strong> reflux, le mélange réactionnel est versé dans 150 mL d’eau, acidifié<br />
avec du HCl 0,1N jusqu’à disparition <strong>de</strong> la coloration noire, puis la phase aqueuse est extraite<br />
avec 3 x 120 mL <strong>de</strong> CH2Cl2. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgSO4 <strong>et</strong><br />
concentrées sous vi<strong>de</strong>. Le produit obtenu est purifié sur colonne <strong>de</strong> gel <strong>de</strong> silice avec comme<br />
éluant du dichlorométhane. Trois fractions ont été récupérées. La <strong>de</strong>uxième fraction<br />
correspond au composé P85, le ren<strong>de</strong>ment est <strong>de</strong> 13% (Top, S. <strong>et</strong> al., 1997 ; Top, S. <strong>et</strong> al.,<br />
2003).<br />
U.P.M.C./U.S. 78<br />
2010<br />
THF<br />
Fe<br />
P85<br />
OH
1.10.3. <strong>Synthèse</strong> du propionylcyclopentadiénylrhéniumtricarbonyle, P217<br />
Re(CO)3<br />
Cl<br />
O<br />
Re(CO)3<br />
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
U.P.M.C./U.S. 79<br />
2010<br />
AlCl 3<br />
CH 2Cl 2<br />
O<br />
P217<br />
Schéma 13 : <strong>Synthèse</strong> du Propionylcyclopentadiénylrhéniumtricarbonyle<br />
A une solution <strong>de</strong> CpRe(CO)3 (500 mg ; 1,49 mmol) dans 5 mL <strong>de</strong> CS2, est ajouté goutte à<br />
goutte le chlorure <strong>de</strong> propionyle (193 mg ; 2,09 mmol ; 1,4 eq). AlCl3 (267 mg, 2 mmoles) est<br />
ensuite additionné progressivement <strong>et</strong> le mélange réactionnel est mis au reflux pendant 2<br />
heures. La solution jaune avec un précipité orange est hydrolysée avec 30 mL d’eau. La phase<br />
aqueuse est extraite avec 4 x 50 mL <strong>de</strong> dichlorométhane. Les phases organiques sont<br />
rassemblées, séchées su MgSO4, filtrées <strong>et</strong> concentrées sous vi<strong>de</strong>. L’huile orange marron est<br />
purifiée sur colonne <strong>de</strong> gel <strong>de</strong> silice avec comme éluant le mélange CH2Cl2/éther : 50/50. On<br />
obtient 403 mg <strong>de</strong> P217 (ren<strong>de</strong>ment <strong>de</strong> 69%) (Jaouen, G. <strong>et</strong> al., 2001). Le produit est utilisé<br />
tel quel pour la suite <strong>de</strong> la réaction.<br />
1.10.4. <strong>Synthèse</strong> du propionylruthénocène, P215<br />
Ru<br />
Cl<br />
O<br />
AlCl 3<br />
CH 2Cl 2<br />
Schéma 14 : <strong>Synthèse</strong> du Propionylruthénocène<br />
A une solution <strong>de</strong> ruthénocène (1 g ; 4,3 mmol) dans 5 mL <strong>de</strong> CH2Cl2, est ajouté goutte-à-<br />
goutte le chlorure <strong>de</strong> propionyle (480 mg ; 0,45 mL ; 5,2 mmol ; 1,2 eq). AlCl3 (0.865 g, 6.5<br />
mmoles) est ensuite additionné progressivement <strong>et</strong> le mélange réactionnel est mis au reflux<br />
pendant 3 heures. La solution jaune est hydrolysée avec 50 mL d’eau. La phase aqueuse est<br />
extraite avec 4 x 50 mL dichlorométhane. Les phases organiques sont rassemblées, séchées<br />
sur MgSO4 <strong>et</strong> concentrées sous vi<strong>de</strong>. Le produit obtenu est purifié sur colonne <strong>de</strong> gel <strong>de</strong> silice<br />
Ru<br />
O<br />
P215
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
en utilisant l’éther comme éluant. On obtient 409 mg <strong>de</strong> P215 (ren<strong>de</strong>ment <strong>de</strong> 33%) (Pigeon,<br />
P. <strong>et</strong> al., 2005). Le produit est utilisé tel quel pour la suite <strong>de</strong> la réaction.<br />
1.10.5. <strong>Synthèse</strong> du propiopnylcyclopentadiénylmanganès<strong>et</strong>ricarbonyle, P218<br />
Le produit P218 a été synthétisé au sein du laboratoire selon la réaction suivante.<br />
Mn(CO)3<br />
Cl<br />
O<br />
Mn(CO)3<br />
U.P.M.C./U.S. 80<br />
2010<br />
AlCl 3<br />
CH 2 Cl 2<br />
O<br />
P218<br />
Schéma 15 : <strong>Synthèse</strong> du Propiopnylcyclopentadiénylmanganès<strong>et</strong>ricarbonyle<br />
1.10.6. <strong>Synthèse</strong> du 1,1-di(p-hydroxyphényl)-2-ruthénocényl-but-1-ène, P88<br />
Ru<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
TiCl 4 /Zn<br />
Schéma 16 : <strong>Synthèse</strong> du 1,1-di(p-hydroxyphényl)-2-ruthénocényl-but-1-ène<br />
A une suspension <strong>de</strong> Zn (651 mg; 10 mmol ; 7 eq) dans 20 mL <strong>de</strong> THF, est ajouté à froid <strong>et</strong><br />
goutte-à-goutte le tétrachlorure <strong>de</strong> titane (1,35 g ; 0,78 mL ; 7,1 mmol ; 5 eq). Le mélange<br />
obtenu est mis au reflux pendant 2 heures. On laisse revenir à la température ambiante avant<br />
d’additionner le mélange <strong>de</strong> 4,4’-dihydroxybenzophénone (0,61 g ; 2,8 mmol; 2eq) <strong>et</strong> <strong>de</strong> P215<br />
(0,41 g ; 1,42 mmol) préalablement dissouts dans 10 mL <strong>de</strong> THF. Après <strong>de</strong>ux heures <strong>de</strong><br />
reflux, le mélange réactionnel est traité avec 60 mL d’eau. La phase aqueuse est extraite avec<br />
3 x 120 mL <strong>de</strong> CH2Cl2. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgSO4, filtrées<br />
<strong>et</strong> concentrées sous vi<strong>de</strong>. Le produit obtenu est purifié sur colonne <strong>de</strong> gel <strong>de</strong> silice avec<br />
comme éluant le mélange éther/éther <strong>de</strong> pétrole (2/1). On obtient le P88 avec un ren<strong>de</strong>ment <strong>de</strong><br />
THF<br />
Ru<br />
P88<br />
OH<br />
OH
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
82%. Il est recristallisé dans éther/hexane ; Le produit est i<strong>de</strong>ntifié par RMN. Données RMN<br />
(Hillard, E.A. (a) <strong>et</strong> al., 2007).<br />
1.10.7. <strong>Synthèse</strong> du 1,1-di(p-hydroxyphényl)-2-cyclopentadiénylrehniumtricarbonyl-but-<br />
1-ène, P89<br />
O<br />
Re(CO)3<br />
P217<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
TiCl 4/Zn<br />
U.P.M.C./U.S. 81<br />
2010<br />
THF<br />
Re(CO)3<br />
Schéma 17 : <strong>Synthèse</strong> du 1,1-di(p-hydroxyphényl)-2-cyclopentadiénylrehniumtricarbonyl-but-1-ène<br />
A une suspension <strong>de</strong> Zn (818 mg; 12,5 mmol ; 7 eq) dans 25 mL <strong>de</strong> THF, est ajouté à froid <strong>et</strong><br />
goutte à goutte le tétrachlorure <strong>de</strong> titane (1,69 g ; 0,98 mL ; 8,9 mmol ; 5eq). Le mélange<br />
obtenu est mis au reflux pendant 2 heures. On laisse revenir à la température ambiante avant<br />
d’additionner le mélange <strong>de</strong> 4,4’-dihydroxybenzophenone (0,766 g ; 3,6 mmol ; 2 eq) <strong>et</strong> le<br />
P217 (0,7 g ; 1,79 mmol ; 1eq) préalablement dissouts dans 10 mL <strong>de</strong> THF. Après <strong>de</strong>ux<br />
heures <strong>de</strong> reflux, le mélange réactionnel est traité avec 60 mL d’une solution aqueuse <strong>de</strong><br />
K2CO3 à 10%. La phase aqueuse est extraite avec 3 x 120 mL <strong>de</strong> CH2Cl2. Les phases<br />
organiques rassemblées, séchées sur MgSO4 <strong>et</strong> concentrées sous vi<strong>de</strong>. Le produit obtenu est<br />
purifié sur colonne <strong>de</strong> silice avec comme éluant éther/éther <strong>de</strong> pétrole (3/1). On obtient le<br />
composé P89 avec un ren<strong>de</strong>ment <strong>de</strong> 76%. Il est recristallisé dans le mélange éther/hexane. Le<br />
produit est i<strong>de</strong>ntifié par RMN. Données RMN (Hillard, E.A. (a) <strong>et</strong> al., 2007).<br />
1.10.8. <strong>Synthèse</strong> du (Z+E)-1-(p-aminophényl)-1-phényl-2-ferrocényl-but-1-ène, P35<br />
Fe<br />
O<br />
O<br />
NO 2<br />
TiCl 4/Zn<br />
Schéma 18 : <strong>Synthèse</strong> du (Z+E)-1-(p-aminophényl)-1-phényl-2-ferrocényl-but-1-ène<br />
THF<br />
Fe<br />
P35<br />
OH<br />
OH<br />
NH 2<br />
P89
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
A une suspension <strong>de</strong> Zn (15,68 g; 240 mmol ; 8 eq) dans 200 mL <strong>de</strong> THF, est ajouté à froid <strong>et</strong><br />
goutte-à-goutte le tétrachlorure <strong>de</strong> titane (34,15 g ; 19,8 mL ; 180 mmol ; 6 eq). Le mélange<br />
obtenu est mis au reflux pendant 2 heures. On laisse revenir à la température ambiante avant<br />
d’additionner le mélange <strong>de</strong> 4-nitrobenzophénone (6,817 g ; 34,38 mmol) <strong>et</strong> le<br />
propionylferrocène (7,26 g ; 30 mmol) préalablement dissouts dans 50 mL <strong>de</strong> THF. Après<br />
<strong>de</strong>ux heures <strong>de</strong> reflux, le mélange réactionnel est versé dans 150 mL d’eau, acidifié avec du<br />
HCl 0,1N jusqu’à disparition <strong>de</strong> la coloration noire, puis la phase aqueuse est extraite avec 3 x<br />
120 mL <strong>de</strong> CH2Cl2. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgSO4 <strong>et</strong><br />
concentrées sous vi<strong>de</strong>. Le produit obtenu est purifié sur colonne <strong>de</strong> gel <strong>de</strong> silice avec comme<br />
éluant du dichlorométhane, la fraction contenant le produit P35 est repurifié par HPLC<br />
préparative. . Le produit est i<strong>de</strong>ntifié par RMN. (Buriez, O. <strong>et</strong> al., 2008 ; Pigeon, P. <strong>et</strong> al.,<br />
2009).<br />
.<br />
1.10.9. <strong>Synthèse</strong> du (Z+E)-1-(p-propionylaminophényl)-1-phényl-2-ferrocényl-but-1-ène,<br />
P315<br />
Fe<br />
P35<br />
NH 2<br />
EtCOCl, pyridine<br />
THF<br />
U.P.M.C./U.S. 82<br />
2010<br />
Fe<br />
HN<br />
P315<br />
Schéma 19 : <strong>Synthèse</strong> du (Z+E)-1-(p-propionylaminophényl)-1-phényl-2-ferrocényl-but-1-ène<br />
Dans un tube <strong>de</strong> Schlenk sous argon, 810 mg (2 mmol) <strong>de</strong> P35 sont dissouts dans 15 mL <strong>de</strong><br />
THF anhydre. Le chlorure <strong>de</strong> propionyle (204 mg, 2,2 mmol) <strong>et</strong> la pyridine (174 mg, 2,2<br />
mmol) sont ajoutés <strong>et</strong> le mélange est agité pendant 3 h. Ensuite, 50 mL d’eau sont ajoutés<br />
<strong>et</strong> le produit est extrait au dichlorométhane (3 x 50 mL). La phase organique est lavée<br />
avec 50 mL d’eau, séchée sur MgSO4, <strong>et</strong> concentrée sous vi<strong>de</strong>. Le produit est ensuite purifié<br />
par HPLC préparative avec l’acétonitrile comme éluant puis cristallisé dans un mélange<br />
éther/pentane (1/1). On obtient 890 mg <strong>de</strong> P315, soit un ren<strong>de</strong>ment <strong>de</strong> 92%.<br />
O<br />
Et
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
1 H NMR (CDCl3) : � 0.91 and 0.92 (t, J=7.3 Hz, 3 H, CH3), 1.12 and 1.14 (t, J=7.3 Hz, 3 H,<br />
CH3), 2.25 and 2.28 (q, J=7.3 Hz, 2 H, CH2), 2.45 and 2.47 (q, J=7.3 Hz, 2 H, CH2), 3.79 and<br />
3.85 (s, 2 H, H C5H4), 3.98 and 4.00 (s, 2 H, H C5H4), 4.02 and 4.03 (s, 5 H, Cp), 6.91 and<br />
6.95 (d, J=8.0 Hz, 2 H, Harom), 7.00-7.43 (m, 7 H, Harom). 13 C NMR (CDCl3) : � 7.8 (CH3),<br />
13.5 (CH3), 25.9 and 26.1 (CH2), 28.9 (CH2), 66.5 and 66.7 (2 CH C5H4), 67.5 and 67.6 (2<br />
CH C5H4), 67.7 and 67.8 (5 CH Cp), 85.2 and 85.5 (C C5H4), 117.5 and 117.7 (2 CHarom),<br />
124.3 (CHarom), 126.2 and 126.3 (2 CHarom), 127.5 and 128.0 (2 CHarom), 128.1 and 128.7 (2<br />
CHarom), 134.2 (C), 135.5 (C), 135.6 (C), 138.5 and 138.6 (C), 142.4 and 142.7 (C), 169.9 and<br />
170.0 (CON). IR (KBr, � cm -1 ): 3451, 3272 (NH), 3094, 2967, 2930, 2872 (CH2, CH3), 1650<br />
(CON). MS (EI, 70 eV) m/z : 463 [M] +. , 398, 397, 326, 121. HRMS (ESI, C29H29FeNO:<br />
[M] +. ) calcd: 463.15931, found: 463.15884. Anal. Calcd for C29H29FeNO: C, 75.16; H, 6.3; N,<br />
3.02. Found: C, 74.78; H, 6.41; N, 2.73.<br />
1.10.10. <strong>Synthèse</strong> du (Z+E)-1-(p-isopropionylaminophényl)-1-phényl-2-ferrocényl-but-1-<br />
ène, P316<br />
Fe<br />
P35<br />
NH 2<br />
iPrCOCl, pyridine<br />
THF<br />
Schéma 20 : <strong>Synthèse</strong> du (Z+E)-1-(p-isopropionylaminophényl)-1-phényl-2-ferrocényl-but-1-ène<br />
Dans un tube <strong>de</strong> Schlenk sous argon, 410 mg (1 mmol) <strong>de</strong> P35 sont dissous dans 15 mL <strong>de</strong><br />
THF anhydre. Le chlorure d’isobutyryle (117 mg, 1,1 mmol) <strong>et</strong> la pyridine (87 mg, 1,1<br />
mmol) sont ajoutés <strong>et</strong> le mélange est agité pendant 3 h. 50 mL d’eau sont ensuite ajoutés <strong>et</strong><br />
le produit est extrait au dichlorométhane (3 x 50 mL). La phase organique est lavée avec<br />
50 mL d’eau, séchée sur MgSO4, <strong>et</strong> concentrée sous vi<strong>de</strong>. Le produit est purifié par HPLC<br />
préparative avec l’acétonitrile comme éluant puis cristallisé dans un mélange éther/pentane<br />
(1/1). On obtient 362 mg <strong>de</strong> P316, soit un ren<strong>de</strong>ment <strong>de</strong> 76%.<br />
U.P.M.C./U.S. 83<br />
2010<br />
Fe<br />
HN<br />
P316<br />
O<br />
iPr
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
1 H NMR (CDCl3) : � 0.91 and 0.92 (t, J=7.3 Hz, 3 H, CH3), 1.13 and 1.15 (d, J=6.2 Hz, 6 H, 2<br />
CH3), 2.30-2.53 (m, 3 H, CH2 + CH), 3.80 and 3.88 (s, 2 H, H C5H4), 3.99 and 4.00 (s, 2 H, H<br />
C5H4), 4.03 and 4.04 (s, 5 H, Cp), 6.92 and 6.96 (d, J=8.1 Hz, 2 H, Harom), 6.99-7.44 (m, 7 H,<br />
Harom). 13 C NMR (CDCl3) : � 15.4 and 15.5 (CH3), 19.7 (2 CH3), 27.9 and 28.0 (CH2), 36.8<br />
(CH), 68.6 and 68.9 (2 CH C5H4), 69.5 and 69.7 (2 CH C5H4), 69.7 and 69.9 (5 CH Cp), 86.0<br />
(C C5H4), 119.4 and 119.6 (2 CHarom), 126.2 (CHarom), 128.1 and 128.2 (2 CHarom), 129.5 and<br />
129.9 (2 CHarom), 130.0 and 130.7 (2 CHarom), 136.2 (C), 137.4 and 137.6 (C), 137.6 and<br />
137.7 (C), 140.4 and 140.5 (C), 144.3 and 144.6 (C), 175.0 and 175.1 (CON). IR (KBr, � cm -<br />
1 ): 3451, 3262 (NH), 3094, 2967, 2930, 2871 (CH, CH2, CH3), 1652 (CON). MS (EI, 70 eV)<br />
m/z : 477 [M] +. . HRMS (ESI, C30H31FeNO: [M] +. ) calcd: 477.17496, found: 477.17429.<br />
1.10.11. <strong>Synthèse</strong> du (Z+E)-1-(p-t-butylamidophényl)-1-phényl-2-ferrocényl-but-1-ène,<br />
P317<br />
Fe<br />
P35<br />
NH 2<br />
tBuCOCl, pyridine<br />
THF<br />
Schéma 21 : <strong>Synthèse</strong> du (Z+E)-1-(p-t-butylamidophényl)-1-phényl-2-ferrocényl-but-1-ène<br />
Dans un tube <strong>de</strong> Schlenk sous argon, 410 mg (1 mmol) <strong>de</strong> P35 sont dissouts dans 15 mL <strong>de</strong><br />
THF anhydre. Le chlorure <strong>de</strong> pivaloyle (132 mg, 1,1 mmol) <strong>et</strong> la pyridine (87 mg, 1,1 mmol)<br />
sont ajoutés <strong>et</strong> le mélange est agité pendant 3 h. 50 ml d’eau sont ensuite ajoutés <strong>et</strong> le<br />
produit est extrait au dichlorométhane (3 x 50 mL). La phase organique est lavée avec 50<br />
mL d’eau, séchée sur MgSO4, <strong>et</strong> concentrée sous vi<strong>de</strong>. Le produit obtenu est purifié par<br />
HPLC préparative avec l’acétonitrile comme éluant puis cristallisé dans un mélange<br />
U.P.M.C./U.S. 84<br />
2010<br />
Fe<br />
HN<br />
P317<br />
éther/pentane (1/1). On a obtenu 309 mg <strong>de</strong> P317 soit un ren<strong>de</strong>ment <strong>de</strong> 63%.<br />
1 H NMR (CDCl3) : � 0.91 and 0.92 (t, J = 7.3 Hz, 3 H, CH3), 1.20 and 1.22 (s, 9 H, tBu), 2.45<br />
and 2.47 (q, J = 7.3 Hz, 2 H, CH2), 3.79 and 3.86 (s, 2 H, H C5H4), 3.98 and 4.00 (s, 2 H, H<br />
C5H4), 4.02 and 4.03 (s, 5 H, Cp), 6.87-7.44 (m, 9 H, Harom). 13 C NMR (CDCl3) : � 15.4<br />
O<br />
tBu
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
(CH3), 27.7 (tBu), 28.0 (CH2), 39.6 (C), 68.8 and 69.1 (2 CH C5H4), 69.6 and 69.8 (2 CH<br />
C5H4), 69.9 and 70.1 (5 CH Cp), 87.9 (C C5H4), 119.6 and 119.8 (2 CHarom), 126.2 (CHarom),<br />
128.1 and 128.2 (2 CHarom), 129.5 and 130.0 (2 CHarom), 130.0 and 130.7 (2 CHarom), 136.2<br />
(C), 137.4 and 137.5 (C), 137.6 and 137.7 (C), 140.4 and 140.6 (C), 144.2 and 144.5 (C),<br />
176.4 and 176.5 (CON). IR (KBr, � cm -1 ): 3432 (NH), 3094, 2965, 2929, 2871 (CH2, CH3),<br />
1655 (CON). MS (EI, 70 eV) m/z : 491 [M] +. , 426, 377, 343, 326, 121. HRMS (ESI,<br />
C31H33FeNO: [M] + ) calcd: 491.19061, found: 491.18981. Anal. Calcd for C31H33FeNO: C,<br />
75.76; H, 6.76; N, 2.85. Found: C, 75.59; H, 6.83; N, 2.82.<br />
1.10.12. <strong>Synthèse</strong> du P312<br />
HN<br />
O<br />
PhCOCl, AlCl3<br />
CH2Cl2<br />
Schéma 22 : <strong>Synthèse</strong> du P312<br />
A une suspension <strong>de</strong> 3,4-dihydro-2(1H)-quinolinone (1,472g, 10 mmol, 1eq) <strong>et</strong> <strong>de</strong> chlorure<br />
d’aluminium (8,8 g, 66 mmol, 6,6 eq) dans 10 mL <strong>de</strong> CS2 à 0°C, est ajouté du chlorure <strong>de</strong><br />
benzoyle (2,109 g, 1,74 mL, 15 mmol, 1,5 eq). Le mélange est agité à la température ambiante<br />
pendant une heure puis mis sous reflux durant 18 heures. Le mélange réactionnel est versé<br />
dans l’eau glacé <strong>et</strong> le précipité est récupéré par filtration sur un entonnoir en verre fritté <strong>et</strong><br />
lavé à l’eau. Une fois séché, le produit est cristallisé dans l’acétate d’éthyle. Le ren<strong>de</strong>ment <strong>de</strong><br />
U.P.M.C./U.S. 85<br />
2010<br />
O<br />
HN<br />
O<br />
P312<br />
la réaction est <strong>de</strong> 46 % (Martinez, G.R. <strong>et</strong> al., 1992 ; Walker, K.A.M. <strong>et</strong> al., 1988).<br />
1 H NMR (CDCl3) : � 2.63 (t, J = 7.5 Hz, 2 H, CH2), 2.98 (t, J = 7.5 Hz, 2 H, CH2), 6.77 (d, J =<br />
8.1 Hz, 1 H, Harom), 7.34-7.76 (m, 7 H, Harom), 8.21 (s broad, 1H, NH). 13 C NMR (CDCl3) : �<br />
25.2 (CH2), 30.5 (CH2), 115.0 (CHarom), 123.5 (C), 128.3 (2 CH C6H5), 129.8 (2 CH C6H5),<br />
130.2 (CHarom), 130.6 (CHarom), 132.2 (CHarom), 132.4 (C), 137.9 (C), 141.1 (C), 161.7<br />
(CON), 195.5 (CO).
1.10.13. Tentative <strong>de</strong> synthèse du P407<br />
Fe<br />
O<br />
O<br />
HN<br />
P312<br />
O<br />
TiCl4/Zn<br />
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
U.P.M.C./U.S. 86<br />
2010<br />
THF<br />
Schéma 23 : <strong>Synthèse</strong> du P407<br />
A une suspension <strong>de</strong> Zn (1,961 g; 30 mmol ; 6 eq) dans 30 mL <strong>de</strong> THF, est ajouté à froid <strong>et</strong><br />
goutte-à-goutte le tétrachlorure <strong>de</strong> titane (3,794 g ; 2,2 mL ; 20 mmol ; 4 eq). Le mélange<br />
obtenu est mis au reflux pendant 2 heures. On laisse revenir à la température ambiante avant<br />
d’additionner le mélange <strong>de</strong> P312 (1,26 g ; 5 mmol ; 1 eq) <strong>et</strong> le propionymferrocène P8 (1,21<br />
g ; 5 mmol ; 1eq) préalablement dissouts dans 20 mL <strong>de</strong> THF. Le mélange est chauffé <strong>de</strong><br />
nouveau à reflux pendant 3 jours. Le mélange réactionnel est ensuite versé dans 50 mL d’eau,<br />
acidifié avec du HCl 0,1N jusqu’à disparition <strong>de</strong> la coloration noire, puis la phase aqueuse est<br />
extraite avec 3 x 25 mL <strong>de</strong> CH2Cl2. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur<br />
MgSO4 <strong>et</strong> concentrées sous vi<strong>de</strong>. Le brut obtenu est purifié sur colonne <strong>de</strong> gel <strong>de</strong> silice en<br />
utilisant comme éluant du dichlorométhane. Deux fractions ont été récupérées. L’analyse <strong>de</strong>s<br />
spectres RMN <strong>de</strong> ces <strong>de</strong>ux fractions a permis d’i<strong>de</strong>ntifier les produits <strong>de</strong> départ, mais aucune<br />
trace du produit voulu P407.<br />
Fe<br />
P407<br />
1.10.14. Tentative <strong>de</strong> synthèse du 2-(4-pyridinyl)-3-ferrocenylbut-2-ene, P321<br />
Fe<br />
N<br />
P321<br />
Figure 33 : Formule chimique du P321<br />
HN<br />
O
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
A une suspension <strong>de</strong> Zn (1,569 g; 24 mmol ; 6 eq) dans 30 mL <strong>de</strong> THF, est ajouté à froid <strong>et</strong><br />
goutte à goutte le tétrachlorure <strong>de</strong> titane (3,035 g ; 1,76 mL ; 16 mmol ; 4 eq). Le mélange<br />
obtenu est mis au reflux pendant 2 heures. On laisse revenir à la température ambiante avant<br />
d’additionner le mélange <strong>de</strong> 4-acétylpyridine (0,485 g ; 0,44 mL ; 4 mmol ; 1 eq) <strong>et</strong> le<br />
propionylferrocène P8 (0,97 g ; 4 mmol ; 1eq) préalablement dissouts dans 20 mL <strong>de</strong> THF.<br />
Après <strong>de</strong>ux heures <strong>de</strong> reflux, le mélange réactionnel est versé dans 50 mL d’eau, acidifié avec<br />
du HCl 0,1N jusqu’à disparition <strong>de</strong> la coloration noire, puis la phase aqueuse est extraite avec<br />
3 x 25 mL <strong>de</strong> CH2Cl2. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgSO4 <strong>et</strong><br />
concentrées sous vi<strong>de</strong>. Les produits obtenus sont séparés par HPLC préparative. Trois<br />
fractions ont été récupérées mais aucune fraction ne correspond au produit attendu.<br />
1.10.15. Tentative <strong>de</strong> synthèse du 2-(3-pyridinyl)-3-ferrocenylbut-2-ene, P322<br />
Fe<br />
U.P.M.C./U.S. 87<br />
2010<br />
P322<br />
Figure 34 : Formule chimique du P322<br />
A une suspension <strong>de</strong> Zn (1,961 g; 10.mmol ; 6 eq) dans 30 mL <strong>de</strong> THF, est ajouté à froid <strong>et</strong><br />
goutte à goutte le tétrachlorure <strong>de</strong> titane (3,794 g ; 2,2 mL ; 20 mmol ; 4 eq). Le mélange<br />
obtenu est mis au reflux pendant 2 heures. On laisse revenir à la température ambiante avant<br />
d’additionner le mélange <strong>de</strong> 2-acétopyridine (0,606 g ; 0,55 mL, 5 mmol ; 1 eq) <strong>et</strong> le<br />
propionylferrocène P8 (1,21 g ; 5 mmol ; 1eq) préalablement dissouts dans 20 mL <strong>de</strong> THF.<br />
Après <strong>de</strong>ux heures <strong>de</strong> reflux, le mélange réactionnel est versé dans 50 mL d’eau, acidifié avec<br />
du HCl 0,1N jusqu’à disparition <strong>de</strong> la coloration noire, puis la phase aqueuse est extraite avec<br />
3 x 25 ml <strong>de</strong> CH2Cl2. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgSO4 <strong>et</strong><br />
concentrées sous vi<strong>de</strong>. Les produits obtenus sont séparés par HPLC préparative. Aucune<br />
fraction récupérée ne correspond au produit attendu.<br />
N
1.10.16. Tentative <strong>de</strong> synthèse du 1-(4-aminophenyl)-2-ferrocenylbut-1-ene, P323<br />
Fe<br />
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
U.P.M.C./U.S. 88<br />
2010<br />
H<br />
P323<br />
NH2<br />
Figure 35 : Formule chimique du P323<br />
A une suspension <strong>de</strong> Zn (2,092 g; 32.mmol ; 8 eq) dans 30 ml <strong>de</strong> THF, est ajouté à froid <strong>et</strong><br />
goutte-à-goutte le tétrachlorure <strong>de</strong> titane (4,553 g ; 2,64 mL ; 24 mmol ; 6 eq). Le mélange<br />
obtenu est mis au reflux pendant 2 heures. On laisse revenir à la température ambiante avant<br />
d’additionner le mélange <strong>de</strong> 4-nitrobenzal<strong>de</strong>hy<strong>de</strong> (0,604 g ; 4 mmol ; 1 eq) <strong>et</strong> le<br />
propionylferrocène P8 (0,97 g ; 4 mmol ; 1eq) préalablement dissouts dans 20 mL <strong>de</strong> THF.<br />
Après <strong>de</strong>ux heures <strong>de</strong> reflux, le mélange réactionnel est versé dans 50 mL d’eau, acidifié avec<br />
du HCl 0,1N jusqu’à disparition <strong>de</strong> la coloration noire, puis la phase aqueuse est extraite avec<br />
3 x 25 ml <strong>de</strong> CH2Cl2. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgSO4 <strong>et</strong><br />
concentrées sous vi<strong>de</strong>. Les produits obtenus sont séparés par HPLC préparative. Trois<br />
fractions ont été récupérées mais aucune fraction ne correspond au produit attendu.<br />
1.10.17. <strong>Synthèse</strong> du 2-(4-aminophenyl)-3-ferrocenylbut-2-ene, P371<br />
Fe<br />
P371<br />
NH2<br />
Schéma 36 : Formule chimique du P371<br />
A une suspension <strong>de</strong> Zn (1,961 g; 30 mmol ; 6 eq) dans 30 mL <strong>de</strong> THF, est ajouté à froid <strong>et</strong><br />
goutte-à-goutte le tétrachlorure <strong>de</strong> titane (3,794 g ; 2,2 ml ; 20 mmol ; 4 eq). Le mélange<br />
obtenu est mis au reflux pendant 2 heures. On laisse revenir à la température ambiante avant<br />
d’additionner le mélange <strong>de</strong> 4-aminoacétophénone (0,676 g ; 5 mmol ; 1 eq) <strong>et</strong> le
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
propionylferrocène P8 (1,21 g ; 5 mmol ; 1eq) préalablement dissout dans 20 mL <strong>de</strong> THF.<br />
Après <strong>de</strong>ux jours <strong>de</strong> reflux, le mélange réactionnel est versé dans 50 mL d’eau, acidifié avec<br />
du HCl 0,1N jusqu’à disparition <strong>de</strong> la coloration noire, puis la phase aqueuse est extraite avec<br />
3 x 25 ml <strong>de</strong> CH2Cl2. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgSO4 <strong>et</strong><br />
concentrées sous vi<strong>de</strong>. Les produits obtenus sont séparés par HPLC préparative. Cinq<br />
fractions ont été récupérées. Une <strong>de</strong>s fractions correspond au composé P371 (ren<strong>de</strong>ment <strong>de</strong><br />
10%).<br />
1 H NMR (CDCl3) : � 0.84 and 1.14 (t, J = 7.5 Hz, 3 H, CH3), 1.94 and 2.05 (s, 3 H, CH3),<br />
2.26 and 2.54 (q, J = 7.5 Hz, 2 H, CH2), 3.70 and 4.16 (t, J = 1.9 Hz, 2 H, H C5H4), 3.91 and<br />
4.30 (t, J = 1.9 Hz, 2 H, H C5H4), 3.97 and 4.08 (s, 5 H, H Cp), 6.55 and 6.63 (d, J = 8.4 Hz, 2<br />
H, H C6H4), 6.77 (d, J = 8.4 Hz, 2 H, H C6H4). 13 C NMR (CDCl3) : � 13.6 and 14.2 (CH3),<br />
21.5 and 23.2 (CH3), 26.2 and 27.0 (CH2), 66.3 and 66.5 (2 CH C5H4), 67.7 and 68.2 (2 CH<br />
C5H4), 67.8 and 68.0 (5 CH Cp), 87.1 and 87.3 (C C5H4), 114.2 (2 CH C6H4), 127.8 and 128.5<br />
(2 CH C6H4), 130.8 (C), 132.0 (C), 135.8 (C), 143.1 (C). MS (EI, 70 eV) m/z : 345 [M] +. , 316,<br />
280, 264, 121.<br />
1.10.18. <strong>Synthèse</strong> du 4,4’-bis(bromopropoxy)benzophenone, P477<br />
La 4,4’-bis(hydroxy)benzophenone (8,569 g, 40mmol, 1eq) est dissoute dans du THF <strong>et</strong> du<br />
DMF puis l’hydrure <strong>de</strong> sodium (dispersé dans l’huile) (1,92 g, 80 mmol, 2 eq) est ajouté <strong>et</strong> le<br />
mélange est laissé en agitation pendant 10 min. Le 1,3-dibromopropane (12,114 g, 6,09 mL,<br />
60 mmol, 1,5 eq) est ajouté <strong>et</strong> le reflux est maintenu toute la nuit. La phase aqueuse est<br />
extraite avec 3 x 25 mL <strong>de</strong> CH2Cl2. Les phases organiques rassemblées, séchées sur MgSO4 <strong>et</strong><br />
concentrées sous vi<strong>de</strong>. Le brut obtenu est chromatographié sur colonne <strong>de</strong> silice en utilisant<br />
comme éluant du dichlorométhane. Deux fractions ont été récupérées <strong>et</strong> analysées par RMN.<br />
Les produits se sont avérés bons, <strong>et</strong> le ren<strong>de</strong>ment <strong>de</strong> la réaction est <strong>de</strong> 43 % pour P196 <strong>et</strong> 27 %<br />
pour P477 (Top, S. <strong>et</strong> al., 2004).<br />
1 H NMR (CDCl3) : � 2.22-2.35 (m, 4 H, CH2), 3.55 (t, J = 6.3 Hz, 4 H, CH2Br), 4.12 (t, J =<br />
5.8 Hz, 4 H, CH2O), 6.90 (d, J = 8.7 Hz, 4 H, H C6H4), 7.71 (d, J = 8.7 Hz, 4 H, H C6H4). 13 C<br />
NMR (CDCl3) : � 29.8 (2 CH2), 32.2 (2 CH2Br), 65.5 (2 CH2O), 114.0 (2 x 2 CH C6H4),<br />
130.9 (2 C), 132.2 (2 x 2 CH C6H4), 161.9 (2 C), 194.4 (CO).<br />
U.P.M.C./U.S. 89<br />
2010
1.10.19. <strong>Synthèse</strong> du 4,4’-bis(diméthylaminopropoxy)benzophenone, P490<br />
O<br />
O(CH2)3NMe2<br />
O(CH 2) 3NMe 2<br />
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
U.P.M.C./U.S. 90<br />
2010<br />
P490<br />
Figure 37 : Formule chimique du 4,4’-bis(diméthylaminopropoxy)benzophenone<br />
Dans un tube à pression, on ajoute le 4,4’-bis(bromopropoxy)benzophenone, P477, (0,365<br />
g ;0,8 mmol ; 1eq) dans une solution 2M <strong>de</strong> diméthylamine, dans du méthanol, (0,432 g ; 4,8<br />
ml ; 12 eq). Le tube est ensuite fermé <strong>et</strong> chauffé à 60°C pendant 24 heures. Après<br />
refroidissement, le mélange est concentré sous vi<strong>de</strong> puis remis en solution dans du<br />
dichlorométhane. La solution est d’abord lavée avec une solution <strong>de</strong> carbonate <strong>de</strong> sodium<br />
monosodique, puis avec <strong>de</strong> l’eau. La phase organique est séchée sur MgSO4 <strong>et</strong> concentrée. Le<br />
soli<strong>de</strong> obtenu est recristallisé dans éther/éther <strong>de</strong> pétrole. On obtient le produit P490 avec un<br />
ren<strong>de</strong>ment <strong>de</strong> 88%.<br />
Mp : 75°C. 1 H NMR (CDCl3) : � 1.80-2.00 (m, 4 H, CH2), 2.19 (s, 12 H, NMe2), 2.39 (t, J =<br />
7.1 Hz, 4 H, CH2N), 4.02 (t, J = 6.4 Hz, 4 H, CH2O), 6.88 (d, J = 8.8 Hz, 4 H, Harom), 7.69 (d,<br />
J = 8.8 Hz, 4 H, Harom). 13 C NMR (CDCl3) : � 26.4 (2 CH2), 44.5 (2 NMe2), 55.2 (2 CH2N),<br />
65.4 (2 CH2O), 112.9 (2 x 2 CH C5H4), 129.6 (2 Carom), 131.2 (2 x 2 CH C5H4), 161.3 (2<br />
Carom), 193.5 (CO). MS (CI, NH3) m/z : 385 [M+H] + . Anal. Calcd for C23H32N2O3: C, 71.84;<br />
H, 8.38; N, 7.28. Found: C, 71.81; H, 8.41; N, 7.29.<br />
1.10.20. <strong>Synthèse</strong> du 4,4’-bis(pyrrolidinylpropoxy)benzophenone, P583<br />
O<br />
O(CH 2 ) 3 N<br />
O(CH 2 ) 3 N<br />
P583<br />
Figure 38 : Formule chimique du 4,4’-bis(pyrrolidinylpropoxy)benzophenone
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
Dans un tube à pression, on dissout 4,4’-bis(bromopropoxy)benzophenone, P477 (1,43 g ; 3,13<br />
mmol ; 1eq) dans 20 mL <strong>de</strong> méthanol. On ajoute pyrrolidine (2,675 g ; 37.6 mmol). Le tube<br />
est ensuite fermé <strong>et</strong> chauffé à 60°C pendant 24 heures. Après refroidissement, le mélange est<br />
concentré sous vi<strong>de</strong> puis remis en solution dans du dichlorométhane. La solution est d’abord<br />
lavée avec une solution <strong>de</strong> carbonate <strong>de</strong> sodium monosodique, puis avec <strong>de</strong> l’eau. La phase<br />
organique est séchée sur MgSO4 <strong>et</strong> concentrée. On obtient le produit P583 avec un ren<strong>de</strong>ment<br />
presque quantitatif. Le soli<strong>de</strong> obtenu est recristallisé dans éther/éther <strong>de</strong> pétrole.<br />
1 H NMR (CDCl3) : � 1.68-1.79 (m, 8 H, Hpyr), 1.91-2.04 (m, 4 H, CH2), 2.42-2.53 (m, 8 H,<br />
Hpyr), 2.58 (t, J = 7.4 Hz, 4 H, CH2N), 4.04 (t, J = 6.4 Hz, 4 H, CH2O), 6.88 (d, J = 8.7 Hz, 4<br />
H, H C6H4), 7.70 (d, J = 8.7 Hz, 4 H, H C6H4). 13 C NMR (CDCl3) : � 23.5 (2 x 2 CH2<br />
pyrrolidine), 28.7 (2 CH2), 53.0 (2 CH2N), 54.3 (2 x2 CH2 pyrrolidine), 66.6 (2 CH2O), 113.9<br />
(2 x 2 CH C6H4), 130.6 (2 C), 132.2 (2 x 2 CH C6H4), 162.3 (2 C), 194.5 (CO).<br />
1.10.21. <strong>Synthèse</strong> du 1,1-bis[4-(3-Diméthylaminopropoxy)phenyl]-2-ferrocenyl-but-1-<br />
ène, P116.<br />
Le diphénol P5 (3.00 g, 7.7 mmol) est ajouté a une solution d’éthanolate <strong>de</strong> sodium préparé<br />
par traitement <strong>de</strong> sodium (0.325 g, 14.1 mmol) avec <strong>de</strong> l’éthanol (20 mL). Après reflux<br />
pendant 1 h, le dibromopropane (8.56 g, 42.4 mmol) est ajouté. Après 1 h supplémentaire à<br />
reflux, la solution est refroidie à température ambiante <strong>et</strong> est hydrolysée avec <strong>de</strong> l’eau (100<br />
mL). Le produit est extrait avec du dichlorométhane. La phase organique est lavée avec <strong>de</strong><br />
l’eau, séchée sur sulfate <strong>de</strong> magnésium, filtrée, <strong>et</strong> le mélange est concentré sous pression<br />
réduite. Le produit brut est chromatographié par colonne sur gel <strong>de</strong> silice avec l’éther <strong>de</strong><br />
pétrole comme éluant <strong>et</strong> la première fraction colorée (contenant le produit P476 contaminé<br />
avec <strong>de</strong>s produits mono <strong>et</strong> di <strong>de</strong>shydrobromés inséparables) est récupérée. Le produit brut est<br />
utilisé sans autre purification dans la secon<strong>de</strong> étape: Il est transféré dans un tube à pression <strong>et</strong><br />
une solution 2 M <strong>de</strong> diméthylamine dans le méthanol (30 mL, 60 mmol) est ajoutée. Le tube à<br />
pression est chauffé à 60°C pendant 24 h, puis est refroidi à température ambiante. La<br />
solution est concentrée sous pression réduite, diluée dans le dichlorométhane, lavée avec une<br />
solution d’hydrogénocarbonate <strong>de</strong> sodium saturée, puis avec <strong>de</strong> l’eau, séchée sur sulfate <strong>de</strong><br />
magnésium <strong>et</strong> concentrée sous pression réduite. Le produit brut est chromatographié sur une<br />
colonne <strong>de</strong> gel <strong>de</strong> silice avec l’acétone comme éluant (afin d’enlever les produits<br />
<strong>de</strong>shydrobromés non réactifs) puis avec une solution <strong>de</strong> triéthylamine à 10% dans l’acétone<br />
U.P.M.C./U.S. 91<br />
2010
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
pour obtenir le produit P116 sous forme d’huile non cristallisable avec un ren<strong>de</strong>ment <strong>de</strong> 57%<br />
au total.<br />
1 H NMR (CDCl3) : � 0.94 (t, J = 7.4 Hz, 3 H, CH3), 1.79-1.95 (m, 4 H, 2CH2), 2.18 (s, 6 H,<br />
NMe2), 2.19 (s, 6 H, NMe2), 2.37 (t, J = 7.2 Hz, 2 H, CH2N), 2.40 (t, J = 7.2 Hz, 2 H, CH2N),<br />
2.50 (q, J = 7.4 Hz, 2 H, CH2), 3.83 (t, J = 1.9 Hz, 2 H, C5H4), 3.89 (t, J = 6.6 Hz, 2 H,<br />
CH2O), 3.91 (t, J = 6.6 Hz, 2 H, CH2O), 3.98 (t, J = 1.9 Hz, 2 H, C5H4), 4.02 (s, 5 H, Cp), 6.66<br />
(d, J = 8.7 Hz, 2 H, Harom), 6.77 (d, J = 8.7 Hz, 2 H, Harom), 6.86 (d, J = 8.7 Hz, 2 H, Harom),<br />
7.02 (d, J = 8.7 Hz, 2 H, Harom). 13 C NMR (CDCl3) : � 15.5 (CH3), 27.5 (CH2), 27.6 (CH2),<br />
27.9 (CH2), 45.5 (2xNMe2), 56.5 (2xCH2N), 66.1 (2xCH2O), 67.9 (2xCH C5H4), 69.1 (5xCH<br />
Cp), 69.3 (2xCH C5H4), 87.2 (Cipso), 114.1 (2xCH), 114.2 (2xCH), 130.4 (2xCH), 130.9<br />
(2xCH), 136.5 (C), 137.2 (C), 137.3 (C), 137.4 (C), 157.3 (2xC). IR : non fait ! MS (EI, 70<br />
eV) m/z : 594 [M] + , 121 [CpFe] + , 86 [CH2CH2CH2NMe2] + , 58 [CH2NMe2] + . HRMS (ESI,<br />
C36H47FeN2O2: [M+H] + ) calcd: 595.29815, found: 595.29681.<br />
1.10.22. <strong>Synthèse</strong> du dérivé glycosylé P28<br />
Fe<br />
AcO OAc<br />
OAc<br />
AcO<br />
O<br />
O<br />
U.P.M.C./U.S. 92<br />
2010<br />
P28<br />
Figure 39 : Formule chimique du dérivé glycosylé P28<br />
Le 1,1-bis(4-hydroxyphényl)-2-ferrocényl-but-1-ène P5 (1 g ; 2.45 mmol) <strong>et</strong> le pentaacétate<br />
<strong>de</strong> �-D-glucose (0.957 g ; 2.5 mmol ; 1 eq) sont dissous dans du dichlorométhane sec. Le<br />
diéthyl éthérate <strong>de</strong> trifluorobore BF3.Et2O (0,348 g ; 0,31 ml ; 2.5 mmol ; 1 eq) est ensuite<br />
ajouté <strong>et</strong> le mélange est agité à température ambiante pendant 24h. Le mélange est ensuite<br />
versé dans une solution <strong>de</strong> bicarbonate <strong>de</strong> sodium <strong>et</strong> la phase aqueuse <strong>et</strong> extraite avec 3 x 50<br />
ml <strong>de</strong> CH2Cl2. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgSO4 <strong>et</strong> concentrées<br />
sous vi<strong>de</strong>. Le brut obtenu est chromatographié par HPLC préparative (CH3CN/H2O : 80/20).<br />
Le composé P28 obtenue avec un ren<strong>de</strong>ment <strong>de</strong> 16%.
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
1 H NMR (CDCl3) : � 0.94 and 0.96 (t, J = 7.3 Hz, 3 H, CH3), 1.95 and 1.96 (s, 3 H, OAc),<br />
1.96 (s, 3 H, OAc), 1.97 (s, 3 H, OAc), 1.98 and 1.99 (s, 3 H, OAc), 2.47 (q, J = 7.3 Hz, 2 H,<br />
CH2), 3.70-3.89 (m, 2 H, CH2O), 3.96-4.14 (m, 9 H, C5H4+Cp), 4.16-4.28 (m, 1 H, CH<br />
glucose), 5.00-5.35 (m, 4 H, CH glucose), 6.76 and 6.86 (d, J = 8.5 Hz, 2 H, Harom), 6.89-7.29<br />
(m, 7 H, Harom). 13 C NMR (CDCl3) : � 14.4 and 14.5 (CH3), 19.6 (4 CH3 OAc), 26.8 and 27.0<br />
(CH2), 61.0 (CH2O), 67.3 (2 x 2 CH C5H4), 68.3 (5 CH Cp + CH glucose), 70.2 (CH glucose),<br />
71.0 (CH glucose), 71.8 (CH glucose), 85.5 and 85.7 (C C5H4), 98.0 and 98.1 (OCHO<br />
glucose), 115.6 and 115.7 (2 CH C6H4), 125.2 (CH C6H5), 127.2 and 127.3 (2 CHarom), 128.3<br />
and 128.8 (2 CHarom), 129.5 and 130.0 (2 CHarom), 136.0 and 136.1 (C), 136.6 and 136.7 (C),<br />
138.7 and 138.8 (C), 143.5 and 143.6 (C), 154.1 and 154.2 (C), 168.3 (CO), 168.4 (CO),<br />
169.2 (CO), 169.6 (CO). IR : non fait ! MS (FAB) m/z : 738.3 [M] + . Anal. Calcd for<br />
C40H42FeO10: C, 65.04; H, 5.73. Found: C, 65.05; H, 5.69.<br />
1.10.23. <strong>Synthèse</strong> du dérivé glycosylé P29<br />
Fe<br />
P29<br />
AcO OAc<br />
OAc<br />
AcO<br />
O<br />
O<br />
U.P.M.C./U.S. 93<br />
2010<br />
O<br />
O<br />
OAc<br />
OAc<br />
OAc<br />
OAc<br />
Figure 40 : Formule chimique du dérivé glycosylé P29<br />
Le 1,1-bis(4-hydroxyphényl)-2-ferrocényl-but-1-ène P5 (1.7 g ; 4 mmol) <strong>et</strong> le pentaacétate <strong>de</strong><br />
�-D-glucose (3.12 g ; 8 mmol ; 2 eq) sont dissous dans du dichlorométhane sec. Le diéthyl<br />
éthérate <strong>de</strong> trifluorobore BF3.Et2O (1.13 g ; 1.0 ml ; 8 mmol ; 2 eq) est ensuite ajouté <strong>et</strong> le<br />
mélange est agité à température ambiante pendant 24h. Le mélange est ensuite versé dans une<br />
solution <strong>de</strong> bicarbonate <strong>de</strong> sodium <strong>et</strong> la phase aqueuse <strong>et</strong> extraite avec 3 x 50 ml <strong>de</strong> CH2Cl2.<br />
Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgSO4 <strong>et</strong> concentrées sous vi<strong>de</strong>. Le brut<br />
obtenu est chromatographié par HPLC préparative (CH3CN/H2O : 80/20). Le composé P29<br />
obtenue avec un ren<strong>de</strong>ment <strong>de</strong> 19%.
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
1 H NMR (CDCl3) : � 0.94 (t, J = 6.9 Hz, 3 H, CH3), 1.95 (s, 3 H, OAc), 1.96 (s, 9 H, OAc),<br />
1.97 (s, 6 H, OAc), 1.98 (s, 3 H, OAc), 1.99 (s, 3 H, OAc), 2.46 (q, J = 6.9 Hz, 2 H, CH2),<br />
3.77-4.02 (m, 4 H, CH2O), 4.04-4.22 (m, 9 H, C5H4+Cp), 4.23-4.36 (m, 2 H, CH glucose),<br />
4.98-5.35 (m, 8 H, CH glucose), 6.76 (d, J = 8.2 Hz, 2 H, Harom), 6.86 (d, J = 8.2 Hz, 2 H,<br />
Harom), 6.88 (d, J = 8.2 Hz, 2 H, Harom), 7.03 (d, J = 8.2 Hz, 2 H, Harom). 13 C NMR (CDCl3) : �<br />
14.5 (CH3), 19.6 (8 CH3 OAc), 27.0 (CH2), 61.0 (2 CH2O), 67.3 (2 x 2 CH C5H4), 68.3 (5 CH<br />
Cp + 2 CH glucose), 70.2 (2 CH glucose), 71.0 (2 CH glucose), 71.7 (2 CH glucose), 85.7 (C<br />
C5H4), 98.0 (OCHO glucose), 98.1 (OCHO glucose), 115.6 (2 CH C6H4), 115.7 (2 CH C6H4),<br />
129.5 (2 CH C6H4), 130.0 (2 CH C6H4), 135.1 (C), 136.9 (C), 138.6 (C), 138.8 (C), 154.2 (C),<br />
154.3 (C), 168.2 (2 CO), 168.4 (2 CO), 169.2 (2 CO), 169.5 (2 CO). IR : non fait ! MS (FAB)<br />
m/z : 1084.3 [M] + . Anal. Calcd for C54H60FeO20: C, 59.78; H, 5.57. Found: C, 59.81; H, 5.66.<br />
1.10.24. <strong>Synthèse</strong> <strong>de</strong>s dérivés P345 <strong>et</strong> P346<br />
Fe<br />
Fe<br />
P5<br />
P345<br />
OAc<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
OAc<br />
OAc<br />
O<br />
O<br />
OAc<br />
AcO<br />
OA<br />
c<br />
O<br />
OAc<br />
OAc<br />
OAc<br />
OAc<br />
O<br />
O<br />
OAc<br />
OA<br />
c<br />
O<br />
OAc<br />
�-D-maltose octaacétate<br />
BF 3 .Et 2 O<br />
CH 2Cl 2<br />
OAc<br />
OAc<br />
U.P.M.C./U.S. 94<br />
2010<br />
OAc<br />
OAc<br />
Fe<br />
P346<br />
OAc<br />
Schéma 24 : <strong>Synthèse</strong> <strong>de</strong>s dérivé P345 <strong>et</strong> P346<br />
O<br />
O<br />
OAc<br />
OAc<br />
O<br />
O<br />
OAc<br />
OAc<br />
OAc<br />
O<br />
OAc<br />
OAc<br />
OAc<br />
O<br />
OAc<br />
O<br />
OAc<br />
OAc O
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
Le 1,1-bis(4-hydroxyphényl)-2-ferrocényl-but-1-ène P5 (0,85 g ; 2 mmol) <strong>et</strong> l’octaacétate <strong>de</strong><br />
�-D-maltose (2,714 g ; 4 mmol ; 2eq) sont mélangés dans du CH2Cl2. Le diéthyl éthérate <strong>de</strong><br />
trifluorobore BF3.Et2O (0,568 g ; 0,51 ml ; 4 mmol ; 2eq) est ensuite ajouté <strong>et</strong> le mélange est<br />
agité à température ambiante pendant 24h.Le mélange est ensuite versé dans une solution <strong>de</strong><br />
bicarbonate <strong>de</strong> sodium <strong>et</strong> la phase aqueuse <strong>et</strong> extraite avec 3 x 50 ml <strong>de</strong> CH2Cl2. Les phases<br />
organiques sont rassemblées, séchées sur MgSO4 <strong>et</strong> concentrées sous vi<strong>de</strong>. Le brut obtenu<br />
chromatographié par HPLC préparative (CH3CN/H2O : 80/20). Les <strong>composés</strong> P345 <strong>et</strong> P346<br />
ont été isolés.<br />
P345 : 1 H NMR (CDCl3) : � 0.93 (t, J = 7.2 Hz, 3 H, CH3), 1.82-2.12 (m, 21 H, OAc), 2.47<br />
(q, J = 7.2 Hz, 2 H, CH2), 3.66-4.51 (m, 16 H, C5H4+Cp+CH2O+CH maltose), 4.70-4.88 (m, 1<br />
H, CH maltose), 4.89-5.13 (m, 3 H, CH maltose), 5.13-5.45 (m, 3 H, CH maltose), 6.45-7.15<br />
(m, 8 H, Harom). 13 C NMR (CDCl3) : � 15.4 and 15.5 (CH3), 20.5 (6 OAc), 20.9 (OAc), 27.8<br />
and 28.0 (CH2), 61.6 (CH2O), 62.9 (CH2O), 68.1 (2 x 2 CH C5H4), 68.5 (CH maltose), 69.1 (5<br />
CH Cp + CH maltose), 70.0 (CH maltose), 72.0 (CH maltose), 72.2 (CH maltose), 72.8 (CH<br />
maltose), 75.3 (CH maltose), 86.9 and 87.0 (C C5H4), 95.6 (OCHO), 98.3 and 98.4 (OCHO),<br />
115.1 and 115.2 (2 CH C6H4), 116.4 and 116.5 (2 CH C6H4), 130.5 (2 CH C6H4), 131.0 (2 CH<br />
C6H4), 136.4 and 136.6 (C), 136.8 (C), 137.0 and 137.1 (C), 139.9 and 140.1 (C), 154.7 (C),<br />
154.9 (C), 169.5 (CO), 169.7 (CO), 170.0 (CO), 170.3 (CO), 170.5 (2 CO), 170.7 (CO). MS<br />
(ESI) m/z : 1060 . HRMS (ESI, C52H58FeNaO19) calcd: 1065.28178, found: 1065.28089.<br />
P346 : 1 H NMR (CDCl3) : � 0.94 (t, J = 7.2 Hz, 3 H, CH3), 1.84-2.11 (m, 42 H, OAc), 2.49<br />
(q, J = 7.2 Hz, 2 H, CH2), 3.69-4.48 (m, 23 H, C5H4+Cp+CH2O+CH maltose), 4.73-4.86 (m, 2<br />
H, CH maltose), 4.91-5.12 (m, 6 H, CH maltose), 5.17-5.44 (m, 6 H, CH maltose), 6.75 (d, J<br />
= 8.5 Hz, 2 H, Harom), 6.88 (t, J = 8.5 Hz, 4 H, Harom), 7.04 (d, J = 8.5 Hz, 2 H, Harom). 13 C<br />
NMR (CDCl3) : � 15.4 (CH3), 20.6 (6 x 2 OAc), 20.9 (2 OAc), 27.9 (CH2), 61.6 (2 CH2O),<br />
62.8 (2 CH2O), 68.0 (2 CH C5H4), 68.2 (2 CH C5H4), 68.5 (2 CH maltose), 69.1 (5 CH Cp),<br />
69.2 (2 CH maltose), 70.0 (2 CH maltose), 72.0 (2 CH maltose), 72.2 (2 CH maltose), 72.7 (2<br />
CH maltose), 75.3 (2 CH maltose), 86.5 (C C5H4), 95.6 (2 OCHO), 98.3 (OCHO), 98.4<br />
(OCHO), 116.6 (2 x 2 CH C6H4), 130.5 (2 CH C6H4), 131.0 (2 CH C6H4), 136.1 (C), 137.8<br />
(C), 139.5 (C), 139.7 (C), 155.1 (2 C), 169.4 (2 CO), 169.6 (2 CO), 169.9 (2 CO), 170.2 (2<br />
CO), 170.4 (2 CO), 170.5 (2 x 2 CO). MS (ESI) m/z : 1678 . HRMS (ESI, C78H92FeNaO36: )<br />
calcd: 1683.46164, found: 1683.46024.<br />
U.P.M.C./U.S. 95<br />
2010
1.10.25. <strong>Synthèse</strong> du dérivé glycosylé P42<br />
Fe<br />
HO<br />
P42<br />
HO OH<br />
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
U.P.M.C./U.S. 96<br />
2010<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
Figure 41 : Formule chimique du dérivé P42<br />
Dans un ballon, on verse du méthanol (20 mL) puis on introduit du sodium (0.144 g, 6 mmol)<br />
par portions. Quand tout le sodium a disparu, on introduit P28 (0.739 g, 1 mmol) par portions<br />
<strong>et</strong> on laisse agiter pendant la nuit.<br />
De la résine Amberlit IR120 (forme protonée, 10 g) est placée sur un fritté, lavée<br />
abondamment d'abord à l'eau distillée, puis au méthanol. On verse la résine dans le milieu<br />
réactionnel <strong>et</strong> on agite 10 min. On vérifie que le pH est neutre (sinon, ajouter encore <strong>de</strong> la<br />
résine), on filtre le mélange sur fritté <strong>et</strong> on rince la résine au méthanol. La solution est<br />
concentrée sous vi<strong>de</strong> pour obtenir P42 quantitativement.<br />
1 H NMR (CDCl3) : � 0.94 and 0.96 (t, J = 7.3 Hz, 3 H, CH3), 1.95 and 1.96 (s, 3 H, OAc),<br />
1.96 (s, 3 H, OAc), 1.97 (s, 3 H, OAc), 1.98 and 1.99 (s, 3 H, OAc), 2.47 (q, J = 7.3 Hz, 2 H,<br />
CH2), 3.70-3.89 (m, 2 H, CH2O), 3.96-4.14 (m, 9 H, C5H4+Cp), 4.16-4.28 (m, 1 H, CH<br />
glucose), 5.00-5.35 (m, 4 H, CH glucose), 6.76 and 6.86 (d, J = 8.5 Hz, 2 H, Harom), 6.89-7.29<br />
(m, 7 H, Harom). 13 C NMR (CDCl3) : � 14.4 and 14.5 (CH3), 19.6 (4 CH3 OAc), 26.8 and 27.0<br />
(CH2), 61.0 (CH2O), 67.3 (2 x 2 CH C5H4), 68.3 (5 CH Cp + CH glucose), 70.2 (CH glucose),<br />
71.0 (CH glucose), 71.8 (CH glucose), 85.5 and 85.7 (C C5H4), 98.0 and 98.1 (OCHO<br />
glucose), 115.6 and 115.7 (2 CH C6H4), 125.2 (CH C6H5), 127.2 and 127.3 (2 CHarom), 128.3<br />
and 128.8 (2 CHarom), 129.5 and 130.0 (2 CHarom), 136.0 and 136.1 (C), 136.6 and 136.7 (C),<br />
138.7 and 138.8 (C), 143.5 and 143.6 (C), 154.1 and 154.2 (C), 168.3 (CO), 168.4 (CO),<br />
169.2 (CO), 169.6 (CO). MS (FAB) m/z : 738.3 [M] + . Anal. Calcd for C40H42FeO10: C, 65.04;<br />
H, 5.73. Found: C, 65.05; H, 5.69.
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
1.10.26. <strong>Synthèse</strong> du citrate <strong>de</strong> 1-[4-(3-Hydrodiméthylamoniumpropoxy)phényl]-1-(4-<br />
hydroxyphényl)-2-ferrocényl-but-1-ène, P514<br />
Fe<br />
P15<br />
OH<br />
O(CH 2 ) 3 NMe 2<br />
HO<br />
HOOC<br />
Ether/THF<br />
COOH<br />
COOH<br />
U.P.M.C./U.S. 97<br />
2010<br />
Fe<br />
P514<br />
OH<br />
HO<br />
OOC<br />
O(CH 2) 3NMe 2H<br />
COOH<br />
COOH<br />
Schéma 25 : <strong>Synthèse</strong> du Citrate <strong>de</strong> 1-[4-(3-Hydrodiméthylamoniumpropoxy)phényl]-1-(4-<br />
hydroxyphényl)-2-ferrocényl-but-1-ène<br />
Le produit P15 (0,509 g ; 1 mmol) est dissout dans un ballon contenant 250 ml d’éther sec.<br />
L’aci<strong>de</strong> citrique (0,210 g ; 1 mmol ; 1 eq), préalablement dissout dans du THF est ajouté<br />
goutte à goutte. Un précipité jaune est instantanément formé <strong>et</strong> est isolé par filtration puis<br />
séché à la pompe à vi<strong>de</strong> fournissant P514 en ren<strong>de</strong>ment quantitatif.<br />
P514 contient <strong>de</strong>s traces <strong>de</strong> solvants (THF <strong>et</strong> di<strong>et</strong>hyl <strong>et</strong>her). IR (KBr, �/cm -1 ): 3421 (OH),<br />
3093, 3032, 2966, 2873 (CH2, CH3), 1720 (CO). 1 H NMR (CD3OD) (Z/E � 50/50): � 0.98 (3<br />
H, t, J 7.3 Hz, CH3 for one isomer), 1.00 (3 H, t, J 7.3 Hz, CH3 for one isomer), 2.21 (2 H,<br />
broad m, CH2), 2.60 (2 H, q, J 7.3 Hz, CH2 for one isomer), 2.74 (2 H, d, J 15.3 Hz, CH2),<br />
2.79 (2 H, d, J 15.3 Hz, CH2), 2.85 and 2.86 (6 H, 2 s, NMe2H), 3.24 (2 H, broad m, CH2N),<br />
3.87 (2 H, t, J 1.9 Hz, C5H4 for one isomer), 3.89 (2 H, t, J 1.9 Hz, C5H4 for one isomer), 4.04<br />
(4 H, m, CH2O + C5H4), 4.09 (5 H, s, Cp), 6.61 (2 H, d, Harom for one isomer), 6.73 (2 H, d,<br />
Harom for one isomer), 6.76 (2 H, d, Harom for one isomer), 6.79 (2 H, d, Harom for one isomer),<br />
6.90 (4H, d, Harom), 6.98 (2 H, d, Harom for one isomer), 7.10 (2 H, d, Harom for one isomer).<br />
13 C NMR (CD3OD): � 15.9 (CH3), 25.7 (CH2), 29.1 (CH2), 43.6 (NMe2H + ), 45.3 (CH2), 56.7<br />
(CH2N), 66.1 (CH2O), 68.9 (2 CH, C5H4), 70.1 (5 CH, Cp), 70.3 (2 CH, C5H4), 74.6 (Cq,<br />
citrate), 88.7 (Cipso C5H4), 115.1 (2 CH, C6H4 for one isomer), 115.3 (2 CH, C6H4 for one<br />
isomer), 115.9 (2 CH for one isomer), 116.0 (2 CH, 115.1 (2 CH for one isomer), 131.6 (2<br />
CH, C6H4), 132.2 (2 CH, C6H4), 137.7 (C), 137.8 (C), 138.8 (C), 139.2 (C), 156.9 (C), 158.3<br />
(C), 175.9 (2xCO), 180.3 (CO).
<strong>Synthèse</strong> chimique<br />
1.10.27. <strong>Synthèse</strong> du citrate <strong>de</strong> 1-[4-(3-Hydrodiméthylamoniumpropoxy)phényl]-[4-(3-<br />
diméthylaminopropoxy)phényl]-12-ferrocényl-but-1-ène, P493<br />
Fe<br />
P116<br />
O(CH 2) 3NMe 2<br />
O(CH 2) 3NMe 2<br />
HO<br />
HOOC<br />
Ether/THF<br />
COOH<br />
COOH<br />
U.P.M.C./U.S. 98<br />
2010<br />
Fe<br />
P493<br />
O(CH 2 ) 3 NMe 2<br />
HO<br />
OOC<br />
O(CH 2 ) 3 NMe 2 H<br />
COOH<br />
COOH<br />
Schéma 26 : <strong>Synthèse</strong> du Citrate <strong>de</strong> 1-[4-(3-Hydrodiméthylamoniumpropoxy)phényl]-[4-(3-<br />
diméthylaminopropoxy)phényl]-12-ferrocényl-but-1-ène<br />
Le produit P116 (0,835 g ; 1,4 mmol) est dissout dans un ballon contenant 250 ml d’éther sec.<br />
L’aci<strong>de</strong> citrique (0,27 g ; 1, 3 mmol ; 0,9 eq), préalablement dissout dans du THF est ajouté<br />
goutte à goutte. Un précipité jaune est instantanément formé <strong>et</strong> est isolé par filtration puis<br />
séché à la pompe à vi<strong>de</strong> fournissant P493 en ren<strong>de</strong>ment quantitatif..<br />
P493 contient <strong>de</strong>s traces <strong>de</strong> solvants (THF <strong>et</strong> di<strong>et</strong>hyl <strong>et</strong>her). IR (KBr, �/cm -1 ): 3421 (OH),<br />
3032, 2962, 2877, (CH2, CH3), 1720 (CO). 1 H NMR (CD3OD): � 0.99 (3 H, t, J 7.4 Hz, CH3),<br />
1.86 (4 H, broad m, 2 CH2), 2.61 (2 H, q, J 7.4 Hz, CH2), 2.66 (2 H, d, J 15.3 Hz, CH2), 2.75<br />
(2 H, d, J 15.3 Hz, CH2), 2.86 and 2.87 (12 H, 2 s, 2 NMe2H + ), 3.30 (4 H, broad m, 2 CH2N),<br />
3.87 (2 H, m, C5H4), 4.02 (6 H, m, 2 CH2O + C5H4), 4.08 (5 H, s, Cp), 6.75 (2 H, d, J 8.1 Hz,<br />
C6H4), 6.90 (4 H, m, J 8.1 Hz, C6H4), 7.08 (2 H, d, J 8.1 Hz, C6H4). 13 C NMR (CD3SOCD3): �<br />
15.3 (CH3), 24.3 (2 CH2), 42.8 (2 NMe2H + ), 44.3 (2 CH2 citrate), 54.5 (2 CH2N), 66.9 (2<br />
CH2O), 67.8 (2 CH, C5H4), 68.6 (2 CH, C5H4), 69.0 (5 CH, Cp), 71.4 (Cq, citrate), 86.0 (Cipso<br />
C5H4), 114.1 (2x2 CH, C6H4), 129.9 (2 CH, C6H4), 130.3 (2 CH, C6H4), 136.2 (C), 136.4 (C),<br />
136.9 (C), 137.1 (C), 156.6 (2 C), 171.5 (2xCO), 176.9 (CO).
2. Essais <strong>biologiques</strong><br />
2.1. Etu<strong>de</strong> <strong>de</strong> l’eff<strong>et</strong> antimicrobien <strong>et</strong> antitumorale <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> synthétisés<br />
Essais <strong>biologiques</strong><br />
Les produits synthétisés sont <strong>de</strong>s analogues <strong>de</strong> produits bien connus par leur eff<strong>et</strong><br />
antitumorale. Pour déceler <strong>et</strong> m<strong>et</strong>tre en évi<strong>de</strong>nce un probable eff<strong>et</strong> antimicrobien <strong>de</strong> nos<br />
<strong>composés</strong>, quelques produits synthétisés, ont été testés contre Agrobaterium tumefaciens <strong>et</strong><br />
Fusarium oxysporium, respectivement bactérie responsable <strong>de</strong> la maladie <strong>de</strong> la galle du coll<strong>et</strong><br />
<strong>de</strong>s arbres fruitiers <strong>et</strong> champignon responsable du flétrissement <strong>de</strong> plusieurs plantes herbacées<br />
<strong>et</strong> ligneuses, par la métho<strong>de</strong> <strong>de</strong>s puits décrite par Tagg <strong>et</strong> Mc Given en 1971 (doses testées<br />
étaient <strong>de</strong> 1 mg/ml d'éthanol).<br />
Fe<br />
O<br />
O<br />
C 15 H 31<br />
O<br />
C 15 H 31<br />
O<br />
P66 (Fc(Opa2)) P15 (FcOHTAM) P5 (FcdiOH)<br />
Figure 42 : Produits testés pour l’essai antimicrobien<br />
Les essais menés in vitro montrent que le produit palmitate P66 (FcOPa2) n’est pas efficace<br />
contre Fusarium oxysporium à l’opposé <strong>de</strong>s produit P5 (FcdiOH) <strong>et</strong> P15 (FcOHTAM) qui se<br />
sont montrés efficaces.<br />
Les résultats consignés dans la figure 43 montrent également que le produit P66 (FcOPa2) est,<br />
contrairement à ce qui a été trouvé avec Fusarium oxysporium, efficace contre les trois<br />
souches d’Agrobacterium. Il apparaît également que le produit P15 (FcOHTAM) est<br />
légèrement plus efficace, contre Agrobacterium tumefaciens, que le produit P66 (FcOPa2) <strong>et</strong><br />
que le produit P5 (FcOHTAM) n’a cependant aucun eff<strong>et</strong> inhibiteur contre les bactéries<br />
testées.<br />
Fe<br />
( )<br />
3<br />
N<br />
O<br />
U.P.M.C./U.S. 99<br />
2010<br />
OH<br />
Fe<br />
OH<br />
OH
Essais <strong>biologiques</strong><br />
Le composé <strong>organométalliques</strong> P15 (FcOHTAM) se prom<strong>et</strong> avoir une activité antifongique <strong>et</strong><br />
antibactérienne alors que le composé P66 (FcOPa2) se porte candidat à un antibactérien <strong>et</strong> le<br />
P5 (FcOHTAM) se prom<strong>et</strong> un antifongique.<br />
Fusarium oxysporium<br />
OHTAM<br />
Figure 43 : Résultats antimicrobien<br />
(Agrobacterium tumefaciens : Souche 125 (isolée localement), Souche B6 (USA) <strong>et</strong> Souche RV3 (France))<br />
(Abréviations <strong>de</strong>s produits : P5 (OH2), P66 (OPA2) <strong>et</strong> P15 (OHTAM))<br />
Ces résultats seront donc confirmé <strong>et</strong> approfondi dans ce qui suit par la détermination <strong>de</strong> la<br />
concentration minimale inhibitrice (CMI) <strong>et</strong> <strong>de</strong> la concentration minimale bactérici<strong>de</strong> (CMB)<br />
<strong>de</strong>s produits obj<strong>et</strong> <strong>de</strong> notre étu<strong>de</strong> (Moroh, J.-L. <strong>et</strong> al., 2008).<br />
U.P.M.C./U.S. 100<br />
2010<br />
OH2<br />
Agrobaterium tumefaciens<br />
OPA2
Essais <strong>biologiques</strong><br />
Les tableaux suivants regroupent les résultats <strong>de</strong>s essais <strong>biologiques</strong> effectués sur les produits<br />
déjà synthétisés. (LogP0/w, antiprolifératif sur MDA-MB231 <strong>et</strong> eff<strong>et</strong> antimicrobien).<br />
Tableau 4 : Résultats <strong>biologiques</strong> <strong>de</strong>s produits utilisés comme référence<br />
Produits<br />
LogP0/w<br />
Aci<strong>de</strong> Tannique<br />
-<br />
(%) MDA-MB231/Contrôle<br />
(à 10<br />
-<br />
-6 M, J5)<br />
IC50 (10 -<br />
-6 M) « MDA-MB231 »<br />
Bactéries pathogènes aux végétaux<br />
A. tumefaciens<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
12,5<br />
25<br />
P. savastanoi<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
50<br />
100<br />
Champignons pathogènes aux végétaux<br />
F. Solani<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
50<br />
100<br />
Bactéries pathogènes à l’Homme<br />
P. aeruginosa<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
50<br />
100<br />
S. aureus<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
50<br />
100<br />
Champignons pa thogènes à l’Homme<br />
C. albicans<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
200<br />
>200<br />
OH O OH O O<br />
OH<br />
OH<br />
H H<br />
CH3 OH N<br />
H3C CH3<br />
Doxycycline<br />
-<br />
-<br />
-<br />
Produits<br />
Essais <strong>biologiques</strong><br />
P239 (DP1) P92<br />
P501<br />
ZEKCN ZEKBr<br />
LogP0/w<br />
4,6<br />
4,4<br />
-<br />
6,4<br />
-<br />
(%) MDA-MB231/Contrôle<br />
(à 10<br />
4,1<br />
+/- 0,2<br />
97,2<br />
+/- 0<br />
-<br />
90,7<br />
+/- 5<br />
92,8<br />
+/- 1<br />
-6 M, J5)<br />
>> 1 (d)<br />
10,9 (d)<br />
n. tox. -<br />
+/- 0,2<br />
(b)<br />
0,09 (c)<br />
IC50 (10<br />
+/- 0,01<br />
-6 M) « MDA-MB231 »<br />
Bactéries pathogènes aux végétaux<br />
A. tumefaciens<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
50<br />
100<br />
50<br />
100<br />
25<br />
50<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200<br />
P. savastanoi<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
50<br />
100<br />
25<br />
50<br />
25<br />
50<br />
50<br />
200<br />
50<br />
200<br />
Champignons pathogènes aux végétaux<br />
F. Solani<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
Tableau 7 : Résultats <strong>biologiques</strong> d’analogues <strong>de</strong>s diaryl-ferrocényl-butènes<br />
Produits<br />
HO<br />
Fe<br />
OMe<br />
Essais <strong>biologiques</strong><br />
P38 (c)<br />
P2<br />
P23<br />
P24<br />
(a)<br />
LogP0/w<br />
-<br />
6,4<br />
6,4<br />
6,2<br />
(%) MDA-MB231/Contrôle<br />
(à 10<br />
-<br />
99<br />
+/- 1,17<br />
85,5<br />
+/- 0,8<br />
95,7<br />
+/- 0,5<br />
-6 M, J5)<br />
4,15<br />
-<br />
(b)<br />
3,74<br />
+/- 0,2<br />
(b)<br />
IC50 (10 -<br />
+/- 0,24<br />
-6 M) « MDA-MB231 »<br />
Bactéries pathogènes aux végétaux<br />
A. tumefaciens<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
100<br />
200<br />
50<br />
200<br />
50<br />
200<br />
50<br />
200<br />
P. savastanoi<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
50<br />
100<br />
50<br />
200<br />
50<br />
200<br />
50<br />
200<br />
Champignons pathogènes aux végétaux<br />
F. Solani<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
100<br />
200<br />
50<br />
200<br />
50<br />
200<br />
50<br />
200<br />
Bactéries pathogènes à l’Homme<br />
P. aeruginosa<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
50<br />
100<br />
50<br />
200<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200<br />
S. aureus<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200<br />
Champignons pa thogènes à l’Homme<br />
C. albicans<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200<br />
50<br />
100<br />
100<br />
200<br />
a) Produit <strong>de</strong> (Tan, Y.L.K. <strong>et</strong> al., 2009), b) valeur <strong>de</strong> (Hillard, E.A. (b) <strong>et</strong> al., 2007), c) Produit <strong>de</strong> (Nguyen, A. <strong>et</strong> al., 2009)<br />
Tableau 8 : Résultats <strong>biologiques</strong> <strong>de</strong> <strong>composés</strong> métalliques <strong>de</strong> diphénol butène<br />
Produits<br />
P90 (c)<br />
P88 (c)<br />
P5 P239 (DP1)<br />
LogP0/w<br />
4,9<br />
4,6<br />
4,9<br />
5,6<br />
5,5<br />
(%) MDA-MB231/Contrôle 26,5<br />
4,1<br />
96,3<br />
97<br />
98,3<br />
(à 10 +/- 0,6<br />
+/- 0,2<br />
+/- 2,3 +/- 0,05<br />
+/- 0<br />
-6 M, J5)<br />
0,09<br />
-<br />
-<br />
-<br />
(b)<br />
0,64<br />
+/- 0,01<br />
(a)<br />
IC50 (10<br />
+/- 0,06<br />
-6 M) « MDA-MB231 »<br />
Bactéries pathogènes aux végétaux<br />
A. tumefaciens<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
50<br />
100<br />
50<br />
100<br />
50<br />
100<br />
25<br />
50<br />
50<br />
100<br />
P. savastanoi<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
50<br />
100<br />
50<br />
100<br />
50<br />
100<br />
50<br />
100<br />
50<br />
100<br />
Champignons pathogènes aux végétaux<br />
F. Solani<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
Tableau 9 : Résultats <strong>biologiques</strong> d’ami<strong>de</strong>s analogues du ferrociphénol<br />
Produits<br />
P314 (a)<br />
LogP0/w<br />
5,9<br />
(%) MDA-MB231/Contrôle 37,05<br />
(à 10 +/- 0<br />
-6 M, J5)<br />
0,65 (a)<br />
IC50 (10<br />
+/- 0,01<br />
-6 M) « MDA-MB231 »<br />
Bactéries pathogènes aux végétaux<br />
A. tumefaciens<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
50<br />
100<br />
P. savastanoi<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
50<br />
200<br />
Champignons pathogènes aux végétaux<br />
F. Solani<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
100<br />
200<br />
Bactéries pathogènes à l’Homme<br />
P. aeruginosa<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
100<br />
200<br />
S. aureus<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
100<br />
200<br />
Champignons pa thogènes à l’Homme<br />
C. albicans<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
100<br />
200<br />
Produits<br />
LogP0/w<br />
(%) MDA-MB231/Contrôle<br />
(à 10 -6 M, J5)<br />
IC50 (10 -6 M) « MDA-MB231 »<br />
P274 (b)<br />
-<br />
-<br />
-<br />
P315<br />
5,9<br />
33,9<br />
+/- 4,9<br />
1,2<br />
+/- 0,2<br />
50<br />
100<br />
50<br />
200<br />
50<br />
100<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200<br />
P318 (b)<br />
-<br />
-<br />
-<br />
Essais <strong>biologiques</strong><br />
U.P.M.C./U.S. 104<br />
2010<br />
P316<br />
6,1<br />
23,4<br />
+/- 1,9<br />
2,02<br />
+/- 0,2<br />
25<br />
50<br />
50<br />
200<br />
50<br />
100<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200<br />
P331 (b)<br />
-<br />
-<br />
-<br />
P317<br />
6,3<br />
42,5<br />
+/- 4<br />
5,7<br />
+/- 0,01<br />
25<br />
50<br />
50<br />
200<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200<br />
P290 (b)<br />
Bactéries pathogènes aux végétaux<br />
A. tumefaciens<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200<br />
25<br />
100<br />
25<br />
100<br />
P. savastanoi<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200<br />
50<br />
100<br />
50<br />
100<br />
Champignons pathogènes aux végétaux<br />
F. Solani<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200<br />
25<br />
100<br />
Produits<br />
Tableau 10 : Résultats <strong>biologiques</strong> d’amines d’aryl-ferrocényl-butène<br />
Citrate P17 (b)<br />
P17 (b)<br />
P246<br />
P35<br />
LogP0/w<br />
4,8<br />
5,7<br />
-<br />
-<br />
(%) MDA-MB231/Contrôle<br />
(à 10<br />
95,4<br />
+/- 0,1<br />
58,8<br />
+/- 0<br />
13,5<br />
+/- 0,4<br />
-<br />
-6 M, J5)<br />
0,86 2,97<br />
+/- 0,57<br />
-<br />
(a)<br />
> 1<br />
+/- 0,04<br />
(a)<br />
IC50 (10 -6 M) « MDA-MB231 »<br />
Bactéries pathogènes aux végétaux<br />
A. tumefaciens<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
50<br />
200<br />
100<br />
200<br />
50<br />
100<br />
50<br />
100<br />
P. savastanoi<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
50<br />
100<br />
25<br />
200<br />
50<br />
100<br />
50<br />
100<br />
Champignons pathogènes aux végétaux<br />
F. Solani<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
50<br />
200<br />
100<br />
200<br />
50<br />
100<br />
50<br />
100<br />
Bactéries pathogènes à l’Homme<br />
P. aeruginosa<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
50<br />
200<br />
25<br />
50<br />
50<br />
200<br />
50<br />
100<br />
S. aureus<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
50<br />
200<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200<br />
50<br />
100<br />
Champignons pa thogènes à l’Homme<br />
C. albicans<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
50<br />
200<br />
100<br />
200<br />
50<br />
100<br />
50<br />
100<br />
a) Valeur <strong>de</strong> (Pigeon, P.<strong>et</strong> al., 2009), b) Produit <strong>de</strong> Pascal Pigeon<br />
Produits<br />
LogP0/w<br />
(%) MDA-MB231/Contrôle<br />
(à 10 -6 M, J5)<br />
IC50 (10 -6 M) « MDA-MB231 »<br />
Tableau 11 : Résultats <strong>biologiques</strong> <strong>de</strong> différents esters<br />
P66 (a)<br />
-<br />
100<br />
+/- 1,24<br />
-<br />
Essais <strong>biologiques</strong><br />
U.P.M.C./U.S. 105<br />
2010<br />
P67 (b)<br />
-<br />
-<br />
-<br />
0H<br />
P78 (b)<br />
Bactéries pathogènes aux végétaux<br />
Agrobacterium tumefaciens<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
50<br />
200<br />
50<br />
200<br />
50<br />
200<br />
Pseudomonas savastanoi<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
50<br />
100<br />
50<br />
100<br />
50<br />
100<br />
Champignons pathogènes aux végétaux<br />
Fusarium Solani<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200<br />
Bactéries pathogènes à l’Homme<br />
Pseudomonas aeruginosa<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
50<br />
200<br />
50<br />
200<br />
50<br />
200<br />
Staphylococcus aureus<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
100<br />
200<br />
50<br />
200<br />
100<br />
200<br />
Champignons pa thogènes à l’Homme<br />
Candida albicans<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200<br />
a) Produit <strong>de</strong> (Soares, M.B.P. <strong>et</strong> al., 2010) b) Produit <strong>de</strong> Pascal Pigeon<br />
-<br />
-<br />
-<br />
0H<br />
P79 (b)<br />
-<br />
-<br />
-<br />
100<br />
200<br />
50<br />
100<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200<br />
50<br />
200<br />
P371<br />
-<br />
-<br />
-<br />
-<br />
-<br />
-<br />
-<br />
-<br />
-<br />
50<br />
100<br />
50<br />
100<br />
100<br />
200<br />
P80 (b)<br />
-<br />
-<br />
-<br />
50<br />
100<br />
25<br />
200<br />
50<br />
100<br />
25<br />
50<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200
Produits<br />
LogP0/w<br />
(%)<br />
MDA-MB231/Contrôle<br />
(à 10 -6 M, J5)<br />
IC50 (10 -6 M)<br />
Tableau 12 : Résultats <strong>biologiques</strong> <strong>de</strong> différents <strong>composés</strong> aminés<br />
( )3 )3<br />
( )3 )3<br />
P490<br />
-<br />
Bactéries pathogènes aux végétaux<br />
A. tumefaciens<br />
CMI<br />
CMB<br />
50<br />
100<br />
P. savastanoi<br />
CMI<br />
CMB<br />
50<br />
100<br />
Champignons pathogènes aux végétaux<br />
F. Solani<br />
CMI<br />
CMB<br />
50<br />
100<br />
Bactéries pathogènes à l’Homme<br />
P. aeruginosa<br />
CMI<br />
CMB<br />
25<br />
50<br />
S. aureus<br />
CMI<br />
CMB<br />
50<br />
200<br />
Champignons pa thogènes à l’Homme<br />
C. albicans<br />
CMI<br />
CMB<br />
50<br />
100<br />
Produits<br />
LogP0/w<br />
(%)<br />
MDA-MB231/Contrôle<br />
(à 10 -6 M, J5)<br />
IC50 (10 -6 M)<br />
-<br />
-<br />
P14 (b)<br />
4,065<br />
-<br />
-<br />
( )4 )4<br />
P305<br />
3,8<br />
2,45<br />
+/- 0<br />
( )3 )3<br />
( )3 )3<br />
0,34<br />
+/- 0,05<br />
2.2. Application <strong>de</strong>s meilleures produits synthétisés à la phytopharmacie<br />
2.2.1. Test <strong>de</strong> phytotoxicité<br />
Essais <strong>biologiques</strong><br />
Comme illustré dans le tableau suivant, le produit P493 s’est avéré non phytotoxique même<br />
pour la dose la plus élevée (1000 µg/ml).<br />
D’ail<strong>leurs</strong>, pour les autres doses utilisées, ce produit a démontré une amélioration <strong>de</strong> la<br />
germination <strong>de</strong>s graines.<br />
Témoin négatif 25 µg/ml 200 µg/ml 1000 µg/ml<br />
Figure 44 : Etu<strong>de</strong> <strong>de</strong> la phytotoxicité du P493<br />
Ce produit pourrait donc, entre autres, puisqu’il présente un eff<strong>et</strong> antimicrobien assez<br />
intéressant être utilisé dans le traitement <strong>de</strong>s semences.<br />
Tableau 13 : Indices <strong>de</strong> germination pour différentes concentrations <strong>de</strong> P493<br />
Concentration 25 µg/ml 100 µg/ml 200 µg/ml 1000 µg/ml<br />
IG 142,63 148,83 149,35 117,31<br />
2.2.2. Lutte contre la galle du coll<strong>et</strong> sur olivier<br />
Ce test a été effectué sur <strong>de</strong>s plants d’olivier <strong>de</strong> la variété Chemlali qu’on a multiplié in vitro.<br />
En eff<strong>et</strong>, après 15 jours <strong>de</strong> la mise en culture il y a eu apparition <strong>de</strong>s racines <strong>et</strong> <strong>de</strong>s p<strong>et</strong>ites<br />
feuilles pour les <strong>de</strong>mi amendons dont l’utilisation améliore n<strong>et</strong>tement le taux <strong>de</strong> germination<br />
qui atteint 74,12 % <strong>et</strong> qui ne dépasse pas les 38% lors <strong>de</strong> l’utilisation d’amendons intactes<br />
U.P.M.C./U.S. 107<br />
2010
Essais <strong>biologiques</strong><br />
(Figure 45). L’utilisation <strong>de</strong>s <strong>de</strong>mi-amendons a donc un eff<strong>et</strong> important sur l’accélération <strong>et</strong> le<br />
taux <strong>de</strong> la germination <strong>de</strong> l’olivier.<br />
Après 2 mois d’incubation il est ressorti que 80% <strong>de</strong>s plants du témoin (+) <strong>et</strong> 30 % seulement <strong>de</strong>s<br />
plants traités ont manifesté les symptômes <strong>de</strong> la maladie <strong>et</strong> ont développé <strong>de</strong>s galles (Figure 46).<br />
Gonflement <strong>de</strong> la graine (10 ème jours) Emergence <strong>de</strong> la radicule (15 ème jours)<br />
Apparition <strong>de</strong>s cotylédons (28 ème jours) Développement <strong>de</strong> la tige (35 ème jours)<br />
Plante bien développée (60 ème Jours)<br />
Figure 45 : Différents sta<strong>de</strong>s <strong>de</strong> la culture in vitro <strong>de</strong>s oliviers<br />
U.P.M.C./U.S. 108<br />
2010
Non traité Traité (250 µg/ml)<br />
Figure 46 : Essai in vivo <strong>de</strong> l’eff<strong>et</strong> du P493 contre la galle du coll<strong>et</strong> sur olivier<br />
2.2.3. Lutte contre la tuberculose <strong>de</strong> l’olivier<br />
Essais <strong>biologiques</strong><br />
Après 3 mois d’incubation à la température ambiante, il est ressorti que 83 % <strong>de</strong>s plants du témoin<br />
(+) ont développé <strong>de</strong>s tumeurs bien différenciées, le témoin (-) ainsi que tous les plants <strong>de</strong>s <strong>de</strong>ux<br />
concentrations testées (100 <strong>et</strong> 200 µg/ml) n’ont pas manifesté la maladie (Figure 47)<br />
T- T+ 100 µg/ml 200 µg/ml<br />
Figure 47 : Essai in vivo <strong>de</strong> l’eff<strong>et</strong> du P493 contre la tuberculose <strong>de</strong> l’olivier<br />
2.2.4. Lutte contre la maladie causée par Fusarium solani<br />
Après 3 mois d’incubation il est ressorti que les plants du témoin (+) ont manifesté les symptômes<br />
<strong>de</strong> la maladie <strong>et</strong> ont perdu la majorité <strong>de</strong>s feuilles inoculées tandis que les plants traités par les<br />
différentes concentrations (25 <strong>et</strong> 100 µg/ml) ont vu les blessures <strong>de</strong>s feuilles cicatrisées <strong>et</strong> ont<br />
conservé la majorité <strong>de</strong>s feuilles inoculées. (Figure 48).<br />
U.P.M.C./U.S. 109<br />
2010
T+ (Jaunissement puis perte <strong>de</strong>s feuilles) 100 µg/ml (absence <strong>de</strong>s symptomes)<br />
Figure 48 : Essai in vivo <strong>de</strong> l’eff<strong>et</strong> du P493 contre Fusarium solani sur olivier<br />
2.3. Partie expérimentale<br />
2.3.1. Détermination du coefficient <strong>de</strong> partage<br />
Essais <strong>biologiques</strong><br />
Les coefficients <strong>de</strong> partage ont été déterminés par l’utilisation d’une HPLC en phase inverse<br />
ayant comme colonne Kromazil C8 Macherey Nagel. La détection a été faite à 270 nm en<br />
utilisant comme phase organique le MeOH contenant 0,25% d’octanol <strong>et</strong> comme phase<br />
aqueuse <strong>de</strong> l’eau saturée en octanol contenant 0,15% <strong>de</strong> N-décylamine <strong>et</strong> 0,002 M <strong>de</strong> MOPS à<br />
pH 7,4 (Hansch, C. <strong>et</strong> Leo, A., 1995).<br />
Les injections <strong>de</strong> 20 µl <strong>de</strong>s produits à tester à une concentration <strong>de</strong> 10 -3 M en MeOH, ont été<br />
faites par seringue Hamilton en utilisant comme référence l’œstradiol (provenant <strong>de</strong> Sigma-<br />
Aldrich) <strong>et</strong> comme indicateur du t0 l’uracile (Les solutions à injecter ont été préparées par le<br />
mélange <strong>de</strong> 125 µl du produit 10 -3 M <strong>et</strong> 25 µl d’uracile 10 -3 M). Ainsi, chaque produit a été<br />
passé 4 fois sur HPLC tout en changeant, en fonction du produit, à chaque injection le<br />
pourcentage <strong>de</strong> la phase organique (70%, 75%, 77,5%, 80%, 80%, 85%, 90% <strong>et</strong> 95%).<br />
La mesure <strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong> capacité chromatographique (k’) pour chaque molécule a été donc<br />
effectuée <strong>et</strong> extrapolés à 100% <strong>de</strong> la phase aqueuse, donnant ainsi la valeur <strong>de</strong> kw’. Le log<br />
Po/w est alors obtenu par la formule log Po/w = 0,13418 + 0,98452 log kw’.<br />
U.P.M.C./U.S. 110<br />
2010
Essais <strong>biologiques</strong><br />
Nous avons testé les produits synthétisés sous la responsabilité du Dr . Anne Vessières <strong>et</strong><br />
certains essais ont été réalisés par Marie Au<strong>de</strong> PLAMONT. Dans l’exemple qui suit sera<br />
développée la détermination du coefficient <strong>de</strong> partage <strong>de</strong> l’œstradiol (Produit <strong>de</strong> référence) <strong>et</strong><br />
du P116 illustrés sur la figure 49.<br />
P116<br />
( )3 )3<br />
( )3 )3<br />
Figure 49 : Echantillon <strong>de</strong> produits testés<br />
Les tableaux <strong>et</strong> figures suivantes illustrent les différents temps <strong>de</strong> rétention <strong>de</strong>s produits testés<br />
pour les différentes phases mobiles utilisés ainsi que <strong>leurs</strong> coefficients <strong>de</strong> partage.<br />
Tableau 14 : Détermination du coefficient <strong>de</strong> partage (œstradiol)<br />
MeOH To T t-to t-to/to Logk' MeOH A B<br />
-23,594 75,281<br />
95 3,13 3,58 0,45 0,14 -0,84 95 0,252 0,112<br />
90 3,15 3,90 0,75 0,24 -0,62 90 1,000 0,225<br />
80 3,18 5,23 2,05 0,64 -0,19 80 8789,188 4,000<br />
77,5 3,17 5,77 2,6 0,82 -0,09 77,5 446,672 0,203<br />
75 3,15 6,40 3,25 1,03 0,01 75 log k'w= 3,191<br />
70 3,20 8,40 5,2 1,63 0,21 70 logPo/w 3,275<br />
Tableau 15 : Détermination du coefficient <strong>de</strong> partage (P116)<br />
MeOH To T t-to t-to/to Logk' MeOH A B<br />
-26,547 92,397<br />
80 3,17 12,78 9,61 3,03 0,48 80 1,737 1,123<br />
77,5 3,17 14,58 11,41 3,60 0,56 77,5 0,992 0,482<br />
75 3,15 16,80 13,65 4,33 0,64 75 233,675 2,000<br />
70 3,20 25,98 22,780 7,12 0,85 70 54,223 0,464<br />
Log k'w= 3,481<br />
logPo/w 3,561<br />
logPo/w<br />
-1,00 -0,50<br />
0<br />
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50<br />
U.P.M.C./U.S. 111<br />
2010<br />
100<br />
75<br />
50<br />
25<br />
-25<br />
-50<br />
%MeOH<br />
%MeOH<br />
100<br />
75<br />
50<br />
25<br />
-25<br />
logk'<br />
Figure 50 : Coefficient <strong>de</strong> partage (Œstradiol)<br />
logPo/w<br />
0<br />
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00<br />
logk'<br />
Figure 51 : Coefficient <strong>de</strong> partage (P116)
2.3.2. Eff<strong>et</strong> antiprolifératif<br />
Essais <strong>biologiques</strong><br />
Les produits ont été testés contre <strong>de</strong>s cellules du cancer du sein hormono-indépendantes<br />
« MDA-MB231 ». Les produits testés ont été dissouts dans du diméthylsulfoxy<strong>de</strong> (DMSO) <strong>et</strong><br />
leur efficacité a été évaluée contre les cellules tumorales cultivées dans du milieu DMEM<br />
(Dulbecco’s modified eagle medium).<br />
Le DMEM provient <strong>de</strong> Gibco/Invitrogen. Le sérum fœtal <strong>de</strong> veau, la glutamine <strong>et</strong> la<br />
kanamycine proviennent d’Invitrogen. Le sulfate <strong>de</strong> protamine provient <strong>de</strong> Sigma. Les<br />
cellules MDA-MB231 sont issues <strong>de</strong> la banque cellulaire ATCC (American Type Culture<br />
Collection).<br />
Les cellules ont été maintenues dans une culture dans DMEM avec le rouge <strong>de</strong><br />
phénol/Glutamax complété avec le sérum <strong>de</strong> bœuf fo<strong>et</strong>al <strong>de</strong> 9% à 37°C dans un incubateur à<br />
air-humidifié <strong>et</strong> à 5% <strong>de</strong> CO2.<br />
Pour les analyses <strong>de</strong> prolifération, <strong>de</strong>s cellules MDA-MB-231 ont été ensemencées dans 1 ml <strong>de</strong><br />
DMEM sans rouge <strong>de</strong> phénol, complété avec 9% <strong>de</strong> sérum fo<strong>et</strong>al <strong>de</strong> bœuf dépourvu<br />
d’hormone, 0,9% kanamycine, 0,9% <strong>de</strong> Glutamax I puis incubé.<br />
Le jour suivant (J0), 1 ml du même milieu contenant les <strong>composés</strong> à examiner a été<br />
ajouté aux puits. Après 3 jours (J3) le milieu d'incubation a été enlevé <strong>et</strong> 2 ml du milieu<br />
frais contenant les <strong>composés</strong> à tester ont été ajoutés.<br />
Après 5 jours la teneur en protéines totales du puits a été analysée comme suit : les<br />
couches unitaires <strong>de</strong> cellules étaient fixées avec du bleu <strong>de</strong> méthylène (1 mg/ml dans<br />
<strong>de</strong> l'eau <strong>et</strong> MeOH 50:50) pendant 1 h à la température ambiante, puis lavé avec <strong>de</strong> l'eau.<br />
Après addition <strong>de</strong> HCl (0,1 M, 2 ml), la plaque a été incubée pour 1 h à 37°C <strong>et</strong> alors<br />
l'absorbance <strong>de</strong> chacun <strong>de</strong>s puits (trois puits pour chaque concentration) a été mesurée à<br />
655 nm avec un lecteur <strong>de</strong> microplaque <strong>de</strong> Biorad.<br />
Les expériences ont été réalisées <strong>de</strong>ux fois <strong>et</strong> les résultats sont exprimés comme<br />
pourcentage <strong>de</strong>s protéines par rapport au contrôle négatif.<br />
U.P.M.C./U.S. 112<br />
2010
Essais <strong>biologiques</strong><br />
Nous avons testé les produits synthétisés sous la responsabilité du Dr . Anne Vessières <strong>et</strong><br />
certains essais ont été réalisés par Marie Au<strong>de</strong> PLAMONT. L’exemple qui suit, illustre la<br />
détermination <strong>de</strong> leur eff<strong>et</strong> antiprolifératif sur MDA-MB231 <strong>de</strong>s produits P35, P314, P315,<br />
P316, P317, P305, P257, P286, P116 <strong>et</strong> P292.<br />
L’essai a été effectué <strong>de</strong>ux fois <strong>et</strong> les résultats <strong>de</strong>s <strong>de</strong>ux analyses effectuées sont illustrés sur<br />
la figure (52) <strong>et</strong> le tableau (16) contient la moyenne <strong>de</strong>s <strong>de</strong>ux analyses réalisées.<br />
Figure 52 : Eff<strong>et</strong> antiprolifératif <strong>de</strong> quelques <strong>composés</strong> synthétisés<br />
Tableau 16 : Eff<strong>et</strong> antiprolifératif <strong>de</strong>s produits testés sur MDA-MB231 (J5 à 10 -6 M)<br />
Produits P35 P314 P315 P316 P317 P305 P257 P286 P116 P292<br />
(%)<br />
MDA-MB231 /Contrôle<br />
(à 10 -6 M, J5)<br />
58,8 37,05 33,9 23,4 42,5 2,45 18,9 6,42 5,1 47,02<br />
U.P.M.C./U.S. 113<br />
2010
2.3.3. Estimation <strong>de</strong> l’eff<strong>et</strong> antimicrobien<br />
2.3.3.1. Détermination <strong>de</strong>s zones d’inhibition<br />
Essais <strong>biologiques</strong><br />
A l’ai<strong>de</strong> <strong>de</strong> cônes jaunes stériles, <strong>de</strong>s puits sont creusés dans une boite <strong>de</strong> Pétri préalablement<br />
coulée par du milieu Plate Count Agar (PCA) <strong>et</strong> inoculée en surface par une culture jeune<br />
d’Agrobacterium tuméfaciens (10 6 UFC/ml). (Tagg, J. R. <strong>et</strong> McGiven, A. R., 1971).<br />
Les puits sont par la suite remplis par 50 µl <strong>de</strong>s différentes suspensions <strong>de</strong> produits à tester<br />
(1 mg/ml), puis incubés 24 heures à la température <strong>de</strong> 37°C.<br />
La même technique a été utilisé pour la détection <strong>de</strong> l’eff<strong>et</strong> inhibiteur sur le champignon<br />
Fusarium oxysporium, qui a été cependant inoculés au centre <strong>de</strong> la boite <strong>de</strong> Pétri <strong>et</strong> incubé<br />
pendant une semaine à la température <strong>de</strong> 25°C pour la détection d’une inhibition à la<br />
périphérie <strong>de</strong>s puits.<br />
2.3.3.2. Détermination <strong>de</strong>s CMI <strong>et</strong> CMB<br />
2.3.3.2.1. Souches microbiennes testées<br />
La concentration minimale inhibitrice (CMI) <strong>et</strong> la concentration minimale bactérici<strong>de</strong> (CMB)<br />
ont été mesurées sur les souches microbiennes illustrées sur le tableau suivant :<br />
Tableau 17 : Souches microbiennes utilisées pour la détermination <strong>de</strong> la CMI <strong>et</strong> <strong>de</strong> la CMB<br />
Souches Référence Description<br />
Pathogènes pour les végétaux<br />
Pseudomonas savastanoi CFBP 5514 Bacille à Gram –<br />
Agrobacterium tumefaciens CFBP 1903 Bacille à Gram –<br />
Fusarium Solani Isolée localement Champignon<br />
Pathogènes pour l’homme<br />
Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 Bacille à Gram –<br />
Staphylococcus aureus ATCC 9144 Coques à Gram +<br />
Candida albicans ATCC 10231 Levure<br />
U.P.M.C./U.S. 114<br />
2010
2.3.3.2.2. Milieux <strong>de</strong> cultures utilisés<br />
2.3.3.2.2.1. Milieu liqui<strong>de</strong><br />
Essais <strong>biologiques</strong><br />
Le milieu liqui<strong>de</strong> utilisé pour la préparation <strong>de</strong>s cultures microbiennes, <strong>de</strong>s inoculums <strong>et</strong> la<br />
détermination <strong>de</strong> la CMI, est un milieu reconstitué à partir <strong>de</strong>s constituants du milieu PCA<br />
sans ajout <strong>de</strong> l’agar (tryptone (5g), extrait <strong>de</strong> levure (2,5g), glucose (1g)).<br />
2.3.3.2.2.2. Milieu soli<strong>de</strong><br />
Le milieu soli<strong>de</strong> utilisé pour la détermination <strong>de</strong> la CMB est le milieu PCA dont la<br />
composition pour un litre est la suivante : tryptone (5g), extrait <strong>de</strong> levure (2,5g), glucose (1g)<br />
<strong>et</strong> agar bactériologique (12g).<br />
2.3.3.2.3. Préparation <strong>de</strong> l’inoculum<br />
Une culture microbienne est préparée par repiquage d’une colonie <strong>de</strong> la souche à tester dans<br />
100 ml <strong>de</strong> milieu liqui<strong>de</strong>.<br />
Après incubation 20 heures à 30°C, 200 µl sont prélevés <strong>et</strong> dissous dans 50 ml du même<br />
milieu pour constituer l’inoculum.<br />
Pour estimer la concentration microbienne <strong>de</strong> l’inoculum, <strong>de</strong>s dilutions décimales sont<br />
effectuées puis ensemencées par stries, sur milieu soli<strong>de</strong>, dans une boite <strong>de</strong> Pétri.<br />
2.3.3.2.4. Détermination <strong>de</strong> la CMI<br />
Des solutions dans l’éthanol, <strong>de</strong> concentration 2 mg/ml pour les produits à tester ont été<br />
préparées.<br />
Dans le premier tube, contenant 1,6 ml <strong>de</strong> milieu <strong>de</strong> culture liqui<strong>de</strong>, d’une série <strong>de</strong> 5 tubes à<br />
essai sont introduit 400 µl <strong>de</strong> la solution du produit à tester. Des dilutions au ½ sont effectuées<br />
par transfert <strong>de</strong> 1ml du premier tube au second, puis <strong>de</strong> ce <strong>de</strong>rnier au suivant <strong>et</strong> ainsi <strong>de</strong> suite.<br />
U.P.M.C./U.S. 115<br />
2010
Essais <strong>biologiques</strong><br />
Une fois les dilutions <strong>de</strong>s produits à tester sont effectuées, on introduit dans chaque tube 1 ml<br />
<strong>de</strong> l’inoculum <strong>de</strong> la souche à tester préalablement préparé.<br />
Un témoin négatif (tube non ensemencé), un témoin positif (Tube ensemencé) <strong>et</strong> un témoin<br />
positif contenant les mêmes proportions d’éthanol que le tube 1, sont incubé avec les tubes <strong>de</strong><br />
dilution pendant 20 heures à 30°C.<br />
La détermination <strong>de</strong> la concentration minimale inhibitrice est effectué par estimation visuelle<br />
<strong>de</strong> l’apparition ou non <strong>de</strong> trouble dans les tubes incubé <strong>et</strong> la CMI correspond à la plus p<strong>et</strong>ite<br />
concentration ayant resté limpi<strong>de</strong>.<br />
2.3.3.2.5. Détermination <strong>de</strong> la CMB<br />
Un ensemencement par strie est effectué dans une boite <strong>de</strong> Pétri à partir <strong>de</strong>s tubes <strong>de</strong>s<br />
différentes dilutions qui sera par suite incubé à 37°C pendant 24 heures.<br />
C<strong>et</strong>te étape va nous perm<strong>et</strong>tre <strong>de</strong> déterminer la CMB qui correspond à la dilution qui arrive à<br />
tuer les microorganismes présents dans le tube (se manifeste par l’absence <strong>de</strong> biomasse sur la<br />
strie), <strong>et</strong> <strong>de</strong> confirmer les résultats <strong>de</strong> CMI.<br />
Pour s’assurer que l’éthanol, utilisé comme solvant pour le produits à tester n’a pas d’eff<strong>et</strong><br />
bactérici<strong>de</strong> sur les souches testées, un ensemencement par strie, sur boite <strong>de</strong> Pétri, à partir <strong>de</strong>s<br />
témoins positifs qui en contiennent a été effectué.<br />
2.3.4. Estimation in vivo <strong>de</strong> l’eff<strong>et</strong> antimicrobien<br />
2.3.4.1. Test <strong>de</strong> phytotoxicité<br />
La phytotoxicité a été estimée par la détermination <strong>de</strong> l’indice <strong>de</strong> germination selon Zucconi<br />
<strong>et</strong> al. en 1981. Dix graines <strong>de</strong> tomate <strong>de</strong> la variété Lycopersion esculentum ont été semées<br />
dans une boite <strong>de</strong> Pétri contenant 3 ml d’une solution aqueuse du produit P493 (0 µg/ml, 25<br />
µg/ml, 100 µg/ml, 200 µg/ml <strong>et</strong> 1000 µg/ml).<br />
U.P.M.C./U.S. 116<br />
2010
Essais <strong>biologiques</strong><br />
Les boites ont été incubées à l’obscurité <strong>et</strong> à la température <strong>de</strong> 28°C durant 72 heures puis le<br />
nombre <strong>de</strong> graines germées ainsi que la longueur <strong>de</strong> <strong>leurs</strong> racines ont été déterminés.<br />
L’indice <strong>de</strong> germination est ensuite déterminé par l’application <strong>de</strong> la formule suivante :<br />
Nombre <strong>de</strong> semences germées dans l’essai Moyenne <strong>de</strong> la longueur <strong>de</strong>s racines dans l’essai<br />
IG = X X 100<br />
Nombre <strong>de</strong> semences germées dans le témoin Moyenne <strong>de</strong> la longueur <strong>de</strong>s racines dans le témoin<br />
2.3.4.2. Lutte contre la galle du coll<strong>et</strong> sur olivier<br />
Des plants d’oliviers <strong>de</strong> la variété Chemlali, issus <strong>de</strong> culture in vitro ont été r<strong>et</strong>irés stérilement<br />
<strong>de</strong> <strong>leurs</strong> tubes <strong>de</strong> cultures, blessés à l’ai<strong>de</strong> d’un scalpel stérile puis inoculés à l’ai<strong>de</strong> d’une anse<br />
stériles par une culture jeune <strong>de</strong> C58 (CFBP 1903) d’Agrobacterium tumefaciens.<br />
Les plants inoculés sont remis aussitôt dans <strong>leurs</strong> tubes <strong>et</strong> incubés dans la salle <strong>de</strong> culture à la<br />
température <strong>de</strong> 25°C pour servir par la suite aux tests <strong>de</strong> l’eff<strong>et</strong> antimicrobien <strong>et</strong> antitumoral<br />
<strong>de</strong> nos produits.<br />
Les plants d’oliviers, issus <strong>de</strong> la culture in vitro, ont été traités par pulvérisation d’une<br />
suspension aqueuse du produit P493 (250 µg/ml) après trois jours <strong>de</strong> leur inoculation par la<br />
souche C58 (CFBP 1903) d’Agrobacterium tumefaciens.<br />
2.3.4.3. Lutte contre la tuberculose <strong>de</strong> l’olivier<br />
Pour la détermination <strong>de</strong> l’eff<strong>et</strong> antimicrobien in vivo contre Pseudomonas savastanoi, <strong>de</strong>s plants<br />
d’olivier <strong>de</strong> la variété Chemlali âgés d’une année, ont été blessés à l’ai<strong>de</strong> d’un scalpel puis inoculés<br />
par 10µl d’une suspension microbienne <strong>de</strong> 10 8 UFC/ml <strong>de</strong> Pseudomonas savastanoi (CFBP<br />
5514) <strong>et</strong> incubés dans la serre, à la température ambiante pendant 3 jours.<br />
Après 3 jours d’incubation, les blessures sont traitées avec 10 µl <strong>de</strong> différentes concentrations<br />
du P493 puis incubés dans la serre à la température ambiante.<br />
U.P.M.C./U.S. 117<br />
2010
2.3.4.4. Lutte contre la maladie causée par Fusarium solani<br />
Essais <strong>biologiques</strong><br />
Pour la détermination <strong>de</strong> l’eff<strong>et</strong> antimicrobien in vivo contre Fusarium solani, <strong>de</strong>s plants d’olivier<br />
<strong>de</strong> la variété Chemlali âgés d’une année, ont été blessés à l’ai<strong>de</strong> d’une seringue stérile au niveau <strong>de</strong>s<br />
feuilles <strong>et</strong> <strong>de</strong> la tige puis inoculés par pulvérisation d’une suspension sporale <strong>de</strong> 10 6 Spores/ml.<br />
Après 1 heure <strong>de</strong> séchage, les plants préalablement inoculés par la suspension sporale ont été<br />
traitées par pulvérisation <strong>de</strong> différentes concentrations du P493 (25 <strong>et</strong> 100 µg/ml).<br />
2.3.5. Estimation <strong>de</strong> l’eff<strong>et</strong> antitumoral sur cellules végétales<br />
2.3.5.1. Essai sur plants d’oliviers<br />
2.3.5.1.1. Culture in vitro<br />
Les plants d’olivier ont été produits, sur le milieu test «MT» (Annexes 2.5 <strong>et</strong> 2.6), à partir <strong>de</strong><br />
graines ou <strong>de</strong> <strong>de</strong>mi graines <strong>de</strong> la variété Chemlali préalablement débarrassées <strong>de</strong> l’endocarpe<br />
<strong>et</strong> désinfectées à l’eau <strong>de</strong> Javel puis incubées à 24°C <strong>et</strong> à l’obscurité pour favoriser la<br />
germination.<br />
Une fois germées, les graines ont été transférées dans d’autres tubes contenant milieu MT<br />
enrichi en mannitol pour accélérer la croissance <strong>et</strong> placés à la lumière.<br />
2.3.5.1.2. Estimation <strong>de</strong> l’eff<strong>et</strong> antitumoral<br />
Des plants d’olivier <strong>de</strong> la variété chemlali, issus <strong>de</strong> culture in vitro ont été r<strong>et</strong>irés stérilement<br />
<strong>de</strong> leur tubes <strong>de</strong> cultures, blessés à l’ai<strong>de</strong> d’un scalpel stérile puis inoculés à l’ai<strong>de</strong> d’une anse<br />
stériles par une culture jeune <strong>de</strong> C58 (CFBP 1903) d’Agrobacterium tumefaciens <strong>et</strong> remis<br />
aussitôt dans <strong>leurs</strong> tubes <strong>et</strong> incubés dans la salle <strong>de</strong> culture à la température <strong>de</strong> 25°C pendant<br />
quinze jours. Une suspension aqueuse du produit P493 (250 µg/ml) est pulvérisée sur les<br />
plants précé<strong>de</strong>mment infectés avant <strong>de</strong> les rem<strong>et</strong>tre en incubation dans la serre avec les<br />
mêmes conditions d’incubation.<br />
U.P.M.C./U.S. 118<br />
2010
3. Cancers végétal <strong>et</strong> animal<br />
Cancers végétal <strong>et</strong> animal<br />
3.1. Première observation <strong>de</strong> la galle du coll<strong>et</strong> (Modèle végétal du cancer) sur olivier<br />
La tumeur du coll<strong>et</strong>, causée par Agrobacterium spp., est une maladie dont les conséquences<br />
économiques sont importantes surtout en pépinières, mais également en plein champ dans les<br />
zones <strong>de</strong> cultures intensives d'arbres fruitiers. La maladie <strong>de</strong> la galle du coll<strong>et</strong> est capable<br />
d'attaquer plusieurs espèces végétales appartenant à différentes familles. En eff<strong>et</strong>, environ<br />
1193 espèces végétales appartenant à 588 genres <strong>et</strong> 138 familles sont sensibles à c<strong>et</strong>te<br />
maladie. Les plantes d’intérêts pour lesquelles la maladie a été enregistrée sont, entre autres,<br />
la vigne (Panagopoulos, C. <strong>et</strong> al., 1978), les arbres fruitiers prunoïdées <strong>et</strong> pommoidées, les<br />
cultures ornementales comme le rosier, le dahlia (Pionnat, S. <strong>et</strong> al., 1999) <strong>et</strong> les arbres<br />
forestiers comme les peupliers, le meurier ou le noyer (Nesme, X. <strong>et</strong> al., 1990 ; Nesme, X. <strong>et</strong><br />
Mougel, C.,1997) <strong>et</strong> l’eucalyptus (Krimi, Z. <strong>et</strong> al., 2002).<br />
La tumeur du coll<strong>et</strong> cause une perte <strong>de</strong> ren<strong>de</strong>ment due à une baisse <strong>de</strong> vigueur <strong>de</strong>s plantes<br />
atteintes pouvant conduire le cas extrême à la mort <strong>de</strong>s plantes (Nesme, X. <strong>et</strong> al., 1990 ;<br />
Ponc<strong>et</strong>, C. <strong>et</strong> al., 1996). La mort est cependant le plus souvent due à l’action <strong>de</strong> pathogènes<br />
secondaires envahissant les plantes affaiblies.<br />
Le pouvoir pathogène d'Agrobacterium tumefaciens est conféré par la présence d'un<br />
mégaplasmi<strong>de</strong> appelé pTi (Ream, W., 1989). Au cours du processus d'infection, une région du<br />
pTi, le T-ADN, est transférée <strong>de</strong> la bactérie au génome <strong>de</strong> la plante où elle est intégrée<br />
(Gelvin, S.B., 1992). Après son intégration dans le génome <strong>de</strong> la plante, les gènes T-ADN<br />
co<strong>de</strong>nt pour la synthèse incontrôlée <strong>de</strong>s hormones <strong>de</strong> croissance (Auxines <strong>et</strong> cytokinines)<br />
provoquant l'apparence <strong>de</strong> galles au niveau <strong>de</strong>s racines <strong>et</strong> du coll<strong>et</strong>.<br />
Malgré la diversité <strong>de</strong>s espèces végétales hôtes <strong>de</strong> l'Agrobacterium, ce genre <strong>de</strong> bactérie n'a<br />
pas été jusqu'ici observée sur l'olivier. Ce n'est que récemment <strong>de</strong>s travaux en Jordanie <strong>et</strong> en<br />
Australie ont indiqué la présence d'A. tumefaciens dans <strong>de</strong>s tumeurs formées sur les racines <strong>et</strong><br />
le coll<strong>et</strong> <strong>de</strong> l'olivier (Khlaif, H ., 2001 ; Barbara, H., 2001).<br />
U.P.M.C./U.S. 119<br />
2010
Cancers végétal <strong>et</strong> animal<br />
En Tunisie, on a récemment observé pour la première fois, <strong>de</strong>s tumeurs au niveau <strong>de</strong>s racines<br />
<strong>de</strong> quelques pieds d'olivier (variété Sahli) dans la région <strong>de</strong> Kairouan. On s’est alors proposés<br />
d'isoler la bactérie, caractériser les isolats obtenus <strong>et</strong> d'étudier leur pathogénie par les<br />
métho<strong>de</strong>s classiques <strong>et</strong> moléculaires puis <strong>de</strong> confirmer la sensibilité <strong>de</strong> l'olivier à la galle du<br />
coll<strong>et</strong> par l'inoculation <strong>de</strong> plants <strong>de</strong> la variété Chemlali (le cultivar le plus répandu en Tunisie)<br />
obtenus par culture in vitro.<br />
La parcelle est cultivée en oliviers à huile (variété Sahli) <strong>et</strong> se trouve dans la zone d'Elkarma<br />
<strong>de</strong> la région d'Elhouareb, délégation <strong>de</strong> Haffouz du Gouvernorat <strong>de</strong> Kairouan (Figure 53).<br />
Khit el Oued Echrichira<br />
O. Ejjabes<br />
Trozza Sud<br />
Houfia<br />
El Houereb<br />
El Ain<br />
El Karma<br />
Ouled Khal<br />
Figure 53 : Localisation <strong>de</strong> la parcelle<br />
Les symptômes observés se manifestent par un affaiblissement général <strong>de</strong> l'arbre dont la<br />
coloration <strong>de</strong>s feuilles tend vers le vert pâle (Figure 54). Au niveau <strong>de</strong>s racines, se forment<br />
<strong>de</strong>s galles plus ou moins volumineuses selon leur emplacement (Figure 55).<br />
U.P.M.C./U.S. 120<br />
2010<br />
��
Arbre mala<strong>de</strong> Arbre sain<br />
Cancers végétal <strong>et</strong> animal<br />
Figure 54 : Symptômes observés sur arbre Figure 55 : Galles observées sur racines<br />
Des colonies noires apparaissent après incubation à 28°C pendant 4 jours <strong>de</strong> l'isolement<br />
(Figure 56). Ces colonies sont supposées être <strong>de</strong>s agrobactéries car les espèces du genre<br />
Agrobacterium résistent au tellurite <strong>de</strong> potassium ce qui leur donne la couleur noirâtre.<br />
Notons, également, que le tellurite <strong>de</strong> potassium inhibe les espèces du genre Pseudomonas qui<br />
sont fréquemment associées aux agrobactéries.<br />
Figure 56 : Colonies obtenues après isolement sur le milieu Mannitol-Glutamate additionné<br />
<strong>de</strong> tellurite <strong>de</strong> potassium<br />
Les résultats <strong>de</strong>s tests biochimiques sont consignés dans le tableau 18. Il en ressort que ces<br />
tests ont permis <strong>de</strong> distinguer trois isolats O7, O9 <strong>et</strong> O11 qui font parti du biovar1<br />
(Agrobacterium tumefaciens ou radiobacter).<br />
U.P.M.C./U.S. 121<br />
2010
Tableau 18 : Caractérisation biochimique <strong>de</strong>s isolats obtenus<br />
Isolats Uréase Esculine Cétolactose<br />
O1 + - -<br />
O2 - + -<br />
O3 - + -<br />
O4 - + -<br />
O5 - - -<br />
O6 - + -<br />
O7 + + +<br />
O8 - - -<br />
O9 + + +<br />
O10 - + -<br />
O11 + + +<br />
O12 - + -<br />
O13 - + -<br />
O14 - + -<br />
O15 - + -<br />
Cancers végétal <strong>et</strong> animal<br />
Les résultats du test <strong>de</strong> pathogénie ont montré que les isolats appartenant au biovar1 se sont<br />
avérés pathogènes. En eff<strong>et</strong>, <strong>de</strong>s galles se sont développées après 1 mois d'inoculation sur le<br />
coll<strong>et</strong> <strong>de</strong> Kalankoé <strong>et</strong> sur une jeune plantule <strong>de</strong> Kalankoé (Figure 57).<br />
Figure 57 : Galles obtenues sur Kalankoé après 1 mois <strong>de</strong> la date d'inoculation<br />
La migration <strong>de</strong> l'amplifiât sur un gel d'agarose (Figure 58) a montré <strong>de</strong>s ban<strong>de</strong>s <strong>de</strong> 432 pb au<br />
même niveau que la ban<strong>de</strong> obtenue avec la souche <strong>de</strong> référence C58.<br />
U.P.M.C./U.S. 122<br />
2010
432 pb<br />
Cancers végétal <strong>et</strong> animal<br />
Figure 58 : Test <strong>de</strong> pathogénie par PCR. Couple d'amorce du pTi universel (F14 VIRG <strong>et</strong><br />
F749VIRB11). Électrophorèse sur gel d'agarose (0.8%, 80v )<br />
Les séquences <strong>de</strong>s <strong>de</strong>ux isolats O7 <strong>et</strong> O9 obtenues sont les suivantes :<br />
>O7<br />
GTATNATGCTCGCACGCAGTTCGATGTCATCGTACCCTTCCGTGCCCACGGTGACATTTACGAGGTGGGCGAAAT<br />
CTGGCTCGCTGCCGATGCGCGTCGGCGCGGTGAGACAATAGGCGATCTTCTTAACCAGCAGTAGTTGTGATCCAT<br />
GTTTCTAAATGCCGCATGGCGCGTTGTAGAATTACGTTTGTAGCAATGCTCAGCAATCTTTGTCATCAAACGGAG<br />
ACATCTAGTTTGCATTTCTGTCGTGCGCGGTTTGGTCGAAATCTTGCCGAAATGCCCGTGTAGTGAGAGAAAATT<br />
AAAGAGTGGAGTCTAGCAAATACAACCTTTACGTGTATAAATTCTGTTGAGCTGCAAATGGCTGGCCAGGATCCT<br />
AGATTGAGAGGTGAACCGTTAAAC<br />
>O9<br />
1Kb+ Eau C58 14 66 O8 O10 O7 O9 5 118 O11 105<br />
GTATNATGCTCGCACGCAGTTCGATGTCATCGTACCCTTCCGTGCCCACGGTGACATTTACGAGGTGGGCGAAAT<br />
CTGGCTCGCTGCCGATGCGCGTCGGCGCGGTGAGACAATAGGCGATCTTCTTAACCAGCAGTAGTTGTGATCCAT<br />
GTTTCTAAATGCCGCATGGCGCGTTGTAGAATTACGTTTGTAGCAATGCTCAGCAATCTTTGTCATCAAACGGAG<br />
ACATCTAGTTTGCATTTCTGTCGTGCGCGGTTTGGTCGAAATCTTGCCGAAATGCCCGTGTAGTGAGAGAAAATT<br />
AAAGAGTGGAGTCTAGCAAATACAACCTTTACGTGTATAAATTCTGTTGAGCTGCAAATGGCTGGCCAGGATCCT<br />
AGATTGAGAGGTGAACCGTTAAAC<br />
U.P.M.C./U.S. 123<br />
2010
Cancers végétal <strong>et</strong> animal<br />
L'analyse <strong>de</strong>s données <strong>de</strong> séquençage avec <strong>de</strong>s logiciels appropriés a montré que les<br />
plasmi<strong>de</strong>s <strong>de</strong>s isolats issus <strong>de</strong> l'olivier sont <strong>de</strong> type nopaline. Notons, à c<strong>et</strong> eff<strong>et</strong>, que la<br />
majorité <strong>de</strong>s souches locales tunisiennes sont <strong>de</strong> type nopaline (Rhouma, A. <strong>et</strong> al., 2006).<br />
Les plantules <strong>de</strong> la variété Chemlali, issues <strong>de</strong> la culture in vitro <strong>et</strong> inoculé par Agrobacterium<br />
tumefaciens (C58) ont tous développé <strong>de</strong>s galles <strong>et</strong> ce après un mois d’incubation ce qui<br />
confirme la sensibilité <strong>de</strong> l’olivier à la galle du coll<strong>et</strong>.<br />
Figure 59 : Galle sur olivier (Variété Chemlali)<br />
La maladie causée par Agrobacterium tumefaciens connue sur les arbres fruitiers peut<br />
également s'attaquer à l'olivier. Les observations effectuées en Australie <strong>et</strong> en Jordanie <strong>et</strong><br />
récemment en Tunisie ont montré que l'olivier est aussi un hôte <strong>de</strong> c<strong>et</strong>te bactérie.<br />
3.2. Analogies entre le cancer humain <strong>et</strong> le « cancer » végétal<br />
Il est largement admis que le cancer humain est une maladie provoquée par l'accumulation <strong>de</strong>s<br />
mutations dans <strong>de</strong>s oncogènes <strong>et</strong> <strong>de</strong>s gènes suppresseurs <strong>de</strong> tumeur (Vogelstein, B. <strong>et</strong> Kinzler,<br />
K.W., 2004). Ces mutations spécifiques aux tumeurs fournissent <strong>de</strong>s indices aux processus<br />
cellulaires à la base <strong>de</strong> la tumorogenèse <strong>et</strong> sont utiles pour <strong>de</strong>s buts <strong>de</strong> diagnostique <strong>et</strong> <strong>de</strong><br />
thérapie. Jusqu'ici, seulement une p<strong>et</strong>ite fraction <strong>de</strong> ces gènes a été analysée, <strong>et</strong> le nombre <strong>et</strong> le<br />
type <strong>de</strong> changements responsables du développement <strong>de</strong>s types communs <strong>de</strong> tumeur sont<br />
inconnus (Futreal, P.A. <strong>et</strong> al., 2004).<br />
U.P.M.C./U.S. 124<br />
2010
Cancers végétal <strong>et</strong> animal<br />
Dans le passé, la sélection <strong>de</strong>s gènes choisis pour <strong>de</strong>s analyses mutationnelles dans le cancer a<br />
été guidé par <strong>de</strong>s étu<strong>de</strong>s d’associations familiales, l’i<strong>de</strong>ntification <strong>de</strong>s anomalies<br />
chromosomiques dans les tumeurs ou <strong>de</strong>s fonctions connues attribuées aux gènes individuels<br />
ou familles <strong>de</strong> gènes (Futreal, P.A. <strong>et</strong> al., 2004 ; Bar<strong>de</strong>lli, A. <strong>et</strong> Velculescu, V.E., 2005 ;<br />
Vogelstein, B. <strong>et</strong> Kinzler; K.W., 2002). Avec la détermination <strong>de</strong> la séquence du génome<br />
humain <strong>et</strong> <strong>de</strong>s améliorations récentes du séquençage <strong>et</strong> <strong>de</strong>s approches bioinformatiques, il est<br />
maintenant possible d'examiner le génome <strong>de</strong> la cellule cancéreuse d'une façon complète <strong>et</strong><br />
objective. Une telle approche fournit non seulement les moyens <strong>de</strong> découvrir d'autres gènes<br />
qui contribuent à la tumorogenèse, mais aussi peut mener à la compréhension <strong>de</strong>s<br />
mécanismes <strong>de</strong> son développement.<br />
Les analyses génétiques complètes <strong>de</strong>s cancers humains pourraient mener à la découverte d'un<br />
ensemble <strong>de</strong> gènes, liés par un phénotype partagé, qui indiquent l'importance <strong>de</strong>s processus ou<br />
<strong>de</strong>s voies cellulaires spécifiques.<br />
Pour rechercher l’analogie entre le cancer humain <strong>et</strong> végétal nous nous sommes basés sur une<br />
fraction <strong>de</strong> gènes humains impliqués dans les tumeurs du sein (Tableau 19) <strong>et</strong> les tumeurs <strong>de</strong><br />
l’estomac (APC, IRF1, KLF6, CASP10 <strong>et</strong> MUTYH). Ces cancers ont été choisis en raison <strong>de</strong><br />
leur importance clinique substantielle dans le mon<strong>de</strong> (Parkin, D.M. <strong>et</strong> al., 2005) <strong>et</strong> du fait que<br />
ces <strong>de</strong>ux cancers pourraient résulter <strong>de</strong> l’infection par <strong>de</strong>s virus ou <strong>de</strong>s bactéries, même si<br />
pour le cancer du sein c<strong>et</strong>te hypothèse est récente <strong>et</strong> encore très controversée.<br />
La comparaison <strong>de</strong>s séquences récupérées par rapport au génome <strong>de</strong>s végétaux avec blastp<br />
fournit différentes espèces produisant <strong>de</strong>s divers homologues <strong>de</strong> la protéine humaine avec <strong>de</strong>s<br />
taux <strong>de</strong> similarité différents.<br />
Les numéros d’accession <strong>de</strong> ces protéines, <strong>leurs</strong> fonctions, <strong>leurs</strong> longueurs, la significativité<br />
statistique (Evalue) <strong>et</strong> l’espèce d’où elles dérivent sont résumés dans les tableaux 3.1 <strong>et</strong> 3.2 <strong>de</strong><br />
l’annexe 3. Il est à noter que ces tableaux ainsi que les autres tableaux <strong>de</strong> c<strong>et</strong>te annexe<br />
représentent un seul exemplaire d’homologue végétal pour chaque gène humain.<br />
U.P.M.C./U.S. 125<br />
2010
Cancers végétal <strong>et</strong> animal<br />
Tableau 19 : Gènes impliqués dans le cancer du sein (Tobias, S. <strong>et</strong> al., 2006).<br />
U.P.M.C./U.S. 126<br />
2010
Cancers végétal <strong>et</strong> animal<br />
Les homologies ressorties perm<strong>et</strong>tent <strong>de</strong> dégager <strong>de</strong>s résultats intéressants <strong>et</strong> inattendus parmi<br />
lesquels on peut citer :<br />
� la présence d’un homologue chez le peuplier du gène humain MYH1 codant pour une<br />
myosine (protéine impliquée dans la structure cellulaire). C<strong>et</strong> homologue est d’autant plus<br />
intéressant qu’il correspond à une protéine prédite <strong>et</strong> non encore étudiée chez le peuplier.<br />
� La présence d’un homologue chez le maïs du fameux gène TP53 codant pour une protéine<br />
impliquée dans la régulation du cycle cellulaire (suppresseur <strong>de</strong> tumeur). Le rôle <strong>de</strong> c<strong>et</strong>te<br />
protéine chez le maïs reste à étudier.<br />
� La présence d’un homologue chez l’arab<strong>et</strong>te du suppresseur <strong>de</strong> tumeur BRCA1 dont la<br />
mutation chez la femme est responsable <strong>de</strong>s cas <strong>de</strong> cancer du sein familiaux.<br />
� La présence d’un homologue chez la vigne du gène MUTYH décrit pour être responsable<br />
chez l’homme <strong>de</strong> cancers gastriques induits par Heliobacter pylori.<br />
� La présence d’un homologue chez le riz (Oryza sativa) <strong>et</strong> chez l’arab<strong>et</strong>te (Arabidopsis<br />
thaliana) du gène humain KIAA0999 codant pour une Serine/Thréonine protéine kinase.<br />
C<strong>et</strong>te homologie est intéressante puisque le tamoxifène dont nos produits sont homologues est<br />
un inhibiteur <strong>de</strong>s Protéines Kinase (O'brian, C.A. <strong>et</strong> al., 1985).<br />
� La présence d’un homologue chez le maïs (Zea mays), le sorgho (Sorghum bicolor), la<br />
pomme <strong>de</strong> terre (Solanum tuberosum) <strong>et</strong> le riz (Oryza sativa Japonica) du gène humain<br />
ACADM codant pour une acyl-Coenzyme A déshydrogénase est également très importante.<br />
En eff<strong>et</strong> le tamoxifène présente une analogie structurale avec Sah58-035, inhibiteur spécifique<br />
<strong>de</strong> l’acyl-Coenzyme A déhydrogénase.<br />
� La présence d’un homologue chez la pomme <strong>de</strong> terre <strong>et</strong> la tomate (Solanum lycopersicon)<br />
du gène humain CYP1A1 codant pour cytochrome P450 qui est également une cible<br />
thérapeutique du tamoxifène.<br />
Les résultats concernant les protéines <strong>de</strong> fonction inconnue <strong>et</strong> les domaines conservés ainsi<br />
que <strong>leurs</strong> positions <strong>et</strong> <strong>leurs</strong> fonctions sont représentés dans les tableaux 3.3 <strong>et</strong> 3.4 <strong>de</strong> l’annexe<br />
3. Dans ces tableaux on r<strong>et</strong>rouve dans les homologues <strong>de</strong> plantes les domaines fonctionnels<br />
qui caractérisent le gène humain correspondant. Ceci confirme l’originalité <strong>de</strong>s homologues<br />
trouvés notamment ceux qui sont encore hypothétiques.<br />
U.P.M.C./U.S. 127<br />
2010
Cancers végétal <strong>et</strong> animal<br />
Il est important <strong>de</strong> noter, que le gène ACADM déjà évoqué pour sa fonction Acyl-CoA<br />
déhydrogénases dans les cellules humaines du sein, co<strong>de</strong> pour la même protéine dans le<br />
mon<strong>de</strong> végétal. De même, le gène SPTAN1 peut également être considéré intéressant<br />
puisqu’il co<strong>de</strong> dans le mon<strong>de</strong> végétal pour une calmoduline dont l’inhibition a un eff<strong>et</strong><br />
antiprolifératif. Les gènes ACADM <strong>et</strong> SPTAN1, qui co<strong>de</strong>nt pour <strong>de</strong>s cibles thérapeutiques du<br />
tamoxifène <strong>et</strong> qui conservent <strong>leurs</strong> fonctions dans le mon<strong>de</strong> végétal, soutiennent donc notre<br />
hypothèse d’analogie entre les <strong>de</strong>ux processus tumoraux (végétal <strong>et</strong> humain) <strong>et</strong> nous<br />
perm<strong>et</strong>tent <strong>de</strong> prédire une efficacité <strong>de</strong> nos produits, déjà efficaces sur les tumeurs du sein, sur<br />
les cellules végétales.<br />
Pour <strong>de</strong>s analyses plus avancées nous avons r<strong>et</strong>enus les homologues chez les plantes <strong>de</strong>s<br />
gènes KLF6 <strong>et</strong> MUTYH impliqués dans le cancer gastrique <strong>et</strong> les gènes EGFL6, FLJ13479,<br />
GLI1, ACADM, SPTAN1, KIAA0999 <strong>et</strong> CYP1A1 impliqués dans le cancer du sein. Ces<br />
gènes ont été sélectionnés car ils co<strong>de</strong>nt <strong>de</strong>s protéines avec une activité kinase ou <strong>de</strong>s DNA<br />
binding (régulation) ou parce qu’ils co<strong>de</strong>nt pour <strong>de</strong>s cibles du tamoxifène. Les séquences<br />
sélectionnées ont été « blastées » contre une banque <strong>de</strong> séquence protéique en choisissant<br />
comme organisme le peuplier puis la vigne. Les numéros d’accession <strong>de</strong> ces protéines, <strong>leurs</strong><br />
fonctions, <strong>leurs</strong> longueurs <strong>et</strong> l’Evalue sont résumés dans les tableaux 3.5 <strong>et</strong> 3.6 <strong>de</strong> l’annexe 3.<br />
Une bonne conservation <strong>de</strong>s domaines a été observée entre les séquences <strong>de</strong> peuplier <strong>et</strong> <strong>de</strong><br />
vigne. De plus le pourcentage d’i<strong>de</strong>ntité établit entre les séquences protéiques chez le peuplier<br />
<strong>et</strong> celles chez la vigne varie entre 43% <strong>et</strong> 77% pour la plus part. Ceci montre que ces gènes<br />
sont présents en plusieurs copies dans le génome <strong>et</strong> forment <strong>de</strong>s familles multi géniques, ce<br />
qui est une caractéristique <strong>de</strong>s génomes <strong>de</strong>s plantes. Les numéros d’accession <strong>de</strong> ces<br />
protéines, le pourcentage d’i<strong>de</strong>ntité, les « Positives », les brèches (Gaps) <strong>et</strong> l’Evalue sont<br />
résumés dans les tableaux 3.7 <strong>et</strong> 3.8 <strong>de</strong> l’annexe 3.<br />
C<strong>et</strong>te similitu<strong>de</strong> confirme l’efficacité <strong>de</strong> nos produits contre la galle du coll<strong>et</strong> <strong>et</strong> nous pousse à<br />
la prospection <strong>de</strong> la possibilité d’utiliser ce modèle végétal du cancer pour le screening <strong>de</strong>s<br />
potentielles molécules actives contre les tumeurs humaines.<br />
U.P.M.C./U.S. 128<br />
2010
Cancers végétal <strong>et</strong> animal<br />
3.3. Essai <strong>de</strong> l’estimation <strong>de</strong> l’eff<strong>et</strong> antiprolifératif sur disques <strong>de</strong> pomme <strong>de</strong> terre<br />
Suite à l’analogie trouvée entre le processus tumoral animal <strong>et</strong> végétal, on a cherché à<br />
vérifier l’efficacité <strong>de</strong> nos meil<strong>leurs</strong> produits (P116, P305, P5, P92, P15 <strong>et</strong> OHTAM3)<br />
par l’inhibition <strong>de</strong> développement <strong>de</strong> tumeurs sur <strong>de</strong>s disques <strong>de</strong> pomme <strong>de</strong> terre<br />
simultanément inoculés par Agrobacterium tumefaciens <strong>et</strong> le composé testé.<br />
T- T+<br />
P305 P5<br />
P15 OHTAM<br />
P92 P116<br />
Figure 60 : Eff<strong>et</strong> antiprolifératif sur disques <strong>de</strong> pomme <strong>de</strong> terre<br />
U.P.M.C./U.S. 129<br />
2010
3.4. Partie expérimentale<br />
3.4.1. Isolement <strong>et</strong> caractérisation <strong>de</strong>s isolats d’Agrobactérium tumefaciens<br />
3.4.1.1. Isolement <strong>de</strong> la bactérie<br />
Cancers végétal <strong>et</strong> animal<br />
Les échantillons sont lavés à l'eau courante afin d'enlever les particules <strong>de</strong> sol adhérentes aux<br />
galles. Les galles sont, par la suite, désinfectées à l'eau <strong>de</strong> javel (0.5%) <strong>et</strong> lavées à l'eau<br />
distillée stérile.<br />
Des fragments sont coupés aseptiquement <strong>et</strong> placés dans un mortier contenant <strong>de</strong> l'eau<br />
distillée stérile. La suspension obtenue est laissée à la température ambiante pendant 30<br />
minutes. L'isolement a été effectué sur le milieu Mannitol-Glutamate (Annexe 2 .1)<br />
additionné <strong>de</strong> tellurite <strong>de</strong> potassium (Mougel, C. <strong>et</strong> al., 2001). Les boites <strong>de</strong> Pétri inoculées<br />
sont incubées à la température <strong>de</strong> 28°C.<br />
3.4.1.2. I<strong>de</strong>ntification <strong>de</strong>s biovars<br />
Les isolats obtenus <strong>et</strong> ayant la forme <strong>et</strong> la consistance <strong>de</strong>s agrobactéries ont subit quelques<br />
tests biochimiques conformément aux métho<strong>de</strong>s décrites par Moore <strong>et</strong> al. (1988). Ces tests<br />
regroupent: la coloration GRAM, production d'uréase, l'hydrolyse <strong>de</strong> l'esculine <strong>et</strong> la<br />
production <strong>de</strong> 3 cétolactose.<br />
3.4.1.2.1. La coloration <strong>de</strong> GRAM<br />
La coloration Gram est la coloration <strong>de</strong> base <strong>de</strong> la bactériologie. C’est une coloration double<br />
qui perm<strong>et</strong> <strong>de</strong> différencier les bactéries, non seulement d’après leur forme mais également<br />
d’après leur affinité pour les colorants. Les bactéries sont imprégnées par une première<br />
solution colorante, viol<strong>et</strong> <strong>de</strong> gentiane ; puis fixées par un mordant, solution iodo-iodurée <strong>de</strong><br />
Lugol <strong>et</strong> on fait ensuite agir un décolorant (alcool le plus souvent). Suivant la composition <strong>de</strong><br />
leur paroi :<br />
� Certaines bactéries résistent à c<strong>et</strong>te décoloration elles sont dites Gram positif <strong>et</strong><br />
apparaissent colorées en viol<strong>et</strong> ;<br />
U.P.M.C./U.S. 130<br />
2010
Cancers végétal <strong>et</strong> animal<br />
� D’autres bactéries ne résistent pas ; pour les rendre visibles on doit utiliser un <strong>de</strong>uxième<br />
colorant <strong>de</strong> teinte contrastante (fuchsine, colorant rouge) elles sont dites Gram négatif <strong>et</strong><br />
apparaissent colorées en rose.<br />
Après fixation <strong>et</strong> refroidissement du frottis bactérien on opère <strong>de</strong> la façon suivante :<br />
� Recouvrir totalement la lame <strong>de</strong> viol<strong>et</strong> <strong>de</strong> gentiane ;<br />
� Laisser le viol<strong>et</strong> environ 1 minute<br />
� Saisir la lame avec une pince, l’incliner légèrement ;<br />
� Rej<strong>et</strong>er le viol<strong>et</strong> en l’entraînant avec la solution <strong>de</strong> Lugol ;<br />
� Laisser la solution <strong>de</strong> Lugol quelques secon<strong>de</strong>s puis la renouveler trois fois. Ce temps <strong>de</strong><br />
la coloration, le mordançage, qui fixe le viol<strong>et</strong> <strong>et</strong> augmente son action, doit être plus long que<br />
le temps <strong>de</strong> coloration par le viol<strong>et</strong> ;<br />
� Décolorer à l’alcool. Recolorer à la fuchsine.<br />
� Recouvrir la lame la solution <strong>de</strong> fuchsine <strong>et</strong> laisser agir 10 à 20 secon<strong>de</strong>s.<br />
� Rincer à l’eau, sécher en épongeant délicatement entre <strong>de</strong>ux feuilles <strong>de</strong> papier filtre.<br />
� M<strong>et</strong>tre une goutte d’huile à immersion sur le frottis coloré parfaitement sec <strong>et</strong> observer à<br />
l’objectif à immersion.<br />
3.4.1.2.2. Test <strong>de</strong> l’uréase<br />
Toutes les bactéries hydrolysent l’urée selon la réaction suivante :<br />
CO-(NH2)2 + H2O COOH – NH2 + NH3<br />
Toutefois seule une uréase très active hydrolyse l’aci<strong>de</strong> formé selon la réaction suivante:<br />
COOH – NH2 CO2 + NH3<br />
CO2 <strong>et</strong> NH3 se combinent <strong>et</strong> forment alors du bicarbonate d’ammonium :<br />
2 NH3 + H2O CO3 (NH4)<br />
U.P.M.C./U.S. 131<br />
2010
Cancers végétal <strong>et</strong> animal<br />
Le milieu <strong>de</strong> Christensen (Annexe 2.2) à base d’urée est ensemencé par les isolats à tester.<br />
Les boîtes sont incubées dans l’étuve à 28°C <strong>et</strong> on suit durant les <strong>de</strong>ux jours qui suivent<br />
l’évolution <strong>de</strong> la couleur du milieu <strong>de</strong> culture :<br />
� une couleur jaune i<strong>de</strong>ntique à celle du milieu au temps initial traduit un test négatif <strong>et</strong><br />
l’absence <strong>de</strong> l’uréase.<br />
� le virage <strong>de</strong> l’indicateur coloré au rose suite à l’alcalinisation du milieu <strong>de</strong> culture traduit<br />
le test positif.<br />
Figure 61 : Test <strong>de</strong> l’uréase<br />
A droite : test négatif ; A gauche : test positif<br />
Trois répétitions sont effectuées pour chaque souche pour éloigner toute incertitu<strong>de</strong> <strong>et</strong> tout<br />
doute.<br />
3.4.1.2.3. Test <strong>de</strong> l’hydrolyse <strong>de</strong> l’esculine<br />
Le milieu PEs à base <strong>de</strong> peptone, d’esculine <strong>et</strong> <strong>de</strong> citrate <strong>de</strong> fer ammoniacal (Annexe 2.3)<br />
autoclavé à 110°C pendant 30 minutes est coulé dans <strong>de</strong>s tubes à hémolyse à raison <strong>de</strong> 3 ml<br />
par tube. Ces tubes sont ensuite ensemencés à l’ai<strong>de</strong> d’une anse par les différentes souches<br />
isolées <strong>et</strong> incubés à 28°C.<br />
L’évolution du milieu <strong>de</strong> culture est suivie pendant les cinq jours suivants :<br />
� un test positif d’hydrolyse <strong>de</strong> l’esculine se manifeste par une coloration noire du milieu <strong>de</strong><br />
culture due à la libération du glucose <strong>et</strong> <strong>de</strong> l’esculétine, responsable <strong>de</strong> c<strong>et</strong>te teinte en présence<br />
<strong>de</strong> sels <strong>de</strong> fer.<br />
� une couleur i<strong>de</strong>ntique à celle du témoin (tube non ensemencé) traduit le test négatif.<br />
U.P.M.C./U.S. 132<br />
2010
Figure 62 : Test <strong>de</strong> l’esculine<br />
A gauche : test positif ; A droite : test négatif<br />
Cancers végétal <strong>et</strong> animal<br />
Le test est réalisé en triple pour chaque isolat afin <strong>de</strong> s’assurer <strong>de</strong> la positivité <strong>de</strong> la réaction<br />
3.4.1.2.4. Test <strong>de</strong> production du 3-cétolactose<br />
La Métho<strong>de</strong> <strong>de</strong> Bertherts <strong>et</strong> <strong>de</strong> Ley (1963) perm<strong>et</strong> <strong>de</strong> distinguer les souches d’Agrobacterium<br />
du biovar 1, présentant une réaction positive <strong>de</strong> celles <strong>de</strong>s biovars 2 <strong>et</strong> 3.<br />
Un milieu <strong>de</strong> culture contenant 1% <strong>de</strong> lactose, 0,1% d’extrait <strong>de</strong> levure <strong>et</strong> 2% d’agar est<br />
préparé. Les souches isolées sont repiquées en boîtes <strong>de</strong> Pétri à l’ai<strong>de</strong> <strong>de</strong>s cures <strong>de</strong>nts<br />
stérilisés.<br />
On prépare la solution <strong>de</strong> Bénédicte avec laquelle on inon<strong>de</strong> les boîtes après leur incubation<br />
pendant 48 heures à 28°C (Annexe 2.4).<br />
La production du 3-cétolactose se traduit par l’apparition d’un halo jaunâtre autour <strong>de</strong>s<br />
colonies d’Agrobacterium.<br />
Figure 63 : Test du 3-cétolactose<br />
Les colonies jaunes : test positif ; Les colonies blanches : test négatif<br />
Trois répétitions sont réalisées pour chaque souche afin <strong>de</strong> s’assurer du résultat obtenu.<br />
U.P.M.C./U.S. 133<br />
2010
3.4.1.3. Test <strong>de</strong> pathogénie <strong>de</strong>s isolats<br />
Cancers végétal <strong>et</strong> animal<br />
Le test <strong>de</strong> pathogénie a été effectué avec <strong>de</strong>s jeunes plants <strong>de</strong> Kalankoë (Kalankoe<br />
daigrementiana). Des blessures au niveau du coll<strong>et</strong> ont été entreprises à l'ai<strong>de</strong> d'un scalpel<br />
stérile. L'inoculation a été réalisée avec une anse préalablement trempée dans une colonie<br />
jeune âgée <strong>de</strong> 48 heures au niveau <strong>de</strong>s blessures (Moore, L.W. <strong>et</strong> al., 1988).<br />
3.4.1.4. Détection <strong>de</strong> la pathogénie par PCR<br />
3.4.1.4.1. Extraction <strong>de</strong> l’ADN<br />
L'ADN génomique est extrait à l'ai<strong>de</strong> <strong>de</strong> Kit Dneasy TM Tissue Kit (QIAGEN, Courtaboeuf,<br />
France). L'ADN est quantifié en comparaison avec une gamme étalon d'ADN <strong>de</strong> thymus <strong>de</strong><br />
veau grâce au logiciel Molecular Analyst (Bio-Rad, Ivry sur Seine, France).<br />
3.4.1.4.2. Amplification<br />
Les amorces F749 (5'- GCTAGCTTGGAAGATCGCAC-3') <strong>et</strong> F14 (5'-<br />
GAACGTGTTTCAACGGTTCA-3') ont été utilisées afin <strong>de</strong> détecter la région localisée entre<br />
le gêne VIRB11 <strong>et</strong> VIR G15’ sur le T-DNA <strong>de</strong>s isolats testés (Nesme, X. <strong>et</strong> al., 1989).<br />
La PCR a été effectuée dans un volume réactionnel <strong>de</strong> 25 µl contenant: 5µl <strong>de</strong> l'ADN extrait,<br />
2.5 µl <strong>de</strong> Tampon Taq (10x), 2.5µl <strong>de</strong> dNTP’S, 0.75 µl <strong>de</strong> MgCl2, 11 µl <strong>de</strong> H2O ultra pure,<br />
0.75 µl <strong>de</strong> W%, 2.5 µl <strong>de</strong> chaque amorce <strong>et</strong> 0.25µl <strong>de</strong> Taq polymérase (Rhouma, A. <strong>et</strong> al.,<br />
2005).<br />
L'amplification a été entreprise dans un thermocycleur <strong>de</strong> type Perkin-Elmer selon le<br />
programme suivant: une dénaturation initiale à 95°C pendant 7 min, suivie <strong>de</strong> 35 cycles (1<br />
min <strong>de</strong> 95°C, 1 min à 55°C <strong>et</strong> 1 min à 72°C) <strong>et</strong> une phase finale d'élongation <strong>de</strong> 7 min à 72°C.<br />
3.4.1.4.3. Electrophorèse sur gel d’agarose<br />
Les produits <strong>de</strong> la PCR (5 µl <strong>de</strong> chaque échantillon) sont mélangés avec 5 µl d'un tampon <strong>de</strong><br />
dépôt (Saccharose, bleu <strong>de</strong> bromophénol <strong>et</strong> TBE 5x) <strong>et</strong> déposés sur un gel d'agarose<br />
U.P.M.C./U.S. 134<br />
2010
Cancers végétal <strong>et</strong> animal<br />
horizontal <strong>de</strong> 1% contenant 1 µg ml -1 <strong>de</strong> bromure d'éthidium. La migration est réalisée dans<br />
un tampon TBE 1x par une électrophorèse horizontale à 80 V pendant 90 min. Le gel a été<br />
photographié sous UV (302 nm).<br />
3.4.1.4.4. Séquençage <strong>de</strong> l’ADN plasmidique (VIRB11 <strong>et</strong> VIR G15’)<br />
Le produit PCR est purifié en utilisant le Kit QIAquick PCR purification Kit (QIAGEN,<br />
Courtaboeuf, France). Le séquençage a été réalisé par un séquenceur automatique à<br />
capillaires, Megabace 1000 (Amersham Pharmacia Biotech Europe, Orsay, France).<br />
3.4.1.4.5. Analyse <strong>de</strong>s données <strong>de</strong>s séquences<br />
Les séquences ont été vérifiées grâce aux électrophorégrammes. Les séquences ont été<br />
alignées par le programme CLUSTALW (Thompson, J.D. <strong>et</strong> al., 1994). La qualité <strong>de</strong><br />
l'alignement a été contrôlée en utilisant le programme SEAVIEW (Galtier, N. <strong>et</strong> al., 1996).<br />
Pour la comparaison <strong>de</strong>s séquences avec d'autres <strong>de</strong> référence, nous avons utilisé le<br />
programme SeqApp (D. Gilbert ; http://iubio.bio.indiana.edu/soft/molbio/seqapp/; A<br />
Macintosh Biosequence editor, analyser and n<strong>et</strong>work handyman).<br />
3.4.1.5. Sensibilité <strong>de</strong> l’olivier à la galle du coll<strong>et</strong><br />
Les plantes d’olivier, produites par culture in vitro, ont été r<strong>et</strong>irées <strong>de</strong> <strong>leurs</strong> tubes, blessées au<br />
niveau <strong>de</strong> <strong>leurs</strong> tiges par un scalpel stérile, infectées par la souche C58 (CFBP 1903)<br />
d’Agrobacterium tumefaciens, repiquée sur une boîte <strong>de</strong> Pétri par une anse stérile, puis<br />
remises <strong>de</strong> nouveau dans <strong>leurs</strong> tubes dans les mêmes conditions précé<strong>de</strong>ntes tout en suivant<br />
quotidiennement l’apparition <strong>de</strong>s galles.<br />
3.4.2. Etu<strong>de</strong> bioinformatique<br />
L'élucidation <strong>de</strong> la séquence du génome humain a permis d'i<strong>de</strong>ntifier un certain nombre <strong>de</strong><br />
gènes impliqués dans le cancer. Les gènes que nous étudions ici sont impliqués dans le cancer<br />
du sein <strong>et</strong> le cancer gastrique.<br />
U.P.M.C./U.S. 135<br />
2010
Cancers végétal <strong>et</strong> animal<br />
Pour ce travail on a extrait la liste <strong>de</strong>s gènes impliqués dans le cancer du sein à partir d’une<br />
étu<strong>de</strong> récente intitulée « The Consensus Coding Sequences of Human Breast and Colorectal<br />
Cancers » publiée dans la revue science en 2006 (Tobias, S. <strong>et</strong> al., 2006). Les gènes impliqués<br />
dans le cancer gastrique sont obtenus à partir <strong>de</strong> diverses publications sur le suj<strong>et</strong>.<br />
3.4.2.1. Définitions<br />
� Alignement : processus par le quel <strong>de</strong>ux séquences sont comparées afin d’obtenir le plus<br />
<strong>de</strong> correspondances (i<strong>de</strong>ntités ou substitutions conservatives) possibles entre les l<strong>et</strong>tres qui<br />
les composent.<br />
� Domaine : portion <strong>de</strong> protéine supposée avoir un repliement propre, indépendant du reste<br />
<strong>de</strong> la protéine, <strong>et</strong> possé<strong>de</strong>r une fonction spécifique.<br />
� Evalue : (Expect value) : Nombre d’alignement différents ayant un score égal ou supérieur<br />
à « S » que l’on peut espérer trouver par hasard dans les banques. Plus la Evalue est basse,<br />
plus le score est significatif (BLAST).<br />
� Homologie : on dit <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux gènes qu’ils sont homologues lorsqu’ils dérivent d’un gène<br />
ancestral commun.<br />
� Score « S » : mesure <strong>de</strong> la similitu<strong>de</strong> entre la séquence <strong>de</strong> départ <strong>et</strong> celle homologue<br />
déduite <strong>de</strong> la base <strong>de</strong> donné.<br />
3.4.2.2. Récupération <strong>de</strong>s séquences protéiques<br />
Nous avons utilisé le système d’interrogation Entrez disponible au NCBI<br />
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez) pour rechercher les gènes par leur nom. Ceci nous<br />
renvoie à la banque GENE du NCBI dans la quelle sont rassemblés les informations<br />
concernant chaque gènes (séquence, fonction, variations, …).<br />
L’interrogation <strong>de</strong> la banque <strong>de</strong> données GenPept du NCBI fournit plusieurs protéines qui<br />
découlent <strong>de</strong>s gènes <strong>de</strong> départ. Nous avons r<strong>et</strong>enu celles humaines [Homo Sapiens] <strong>et</strong> nous<br />
avons récupéré ces séquences protéiques au format FASTA.<br />
U.P.M.C./U.S. 136<br />
2010
Figure 64 : Exemple <strong>de</strong> séquence FASTA du gène KLF6<br />
3.4.2.3. Recherche <strong>de</strong>s séquences homologues<br />
Cancers végétal <strong>et</strong> animal<br />
La recherche <strong>de</strong>s séquences homologues à nos protéines <strong>de</strong> départ a été faite par le<br />
programme BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) du NCBI<br />
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/) (Altschul, S. F. <strong>et</strong> al., 1990). Les programmes BLAST<br />
effectuent une recherche rapi<strong>de</strong> dans les banques <strong>de</strong> séquences nucléiques <strong>et</strong> protéiques<br />
combinée avec une estimation rigoureuse <strong>de</strong>s statistiques pour apprécier la signification <strong>de</strong>s<br />
similitu<strong>de</strong>s par <strong>de</strong>s alignements.<br />
Il ya 5 programmes BLAST selon le type <strong>de</strong> comparaison souhaité (Tableau 3) <strong>et</strong> on a utilisé<br />
blastp qui compare une séquence <strong>de</strong> protéine contre une base <strong>de</strong> données <strong>de</strong> séquences <strong>de</strong><br />
protéines, afin <strong>de</strong> récupérer les séquences homologues.<br />
Tableau 20 : Les différents programmes BLAST<br />
Programme Nature <strong>de</strong>s séquences Niveau <strong>de</strong> comparaison<br />
BLASTP Protéine Protéine<br />
BLASTN Nucléoti<strong>de</strong> Nucléoti<strong>de</strong><br />
BLASTX Nucléoti<strong>de</strong> (traduit) Protéine<br />
TBLASTN Protéine Nucléoti<strong>de</strong> (traduit)<br />
TBLASTX Nucléoti<strong>de</strong> (traduit) Nucléoti<strong>de</strong> (traduit)<br />
U.P.M.C./U.S. 137<br />
2010
3.4.2.4. Recherche <strong>de</strong>s domaines protéiques<br />
Cancers végétal <strong>et</strong> animal<br />
Les différentes protéines homologues obtenues ont été classées suivant <strong>leurs</strong> fonctions<br />
(connue, inconnue). L'analyse <strong>de</strong>s séquences <strong>et</strong> <strong>de</strong>s structures <strong>de</strong>s protéines a permis <strong>de</strong><br />
constater que beaucoup s'organisaient en domaines, c'est-à-dire en parties acquérant une<br />
structure <strong>et</strong> remplissant une fonction indépendamment du reste <strong>de</strong> la protéine. Ainsi pour les<br />
fonctions inconnues, il est possible <strong>de</strong> prévoir la présence <strong>de</strong> domaines conservés ou non dans<br />
la séquence protéique analysée via la banque CDD (Conserved Domain Database) qui est<br />
une banque <strong>de</strong> domaines (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/). Toutes les protéines prédites ont<br />
été assignées selon <strong>leurs</strong> fonctions.<br />
3.4.2.4.1. Les fonctions cellulaires<br />
� Les protéines <strong>de</strong> structure, qui perm<strong>et</strong>tent à la cellule <strong>de</strong> maintenir son organisation dans<br />
l'espace (myosine,…)<br />
� Les protéines <strong>de</strong> signalisation, qui captent les signaux extérieurs, <strong>et</strong> assurent leur<br />
transmission dans la cellule ou l’organisme (kinases,…)<br />
3.4.2.4.2. Les fonctions biochimiques<br />
Les fonctions biochimiques sont n<strong>et</strong>tement plus nombreuses, <strong>et</strong> sont généralement<br />
équivalentes à la notion d'activité enzymatique (oxydase,…). Il est à noter que la<br />
classification suivant la fonction est représentée en annexe. Parmi ces fonctions on s’intéresse<br />
principalement aux protéines ayant une activité kinase ou DNA binding.<br />
� Les kinases : Les kinases sont les maîtres d'œuvre <strong>de</strong> la régulation <strong>de</strong> la cellule <strong>et</strong> toute<br />
erreur dans leur fonctionnement peut avoir <strong>de</strong>s répercussions pathologiques graves, comme<br />
le cancer. Elles sont très nombreuses chez l’homme où l’on en dénombre 518. Leur<br />
fonctionnement est complexe car elles sont au cœur d’un réseau d’interactions avec<br />
d’autres protéines, en particulier avec d’autres kinases. Dans <strong>de</strong> nombreux cas on observe<br />
<strong>de</strong>s phénomènes <strong>de</strong> casca<strong>de</strong> (une kinase est activée par une autre kinase qui elle-même…,<br />
<strong>et</strong>c.). Ceci laisse imaginer l'ampleur <strong>de</strong>s dysfonctionnements possibles qui traduisent toute<br />
la complexité <strong>de</strong>s pathologies que recouvre le simple vocable « cancer » (P<strong>et</strong>er, B-J. <strong>et</strong><br />
Tony, H., 2001 ; Calleja, V. <strong>et</strong> al., 2007).<br />
U.P.M.C./U.S. 138<br />
2010
Cancers végétal <strong>et</strong> animal<br />
� Les « DNA binding protein » : Les « DNA binding protein » sont <strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong><br />
transcription qui modulent le processus <strong>de</strong> transcription (polymérase…) <strong>et</strong> qui ont <strong>de</strong>ux<br />
mo<strong>de</strong>s d’action : à un niveau qualitatif, ils peuvent activer (eff<strong>et</strong> positif) ou inhiber (eff<strong>et</strong><br />
négatif) la transcription <strong>de</strong> leur(s) gène(s) cible(s) (Elati, M. <strong>et</strong> al, 2007). Les facteurs <strong>de</strong><br />
transcription intègrent <strong>de</strong>s domaines tels que « zinc finger <strong>et</strong> l'helix-turn-helix ». Les facteurs <strong>de</strong><br />
transcription jouent un rôle central au cours du développement <strong>et</strong> <strong>de</strong> la cancérogenèse. Chaque<br />
type cellulaire possè<strong>de</strong> son propre réseau <strong>de</strong> facteurs <strong>de</strong> transcription nécessaire à<br />
l’établissement <strong>et</strong> au maintien <strong>de</strong> son i<strong>de</strong>ntité (Sieweke, M.H. <strong>et</strong> Graf, T., 1998). Leur<br />
dérégulation perturbe c<strong>et</strong>te i<strong>de</strong>ntité <strong>et</strong> est associé au développement <strong>de</strong> tumeurs chez<br />
l’homme.<br />
Après avoir choisi les homologues contenant <strong>de</strong>s domaines intéressants, toutes les séquences<br />
protéiques sélectionnées ont été « blastées » <strong>de</strong> nouveau contre une banque <strong>de</strong> séquences<br />
protéiques chez le peuplier (Populus trichocarpa) <strong>et</strong> la vigne (Vitis vinifera) récemment<br />
séquençés (Respectivement en octobre 2006 <strong>et</strong> en août 2007) pour savoir si ces protéines sont<br />
exprimées <strong>et</strong> éventuellement pour avoir une idée sur le <strong>de</strong>gré d’i<strong>de</strong>ntité.<br />
3.4.2.5. Alignement <strong>de</strong>s séquences<br />
Les séquences homologues déduites à partir du peuplier <strong>et</strong> vigne ont été alignées <strong>de</strong>ux à <strong>de</strong>ux<br />
par le programme blast2seq disponible à (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq:bl2.html).<br />
C<strong>et</strong>te étape est importante pour voir le <strong>de</strong>gré <strong>de</strong> conservation <strong>et</strong> le nombre <strong>de</strong> copies chez les<br />
<strong>de</strong>ux espèces (Figure 65).<br />
3.4.3. Essai sur disques <strong>de</strong> pomme <strong>de</strong> terre<br />
Ce test consiste à induire l'apparition <strong>de</strong> tumeurs sur <strong>de</strong>s disques <strong>de</strong> tissu interne <strong>de</strong> tubercules<br />
<strong>de</strong> pomme <strong>de</strong> terre, par inoculation d'une suspension d'Agrobacterimn tumefaciens, souche<br />
C58 (CFBP 1903). Les produits à tester sont appliqués simultanément. Le nombre <strong>de</strong> tumeurs<br />
est évalué après 21 jours d'incubation à 25°C <strong>et</strong> comparé aux va<strong>leurs</strong> obtenues pour les<br />
témoins.<br />
U.P.M.C./U.S. 139<br />
2010
Cancers végétal <strong>et</strong> animal<br />
La préparation <strong>de</strong>s disques <strong>de</strong> tubercules est réalisée <strong>de</strong> façon classique. Après stérilisation<br />
<strong>de</strong>s surfaces <strong>de</strong> coupe, un cylindre <strong>de</strong> 1,2 cm <strong>de</strong> diamètre <strong>de</strong> tissu interne est prélevé dans<br />
l'axe central <strong>de</strong> chaque tubercule au moyen d'un emporte-pièce. Ce cylindre est débité en<br />
disques <strong>de</strong> 0,5 cm d'épaisseur constituant les explantats. Ces disques sont ensuite placés, leur<br />
face apicale au contact du milieu, dans <strong>de</strong>s boîtes <strong>de</strong> Pétri renfermant 30 ml <strong>de</strong> gélose à 1,5 %<br />
<strong>et</strong> inoculés immédiatement avec 50 µl d'un inoculum contenant 5.10 9 UFC/ml<br />
d'Agrobacterium tumefaciens C58 <strong>et</strong> 1,25 µg <strong>de</strong>s différents produits à tester.<br />
Les tumeurs sont dénombrées sur toute la surface du disque après ajout d'une solution <strong>de</strong><br />
Lugol, <strong>et</strong> après 21 jours d'incubation à 25 °C (Ferrigni, N. H. <strong>et</strong> al., 1982).<br />
Figure 65 : Exemple d’alignement <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux séquences<br />
(N° d’accession XP_002304841 <strong>et</strong> XP_002284688)<br />
U.P.M.C./U.S. 140<br />
2010
4. Discussion<br />
Discussion<br />
La prolifération cellulaire incontrôlée constitue l’élément <strong>de</strong> base <strong>de</strong> la tumorogenèse d’où<br />
plusieurs molécules inhibitrices isolées ou synthétisées ont été utilisées en thérapie. De même<br />
<strong>de</strong>s telles molécules ont été développées pour inhiber la prolifération <strong>de</strong>s microorganismes<br />
pathogènes aux animaux ou végétaux. Dans la présente thèse nous avons fixé comme<br />
objectifs la recherche <strong>de</strong> similitu<strong>de</strong>s entre cancer animal <strong>et</strong> végétal via une étu<strong>de</strong><br />
bioinformatique afin <strong>de</strong> rechercher <strong>de</strong>s cibles communes <strong>et</strong> exploiter les molécules efficaces<br />
dans un système pour les étudier dans l’autre. En plus, l’inhibition <strong>de</strong> la prolifération concerne<br />
aussi les microorganismes d’où l’idée d’utiliser les mêmes molécules aussi bien en cancer que<br />
contre les pathogènes. D’ail<strong>leurs</strong> plusieurs antibiotiques ont montré une activité anti-cancer<br />
tel que le doxycycline (Chhipa, R.R. <strong>et</strong> al., 2005) <strong>et</strong> <strong>de</strong>s molécules utilisées en cancer ont été<br />
efficaces aussi dans l’inhibition <strong>de</strong>s microorganismes pathogènes tel que le tamoxifène qui a<br />
montré une activité antifongique (Dolan, K. <strong>et</strong> al., 2009).<br />
Lors <strong>de</strong>s synthèses effectuées, divers <strong>composés</strong> <strong>organométalliques</strong> <strong>de</strong> différents métaux <strong>et</strong><br />
avec diverses substitutions ont été obtenus avec <strong>de</strong>s ren<strong>de</strong>ments variables. Les essais <strong>de</strong><br />
formulation ont été réussis aussi bien pour les sels d’aci<strong>de</strong>s citriques <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> aminés<br />
(ren<strong>de</strong>ment <strong>de</strong> 100%), que pour les sucres <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> phénoliques.<br />
Les différents produits ont été testés contre les cellules tumorales MDA-MB-231, la galle du<br />
coll<strong>et</strong> ainsi que différents microorganismes pathogènes à l’Homme <strong>et</strong> aux végétaux. Les<br />
va<strong>leurs</strong> CMI <strong>et</strong> CMB <strong>de</strong> la doxycycline ont été trouvées à
Discussion<br />
Les <strong>composés</strong> P15 <strong>et</strong> P116, analogues ferrocéniques <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> <strong>de</strong> l’OHTAM3 <strong>et</strong> du<br />
P305 sont légèrement moins actifs que la doxycycline.<br />
Les autres produits testés <strong>et</strong> potentiellement actifs ont eu comme va<strong>leurs</strong> MIC <strong>et</strong> MBC autour<br />
<strong>de</strong> 100 µg/ml <strong>et</strong> 200 µg/ml, respectivement.<br />
L’efficacité contre les cellules tumorales <strong>et</strong> microbiennes, démontrée par la série du P116,<br />
analogues du tamoxifène, appuie encore l’hypothèse <strong>de</strong> l’existence d’une cible commune pour<br />
les traitements cancéreux <strong>et</strong> infectieux. La calmoduline, cible thérapeutique possible du<br />
tamoxifène, pourrait être la cible <strong>de</strong> nos produits surtout que son existence a été prouvée dans<br />
les cellules fongique <strong>et</strong> supposée être la cible du tamoxifène lors <strong>de</strong> son inhibition <strong>de</strong> Candida<br />
albicans (Dolan, K. <strong>et</strong> al., 2009).<br />
OHTAM3<br />
P116<br />
( )3 )3<br />
( )3 )3<br />
( )3 )3<br />
P305<br />
P490<br />
( )3 NMe O<br />
( )3 2 NMe O<br />
2<br />
( )3 )3 NMe 2<br />
O<br />
U.P.M.C./U.S. 142<br />
2010<br />
( )3 )3<br />
( )3 )3<br />
Fe<br />
P15<br />
P14<br />
Figure 66 : Série <strong>de</strong>s produits aminés les plus actifs<br />
OH<br />
O<br />
( )4 )4<br />
( )3 )3 N<br />
Le principal objectif <strong>de</strong> l’étu<strong>de</strong> bioinformatique était d’i<strong>de</strong>ntifier les gènes végétaux<br />
homologues à ceux impliqués dans le cancer humain. Pour cela une liste <strong>de</strong> gènes décrits pour<br />
leur implication dans le processus d’apparition <strong>et</strong> d’évolution du cancer du sein <strong>et</strong> <strong>de</strong><br />
l’estomac a été choisie. Celle-ci comprend aussi bien <strong>de</strong>s gènes codant pour <strong>de</strong>s protéines <strong>de</strong><br />
signalisation, <strong>de</strong> régulation, <strong>de</strong> structure <strong>et</strong> <strong>de</strong> réparation <strong>de</strong> l’ADN.
Discussion<br />
La recherche d’homologie par le programme BLAST a mis en évi<strong>de</strong>nce <strong>de</strong>s homologues<br />
chez diverses espèces végétales qui présentaient <strong>de</strong>s <strong>de</strong>grés d’homologie variables (<strong>de</strong>s <strong>de</strong>grés<br />
d’i<strong>de</strong>ntité allant <strong>de</strong> 21 à 95%). Parmi les homologies les plus intéressants on peut signaler la<br />
mise en évi<strong>de</strong>nce chez les plantes d’un gène homologue au TP53 (94% d’i<strong>de</strong>ntité avec la<br />
séquence chez maïs), célèbre pour son rôle <strong>de</strong> suppresseur <strong>de</strong> tumeur chez l’homme (Lacave,<br />
R. <strong>et</strong> al., 2005). Il en est <strong>de</strong> même pour le gène humain EGFL6 qui est un EGF-like (facteur<br />
<strong>de</strong> croissance épi<strong>de</strong>rmique), un ligand pour l’EGFR récepteur tyrosine kinase intervenant dans<br />
la transduction du signal chez l’homme (Tobias, S. <strong>et</strong> al,.2006).<br />
Ces homologues végétaux sont d‘autant plus intéressants qu’ils correspon<strong>de</strong>nt, pour une<br />
bonne part d‘entre eux, à <strong>de</strong>s protéines hypothétiques provenant <strong>de</strong> prédiction<br />
bioinformatiques <strong>et</strong> dont la fonction n’a pas été démontrée expérimentalement.<br />
Pour mieux caractériser ces protéines hypothétiques sur le plan fonction, nous avons étudié le<br />
contenu en domaines en les alignant par rapport à la banque <strong>de</strong> domaines CDD. Ainsi nous<br />
avons r<strong>et</strong>rouvé les domaines fonctionnels caractéristiques <strong>de</strong>s protéines d’origine confirmant<br />
ainsi l’homologie.<br />
Parmi les homologues nous avons examinés <strong>de</strong> plus près ceux contenant les domaines kinases<br />
(signalisation) <strong>et</strong> doigt <strong>de</strong> Zinc (facteur <strong>de</strong> transcription). Neuf protéines homologues ont été<br />
ainsi r<strong>et</strong>enues pour rechercher <strong>leurs</strong> homologues chez la vigne <strong>et</strong> le peuplier, les <strong>de</strong>ux seules<br />
espèces <strong>de</strong> la famille <strong>de</strong>s arbres dont les génomes ont été complètement séquencés. En plus,<br />
ce sont les espèces les plus proches <strong>de</strong> l’amandier, arbre très sensible à Agrobacterium<br />
tumefaciens où la galle du coll<strong>et</strong> cause <strong>de</strong>s dégâts importants en Tunisie.<br />
Nous avons alors r<strong>et</strong>rouvé plusieurs homologues (paralogues) <strong>de</strong> ces gènes ce qui ouvre la<br />
voie à plusieurs applications, notamment pour la recherche <strong>de</strong> moyens <strong>de</strong> lutte contre les<br />
galles du coll<strong>et</strong> <strong>et</strong> le cancer, si jamais <strong>de</strong>s ressemblances entre les mécanismes <strong>de</strong> ces <strong>de</strong>ux<br />
maladies sont r<strong>et</strong>rouvées. Toutefois ces homologues i<strong>de</strong>ntifiés doivent être caractérisés sur le<br />
plan fonctionnel.<br />
C<strong>et</strong>te étu<strong>de</strong> nous a permis <strong>de</strong> déterminer <strong>de</strong>s protéines végétales similaires à celles humaines<br />
provoquant la genèse du cancer du sein <strong>et</strong> du cancer gastrique qui méritent une étu<strong>de</strong> plus<br />
approfondie. Ces <strong>de</strong>rnières ont été i<strong>de</strong>ntifiées grâce à une recherche au sein <strong>de</strong> la banque<br />
U.P.M.C./U.S. 143<br />
2010
Discussion<br />
GenPept, prédiction <strong>de</strong>s domaines <strong>et</strong> l’alignement <strong>de</strong> séquences. La recherche dans la banque<br />
<strong>de</strong> données a mis en évi<strong>de</strong>nce différentes protéines à la base <strong>de</strong> la construction <strong>de</strong> parentés<br />
suivant <strong>de</strong>s critères moléculaires stricts.<br />
C<strong>et</strong>te démarche pourrait avoir <strong>de</strong>s r<strong>et</strong>ombées majeures en perm<strong>et</strong>tant l’i<strong>de</strong>ntification <strong>de</strong><br />
nouvelles protéines présentant <strong>de</strong> forte homologie avec celles humaines <strong>et</strong> la compréhension<br />
<strong>de</strong>s mécanismes <strong>de</strong> cancérisation.<br />
Ces résultats représentent une étape critique vers une définition <strong>de</strong> nouvelles cibles<br />
thérapeutiques contre la galle du coll<strong>et</strong>, le cancer du sein <strong>et</strong> le cancer gastrique. En eff<strong>et</strong><br />
l’existence <strong>de</strong> gènes végétaux homologues aux gènes humains cibles du Tamoxifène ne fait<br />
que soutenir notre prospection surtout nos molécules synthétisées sont <strong>de</strong>s analogues <strong>de</strong><br />
tamoxifène.<br />
Compte tenu <strong>de</strong> c<strong>et</strong>te analogie, les cellules tumorales végétales peuvent également servir aux<br />
premiers screening <strong>de</strong>s produits à potentiel eff<strong>et</strong> antitumoral avant le recours aux systèmes <strong>de</strong><br />
criblage cellulaire plus onéreux <strong>et</strong> plus difficiles à m<strong>et</strong>tre en œuvre (Nawaz, H. <strong>et</strong> al., 2009).<br />
Bien que nos essais antitumoraux effectués sur disques <strong>de</strong> pomme <strong>de</strong> terre montrent <strong>de</strong>s<br />
produits inhibant significativement le développement <strong>de</strong>s galles, la métho<strong>de</strong> doit être mise au<br />
point pour confirmer les tests déjà obtenus avec le système <strong>de</strong> criblage cellulaire.<br />
L’existence <strong>de</strong> “calmodulin-like proteins” (containing EF-hand motifs) dans les bactéries a<br />
longtemps resté hypothétique. L’analyse <strong>de</strong>s séquences protéiques procaryotes disponibles<br />
dans les bases <strong>de</strong> données a révélé la présence <strong>de</strong> nombreuses «calmodulin-like » (Michiels,<br />
J. <strong>et</strong> al., 2002), d’ail<strong>leurs</strong> la recherche dans la base NCBI <strong>de</strong> blasts du gene SPTAN1<br />
(XP_002310148) donne différents « calmodulin; Provisional » ou « putative calmodulin-like<br />
protein » telle que YP_001866396.1 chez Nostoc punctiforme, PCC 73102 <strong>et</strong> AAL40866.1<br />
chez Nostoc punctiforme, YP_003422157.1 chez cyanobacterium, UCYN-A <strong>et</strong><br />
ZP_01619828.1 chez Lyngbya sp., PCC 8106 <strong>et</strong> YP_001803260.1 chez Cyanothece sp.,<br />
ATCC 51142 <strong>et</strong> YP_003116483.1 chez Catenulispora acidiphila, DSM 44928 <strong>et</strong><br />
ZP_00517220.1 chez Crocosphaera watsonii, WH 8501 <strong>et</strong> YP_002370979.1, chez<br />
Cyanothece sp. PCC 8801 <strong>et</strong> ZP_04696334.1 <strong>et</strong> chez Streptomyces roseosporus NRRL<br />
15998.<br />
U.P.M.C./U.S. 144<br />
2010
Discussion<br />
Cependant, le fait que certains produits sont actifs contre les cellules tumorales <strong>et</strong> inactifs<br />
contre les bactéries, ém<strong>et</strong> l’hypothèse que ceux-ci pourraient avoir <strong>de</strong>s cibles différentes,<br />
surtout que les doses qui donnent <strong>de</strong>s eff<strong>et</strong>s antimicrobiens sont bien supérieures aux doses<br />
actives contres les cellules tumorales <strong>et</strong> qu’il a été déjà prouvé que le tamoxifène, dont nos<br />
meilleures produits sont <strong>de</strong>s analogues, induirait une altération ultrastructurale dans la<br />
membrane <strong>de</strong> Bacillus stearothermophilus (Luxo, C. <strong>et</strong> al., 2003).<br />
La première remarque que l’on peut tirer <strong>de</strong>s résultats <strong>biologiques</strong> est que la présence <strong>de</strong> la<br />
chaîne diméthylamino est essentielle pour l’activité antimicrobienne du composé. C’est bien<br />
le cas <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> OHTAM3, P305, P14, P15 <strong>et</strong> P116. Les substituants OH, NH2,<br />
NHCOR, Br ou CN en position para ne jouent pratiquement aucun rôle car les produits<br />
portants ces fonctions ont la même activité que celle du composé non-substitué P41.<br />
P85<br />
P35<br />
ZEKBr<br />
U.P.M.C./U.S. 145<br />
2010<br />
Br<br />
ZEKCN<br />
P315 P316 P317 P41<br />
Figure 67 : Produits utilisés pour l’estimation <strong>de</strong> l’eff<strong>et</strong> <strong>de</strong> la substitution sur l’activité<br />
L’examen <strong>de</strong> l’activité antimicrobienne <strong>de</strong>s couples composé organique/analogue<br />
ferrocénique P93/P85, P92/P5, P246/P35, OHTAM3/P15 <strong>et</strong> P305/P116 montre clairement<br />
que le ferrocényle se comporte comme un phényle, voire il désactive légèrement dans certains<br />
cas.<br />
CN
Discussion<br />
Résultat qui se confirme également par l’absence d’activité antimicrobienne pour le produit<br />
diaminé P490. La présence <strong>de</strong> Phényle ou <strong>de</strong> ferrocène est donc indispensable pour l’activité<br />
antibiotique <strong>et</strong> antifongique.<br />
OHTAM3<br />
P15<br />
P93 P92 P246<br />
OH<br />
( )3 )3 N<br />
O<br />
P85 P5<br />
( )3 )3<br />
( )3 )3<br />
U.P.M.C./U.S. 146<br />
2010<br />
( )3 )3<br />
P490 P305<br />
P35<br />
P239 P116<br />
Figure 68 : Produits utilisés pour l’estimation <strong>de</strong> l’eff<strong>et</strong> du ferrocène sur l’activité<br />
( )3 )3<br />
( )3 )3<br />
( )3 )3<br />
( )3 )3
Discussion<br />
Ce résultat est le contraire <strong>de</strong> ce que nous avons obtenu dans le cas du cancer du sein. En<br />
eff<strong>et</strong>, les <strong>composés</strong> organiques P92, P246 <strong>et</strong> OHTAM3 sont inactifs sur les cellules hormono-<br />
indépendantes MDA-MB-231 alors que <strong>leurs</strong> analogues ferrocéniques P5, P35 <strong>et</strong> P15 sont<br />
parmi les <strong>composés</strong> les plus efficaces présentant <strong>de</strong>s va<strong>leurs</strong> IC50 entre 0.5 µM <strong>et</strong> 0.8 µM.<br />
C<strong>et</strong>te différence se vérifie sur le composé P239, il est très actif sur les cellules cancéreuses <strong>et</strong><br />
peu actif maintenant sur les microorganismes.<br />
En eff<strong>et</strong>, le ferrocène (Particulièrement la forme cyclique ferrocénophane), contrairement au<br />
phényle <strong>et</strong> aux autres métaux utilisés (Ru, Re, Mn) est indispensable pour que l’activité<br />
antitumorale soit bonne. Cependant, il est clair que le métal ne joue pas un rôle important<br />
dans l’activité antibiotique (Tous les produits testés ont la même activité contre<br />
Staphylococcus aureus) mais que c’est plutôt la substitution qui la conditionne.<br />
Produits<br />
Tableau 21 : Eff<strong>et</strong> du métal sur les résultats <strong>biologiques</strong><br />
Fe<br />
OH<br />
OH<br />
P5<br />
P239<br />
P88<br />
P89<br />
P90<br />
P92<br />
LogP0/w 4,95 4,603 4,95 5,6 5,5 4,4<br />
(%) MDA-MB231/Contrôle<br />
(à 10 -6 26,5<br />
4,1<br />
96,3<br />
97<br />
98,3<br />
97,24<br />
M, J5)<br />
+/- 0,6 +/- 0,2 +/- 2,3 +/- 0,05 +/- 0<br />
+/- 0<br />
S. aureus<br />
CMI µg/ml<br />
CMB µg/ml<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200<br />
100<br />
200<br />
Les ami<strong>de</strong>s P303, P314, P315, P316 <strong>et</strong> P317 <strong>et</strong> les esters P67, P66, P78 <strong>et</strong> P79 sont parmi les<br />
moins actifs avec <strong>de</strong>s va<strong>leurs</strong> MIC <strong>et</strong> MBC similaires.<br />
Le seul point commun entre les microorganismes testés <strong>et</strong> les cellules cancéreuses MDA-MB-<br />
231 semble être leur sensibilité vis-à-vis <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> portant <strong>de</strong>s chaînes aminées. Par<br />
exemple le composé organique diaminé P305 <strong>et</strong> le composé ferrocénique P116 sont aussi<br />
efficaces sur les microorganismes que sur les cellules cancéreuses. La transformation <strong>de</strong>s<br />
<strong>composés</strong> P15 <strong>et</strong> P116 en sels citriques P514 <strong>et</strong> P493 fait baisser légèrement leur activité<br />
(Diminution <strong>de</strong> la concentration du principe actif). Le composé P493 a l’avantage d’être très<br />
soluble dans l’eau.<br />
U.P.M.C./U.S. 147<br />
2010
Fe<br />
P316<br />
P67<br />
Fe<br />
P303 P314<br />
H<br />
N<br />
O<br />
O<br />
O<br />
Fe<br />
C 15 H 31<br />
O<br />
C 15 H 31<br />
O<br />
P317<br />
H<br />
N<br />
Discussion<br />
U.P.M.C./U.S. 148<br />
2010<br />
O<br />
H<br />
N<br />
O<br />
Fe<br />
Fe<br />
P315<br />
P66<br />
Fe<br />
P78 P79<br />
Figure 69 : Produits utilisés pour l’estimation <strong>de</strong> l’activité <strong>de</strong>s ami<strong>de</strong>s <strong>et</strong> <strong>de</strong>s esters<br />
P514<br />
( )3 )3<br />
P493<br />
( )3 )3<br />
( )3 )3<br />
Figure 70 : Sels d’aci<strong>de</strong> citrique <strong>de</strong>s produits les plus actifs.<br />
H<br />
N<br />
O<br />
O<br />
O<br />
O<br />
O<br />
O<br />
C C15H 15H 31<br />
C 15 H 31<br />
O<br />
O<br />
O
Discussion<br />
En le transformant en composé glycosilé, le ferrocényl monohydroxy P85 originairement<br />
moins efficace que le P5 (FcDiOH) contre les cellules tumorales MDA-MB-231 donne un<br />
produit, P42, aussi efficace que lui. Le P44, dérivé glycosilé du du P5, est 40 fois moins actif<br />
que ce <strong>de</strong>rnier. Le P85 <strong>de</strong>vient donc plus intéressant, même s’il est moins actifs, car il gar<strong>de</strong><br />
la même efficacité, suite à sa formulation en sucre, qui améliore sa solubilité dans l’eau <strong>et</strong><br />
facilite sa future utilisation.<br />
Il est également important <strong>de</strong> noter que la transformation <strong>de</strong>s produits P5 <strong>et</strong> P85 en sucres ne<br />
semble avoir aucun eff<strong>et</strong> sur l’activité antimicrobienne qui reste la même pour tous les germes<br />
à l’exception <strong>de</strong> Fusarium solani, qui <strong>de</strong>vient résistant aux produits formulés.<br />
Tableau 22 : Résultats <strong>biologiques</strong> <strong>de</strong>s ferrocéniphénols <strong>et</strong> <strong>de</strong> <strong>leurs</strong> dérivés glycosilés<br />
Produits<br />
LogP0/w<br />
(%) MDA-MB231/Contrôle<br />
IC50 (10 -6 M)<br />
Bactéries pathogènes pour les végétaux<br />
CMI µg/ml<br />
A. tumefaciens<br />
CMB µg/ml<br />
CMI µg/ml<br />
P. savastanoi<br />
CMB µg/ml<br />
Champignons pathogènes aux végétaux<br />
CMI µg/ml<br />
F. Solani<br />
CMB µg/ml<br />
Bactéries pathogènes à l’Homme<br />
CMI µg/ml<br />
P. aeruginosa<br />
CMB µg/ml<br />
CMI µg/ml<br />
S. aureus<br />
CMB µg/ml<br />
Champignons pathogènes à l’Homme<br />
CMI µg/ml<br />
C. albicans<br />
CMB µg/ml<br />
P44<br />
4,65<br />
96,9<br />
+/- 0,9<br />
25,3<br />
+/- 9<br />
U.P.M.C./U.S. 149<br />
2010<br />
P5<br />
4,95<br />
26,5<br />
+/- 0,6<br />
0,64<br />
+/- 0,06<br />
50<br />
100<br />
50<br />
100<br />
Discussion<br />
En plus <strong>de</strong>s produits aminés (Figure 66) qui ont donnés les meilleures <strong>activités</strong> que ce soit<br />
contres les microorganismes pathogènes à l’Homme <strong>et</strong> aux végétaux ou les cellules tumorales,<br />
quelques <strong>composés</strong> phénoliques (Figure 68) se sont avérés relativement efficaces contre les<br />
microorganismes pathogènes aux végétaux, constat qui peut perm<strong>et</strong>tre à certains d’entres eux<br />
<strong>de</strong> constituer une alternatives pour pallier les eff<strong>et</strong>s néfastes attribués à l’utilisation <strong>de</strong>s<br />
antibiotiques (Kumar, K. <strong>et</strong> al., 2005) <strong>et</strong> <strong>de</strong>s pestici<strong>de</strong>s (Barcelo, D., 1997) surtout qu’ils se<br />
sont avéré, in vitro, aussi efficaces, voir meil<strong>leurs</strong> que la doxycycline, <strong>de</strong> la famille <strong>de</strong>s<br />
tétracycline, utilisée comme référence. D’autre part, le sels d’aci<strong>de</strong> citrique du meil<strong>leurs</strong><br />
parmi eux (P493) s’est montré très actif in vivo, sur olivier, contre Pseudomonas savastanoi,<br />
Agrobacterium tumefaciens <strong>et</strong> Fusarium solani.<br />
Tableau 23 : Produits actifs contre les microorganismes nuisibles aux végétaux<br />
Produits<br />
Bactéries pathogènes pour les végétaux<br />
CMI µg/ml<br />
A. tumefaciens<br />
CMB µg/ml<br />
CMI µg/ml<br />
P. savastanoi<br />
CMB µg/ml<br />
Champignons pathogènes aux végétaux<br />
CMI µg/ml<br />
F. Solani<br />
CMB µg/ml<br />
Produits<br />
Bactéries pathogènes pour les végétaux<br />
CMI µg/ml<br />
A. tumefaciens<br />
CMB µg/ml<br />
CMI µg/ml<br />
P. savastanoi<br />
CMB µg/ml<br />
Champignons pathogènes aux végétaux<br />
CMI µg/ml<br />
F. Solani<br />
CMB µg/ml<br />
Produits<br />
Bactéries pathogènes pour les végétaux<br />
CMI µg/ml<br />
A. tumefaciens<br />
CMB µg/ml<br />
CMI µg/ml<br />
P. savastanoi<br />
CMB µg/ml<br />
Champignons pathogènes aux végétaux<br />
CMI µg/ml<br />
F. Solani<br />
CMB µg/ml<br />
OC<br />
P116<br />
U.P.M.C./U.S. 150<br />
2010<br />
( )3 )3<br />
Discussion<br />
D’après le tableau précé<strong>de</strong>nt, il parait que c’est surtout la substitution « OH » qui est à<br />
l’origine <strong>de</strong> l’activité <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> contre Fusarium solani, <strong>et</strong> que le ferrocène sous ces <strong>de</strong>ux<br />
formes donne <strong>de</strong>s résultats meil<strong>leurs</strong> que le phényle ou les autres métaux.<br />
Fusarium solani, est un champignons polyphage à l’origine <strong>de</strong> plusieurs dégâts dans le mon<strong>de</strong><br />
végétal (Barr<strong>et</strong>o, D. <strong>et</strong> al., 2003), impliqué également dans plusieurs pathologies humaines<br />
(Caux, F. <strong>et</strong> al., 1993 ; Patoux-Pibouin, M. <strong>et</strong> al., 1992) <strong>et</strong> soupçonné être responsable <strong>de</strong><br />
plusieurs autres dégâts matériels tels que ceux engendrés à la grotte <strong>de</strong> LASCAUX<br />
(Alabouv<strong>et</strong>te, C. <strong>et</strong> al., 2009).<br />
La série <strong>de</strong>s amines a démontré une efficacité remarquables contre ce champignons <strong>et</strong> le sel<br />
(P493) du meilleur produit organométallique (P116) s’est avéré in vivo si efficace sur olivier<br />
contre ce germe réputé être résistant aux antifongiques <strong>de</strong> référence (L<strong>et</strong>scher-Bru, V. <strong>et</strong><br />
Herbrecht, R., 2003).<br />
L’activité sélective <strong>de</strong> certains produits phénoliques contre Fusarium solani qui peut<br />
constituer un avantage, lors d’une éventuelle utilisation aux champs, pour la préservation <strong>de</strong>s<br />
bactéries utiles du sol.<br />
Nos produits peuvent donc constituer une solution pour pallier la résistance <strong>de</strong>s différents<br />
microorganismes <strong>et</strong> réduire l’utilisation <strong>de</strong>s pestici<strong>de</strong>s nuisibles à l’Homme à<br />
l’environnement.<br />
Les <strong>composés</strong> organiques <strong>et</strong> ferrocéniques, dérivés du tamoxifène, ont été donc testés sur<br />
les microorganismes pathogènes à l’Homme <strong>et</strong> aux végétaux ainsi que sur <strong>de</strong>s cellules<br />
tumorales. Les résultats obtenus semblent montrer qu’il n’existe pas une corrélation entre<br />
l’activité antitumorale <strong>et</strong> <strong>activités</strong> bactérici<strong>de</strong> <strong>et</strong> fongici<strong>de</strong>.<br />
Les dérivés ferrocéniques <strong>et</strong> <strong>leurs</strong> analogues organiques ont <strong>de</strong>s <strong>activités</strong> similaires sur les<br />
bactéries <strong>et</strong> le champignon. Seuls les <strong>composés</strong> portant une chaîne aminée sont actifs. Il est<br />
intéressant <strong>de</strong> noter que les <strong>composés</strong> diaminés sont aussi actifs que la doxycyline. Ils sont<br />
même plus actifs que la doxycyline sur Candida albicans <strong>et</strong> Fusrium solani <strong>et</strong> possè<strong>de</strong>nt donc<br />
une activité antibiotique <strong>et</strong> antifongique.<br />
U.P.M.C./U.S. 151<br />
2010
Discussion<br />
Par conséquent, nous concentrons notre future étu<strong>de</strong> sur ce type <strong>de</strong> <strong>composés</strong> surtout qu’ils se<br />
sont montrés efficace également contre les cellules tumorales hormono-indépendantes MDA-<br />
MB231 (inhibition jusqu’à : P305, 2,45% ; P116, 5,1%).<br />
Si le ferrocéne <strong>et</strong> particulièrement sa forme cyclique apparaissent indispensables pour<br />
l’amélioration <strong>de</strong> l’activité antitumorale <strong>de</strong>s produits synthétisés (Meilleure activité avec les<br />
mêmes substitutions) alors qu’ils ne le sont pas autant pour l’activité antimicrobienne<br />
(Nécessité <strong>de</strong> sa présence ou d’un phényle dans la structure <strong>et</strong> c’est plutôt la substitution qui<br />
conditionne l’activité), son utilisation est intéressante, surtout en arboriculture, si on prend en<br />
considération la toxicité du phényle, sa biodégradabilité <strong>et</strong> son apport fertilisant.<br />
U.P.M.C./U.S. 152<br />
2010
Il nous faut peu <strong>de</strong> mots pour exprimer l’essentiel ;<br />
il nous faut tous les mots pour le rendre réel.<br />
Paul Eluard (Eugène Grin<strong>de</strong>l)
Conclusion générale<br />
Notre présent travail a concerné la synthèse <strong>de</strong> plusieurs analogues du tamoxifène. La<br />
majorité <strong>de</strong> ces analogues contiennent un groupement organométallique, le ferrocène, qui est<br />
constitué <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux cycles cyclopentadiényles complexés par un atome <strong>de</strong> fer. Ces analogues<br />
ferrocéniques <strong>de</strong> molécules biologiquement actives ont fait l’obj<strong>et</strong> d’une étu<strong>de</strong> biologique<br />
comparative avec ceux organiques. Ces étu<strong>de</strong>s ont portées sur l’eff<strong>et</strong> antiprolifératif contre les<br />
cellules tumorales du cancer du sein MDA-MB231, l’inhibition <strong>de</strong>s tumeurs végétales <strong>de</strong> la<br />
galle du coll<strong>et</strong> causée par Agrobacterium tumefaciens ainsi que l’eff<strong>et</strong> antimicrobien contre<br />
divers microbes pathogènes aux animaux <strong>et</strong> aux végétaux.<br />
La première partie <strong>de</strong> ce travail a été consacrée à la synthèse <strong>de</strong> divers analogues<br />
ferrocéniques du tamoxifène. Ainsi, une série <strong>de</strong> <strong>composés</strong> phénoliques <strong>et</strong> non phénoliques <strong>de</strong><br />
la série <strong>de</strong>s diaryl-ferrocényl-butènes, une série <strong>de</strong> complexes <strong>de</strong> Fe, <strong>de</strong> Ru, <strong>de</strong> Re <strong>et</strong> <strong>de</strong> Mn<br />
du diphénol butène, une série d’ami<strong>de</strong>s analogues du ferrociphénol, une série d’amines d’aryl-<br />
ferrocényl-butène <strong>et</strong> une série <strong>de</strong> <strong>composés</strong> diaminés organiques <strong>et</strong> ferrocéniques ont été<br />
synthétisés. Pour les rendre plus soluble <strong>et</strong> pour faciliter leur utilisation les <strong>composés</strong><br />
phénoliques <strong>de</strong> la première série ont été formulés <strong>et</strong> protégés par <strong>de</strong>s sucres, alors que les<br />
<strong>composés</strong> diaminés <strong>de</strong> la cinquième série ont été transformés en sels d’aci<strong>de</strong> citrique (Figure<br />
71).<br />
La secon<strong>de</strong> partie <strong>de</strong> ce travail a consisté à l’<strong>évaluation</strong> <strong>de</strong> l’eff<strong>et</strong> biologique <strong>de</strong>s différents<br />
<strong>composés</strong> synthétisés. Ainsi, tous nos <strong>composés</strong> ont fait l’obj<strong>et</strong> d’une détermination <strong>de</strong> leur<br />
coefficient <strong>de</strong> partage, <strong>de</strong> leur aptitu<strong>de</strong> à inhiber les cellules tumorales MDA-MB231 du sein,<br />
ainsi que <strong>de</strong> leur eff<strong>et</strong> antimicrobien à l’égard <strong>de</strong> germes pathogènes à l’Homme ou aux<br />
végétaux. L’utilisation phytosanitaire <strong>de</strong> quelques produits, ayant démontrés une excellente<br />
activité contre les différents microorganismes phytopathogènes utilisés, a été également<br />
prospectée in vivo.<br />
La troisième partie <strong>de</strong> ce travail, consacrée à la recherche, par une étu<strong>de</strong> bioinformatique,<br />
d’analogies entre les processus tumoraux animal <strong>et</strong> végétal a confirmé notre hypothèse <strong>et</strong><br />
a appuyé notre idée <strong>de</strong> l’éventuelle efficacité <strong>de</strong>s <strong>composés</strong> <strong>organométalliques</strong>, connus<br />
pour être actifs contre les cellules tumorales du cancer du sein, dans le traitement <strong>de</strong> la<br />
galle du coll<strong>et</strong>. L’existence <strong>de</strong>s gènes impliqués dans le cancer du sein dans le règne<br />
végétal en général <strong>et</strong> dans la pomme <strong>de</strong> terre en particulier, appuie l’utilisation <strong>de</strong>s<br />
U.P.M.C./U.S. 153<br />
2010
Conclusion générale<br />
cellules végétales (Ferrigni, N.H. <strong>et</strong> al., 1982) pour le screening <strong>de</strong> produits pouvant être<br />
efficaces contre le cancer du sein.<br />
P116<br />
P5 P88 P314 P371<br />
( )3 )3<br />
( )3 )3<br />
Fe<br />
P29<br />
AcO OAc<br />
OAc<br />
AcO<br />
O<br />
O<br />
O<br />
O<br />
U.P.M.C./U.S. 154<br />
2010<br />
OAc<br />
OAc<br />
OAc<br />
OAc<br />
P493<br />
Figure 71 : Exemples <strong>de</strong>s produits obj<strong>et</strong>s <strong>de</strong> notre étu<strong>de</strong><br />
Les tests <strong>biologiques</strong> effectués au cours <strong>de</strong> ce travail ont démontré que les produits <strong>de</strong> la série<br />
<strong>de</strong>s <strong>composés</strong> diaminés sont <strong>de</strong>s molécules prom<strong>et</strong>teuses dans le traitement du cancer du sein<br />
hormono-indépendant, <strong>et</strong> présentent également d’excellentes propriétés antibiotiques <strong>et</strong> un<br />
excellent potentiel phytopharmaceutique. Nous avons démontré que le traitement <strong>de</strong>s plants<br />
d’olivier par ces <strong>composés</strong> a inhibé l’apparition <strong>de</strong>s symptômes <strong>de</strong>s maladies causées par les<br />
microorganismes phytophatogènes (Agrabacterium tumefaciens, Fusarium solani <strong>et</strong><br />
Pseudomonas savastanoi). Ceci rend ces <strong>composés</strong> <strong>de</strong>s bons candidats pour les traitements<br />
phytosanitaires en arboriculture.<br />
Compte tenu <strong>de</strong>s résultats obtenus pour la molécule P116, une attention particulière a été<br />
attribuée aux <strong>composés</strong> <strong>de</strong> c<strong>et</strong>te série <strong>et</strong> différents <strong>composés</strong> analogues, ferrocéniques <strong>et</strong><br />
organiques, ont été synthétisés <strong>et</strong> testés (Figure 72)<br />
( )3 )3<br />
( )3 )3
( )3 )3<br />
( )3 )3<br />
P490 P305<br />
OHTAM3<br />
OH<br />
( )3 )3 N<br />
O<br />
P15<br />
( )3 )3<br />
( )3 )3<br />
P116<br />
Conclusion générale<br />
U.P.M.C./U.S. 155<br />
2010<br />
( )3 )3<br />
P283<br />
Figures 72 : Produits <strong>de</strong> la série <strong>de</strong>s produits aminés les plus efficaces biologiquement<br />
Le principal constat à r<strong>et</strong>enir concerne la présence <strong>de</strong> la chaîne diméthylamino, comme pour<br />
les produits OHTAM3, P305, P15 <strong>et</strong> P116, qui est essentielle pour l’activité antimicrobienne.<br />
Les substituants OH, NH2, NHCOR, Br ou CN en position para ne joue pratiquement aucun<br />
rôle.<br />
Bien que les produits organiques P92, P246 <strong>et</strong> OHTAM3 soient inactifs sur les cellules<br />
hormono-indépendantes MDA-MB-231, <strong>leurs</strong> analogues ferrocéniques P5, P35 <strong>et</strong> P15 sont<br />
parmi les <strong>composés</strong> les plus efficaces avec <strong>de</strong>s va<strong>leurs</strong> IC50 entre 0.5 µM <strong>et</strong> 0.8 µM. En plus,<br />
l’activité antimicrobienne <strong>de</strong>s couples composé organique/analogue ferrocénique P93/P85,<br />
P92/P5, P246/P35, OHTAM3/P15 <strong>et</strong> P305/P116 montre clairement que le ferrocényle se<br />
comporte comme un phényle. Le ferrocène (Particulièrement la forme cyclique<br />
ferrocénophane), contrairement au phényle <strong>et</strong> aux autres métaux utilisés (Ru, Re, Mn) est<br />
indispensable pour l’activité antitumorale. Cependant, il est clair que le métal ne joue pas un<br />
rôle important dans l’activité antibiotique mais plutôt la substitution qui la conditionne.<br />
Toutefois, le produit diaminé P490 confirme que la présence <strong>de</strong> Phényle ou <strong>de</strong> ferrocène est<br />
indispensable pour l’activité antibiotique <strong>et</strong> antifongique.<br />
( )3 )3<br />
( )3 )3<br />
( )3 )3<br />
( )3 )3
Une accumulation <strong>de</strong> faits n’est pas plus<br />
une science qu’un tas <strong>de</strong> pierres n’est une<br />
maison.<br />
Henri Poincaré
P23<br />
P15<br />
OH<br />
Fe<br />
P38<br />
P2 P5<br />
( )3 )3<br />
AcO OAc<br />
OAc<br />
AcO<br />
O<br />
O<br />
P28<br />
Annexe 1<br />
P17<br />
Fe<br />
P41<br />
Annexes<br />
U.P.M.C./U.S. A 1<br />
2010<br />
P29<br />
0H<br />
O<br />
P14<br />
AcO OAc<br />
OAc<br />
AcO<br />
O<br />
O<br />
O<br />
OAc<br />
OAc<br />
OAc<br />
Fe<br />
( )4 )4<br />
HOOC NH COOH<br />
2<br />
Citrate P17<br />
OAc<br />
P42<br />
H O<br />
0H<br />
COO-<br />
P35<br />
HO OH<br />
OH<br />
HO<br />
O<br />
O
Fe<br />
P44<br />
HO<br />
HO OH<br />
O<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
OH<br />
OH<br />
P47 P66<br />
P67 P78 P79<br />
P80 P85 P88 P89<br />
P90 P92 P93<br />
P116<br />
( )3 )3<br />
Annexes<br />
U.P.M.C./U.S. A 2<br />
2010<br />
( )3 )3
( )3 )3<br />
P117 P239<br />
P274 P277<br />
P239 P246<br />
Annexes<br />
U.P.M.C./U.S. A 3<br />
2010<br />
Fe<br />
P283<br />
P290 P303 P305<br />
Fe<br />
P314<br />
H<br />
N<br />
O<br />
P315 P316<br />
P317 P318 P331<br />
O<br />
( )3 )3 NMe 2<br />
O<br />
( )3 )3<br />
( )3 )3<br />
( )3 )3 NMe 2
P346<br />
P490<br />
( )3 )3<br />
( )3 )3<br />
P512<br />
( )3 )3<br />
( )3 )3<br />
P492<br />
P371 P423<br />
( )3 )3<br />
( )3 )3<br />
P493<br />
P501 P514<br />
Annexes<br />
U.P.M.C./U.S. A 4<br />
2010<br />
( )3 )3<br />
( )3 )3<br />
( )3 )3
2+<br />
-<br />
Sulphate <strong>de</strong> cuivre<br />
P582<br />
ZEKCN<br />
OHTAM<br />
CN<br />
OH O OH O<br />
OH<br />
CH 3<br />
H H<br />
OH N<br />
H H3C 3C CH 3<br />
Doxycycline<br />
Annexes<br />
U.P.M.C./U.S. A 5<br />
2010<br />
O<br />
OH<br />
( )3 )3<br />
DP6<br />
NH 2<br />
ZEKBr<br />
Br<br />
Aci<strong>de</strong> Tannique
Annexe 2<br />
Annexe 2.1 : Milieu MG<br />
Composition g/l<br />
D-mannitol………………………….5<br />
Aci<strong>de</strong> glutamique…………………...2<br />
KH2 PO4…………………………..0.5<br />
Na Cl……………………………...0.2<br />
Mg SO4 7H2O…………………….0.5<br />
Agar……………………………….18<br />
pH : 7.2<br />
Annexe 2.2 : Milieu <strong>de</strong> Christensen<br />
Composition g/l<br />
Peptone trypsique……………………1<br />
D(+)-glucose………………………...1<br />
Chlorure <strong>de</strong> sodium………………….5<br />
Phosphate monopotassique………….2<br />
Rouge <strong>de</strong> phénol………………..0.012<br />
Agar………………………………..12<br />
pH : 7.4<br />
Annexe 2.3 : Milieu PEs<br />
Composition g/l<br />
Peptone…………………………….10<br />
Citrate <strong>de</strong> fer ammoniacale………….1<br />
Esculine……………………………...1<br />
Gélose……………………………...20<br />
pH : 7.4<br />
Annexe 2.4 : Réactif <strong>de</strong> Bénédicte<br />
Solution A<br />
Citrate <strong>de</strong> sodium…………..173g<br />
Carbonate <strong>de</strong> sodium………100g<br />
H2O distillée……………...850ml<br />
Dissoudre dans 600ml par chauffage puis compléter à 850ml.<br />
Solution B<br />
Cu SO4………………………18g<br />
H2O distillée……………..150ml<br />
Dissoudre dans 100ml puis compléter à 150ml.<br />
Ajouter lentement la solution B à la solution A<br />
Annexes<br />
U.P.M.C./U.S. A 6<br />
2010
Composé<br />
Macro<br />
MS<br />
Macro<br />
OM<br />
Annexe 2.5 : Composition du milieu MT<br />
Micro<br />
OM<br />
Vit<br />
OM<br />
Gly Glu Myo Sacc Agar Chélateur<br />
<strong>de</strong> Fer<br />
Annexes<br />
MgSO4<br />
Quantité 50 ml 50 ml 10 ml 1 ml 2 ml 10 ml 10 ml 30 g 8 g 10 ml 12,5 ml<br />
Avec : Vit : Vitamine ; Gly : Glycine ; Glu : Glutamine ; Myo : Myoinositol ; Sacc : Saccharose<br />
NH 4 NO 3<br />
KNO 3<br />
Annexe 2.6 : Composition <strong>de</strong>s différents constituants (mg/l)<br />
Ca Cl 2, 2H 2O<br />
Mg SO 4, 7H 2O<br />
KH 2PO 4<br />
Ca(NO 3)4H 2O<br />
KCl<br />
Macro éléments<br />
Chélateur <strong>de</strong> fer<br />
Fe SO 4, 7H 2O<br />
Na 2 – EDTA<br />
Microéléments<br />
H 3 BO 3<br />
Mn SO 4, 4 H 2 O<br />
Zn SO 4, 7 H 2O<br />
KI<br />
Na 2 Mo O 4, 2H 2 O<br />
Cu S O 4, 5 H 2 O<br />
Co Cl 2, 6H 2O<br />
Vitamines <strong>et</strong> autres<br />
Glutamine<br />
Glycine<br />
Inositol<br />
Thiamine<br />
Pyridoxine<br />
Aci<strong>de</strong> nicotinique<br />
Aci<strong>de</strong> Ascorbique<br />
Biotine<br />
Aci<strong>de</strong> folique<br />
U.P.M.C./U.S. A 7<br />
2010<br />
MS<br />
(Murashige <strong>et</strong> Skoog)<br />
1650.000<br />
1900.000<br />
440.000<br />
370.000<br />
170.000<br />
-<br />
-<br />
27.850<br />
37.250<br />
6,200<br />
22,300<br />
8,600<br />
0,830<br />
0,250<br />
0,025<br />
0,025<br />
200,000<br />
2,000<br />
100,000<br />
0,100<br />
0,500<br />
0,500<br />
0,000<br />
0,000<br />
0,000<br />
OM (Olive Medium)<br />
412.000<br />
1100.000<br />
440.000<br />
1500.00<br />
340.000<br />
600.000<br />
500.000<br />
27.800<br />
37.500<br />
12,400<br />
22,300<br />
14,300<br />
0,830<br />
0,250<br />
0,250<br />
0,025<br />
0,000<br />
2,000<br />
100,000<br />
0,500<br />
0,500<br />
5,000<br />
0,000<br />
0,050<br />
0,500
Niveau<br />
Adhesion /mobilité cellulaire<br />
Transduction du signal<br />
Regulation transcriptionelle<br />
Transport<br />
Annexe 3<br />
Annexes<br />
Tableau 3.1 : Liste <strong>de</strong>s protéines végétales homologues aux protéines impliquées dans le<br />
Nom du gène<br />
humain<br />
Fonction du gène<br />
humain<br />
cancer <strong>de</strong> sein humain i<strong>de</strong>ntifiées par blastp<br />
N°accession <strong>de</strong> la<br />
proteine humaine<br />
N°accession <strong>de</strong> la<br />
proteine<br />
homologue<br />
U.P.M.C./U.S. A 8<br />
2010<br />
Espèce<br />
Fonction <strong>de</strong> la<br />
proteine<br />
homologue<br />
FLNB Filamin NP_001157789 BAB62628 Riz hypoth<strong>et</strong>ical protein<br />
MYH1 Myosin AAH22376 XP_002307152 Peuplier predicted protein<br />
SPTAN1 Spectrin CAH71405 XP_002310148 Peuplier predicted protein<br />
DBN1 Drebrin NP_004386 XP_001781130 Mousse predicted protein 0.054<br />
TECTA Tectorin NP_005413 XP_002328137 Peuplier protein kinase<br />
E value<br />
1,00<br />
E-06<br />
3,00<br />
E-152<br />
2,00<br />
E-09<br />
Pourcentage<br />
d'i<strong>de</strong>ntité<br />
Longueur <strong>de</strong><br />
proteine homologue<br />
37% 990<br />
36% 1173<br />
32% 163<br />
31% 2302<br />
7.7 31% 560<br />
VEPH1 PH domain AAH42159 NP_001152339 Maïs pleckstrin 0.004 32% 152<br />
SBNO1 Monocyte protein AAH30544 XP_002518826 Ricin hypoth<strong>et</strong>ical protein 4,00E-138 52% 1281<br />
DNASE1L3 Deoxyribonuclease AAH15831 NP_187074 Arab<strong>et</strong>te transferase 0.62 28% 977<br />
RAP1GA1 RAP1 GTPase activating protein NP_001139129 P80471<br />
Pomme <strong>de</strong><br />
terre<br />
EGFL6 EGF-like NP_001161362 CAB42872 Arab<strong>et</strong>te Kinase 2<br />
TP53 DNA binding supressor ACD01221 AAT42177 Maïs putative tumor protein<br />
FLJ13479 DNA binding NP_001166141 XP_002327353 Peuplier hypoth<strong>et</strong>ical protein<br />
SIX4 Homeobox BAA86223 ACF79236 Maïs unknown<br />
KIAA0934 DIP2 homolog C NP_055789 CAN60761 Vigne hypoth<strong>et</strong>ical protein<br />
chloroplastic 2.3 31% 326<br />
3,00<br />
E-07<br />
4,00<br />
E-14<br />
4,00<br />
E-14<br />
8,00<br />
E-05<br />
3,00<br />
E-33<br />
43% 732<br />
94% 224<br />
28% 335<br />
37% 359<br />
25% 631<br />
LRRFIP1 Interection LRR AAH19335 XP_002444282 Sorgo Hypoth<strong>et</strong>ical protein 0.048 24% 741<br />
GLI1 DNA binding NP_001153517 XP_001760438 Mousse predicted protein<br />
6,00<br />
E-17<br />
32% 185<br />
ATP8B1 ATPase NP_005594 NP_189425 Arab<strong>et</strong>te ATPase activity 0.0 39% 1174<br />
CUBN obalamin receptory NP_001072 EEE61664 Riz hypoth<strong>et</strong>ical protein<br />
GRIN2D Glutamate receptor NP_000827 AAD47833 Arab<strong>et</strong>te<br />
HDLBP Lipoprotein binding NP_005327 AAU90323<br />
Pomme <strong>de</strong><br />
terre<br />
ligand-gated channellike<br />
1,00<br />
E-05<br />
5,00<br />
E-23<br />
30% 646<br />
22% 941<br />
KH domain 0.005 21% 533
Métabolisme cellulaire<br />
Trafic intracellulaire<br />
Métabolisme ARN<br />
Autres<br />
Inconnu<br />
Annexes<br />
NUP214 Nucleoporin NP_005076 XP_002283769 Vigne hypoth<strong>et</strong>ical protein 6,00 E -10 23% 1713<br />
ACADM<br />
Acyl-Coenzyme A<br />
<strong>de</strong>hydrogenase<br />
NP_000007 ACF84257 Maïs unknown<br />
PRPS1 Pyrophosphate synth<strong>et</strong>ase NP_002755 NP_001140669 Maïs hypoth<strong>et</strong>ical protein<br />
CYP1A1 Cytochrome P450 NP_000490 AAD52195<br />
Pomme <strong>de</strong><br />
terre<br />
Cytochrome P450<br />
ASL Argininosuccinate lyase NP_000039 XP_002283809 Vigne hypoth<strong>et</strong>ical protein<br />
GALNT5<br />
Ac<strong>et</strong>ylgalactosaminyltransferase<br />
5<br />
NP_055383 XP_002536504 Ricin hypoth<strong>et</strong>ical protein<br />
OTOF Otoferlin NP_004793 XP_002461108 Sorgo C2-domain<br />
LRBA Wesicle trafficking NP_006717 BAD45539 Riz LvsC-like<br />
PLEKHA8 Phosphoinositi<strong>de</strong> binding NP_116028 XP_002302032 Peuplier predicted protein<br />
U.P.M.C./U.S. A 9<br />
2010<br />
6,00<br />
E-63<br />
5,00<br />
E-77<br />
8,00<br />
E-87<br />
3,00<br />
E-103<br />
6,00<br />
E-05<br />
1,00<br />
E-08<br />
2,00<br />
E-151<br />
3,00<br />
E-12<br />
37% 407<br />
45% 399<br />
76% 195<br />
42% 525<br />
25% 531<br />
33% 562<br />
36% 1476<br />
44% 201<br />
AEGP Endosomal glycoprotein NP_996803 CBI19051 Vigne 0.81 34% 376<br />
SORL1 Sortilin-related NP_003096 XP_001773392 Mousse predicted protein 0.030 24% 1289<br />
KIAA0427 NP_001135869 XP_001764043 Mousse predicted protein<br />
DDX10 Box polypepti<strong>de</strong> 10 NP_004389 XP_002522952 Ricin<br />
SP110 Nuclear body protein NP_004500 XP_002523656 Ricin<br />
<strong>de</strong>ad box ATP<strong>de</strong>pen<strong>de</strong>nt<br />
chromodomain<br />
helicase<br />
BRCA1 Breast cancer NP_009225 ACF35259 Arab<strong>et</strong>te BREAST CANCER<br />
MRE11A Meiotic recombination NP_005581 CAJ15653 Blé endo/exonuclease<br />
FLJ40869 Endonuclease NP_001123481 ABG73449 Riz<br />
KIAA0999 Serine/Threonine protein kinases NP_079440 BAA36298 Riz<br />
serine/threonine<br />
protein kinase<br />
7,00<br />
E-08<br />
2,00<br />
E-155<br />
1,00<br />
E-07<br />
3,00<br />
E-16<br />
6,00<br />
E-117<br />
1,00<br />
E-55<br />
6,00<br />
E-78<br />
28% 815<br />
57% 753<br />
43% 2257<br />
26% 674<br />
40% 699<br />
28% 629<br />
43% 505<br />
KIAA1632 Hypoth<strong>et</strong>ical protein NP_066015 XP_002308738 Peuplier predicted protein 1.3 20% 1440<br />
MGC24047 Uncharacterized protein NP_849162<br />
CBI29575 Vigne 3.7 27% 1053<br />
CAN65248 Vigne hypoth<strong>et</strong>ical protein 6.2 39% 1384
Annexes<br />
Tableau 3.2 : Liste <strong>de</strong>s protéines végétales homologues aux protéines impliquées dans le<br />
Nom du gène<br />
humain<br />
Fonction du<br />
gène humain<br />
cancer gastrique humain i<strong>de</strong>ntifiées par blastp<br />
N°accession<br />
<strong>de</strong> la protéine<br />
humaine<br />
Longueur <strong>de</strong><br />
la protéine<br />
humaine<br />
KLF6 krueppel-like NP_001291 283 Aa<br />
CASP10 caspase 10 NP_001221 479 Aa<br />
MUTYH DNA glycosylase NP_036354 546 Aa<br />
N°accession<br />
<strong>de</strong> la protéine<br />
homologue<br />
U.P.M.C./U.S. A 10<br />
2010<br />
Espése<br />
Fonction <strong>de</strong> la<br />
protéine<br />
homologue<br />
XP_002529014 Ricin nucleic acid binding protein<br />
E value<br />
8,00<br />
E-11<br />
Pourcentage<br />
d'i<strong>de</strong>ntité<br />
Longueur <strong>de</strong><br />
la protéine<br />
homologue<br />
42% 372 aa<br />
XP_002465852 Sorgo hypoth<strong>et</strong>ical protein 2,00 E -10 31% 557 aa<br />
CAL64380 Pêche putative neutral invertase 0.059 35% 418 aa<br />
XP_002330026 Peuplier predicted protein 0.32 35% 507 aa<br />
XP_002265027 Vigne hypoth<strong>et</strong>ical protein 1 E -83 41% 506 aa<br />
CAN71629 Vigne hypoth<strong>et</strong>ical protein 2 E -82 39% 1031 aa<br />
Tableau 3.3 : Liste <strong>de</strong>s domaines conservés <strong>de</strong>s protéines homologues recherchées par CDD<br />
Nom du gène<br />
humain<br />
Fonction du<br />
gène humain<br />
N°accession<br />
<strong>de</strong> la<br />
protéine<br />
homologue<br />
FLNB filamin BAB62628<br />
MYH1 Myosin<br />
SPTAN1 Spectrin<br />
DBN1 drebrin<br />
VEPH1 PH domain<br />
SBNO1 Monocyte protein<br />
XP_002307<br />
152<br />
XP_002310<br />
148<br />
XP_002280<br />
049<br />
XP_002299<br />
816<br />
XP_002518<br />
826<br />
E value<br />
1,00<br />
E-06<br />
3,00<br />
E-152<br />
2,00<br />
E-09<br />
0.96<br />
0.003<br />
0.0<br />
dans le cancer du sein<br />
Fonction <strong>de</strong><br />
la protéine<br />
homologue<br />
Hypoth<strong>et</strong>ical<br />
protein<br />
Predicted<br />
protein<br />
Predicted<br />
protein<br />
Predicted<br />
protein<br />
Predicted<br />
protein<br />
Hypoth<strong>et</strong>ical<br />
protein<br />
Longueur<br />
protéine<br />
homologue<br />
990<br />
Aa<br />
1173<br />
Aa<br />
163<br />
Aa<br />
1019<br />
Aa<br />
144<br />
Aa<br />
1281<br />
Aa<br />
Position du<br />
domaine<br />
Nom du<br />
domaine<br />
Fonction du<br />
domaine<br />
106..183 Filamin Filamin<br />
372..437 RRM RNA recognition motif<br />
168..847 MYSc_type_VIII Myosin<br />
21..157 TZ00184 calmodulin<br />
23..85 EFh EF-hand<br />
95..157 EFh EF-hand<br />
501..663 DEXDc DEAD-like helicases<br />
625..721 HELICc Helicase<br />
660..797 SrmB RNA helicases<br />
29..120 PH (PH) domain<br />
E value CDD<br />
6,00<br />
E<br />
-11<br />
2,00<br />
E<br />
-12<br />
1.0<br />
e<br />
-180<br />
3,00<br />
E<br />
-23<br />
2,00<br />
E<br />
-10<br />
3,00<br />
E<br />
-10<br />
5,00<br />
E -49<br />
1,00<br />
E<br />
-15<br />
6,00<br />
E<br />
-20<br />
5,00<br />
E -14<br />
274..424 DEXDc DEAD-like helicases 0.005<br />
686..734 PHD PHD-finger<br />
4,00<br />
E -06<br />
830..887 DEXDc DEAD-like helicases 0.007
DNASE1<br />
L3<br />
RAP1G<br />
A1<br />
<strong>de</strong>oxyribonuclease CBI29351 5.2 Hypoth<strong>et</strong>ical<br />
protein<br />
RAP1 GTPase activating<br />
protein<br />
XP_002318<br />
047<br />
EGFL6 EGF like EEC83832<br />
FLJ1347<br />
9<br />
DNA binding ACR37588<br />
SIX4 Homeobox ACF79236<br />
KIAA09<br />
34<br />
LRRFIP<br />
1<br />
DIP2 homolog C CAN60761<br />
lnterction LRR<br />
GLI1 zinc finger<br />
ATP8B1 ATPase<br />
XP_002444<br />
282<br />
XP_001760<br />
438<br />
XP_002444<br />
267<br />
CUBN cobalamin receptory EEE61664<br />
GRIN2D glutamate receptor EAZ02474<br />
3.1<br />
2,00<br />
E-05<br />
2,00<br />
E-14<br />
8,00<br />
E-05<br />
3,00<br />
E-33<br />
0.048<br />
6,00<br />
E-17<br />
0.0<br />
1,00E-<br />
05<br />
1,00<br />
E-21<br />
HDLBP Lipoprotein binding CAN67284 0.011<br />
ACADM<br />
acyl-Coenzyme A<br />
<strong>de</strong>hydrogenase,<br />
ACF84257<br />
6,00<br />
E-63<br />
Predicted<br />
protein<br />
Hypoth<strong>et</strong>ical<br />
protein<br />
Unknown<br />
unknown<br />
Hypoth<strong>et</strong>ical<br />
protein<br />
Hypoth<strong>et</strong>ical<br />
protein<br />
predicted<br />
protein<br />
hypoth<strong>et</strong>ical<br />
protein<br />
hypoth<strong>et</strong>ical<br />
protein<br />
hypoth<strong>et</strong>ical<br />
protein<br />
hypoth<strong>et</strong>ical<br />
protein<br />
unknown<br />
1..84 Cu-oxidase oxidase<br />
206..319 Cu-oxidase oxidase<br />
338..491 Cu-oxidase oxidase<br />
Annexes<br />
U.P.M.C./U.S. A 11<br />
2010<br />
761<br />
Aa<br />
481<br />
Aa<br />
716<br />
Aa<br />
349<br />
Aa<br />
359<br />
Aa<br />
631<br />
Aa<br />
741<br />
Aa<br />
185<br />
Aa<br />
1161<br />
Aa<br />
646<br />
Aa<br />
951<br />
Aa<br />
332<br />
Aa<br />
407<br />
Aa<br />
600..726 Cu-oxidase oxidase<br />
29..101 Pex14_N Peroxisomal membrane<br />
223..256 EGF_CA EGF-like<br />
266..>2<br />
97<br />
EGF_CA EGF-like<br />
391..651 TyrKc Tyrosine kinase,<br />
393..656 PKc_like Protein Kinases<br />
96..243 COG5048 Zn-finger<br />
102..146 KNOX1 KNOX1 domain<br />
153..204 KNOX2 KNOX2 domain<br />
274..326 homeodomain DNA binding domains<br />
45..487 AMP-binding AMP-binding enzyme<br />
208..491 LuxE Acyl-protein synth<strong>et</strong>ase<br />
409..582 PRK05857 acyl-CoA synth<strong>et</strong>ase<br />
157..550 Smc ATPases<br />
26..104 COG5048 Zn-finger<br />
91..185 SFP1<br />
Putative transcriptional<br />
repressor regulating<br />
G2/M transition<br />
70..1155 ATPase-Plipid ATPase<br />
166..400 E1-E2_ATPase E1-E2 ATPase<br />
848..904 HAD_like<br />
50..145 PA<br />
33..427<br />
PBP1_GABAb_re<br />
ceptor<br />
Haloacid <strong>de</strong>halogenaselike<br />
Protease-associated (PA)<br />
domain<br />
Ligand-binding domain<br />
50..408 ANF_receptor ligand binding region<br />
471..574 PBPb<br />
periplasmic binding<br />
proteins<br />
591..840 Lig_chan Ligand-gated ion channel<br />
687..809 PBPb<br />
periplasmic binding<br />
proteins<br />
98..163 KH-I RNA-binding domain<br />
29..406 CaiA<br />
29..405 IVD<br />
Acyl-CoA<br />
<strong>de</strong>hydrogenases<br />
Isovaleryl-CoA<br />
<strong>de</strong>hydrogenase<br />
1,00<br />
E<br />
-31<br />
4,00<br />
E<br />
-30<br />
1,00<br />
E<br />
-24<br />
1,00<br />
E<br />
-17<br />
7,00<br />
E -16<br />
9,00<br />
E<br />
-06<br />
2,00<br />
E<br />
-04<br />
3,00<br />
E<br />
-43<br />
4,00<br />
E<br />
-40<br />
4,00<br />
E<br />
-07<br />
1,00<br />
E<br />
-16<br />
3,00<br />
E<br />
-18<br />
3,00<br />
E<br />
-08<br />
1,00<br />
E<br />
-57<br />
5,00<br />
E<br />
-06<br />
8,00<br />
E<br />
-04<br />
6,00<br />
E -11<br />
2,00<br />
E -04<br />
2,00<br />
E -04<br />
1.0<br />
e<br />
-180<br />
5,00<br />
E<br />
-04<br />
0.005<br />
9,00<br />
E -22<br />
6,00<br />
E -103<br />
2,00<br />
E -65<br />
2,00<br />
E -26<br />
5,00<br />
E -56<br />
0.002<br />
9,00<br />
E -12<br />
1.0<br />
e -180<br />
1.0<br />
e -180
PRPS1<br />
Pyrophosphate<br />
synth<strong>et</strong>ase 1<br />
NP_001140<br />
669<br />
ASL argininosuccinate lyase XP_002283<br />
809<br />
GALNT<br />
5<br />
Ac<strong>et</strong>ylgalactosaminyltra<br />
nsferase 5<br />
XP_002536<br />
504<br />
OTOF Otoferlin EEE68441<br />
LRBA vesicle trafficking<br />
PLEKH<br />
A8<br />
Phosphoinositi<strong>de</strong> binding<br />
XP_002283<br />
760<br />
XP_002302<br />
032<br />
AEGP Endosomal glycoprotein XP_002284<br />
416<br />
SORL1 Sortilin-related receptor<br />
KIAA04<br />
27<br />
DDX10 Box polypepti<strong>de</strong> 10<br />
SP110 nuclear body protein<br />
XP_001773<br />
392<br />
XP_001764<br />
043<br />
XP_001754<br />
484<br />
XP_002439<br />
084<br />
BRCA1 breast cancer AAD10669<br />
MRE11<br />
A<br />
Meiotic recombination<br />
XP_002447<br />
179<br />
5,00<br />
E-77<br />
3,00<br />
E-103<br />
6,00<br />
E-05<br />
1,00<br />
E-08<br />
1,00<br />
E-147<br />
3,00<br />
E-12<br />
1.0<br />
0.030<br />
7,00<br />
E-08<br />
2,00<br />
E-154<br />
2,00<br />
E-07<br />
1,00<br />
E-15<br />
1,00<br />
E-116<br />
hypoth<strong>et</strong>ical<br />
protein<br />
hypoth<strong>et</strong>ical<br />
protein<br />
hypoth<strong>et</strong>ical<br />
protein<br />
hypoth<strong>et</strong>ical<br />
protein<br />
hypoth<strong>et</strong>ical<br />
protein<br />
predicted<br />
protein<br />
predicted<br />
protein<br />
predicted<br />
protein<br />
predicted<br />
protein<br />
predicted<br />
protein<br />
hypoth<strong>et</strong>ical<br />
protein<br />
Hypoth<strong>et</strong>ical<br />
protein<br />
hypoth<strong>et</strong>ical<br />
protein<br />
75..388 PRK02812<br />
ribose-phosphate<br />
pyrophosphokinase<br />
Annexes<br />
U.P.M.C./U.S. A 12<br />
2010<br />
399<br />
Aa<br />
525<br />
Aa<br />
531<br />
Aa<br />
584<br />
Aa<br />
3203<br />
Aa<br />
201<br />
Aa<br />
1049<br />
Aa<br />
1289<br />
Aa<br />
815<br />
Aa<br />
704<br />
Aa<br />
880<br />
Aa<br />
727<br />
Aa<br />
704<br />
Aa<br />
83..388 Pribosyltran<br />
Phosphoribosyl<br />
transferase domain<br />
61..518 PRK00855 argininosuccinate lyase<br />
84..517<br />
Argininosuccinate<br />
_lyase<br />
Argininosuccinate lyase<br />
59..268 GT_2_like_c Glycosyltransferase<br />
71..573 COG5038<br />
Ca2+-<strong>de</strong>pen<strong>de</strong>nt lipidbinding<br />
protein<br />
285..388 C2 Protein kinase<br />
1041..12<br />
38<br />
2453..25<br />
00<br />
2544..28<br />
19<br />
2851..29<br />
91<br />
1,00<br />
E -165<br />
6,00<br />
E -176<br />
1.0<br />
e -180<br />
7,00<br />
E -170<br />
2,00<br />
E -37<br />
6,00<br />
E -32<br />
8,00<br />
E -20<br />
LamG Laminin G domain 0.006<br />
PH-like<br />
Beach<br />
WD40<br />
21..160 GLTP<br />
Pleckstrin homology-like<br />
domain<br />
Beige and Chediak-<br />
Higashi domains<br />
adaptor/regulatory<br />
modules in signal<br />
transduction<br />
Glycolipid transfer<br />
protein<br />
99..172 Transgly Transglycosylase<br />
220..329 B_lectin<br />
399..492 S_locus_glycop<br />
Bulb-type mannosespecific<br />
lectin<br />
S-locus glycoprotein<br />
family<br />
3,00<br />
E -04<br />
1,00<br />
E -126<br />
3,00<br />
E -17<br />
5,00<br />
E -43<br />
2,00<br />
E -12<br />
6,00<br />
E -15<br />
4,00<br />
E-04<br />
546..593 PAN_APPLE PAN/APPLE-like domain 0.002<br />
696..887 S_TKc<br />
Serine/Threonine protein<br />
kinases<br />
252..336 FN3 Fibronectin<br />
365..467 FN3 Fibronectin<br />
232..456 MIF4G MIF4G domain<br />
642..750 MA3 MA3 domain<br />
59..264 DEADc DEAD-box helicases<br />
72..265 DEXDc helicases<br />
277..408 HELICc Helicase<br />
522..564 PHD PHD-finger<br />
384..445 COG5141<br />
505..578 BRCT<br />
PHD zinc fingercontaining<br />
protein<br />
Breast Cancer Suppressor<br />
Protein<br />
15..409 Mre11 DNA repair protein<br />
17..261 PP2Ac Protein phosphatase<br />
2,00<br />
E-45<br />
4,00<br />
E-12<br />
2,00<br />
E-11<br />
6,00<br />
E-41<br />
4,00<br />
E-18<br />
1,00<br />
E-62<br />
1,00<br />
E-39<br />
7,00<br />
E-19<br />
1,00<br />
E-07<br />
3,00<br />
E-04<br />
1,00<br />
E-06<br />
4,00<br />
E-120<br />
2,00<br />
E-48
FLJ4086<br />
9<br />
KIAA16<br />
32<br />
MGC240<br />
47<br />
Endonuclease EAZ09797<br />
hypoth<strong>et</strong>ical protein<br />
XP_002308<br />
738<br />
2,00<br />
E-54<br />
1.3<br />
uncharactezed protein CAN65248 6.2<br />
Hypoth<strong>et</strong>ical<br />
protein<br />
Predicted<br />
protein<br />
Hypoth<strong>et</strong>ical<br />
protein<br />
262..460 Mre11_DNA_bind Mre11 DNA-binding<br />
446..508 PTZ00258 GTP-binding protein<br />
Annexes<br />
U.P.M.C./U.S. A 13<br />
2010<br />
630<br />
Aa<br />
1440<br />
Aa<br />
1384<br />
Aa<br />
1..252 XPG<br />
249..495 WD40<br />
1057..12<br />
60<br />
nucleoti<strong>de</strong>-excision repair<br />
and transcription-coupled<br />
repair of oxidative DNA<br />
damage<br />
adaptor/regulatory<br />
modules in signal<br />
transduction<br />
1,00<br />
E-67<br />
1,00<br />
E-41<br />
3,00<br />
E-09<br />
COG4913 unknown 0.008<br />
234..349 RT_LTR Reverse transcriptases<br />
708..914 RT_nLTR_like<br />
1213..12<br />
53<br />
1255..13<br />
15<br />
Non-LTR r<strong>et</strong>rotransposon<br />
and non-LTR r<strong>et</strong>rovirus<br />
revers<strong>et</strong>ranscriptase<br />
RVT_2 Reverse transcriptase<br />
RVT_2<br />
RNA-<strong>de</strong>pen<strong>de</strong>nt<br />
DNApolymerase<br />
Tableau 3.4 : Liste <strong>de</strong>s domaines conservés <strong>de</strong>s protéines homologues recherchés par CDD<br />
Nom du gène<br />
humain<br />
Fonction du<br />
gène humain<br />
N°accession<br />
De la<br />
protéine<br />
homologue<br />
APC DNA binding XP_002327055<br />
IRF1<br />
interferon<br />
regulatory<br />
CBI17756<br />
KLF6 Krueppel-like XP_002465852<br />
CASP10 Caspase 10 XP_002330026<br />
MUTYH<br />
DNA<br />
glycosylase<br />
XP_002265027<br />
Fonction <strong>de</strong><br />
la protéine<br />
homologue<br />
hypoth<strong>et</strong>ical<br />
protein<br />
unnamed<br />
protein product<br />
hypoth<strong>et</strong>ical<br />
protein<br />
predicted<br />
protein<br />
hypoth<strong>et</strong>ical<br />
protein<br />
dans le cancer gastrique<br />
E value<br />
Longueur<br />
protéine<br />
homologue<br />
0.008 918Aa<br />
2.0 1100Aa<br />
Position du<br />
domaine<br />
Nom du<br />
domaine<br />
Fonction du<br />
domaine<br />
2,00<br />
E-27<br />
1,00<br />
E-18<br />
4,00<br />
E-17<br />
1,00 E -<br />
12<br />
E value CDD<br />
43..80 F-box F-box domain 2,00 E -04<br />
422..519 ARM<br />
598..713 ARM<br />
680..754 ARM<br />
119..263 P-loop NTPase<br />
Armadillo/b<strong>et</strong>a-<br />
catenin-like repeats<br />
Armadillo/b<strong>et</strong>a-<br />
catenin-like repeats<br />
Armadillo/b<strong>et</strong>a-<br />
catenin-like repeats<br />
Nucleosi<strong>de</strong><br />
Triphosphate<br />
Hydrolases<br />
2,00 E -07<br />
2,00 E -04<br />
0.003<br />
1,00 E -29<br />
377..487 COG4886 LRR protein 2,00 E -08<br />
2,00E-10 557Aa 474..552 COG5048 Zn-finger 0.003<br />
0.32 507Aa 10..486 Bac_rhamnosid<br />
Bacterial alpha-L-<br />
rhamnosidase<br />
1.0 e -180<br />
1 E -83 506Aa 85..484 MutY DNA glycosylase 5,00E-85
Nom du gène<br />
humain<br />
Fonction du<br />
gène humain<br />
EGFL6<br />
FLJ13479<br />
GLI1<br />
SPTAN1<br />
Annexes<br />
129..285 ENDO3c endonuclease III 3,00E-33<br />
354..482 DNA_Glycosylase_C DNA glycosylase 3,00E-15<br />
Tableau 3.5 : Liste <strong>de</strong>s protéines homologues chez le peuplier <strong>et</strong> la vigne i<strong>de</strong>ntifiées par<br />
EGF like<br />
DNA binding<br />
DNA binding<br />
Spectrin<br />
N°accession<br />
NP_001161362<br />
NP_001166141<br />
NP_001153517<br />
CAH71405<br />
N°accession <strong>de</strong><br />
la protéine<br />
homologue<br />
EEC83832<br />
XP_00176043<br />
8<br />
XP_00176043<br />
8<br />
XP_00231014<br />
8<br />
N°accession <strong>de</strong><br />
la protéine_h<br />
XP_00230484<br />
1<br />
XP_00228288<br />
7<br />
ABK96475<br />
CBI29733<br />
ABK96475<br />
CBI29733<br />
XP_00231478<br />
6<br />
blastp dans le cancer du sein<br />
Espéce<br />
Peuplier<br />
Vigne<br />
Peuplier<br />
Vigne<br />
Peuplier<br />
Vigne<br />
Peuplier<br />
XP_00228522<br />
3 Vigne<br />
E value<br />
Longueur <strong>de</strong> la<br />
protéine_h<br />
U.P.M.C./U.S. A 14<br />
2010<br />
Fonction <strong>de</strong> la<br />
protéine_h<br />
4 E -108 729 Aa predicted<br />
protein<br />
8 E -117 736 Aa<br />
4,00E-<br />
64<br />
4,00E-<br />
67<br />
4,00E-<br />
64<br />
4,00E-<br />
67<br />
1,00E-<br />
28<br />
1,00E-<br />
45<br />
hypoth<strong>et</strong>ica<br />
l protein<br />
isoform 3<br />
Position du<br />
domaine<br />
Nom du<br />
domaine<br />
166..273 WAK<br />
285..>31<br />
2<br />
Fonction du<br />
domaine<br />
Wall-associated<br />
kinase<br />
E value CDD<br />
1,00 E -08<br />
EGF_CA EGF-like 0.001<br />
393..662 S_TKc protein kinases 1,00 E -46<br />
397..666 TyrKc Tyrosine kinase 9,00 E -47<br />
282..316 EGF_CA EGF-like 2,00 E -08<br />
407..690 S_TKc<br />
412..690 Pkinase<br />
Serine/Threonine<br />
protein kinases<br />
Protein kinase<br />
domain<br />
7,00 E -45<br />
3,00 E -45<br />
375 Aa unknown 81..199 COG5048 FOG: Zn-finger 0.001<br />
371 Aa<br />
unnamed<br />
protein<br />
product<br />
113..250 COG5048 FOG: Zn-finger 5,00 E -05<br />
375 Aa unknown 81..199 COG5048 FOG: Zn-finger 0.001<br />
371<br />
Aa<br />
149<br />
Aa<br />
182<br />
Aa<br />
unnamed<br />
protein<br />
product<br />
predicted<br />
protein<br />
hypoth<strong>et</strong>ica<br />
l protein<br />
113..250 COG5048 FOG: Zn-finger 0.001<br />
1..63 EFh<br />
EF-hand, calcium<br />
binding motif<br />
1.23 e -11<br />
7..149 PTZ00184 calmodulin 4.89 e -29<br />
1..63 EFh<br />
EF-hand, calcium<br />
binding motif<br />
1.23 e -10
ACADM<br />
CYP1A1<br />
KIAA0999<br />
acyl-Coenzyme A <strong>de</strong>hydrogenase<br />
cytochrome P450<br />
Serine/Threonine protein kinases<br />
NP_00000<br />
7<br />
NP_00049<br />
0<br />
NP_07944<br />
0<br />
ACF84257<br />
AAD52195<br />
BAA36298<br />
EEF12457<br />
CBI22806<br />
XP_00231400<br />
4<br />
CBI15433<br />
Peuplier<br />
Vigne<br />
Peuplier<br />
Vigne<br />
XP_00230605<br />
3 Peuplier<br />
XP_00228399<br />
9 Vigne<br />
h : Homologue chez le peuplier <strong>et</strong> la vigne<br />
1,00E-<br />
37<br />
8,00E-<br />
37<br />
3,00E-<br />
12<br />
1,00E-<br />
15<br />
0.0<br />
0.0<br />
Annexes<br />
12..148 PTZ00184 calmodulin 5.05 e -14<br />
U.P.M.C./U.S. A 15<br />
2010<br />
316<br />
Aa<br />
446<br />
Aa<br />
509<br />
Aa<br />
541<br />
Aa<br />
515<br />
Aa<br />
508<br />
Aa<br />
predicted<br />
protein<br />
hypoth<strong>et</strong>ica<br />
l protein<br />
flavonoid<br />
3',5'hydroxylas<br />
e<br />
hypoth<strong>et</strong>ica<br />
l protein<br />
predicted<br />
protein<br />
hypoth<strong>et</strong>ica<br />
l protein<br />
1..294 ACAD<br />
1..386 ACAD<br />
Both mitochondrial<br />
acyl-CoA<br />
<strong>de</strong>hydrogenases<br />
Both mitochondrial<br />
acyl-CoA<br />
<strong>de</strong>hydrogenases<br />
1.77 e -63<br />
3.46 e -<br />
169<br />
7..437 PLN02526 acyl-CoA oxidase 0,00 E +00<br />
1..452 P450 Cytochrome P450<br />
1..508 PLN00110<br />
flavonoid 3',5'hydroxylase<br />
(F3'5'H)<br />
5.33 e -<br />
108<br />
0,00 E +00<br />
50..419 p450 Cytochrome P450 4.89 e -67<br />
1..250<br />
STKc_AG<br />
C<br />
1..37 UBA<br />
1..30 KA1<br />
1..244 S_TKc<br />
1..250<br />
STKc_AG<br />
C<br />
1..37 UBA<br />
1..30 KA1<br />
1..244 S_TKc<br />
1..37 UBA<br />
1..30 KA1<br />
1..244 S_TKc<br />
Serine/Threonine<br />
Kinases (STKs),<br />
AGC (Protein<br />
Kinases A, G and<br />
C)<br />
Ubiquitin<br />
Associated<br />
domain.<br />
Kinase associated<br />
domain 1.<br />
Phosphotransferase<br />
s<br />
Serine/Threonine<br />
Kinases (STKs),<br />
AGC (Protein<br />
Kinases A, G and<br />
C)<br />
Ubiquitin<br />
Associated<br />
domain.<br />
Kinase associated<br />
domain 1.<br />
Phosphotransferase<br />
s<br />
Ubiquitin<br />
Associated<br />
domain.<br />
Kinase associated<br />
domain 1.<br />
Phosphotransferase<br />
s<br />
8.49 e -69<br />
6.94 e -05<br />
9.59 e -05<br />
1.17 e -89<br />
2.71 e -67<br />
1.54 e -04<br />
2.06 e -04<br />
1.51 e -88<br />
1.52 e -04<br />
2.17 e -04<br />
1.45 e -88
Annexes<br />
Tableau 3.6 : Liste <strong>de</strong>s protéines homologues chez le peuplier <strong>et</strong> la vigne i<strong>de</strong>ntifiées par<br />
Nom du gène<br />
humain<br />
Fonction du<br />
gène humain<br />
KLF6<br />
MUTYH<br />
krueppel-like<br />
DNA glycosylase<br />
N°accession<br />
NP_001291<br />
NP_036354<br />
N°accession<br />
<strong>de</strong> la protéine<br />
homologue<br />
XP_002328766<br />
XP_002321221<br />
N°accession<br />
<strong>de</strong> la<br />
protéine_h<br />
XP_002328766<br />
blastp dans le cancer gastrique<br />
Fonction <strong>de</strong> la<br />
protéine _h<br />
predicted<br />
protein<br />
Espéce<br />
Peuplier<br />
XP_002265428 hypoth<strong>et</strong>ical<br />
protein Vigne<br />
XP_002321221<br />
predicted<br />
protein<br />
XP_002265027 hypoth<strong>et</strong>ical<br />
protein<br />
h : Homologue chez le peuplier <strong>et</strong> la vigne<br />
Peuplier<br />
Vigne<br />
E value<br />
0.0<br />
2,00E-<br />
153<br />
0.0<br />
9,00E-<br />
158<br />
U.P.M.C./U.S. A 16<br />
2010<br />
Longueur <strong>de</strong><br />
la protéine_h<br />
378<br />
Aa<br />
Position du<br />
domaine<br />
Nom du<br />
domaine<br />
Fonction du<br />
domaine<br />
E value CDD<br />
82..200 COG5048 Zn-finger 2,00 E -04<br />
173..259 SFP1<br />
Putative<br />
transcriptional<br />
repressor regulating<br />
G2/M transition<br />
0.009<br />
77..194 COG5048 Zn-finger 5,00E-05<br />
372<br />
Aa 168..254 SFP1<br />
480<br />
Aa<br />
506<br />
Aa<br />
Putative<br />
transcriptional<br />
repressor regulating<br />
G2/M transition<br />
0.002<br />
40..445 MutY DNA glycosylase 1,00E-78<br />
91..247 ENDO3c endonuclease III 2,00E-33<br />
85..484 MutY DNA glycosylase 5,00E-85<br />
129..285 ENDO3c endonuclease III 3,00E-33<br />
354..482 DNA_Glycosylase_C DNA glycosylase 3,00E-15
Espèce<br />
Peuplier<br />
Vigne<br />
Peuplier<br />
Vigne<br />
Espèce<br />
Peuplier<br />
Vigne<br />
Tableau 3.7 : Alignement <strong>de</strong>ux à <strong>de</strong>ux entre séquences <strong>de</strong> peuplier <strong>et</strong> <strong>de</strong> vigne<br />
N°accession<br />
<strong>de</strong> la<br />
proteine<br />
homolgue<br />
EEC83832 (homologue <strong>de</strong> EGFL6)<br />
XP_002310148<br />
(homologue <strong>de</strong> SPTAN1 humain)<br />
N°accession<br />
<strong>de</strong> la<br />
proteine<br />
homolgue<br />
XP_002328766 (homologue <strong>de</strong> KLF6)<br />
N°accession<br />
<strong>de</strong> la<br />
proteine <strong>de</strong><br />
départ<br />
XP_002304841<br />
XP_002282887<br />
XP_002314786<br />
XP_002285223<br />
N°accession<br />
<strong>de</strong> la<br />
proteine <strong>de</strong><br />
départ<br />
Cancer <strong>de</strong> sein<br />
N°accession<br />
<strong>de</strong> la 2émé<br />
proteine<br />
Annexes<br />
U.P.M.C./U.S. A 17<br />
2010<br />
Score<br />
XP_002309699 550 bits<br />
XP_002309698 530 bits<br />
XP_002328208 612 bits<br />
Expect<br />
1,00<br />
E-160<br />
1,00<br />
E-154<br />
2,00<br />
E-179<br />
Pourcentage<br />
d'i<strong>de</strong>ntité<br />
Pourcentage<br />
<strong>de</strong>s positives<br />
316/699 (45%) 432/699 (61%)<br />
311/709 (43%) 428/709 (60%)<br />
365/704 (51%) 449/704 (63%)<br />
XP_002304840 748 bits 0.0 415/698 (59%) 498/698 (71%)<br />
XP_002282869 1442 bits 0.0 710/725 (97%) 713/725 (98%)<br />
XP_002284688 917 bits 0.0 459/755 (60%) 571/755 (75%)<br />
XP_002284700 838 bits 0.0 436/752 (57%) 560/752 (74%)<br />
XP_002265582 666 bits 0.0 334/681 (49%) 455/681 (66%)<br />
XP_002312460 276 bits<br />
XP_002305867 132 bits<br />
XP_002317881 128 bits<br />
CAN70198 366 bits<br />
XP_002274476 119 bits<br />
XP_002282075 126 bits<br />
Cancer gastrique<br />
N°accession<br />
<strong>de</strong> la 2émé<br />
proteine<br />
Score<br />
8,00<br />
E-80<br />
3,00<br />
E-36<br />
3,00<br />
E-35<br />
1,00<br />
E-106<br />
2,00<br />
E-32<br />
2,00<br />
E-34<br />
Expect<br />
136/149 (91%) 141/149 (94%)<br />
70/147 (47%) 98/147 (66%)<br />
64/137 (46%) 91/137 (66%)<br />
180/182 (98%) 182/182 (100%)<br />
66/142 (46%) 90/142 (63%)<br />
61/145 (42%) 95/145 (65%)<br />
Pourcentage<br />
d'i<strong>de</strong>ntité<br />
Pourcentage<br />
<strong>de</strong>s positives<br />
XP_002328766 ABK96475 645 bits 0.0 330/367 (89%) 342/367 (93%)<br />
XP_002265428 CBI29733 669 bits 0.0 357/358 (99%) 357/358 (99%)<br />
Pourcentage<br />
<strong>de</strong>s lacunes<br />
68/699<br />
(9%)<br />
83/709<br />
(11%)<br />
43/704<br />
(6%)<br />
47/698<br />
(6%)<br />
3/725<br />
(0%)<br />
25/755<br />
(3%)<br />
26/752<br />
(3%)<br />
26/681<br />
(3%)<br />
0/149<br />
(0%)<br />
11/147<br />
(7%)<br />
1/137<br />
(0%)<br />
0/182<br />
(0%)<br />
7/142<br />
(4%)<br />
0/145<br />
(0%)<br />
Pourcentage<br />
<strong>de</strong>s lacunes<br />
3/36<br />
7<br />
(0%)<br />
1/358<br />
(0%)
Espèce<br />
Peuplier_Vigne<br />
Peuplier_Vigne<br />
Espèce<br />
Peuplier_Vigne<br />
Tableau 3.8 : Alignement <strong>de</strong>ux à <strong>de</strong>ux entre peuplier <strong>et</strong> vigne<br />
N°accession<br />
<strong>de</strong> la<br />
proteine<br />
homolgue<br />
EEC83832<br />
(homologue <strong>de</strong> EGFL6)<br />
XP_002310148<br />
(homologue <strong>de</strong> SPTAN1 humain<br />
N°accession<br />
<strong>de</strong> la<br />
proteine<br />
homolgue<br />
XP_002328766 (homologue <strong>de</strong> KLF6)<br />
N°accession<br />
<strong>de</strong> la<br />
proteine <strong>de</strong><br />
départ chez<br />
le peuplier<br />
XP_002304841<br />
XP_002314786<br />
N°accession<br />
<strong>de</strong> la<br />
proteine <strong>de</strong><br />
départ chez<br />
le peuplier<br />
XP_002328766<br />
ABK96475<br />
Cancer <strong>de</strong> sein<br />
N°accession<br />
<strong>de</strong> la 2émé<br />
proteine<br />
chez la vigne<br />
Annexes<br />
U.P.M.C./U.S. A 18<br />
2010<br />
Score<br />
Expect<br />
Pourcentage<br />
d'i<strong>de</strong>ntité<br />
Pourcentage<br />
<strong>de</strong>s positives<br />
Pourcentage<br />
<strong>de</strong>s lacunes<br />
XP_002282887 529 bits 3,00E-154 309/699 (44%) 422/699 (60%) 54/699 (7%)<br />
XP_002282869 527 bits 7,00E-154 310/702 (44%) 425/702 (60%) 57/702 (8%)<br />
XP_002284688 561 bits 4,00E-164 324/716 (45%) 436/716 (60%) 55/716 (7%)<br />
XP_002284700 542 bits 2,00E-158 320/706 (45%) 435/706 (61%) 51/706 (7%)<br />
XP_002265582 534 bits 8,00E-156 315/701 (44%) 428/701 (61%) 57/701 (8%)<br />
CBI32420 122 bits 4,00E-33 61/139 (43%) 92/139 (66%) 6/139 (4%)<br />
XP_002285223 122 bits 3,00E-33 61/139 (43%) 92/139 (66%) 6/139 (4%)<br />
CAN70198 122 bits 3,00E-33 61/139 (43%) 92/139 (66%) 6/139 (4%)<br />
XP_002274476 145 bits 2,00E-40 71/137 (51%) 97/137 (70%) 1/137 (0%)<br />
XP_002282075 136 bits 2,00E-37 70/140 (50%) 96/140 (68%) 3/140 (2%)<br />
Cancer gastrique<br />
N°accession<br />
<strong>de</strong> la 2émé<br />
proteine<br />
chez la vigne<br />
Score<br />
Expect<br />
Pourcentage<br />
d'i<strong>de</strong>ntité<br />
Pourcentage<br />
<strong>de</strong>s positives<br />
Pourcentage<br />
<strong>de</strong>s lacunes<br />
XP_002265428 542 bits 5,00E-159 284/365 (77%) 314/365 (86%) 7/365 (1%)<br />
CBI29733 536 bits 4,00E-157 283/365 (77%) 314/365 (86%) 8/365 (2%)<br />
XP_002265428 543 bits 3,00E-159 282/362 (77%) 309/362 (85%) 4/362 (1%)<br />
CBI29733 537 bits 2,00E-157 281/362 (77%) 309/362 (85%) 5/362 (1%)
On ne connaît pas complètement une<br />
science tant qu’on n’en sait pas<br />
l’histoire.<br />
Auguste Comte
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