何弘能、錢宗良主編教育部顧問室 - 台大醫學院 - 國立臺灣大學

教 育 部 「 轉 譯 醫 學 及 農 學 人 才 培 育 先 導 型 計 畫 」幹 細 胞 生 物 學Stem Cell Biology幹 細 胞 及 再 生 醫 學 教 學 資 源 中 心 主 編教 育 部 顧 問 室 補 助中 華 民 國 一 〇 一 年 十 二 月 出 版

再 版 序本 教 材 承 蒙 教 育 部 顧 問 室 持 續 重 視 與 鼓 勵 與 在 前 期 「 生 物 及 醫 學 科 技 人 才 培 育 先 導 型 計畫 」 吳 金 洌 總 主 持 人 之 規 劃 與 指 導 及 本 期 「 轉 譯 醫 學 及 農 學 人 才 培 育 先 導 型 計 畫 辦 公 室 」 李德 章 總 主 持 人 之 支 持 與 授 權 下 , 配 合 國 內 幹 細 胞 學 界 之 專 家 努 力 , 得 以 再 版 , 特 此 致 上 最 高感 謝 之 意 。本 書 第 一 章 由 臺 大 醫 學 院 何 弘 能 副 院 長 與 陳 信 孚 醫 師 負 責 撰 寫 , 介 紹 建 立 人 類 胚 胎 幹 細胞 之 技 術 , 為 臺 灣 本 土 人 類 胚 胎 幹 細 胞 研 究 奠 立 之 重 要 里 程 碑 。 第 二 章 胚 胎 幹 細 胞 的 鑑 定 ,則 是 由 中 研 院 細 胞 暨 個 體 生 物 研 究 所 郭 紘 志 博 士 以 其 豐 富 的 教 學 及 研 究 經 驗 負 責 撰 寫 。 第 三章 胚 幹 細 胞 體 外 培 養 與 定 向 誘 導 分 化 , 則 是 由 中 研 院 基 因 體 研 究 中 心 沈 家 寧 研 究 員 深 入 淺 出地 介 紹 , 並 引 用 了 最 新 諾 貝 爾 獎 得 主 日 本 京 都 大 學 山 中 伸 彌 教 授 之 研 究 , 讓 本 書 能 夠 提 供 幹細 胞 研 究 最 新 進 展 。 第 四 章 成 體 幹 細 胞 分 離 培 養 擴 增 及 體 外 分 化 , 則 由 在 成 體 幹 細 胞 領 域 研究 成 果 豐 碩 之 陽 明 大 學 李 光 申 教 授 領 導 的 團 隊 來 撰 寫 精 闢 之 內 容 。 第 五 章 奈 米 科 技 暨 幹 細 胞生 物 學 之 運 用 , 則 由 成 功 大 學 謝 清 河 教 授 介 紹 具 有 前 瞻 性 的 生 醫 奈 米 科 技 及 關 於 幹 細 胞 研 究之 可 能 運 用 。 第 六 章 複 製 動 物 技 術 在 幹 細 胞 相 關 研 究 之 運 用 , 則 邀 請 到 臺 灣 “ 複 製 動 物 之父 ” 鄭 登 貴 教 授 及 其 得 意 門 生 吳 信 志 博 士 共 同 撰 寫 , 介 紹 幹 細 胞 研 究 與 複 製 動 物 之 淵 源 。 第七 章 組 織 工 程 在 幹 細 胞 研 究 之 運 用 , 則 由 台 灣 大 學 徐 善 慧 教 授 負 責 撰 寫 , 介 紹 由 跨 領 域 之 化工 人 才 專 精 組 織 工 程 如 何 應 用 到 幹 細 胞 之 研 究 。 第 八 章 幹 細 胞 的 保 存 與 復 甦 , 則 由 食 品 工 業發 展 研 究 所 黃 效 民 副 主 任 撰 寫 , 提 供 關 於 幹 細 胞 保 存 之 關 鍵 技 術 。 第 九 章 幹 細 胞 在 臨 床 之 應用 , 則 由 中 山 醫 學 大 學 李 茂 盛 教 授 撰 寫 , 李 教 授 為 國 內 不 孕 症 權 威 , 針 對 幹 細 胞 之 臨 床 運 用提 供 全 面 性 的 介 紹 。 第 十 章 幹 細 胞 治 療 研 究 與 臨 床 試 驗 , 則 是 由 台 中 榮 民 總 醫 院 陳 甫 州 主 任與 工 研 院 陳 婉 昕 博 士 共 同 撰 寫 , 對 於 幹 細 胞 潛 在 之 臨 床 治 療 及 相 關 法 律 規 範 均 有 詳 細 介 紹 。最 後 第 十 一 章 幹 細 胞 之 生 技 產 業 運 用 , 則 是 由 工 研 院 陳 婉 昕 博 士 參 考 國 內 外 目 前 的 生 技 產業 , 為 幹 細 胞 研 究 之 市 場 發 展 做 全 面 性 介 紹 。本 書 之 章 節 安 排 需 再 次 感 謝 鄭 登 貴 教 授 在 前 期 計 畫 之 縝 密 規 劃 。 而 約 稿 撰 寫 協 調 工 作 則由 中 研 院 游 特 聘 研 究 員 正 博 之 大 力 協 助 , 始 得 完 成 。 期 望 本 書 之 再 版 , 不 僅 可 提 供 參 與 計 畫

之 各 夥 伴 學 校 授 課 內 容 之 參 考 教 材 , 更 可 為 臺 灣 生 物 醫 學 研 究 提 供 經 過 系 統 整 理 的 幹 細 胞 科技 新 知 。「 轉 譯 醫 學 及 農 學 人 才 培 育 先 導 型 計 畫 」 幹 細 胞 及 教 學 資 源 中 心 主 持 人國 立 臺 灣 大 學 醫 學 院 婦 產 科 教 授國 立 臺 灣 大 學 醫 學 院 解 剖 學 暨 細 胞 生 物 學 研 究 所 教 授中 華 民 國 101 年 11 月 28 日

教 育 部 顧 問 室 「 生 物 及 醫 學 科 技 人 才 培 育 先 導 型 計 畫 」幹 細 胞 學作 者 王 僅 文 、 李 茂 盛 、 李 光 申 、 吳 信 志 、 何 弘 能 、 何 慧 君 、何 嘉 倫 、 沈 家 寧 、 林 宇 星 、 邱 智 東 、 徐 善 慧 、 郭 紘 志 、許 素 菁 、 莊 靜 玉 、 張 為 芳 、 張 曉 旻 、 陳 甫 州 、 陳 信 孚 、陳 志 龍 、 陳 淑 華 、 陳 婉 昕 、 黃 效 民 、 鄭 登 貴 、 謝 清 河 、簡 皎 芸( 依 姓 氏 筆 劃 為 序 )總 編 輯助 理 編 輯何 弘 能 、 錢 宗 良侯 珮 珊 、 甘 偉 君 、 陳 佳 徽 、 李 政 耘 、 楊 喻 惠 、 林 煒 哲幹 細 胞 及 再 生 醫 學 教 學 資 源 中 心 主 編教 育 部 顧 問 室 補 助 出 版中 華 民 國 一 O 一 年 十 二 月 再 版

目錄頁 碼第 一 章第 二 章人 類 胚 胎 幹 細 胞 之 建 立 陳 信 孚 、 何 弘 能The Establishment of Human Embryonic Stem Cells………………….. 1胚 胎 幹 細 胞 的 鑑 定 郭 紘 志 、 陳 淑 華 、 張 為 芳 、 莊 靜 玉Characterization of Embryonic Stem Cells……………………………….. 17第 三 章 胚 幹 細 胞 體 外 培 養 與 定 向 誘 導 分 化 沈 家 寧 、 林 宇 星 、 張 曉 旻 、 陳 志 龍 、簡 皎 芸Cultivation and Differentiation of Embryonic Stem Cells……………… 27第 四 章第 五 章第 六 章第 七 章第 八 章第 九 章第 十 章第 十 一 章成 體 幹 細 胞 分 離 培 養 擴 增 及 體 外 分 化 李 光 申 、 許 素 菁 、 何 慧 君Isolation, Expansion, and Differentiation of Adult Stem Cells…………. 47奈 米 科 技 於 幹 細 胞 生 物 學 之 應 用 何 嘉 倫 、 王 僅 文 、 邱 智 東 、 謝 清 河The Application of Nanotechnology on Stem Cell Biology…………….. 63複 製 動 物 技 術 在 幹 細 胞 相 關 研 究 之 應 用 吳 信 志 、 鄭 登 貴Application of Animal Cloning Technologies in Studies Related toStem Cells……………………………………………………………….... 75組 織 工 程 在 幹 細 胞 研 究 之 運 用 徐 善 慧Tissue Engineering Technique in Stem Cell Research………………… 85幹 細 胞 的 保 存 與 復 甦 黃 效 民Cryopreservation and Re-cultivation of Stem Cells…………………….. 97幹 細 胞 在 臨 床 之 應 用 李 茂 盛Clinical Application of Stem Cells…………………………………………… 103幹 細 胞 治 療 研 究 與 臨 床 試 驗 陳 甫 州 、 陳 婉 昕Clinical Trials and Advance Research for Stem Cell Therapies……… 117幹 細 胞 之 生 技 產 業 運 用 陳 婉 昕Commercialization of stem cell technology………………………………. 129作 者 簡 歷 ……………………………………………………………………………………. 143索 引 ……………………………………………………………………………………. 149

第 一 章人 類 胚 胎 幹 細 胞 之 建 立The Establishment of Human Embryonic Stem Cells陳 信 孚 何 弘 能臺 灣 大 學 醫 學 院 附 設 醫 院 婦 產 部一 、 前 言胚 胎 幹 細 胞 (embryonic stem cells;ESC) 是 多 能 性 (pluripotent) 或 全 能 性 ( totipotent)的 細 胞 , 這 種 細 胞 具 有 自 我 更 新 與 無 限 擴 增 數 目 的 特 性 , 而 且 在 適 當 環 境 下 , 他 們 可 以 分 化成 體 內 所 有 三 個 胚 層 (embryonic germ layer) 的 細 胞 , 以 及 生 殖 細 胞 (germ cell)。 因 此 這種 細 胞 不 論 在 科 學 研 究 上 , 或 未 來 的 毒 物 學 、 藥 物 學 、 或 甚 至 臨 床 應 用 上 , 都 具 有 實 質 的 潛能 。 由 科 學 的 角 度 來 看 , 胚 胎 幹 細 胞 的 培 養 可 以 讓 人 類 進 一 步 瞭 解 各 種 細 胞 之 形 成 與 分 化 的機 轉 與 控 制 的 因 素 , 因 此 對 人 類 生 物 學 的 知 識 可 以 明 顯 增 進 。 另 外 , 胚 胎 幹 細 胞 也 可 以 用 來測 試 藥 物 或 毒 物 對 於 細 胞 分 化 為 特 定 細 胞 之 影 響 。 而 最 重 要 的 , 胚 胎 幹 細 胞 如 果 能 有 效 培 育為 特 定 細 胞 , 例 如 心 肌 細 胞 、 肝 臟 細 胞 、 胰 臟 細 胞 或 甚 至 卵 子 等 等 , 並 用 於 移 植 , 則 胚 胎 幹細 胞 在 細 胞 或 器 官 移 植 以 治 療 人 類 疾 病 上 , 將 具 有 無 限 的 使 用 潛 能 。小 鼠 的 胚 胎 幹 細 胞 早 在 1981 年 就 已 被 建 立 , 且 有 許 多 後 續 的 研 究 證 實 其 科 學 上 的 無 窮價 值 。 而 人 類 胚 胎 幹 細 胞 (hESC) 則 遲 至 1998 年 由 威 斯 康 辛 大 學 James Thomson 的 團 隊1首 度 建 立 。 至 今 全 世 界 已 有 許 多 人 類 胚 胎 幹 細 胞 株 建 立 成 功 與 完 整 的 定 性1-3 , 但 是 有 許 多理 由 使 得 建 立 新 的 細 胞 株 還 是 很 重 要 , 理 由 如 下 :[1] 例 如 要 由 國 外 購 買 細 胞 株 比 較 昂 貴 ;[2]而 且 每 一 個 細 胞 株 之 特 性 皆 有 部 分 差 異 ;[3] 此 外 , 尤 其 是 含 有 特 殊 疾 病 基 因 之 細 胞 株 , 以及 中 國 人 的 細 胞 株 , 皆 對 於 研 究 中 國 人 特 定 的 疾 病 有 其 一 定 的 價 值 , 因 此 我 們 認 為 建 立 自 己國 人 的 細 胞 株 相 當 重 要 ;[4] 還 有 目 前 全 世 界 現 有 之 細 胞 株 多 半 是 建 立 於 含 有 動 物 物 質 或 動物 餵 養 細 胞 之 培 養 環 境 , 因 此 在 我 們 自 己 的 實 驗 室 裡 把 一 個 獲 得 胚 胎 幹 細 胞 的 環 境 建 立 好 ,以 便 將 來 可 以 有 效 建 立 特 殊 的 細 胞 株 , 例 如 含 特 定 疾 病 之 細 胞 株 或 不 含 外 來 動 物 物 質(xeno-free) 之 細 胞 株 , 就 顯 的 特 別 重 要 。 這 個 章 節 , 我 們 將 簡 潔 的 描 述 如 何 建 立 人 類 胚 胎幹 細 胞 株 , 以 便 大 家 可 以 參 考 而 確 實 可 以 應 用 , 這 方 面 可 以 參 考 我 們 最 近 發 表 的 文 獻2 。二 、 實 驗 方 法胚 胎 幹 細 胞 的 建 立 需 符 合 主 管 機 關 有 關 胚 胎 幹 細 胞 研 究 之 倫 理 綱 領 , 並 得 到 機 構 之 人 體試 驗 委 員 會 同 意 , 然 後 在 不 孕 症 夫 婦 同 意 捐 贈 多 餘 胚 胎 且 簽 署 捐 贈 同 意 書 之 後 才 能 進 行 實1

驗 。 實 驗 的 進 行 , 首 先 要 把 冷 凍 胚 胎 先 解 凍 , 然 後 在 胚 胎 培 養 液 中 培 養 至 第 5 至 6 天 , 到 達囊 胚 期 胚 胎 (blastocyst) 的 階 段 ( 圖 一 )。 如 果 捐 出 的 胚 胎 是 新 鮮 的 胚 胎 , 則 直 接 培 養 至 囊胚 期 來 使 用 。 接 下 去 的 步 驟 則 進 入 實 質 分 離 人 類 胚 胎 幹 細 胞 的 階 段 。 人 類 胚 胎 幹 細 胞 是 由 囊胚 的 內 細 胞 團 (inner cell mass;ICM) 分 離 培 養 而 來 , 因 此 首 先 要 獲 得 內 細 胞 團 , 分 離 的 方法 如 下 :囊 胚blastocyst滋 養 層 細 胞trophoblast圖 一 、 囊 胚 的 型 態內 細 胞 團inner cell mass方 法 一 : 只 去 除 透 明 層 (zona pellucida) 的 方 法1. 準 備 四 孔 盤 一 個 、 蛋 白 酶 (protease)、 胚 胎 幹 細 胞 培養 液 (hES medium)、 餵 養 細 胞 , 與 含 餵 養 細 胞 之 培養 盤 (organ culture dish;OCD;Falcon), 皆 應 預 先準 備 好 放 在 培 養 箱 中 平 衡 。2. 將 新 鮮 或 解 凍 後 之 胚 胎 培 養 至 囊 胚 。 記 錄 其 型 態 、 胚 胎分 級 (scoring)( 表 一 ), 及 發 育 天 數 , 通 常 這 時 候 是精 卵 受 精 之 後 5 到 6 天 。3. 以 磷 酸 緩 衝 液 (PBS) 配 置 0.5% 的 蛋 白 酶 , 並 以 0.22μm 的 過 濾 膜 (filter) 過 濾 後 , 取 1 ml 置 於 四 孔 培 養 盤(4-well culture dish;NUNC) 的 第 一 孔 中 , 其 餘 三 孔proteasehESmedium4-well culture dishhESmediumhESmedium中 各 加 入 0.5 ml hES medium( 見 附 錄 三 ), 置 於 培 養 箱 中 平 衡 至 少 1 小 時 。4. 將 囊 胚 置 於 37℃、0.5% 的 蛋 白 酶 中 作 用 ( 四 孔 培 養 盤 的 第 一 孔 ), 在 顯 微 鏡 下 持 續 觀 察 ,待 透 明 層 被 酵 素 部 分 或 完 全 溶 解 後 ( 大 約 1 至 6 分 鐘 左 右 ), 以 hES medium 洗 滌 三 次 ( 培養 盤 第 二 ~ 四 孔 ), 然 後 立 刻 將 囊 胚 置 於 已 製 備 好 之 含 餵 養 細 胞 (MEF) 之 培 養 皿 (OCD)中 培 養 , 使 用 含 生 長 因 子 之 hES medium。5. 兩 天 後 觀 察 胚 胎 與 餵 養 細 胞 黏 著 程 度 , 然 後 就 可 以 更 換 培 養 液 (hES medium), 更 換 時動 作 要 慢 且 輕 柔 , 其 後 每 天 換 一 次 培 養 液 。6. 每 日 觀 察 囊 胚 是 否 持 續 附 著 於 餵 養 細 胞 且 開 始 增 殖 , 然 後 於 適 當 時 機 予 以 繼 代 ( 約 5 至12 天 後 )。 之 後 於 每 生 長 一 週 後 進 行 繼 代 培 養 , 觀 察 其 生 長 型 態 , 生 長 至 一 個 月 後 則 陸 續進 行 胚 胎 幹 細 胞 特 性 之 鑑 定 。2

表 一 、 人 類 囊 胚 分 級 表 ( 根 據 Gardner.Fertil Steril, 2000 修 改 而 來 )等 級敘 述1 囊 胚 已 膨 脹 , 內 細 胞 團 明 顯 , 囊 胚 腔 內 無 退 化 區 域2 囊 胚 已 膨 脹 , 內 細 胞 團 明 顯 , 可 見 退 化 區 域3 囊 胚 已 膨 脹 , 無 內 細 胞 團 , 不 明 顯 或 有 部 分 退 化位 於 囊 胚 內 的 內 細 胞 團 之 分 級 :A 內 細 胞 團 密 集 且 清 楚 , 無 暗 色 細 胞 ; 內 細 胞 團 呈 球 形B 與 A 類 似 , 但 有 少 量 的 暗 色 細 胞C 內 細 胞 團 明 顯 但 不 密 集 , 散 佈 於 滋 養 層 內 側 ; 內 細 胞 團 呈 扁 平 , 無 暗 色 細 胞D 與 C 類 似 , 但 有 暗 色 細 胞方 法 二 : 免 疫 手 術 法 (immunosurgery)實 驗 目 的 : 除 去 透 明 層 與 滋 養 層 細 胞 (trophoblast), 以 獲 得 純 化 之 內 細 胞 團準 備 : 四 孔 盤 三 個 、 蛋 白 酶 、anti-human serum、guinea pig complement、 胚 胎 幹 細 胞 培 養液 、 餵 養 細 胞 , 含 餵 養 細 胞 之 培 養 盤 , 皆 應 預 先 準 備 好 放 在 培 養 箱 中 平 衡 。A 將 囊 胚 之 透 明 層 去 除1. 取 一 個 四 孔 盤 , 配 置 10 units/ml 蛋 白 酶 , 取 80µl 放置 於 第 一 孔 中 並 覆 蓋 上 礦 物 油 , 其 餘 三 孔 中 各 注 入 0.5ml hES medium。2. 將 5~6 天 的 囊 胚 置 入 第 一 孔 中 作 用 1~2 分 鐘 , 觀 察 囊胚 透 明 層 至 即 將 完 全 溶 解 。3. 依 序 將 囊 胚 置 入 第 2~4 孔 中 洗 淨 殘 留 的 酵 素 , 於 第 4孔 中 靜 置 20 分 鐘 。A. 4-well culture dishproteasehESmediumhESmediumhESmediumB 使 用 抗 人 類 血 清 (anti-human serum;anti-HS)( 附 錄二 ) 來 結 合 滋 養 層 細 胞 的 表 面 抗 原1. 取 另 一 個 四 孔 盤 , 以 1:5 比 例 配 置 抗 人 類 血 清 與 hESmedium, 取 80µl 放 置 於 第 一 孔 中 並 覆 蓋 上 礦 物 油 ,其 餘 三 孔 中 各 注 入 0.5 ml hES medium。2. 將 去 除 透 明 層 的 囊 胚 置 入 第 一 孔 中 作 用 30 分 鐘 。3. 依 序 將 囊 胚 置 入 第 2~4 孔 中 洗 淨 殘 留 的 試 劑 。anti-HShESmediumB. 4-well culture dishhESmediumhESmediumC 加 入 補 體 (complement), 以 去 除 滋 養 層 細 胞3

1. 取 另 一 個 四 孔 盤 , 以 1:5 比 例 配 置 天 竺 鼠 補 體 (guineapig complement;GP) 與 hES medium, 取 80µl 置於 第 一 孔 中 並 覆 蓋 上 礦 物 油 , 其 餘 三 孔 中 同 樣 各 注 入0.5ml hES medium。2. 將 anti-human serum 作 用 後 的 囊 胚 置 入 第 一 孔 中 作用 30 分 鐘 , 觀 察 滋 養 層 細 胞 被 溶 解 。3. 依 序 將 取 得 之 內 細 胞 團 置 入 第 2~4 孔 中 洗 淨 殘 留 的 試劑 。GPC.4-well culture dishhESmediumhESmediumhESmediumD 將 處 理 完 成 的 內 細 胞 團 移 置 於 已 加 入 生 長 因 子 之 hES medium, 且 含 餵 養 細 胞 之 培 養 皿(OCD) 中 , 置 入 培 養 箱 中 培 養 ( 圖 二 )。免 疫 手 術A BC DICMFeeder圖 二 、 免 疫 手 術 的 過 程 。A. 第 六 天 的 囊 胚 ;B. 去 除 透 明 帶 的 囊 胚 ;C. 抗 人 類 血 清 處 理後 , 加 入 天 竺 鼠 補 體 作 用 中 的 囊 胚 ;D. 免 疫 手 術 完 成 後 放 到 餵 養 細 胞 上 的 內 細胞 團 。4

三 、 胚 胎 幹 細 胞 的 繼 代 培 養胚 胎 幹 細 胞 的 繼 代 培 養 可 分 兩 種 方 法 :A. 玻 璃 針 切 割 技 術 : 可 控 制 細 胞 群 落 (colony) 大 小 的 一 致 性 , 用 於 長 期 繼 代 。1. 準 備 一 支 巴 斯 特 玻 璃 滴 管 (Pasteur pipette), 以 酒 精燈 將 管 尖 燒 熱 , 待 微 熔 時 輕 拉 管 尖 , 將 形 成 之 頸 部 切斷 ( 圖 三 ), 利 用 切 斷 處 之 玻 璃 針 鋒 利 面 做 切 割 , 而 製PBS+成 玻 璃 切 割 針 。 另 外 亦 可 以 用 29~30G 胰 島 素 針 頭 替代 。2. 準 備 一 四 孔 盤 作 為 清 洗 使 用 , 加 入 磷 酸 鹽 緩 衝 液(PBS) 於 第 一 孔 , 其 餘 三 孔 分 別 注 入 hES medium,hESmedium放 入 培 養 箱 備 用 。3. 將 已 製 備 好 含 餵 養 細 胞 的 培 養 皿 (OCD) 之 培 養 液 更換 為 已 加 入 bFGF 之 hES medium, 放 入 培 養 箱 中 至少 一 小 時 備 用 。4-well culture dishhESmediumhESmedium1 2 3圖 三 、 玻 璃 針 的 製 作 方 法 。4. 使 用 hES medium 配 置 10 µg/ml 的 蛋 白 酶 (dispase) 溶 液 。步 驟 1. 當 胚 胎 幹 細 胞 群 落 生 長 至 大 約 5 至 7 天 , 群 落 大 小 直 徑 約 100 µm 左 右 就 可 以進 行 繼 代 。步 驟 2. 用 準 備 好 之 玻 璃 針 或 29~30G 針 頭 於 解 剖 顯 微 鏡 下 進 行 群 落 切 割 , 將 未 分 化 的部 分 切 割 下 來 。 切 割 方 式 一 般 分 為 輪 狀 切 法 及 井 字 切 法 ( 圖 四 ), 可 依 群 落 的 型態 作 選 擇 。步 驟 3. 切 割 完 畢 後 換 上 0.5 ml dispase 溶 液 , 置 於 培 養 箱 中 約 2~3 分 鐘 。步 驟 4. 取 出 培 養 皿 , 於 顯 微 鏡 下 觀 察 , 可 以 看 見 已 切 下 的 細 胞 群 落 由 周 邊 開 始 翻 起 ,並 逐 漸 與 餵 養 細 胞 脫 離 。步 驟 5. 用 吸 管 尖 (20~200 μl tip) 將 所 有 要 的 細 胞 片 吸 上 來 , 放 入 四 孔 盤 中 依 序 清 洗 。步 驟 6. 最 後 將 細 胞 片 依 序 放 入 準 備 好 含 新 鮮 餵 養 細 胞 的 培 養 皿 中 , 每 盤 培 養 皿 (OCD)5

約 放 置 7 至 9 片 為 宜 。步 驟 7. 兩 天 後 就 可 觀 察 細 胞 群 落 是 否 已 貼 附 完 全 , 並 更 換 培 養 液 。 更 換 時 要 慢 , 並 特別 小 心 減 少 干 擾 剛 附 著 的 幹 細 胞 群 落 , 之 後 每 一 天 要 換 一 次 加 有 bFGF 之 hESmedium。1 2 3圖 四 、 玻 璃 針 切 割 人 類 胚 胎 幹 細 胞 技 術 。1. 以 玻 璃 針 切 割 之 情 形 ;2. 井 字 切 法 ;3. 輪 狀 切 法 。B. 酵 素 方 法 : 此 方 法 適 用 快 速 大 量 繼 代 胚 胎 幹 細 胞 。1. 把 磷 酸 鹽 緩 衝 液 (PBS) 及 人 類 胚 胎 幹 細 胞 培 養 液 (hES medium) 預 先 回 溫 。2. 用 磷 酸 鹽 緩 衝 液 配 製 膠 原 蛋 白 酶 第 四 型 (collagenase IV)200 units/ml 備 用 。3. 將 製 備 好 已 含 有 餵 養 細 胞 之 35-mm 培 養 皿 的 培 養 液 更 換 為 已 加 入 bFGF 之 hESmedium, 並 放 入 培 養 箱 至 少 一 小 時 備 用 。步 驟 1. 使 用 磷 酸 鹽 緩 衝 液 把 已 培 養 7 天 含 人 類 胚 胎 幹 細 胞 的 培 養 皿 清 洗 兩 次 。步 驟 2. 把 已 製 備 之 膠 原 蛋 白 酶 第 四 型 0.5 ml 加 入 培 養 皿 中 , 然 後 置 於 培 養 箱 中 3~6分 鐘 。步 驟 3. 用 吸 管 尖 (20~200 μl tip) 將 略 為 剝 離 之 胚 胎 幹 細 胞 群 落 刮 起 , 放 到 已 含 有 6 mlhES medium 之 15 ml 離 心 管 中 。步 驟 4. 用 電 動 分 注 器 (Pipette Aid) 來 回 吸 放 5~10 次 使 細 胞 群 落 打 碎 成 原 來 大 小 的1/10~1/20。步 驟 5. 離 心 600×g 2 分 鐘 , 抽 掉 上 清 液 , 依 分 盤 數 之 需 要 , 加 入 一 定 量 已 含 bFGF 之hES medium 中 混 和 均 勻 。步 驟 6. 將 碎 成 小 片 的 細 胞 團 塊 懸 浮 液 放 入 含 新 鮮 餵 養 細 胞 的 35-mm 或 60-mm 培 養 皿中 。步 驟 7. 兩 天 後 就 可 觀 察 細 胞 是 否 已 貼 附 完 全 , 並 更 換 培 養 液 , 更 換 時 動 作 輕 柔 , 之 後每 一 天 換 一 次 含 bFGF 之 hES medium。* 註 : 若 是 繼 代 前 細 胞 團 塊 本 身 較 薄 , 即 可 省 略 酵 素 作 用 步 驟 , 直 接 用 電 動 分 注 器 來 回 吸 放 打散 細 胞 , 但 不 宜 將 細 胞 團 塊 打 的 太 碎 。6

1 2 3圖 五 、 人 類 胚 胎 幹 細 胞 經 玻 璃 針 切 割 後 , 繼 代 培 養 後 之 外 觀 。1. 繼 代 後 第 3 天 ;2. 繼 代 後 第5 天 ; 繼 代 後 第 7 天 。四 、 胚 胎 幹 細 胞 的 冷 凍採 玻 璃 化 (vitrification) 冷 凍 方 法 , 以 快 凍 為 原 則 。1. 製 備 冷 凍 液 , 配 置 好 的 冷 凍 液 可 於 4 ℃ 保 存 一 星 期 。名 稱 成 分 比 例DMEM media 78%A.ES-HEPES medium Fetal Bovine Serum (Hyclone) 20%1M HEPES 2%ES-HEPES 80%B.10%Vitrification solution Ethylene Glycol 10%DMSO 10%ES-HEPES 30%C.20%Vitrification solution1M Sucrose Solution 30%Ethylene Glycol 20%DMSO 20%2. 準 備 一 四 孔 盤 依 圖 示 注 入 冷 凍 液 A、B 與 C, 每 一 孔 至 少 0.5 ml, 另 外 用 C 冷 凍 液 分 別各 做 一 滴 20 µl 及 3 µl 冷 凍 液 珠 備 用 。3. 把 一 冷 凍 管 架 在 鋁 條 上 , 然 後 標 上 必 要 資 料 、 日 期 , 然 後 放 到 液 態 氮 內 , 此 時 整 個 管 子已 裝 滿 液 態 氮 。4. 依 玻 璃 針 切 割 法 先 備 好 胚 胎 幹 細 胞 片 於 清 洗 四 孔 盤中 。5. 接 著 使 用 吸 管 尖 把 胚 胎 幹 細 胞 片 移 至 冷 凍 盤 的 第 一個 孔 A 液 中 , 開 始 進 行 冷 凍 。6. 用 吸 管 尖 先 吸 一 點 B 液 , 然 後 把 胚 胎 幹 細 胞 片 由 A液 吸 起 放 到 B 孔 中 , 作 用 1 分 鐘 。7. 先 吸 一 點 C 液 , 然 後 從 B 孔 中 把 細 胞 片 吸 起 放 到 C孔 中 作 用 25 秒 。4-well culture dishA.o○ 20µl 3µlB.C.7

8. 接 著 把 胚 胎 幹 細 胞 片 由 C 孔 吸 到 20 µl 的 C 液 中 。9. 再 把 胚 胎 幹 細 胞 片 吸 到 3 µl 的 C 液 中 。10. 最 後 用 冷 凍 胚 胎 麥 管 (straw) 的 窄 端 用 虹 吸 原 理 把 胚 胎 幹 細 胞 片 吸 起 , 立 即 放 到 液 態氮 中 , 然 後 再 放 進 已 預 備 好 的 冷 凍 管 中 , 蓋 上 蓋 子 , 儲 存 於 液 態 氮 儲 存 桶 中 。* 註 :2~3 分 鐘 以 內 要 完 成 一 次 冷 凍 ; 一 次 最 多 可 冷 凍 8 片 胚 胎 幹 細 胞 片 。五 、 胚 胎 幹 細 胞 的 解 凍1. 製 備 解 凍 液 , 配 置 好 的 冷 凍 液 可 於 4 ℃ 保 存 一 星 期 。名 稱 成 分 比 例DMEM media 78%A.ES-HEPES medium Fetal Bovine Serum (Hyclone) 20%1M HEPEs 2%B.0.2M Sucrose mediumES-HEPES media 80%1M Sucrose Solution 20%C.0.1M Sucrose mediumES-HEPES 90%1M Sucrose Solution 10%2. 將 製 備 好 的 OCD( 內 含 餵 養 細 胞 ) 內 的 培 養 液 更 換 為 已 含 bFGF 之 hES medium, 並放 入 培 養 箱 中 平 衡 至 少 一 小 時 備 用 。3. 從 液 態 氮 儲 存 桶 中 取 出 冷 凍 胚 胎 麥 管 後 , 放 入 已 裝 滿 液態 氮 的 攜 帶 筒 中 。4. 利 用 鑷 子 把 冷 凍 胚 胎 麥 管 從 冷 凍 管 中 取 出 , 立 刻 放 在 第一 個 孔 中 (B. 0.2M sucrose solution), 如 擔 心 胚 胎 幹細 胞 片 會 卡 在 管 壁 上 , 則 插 入 套 在 注 射 筒 上 之 吸 管 尖(20~200 μl tip), 把 冷 凍 小 管 中 的 剩 餘 幹 細 胞 片 再 加以 排 出 , 計 時 1 分 鐘 。5. 接 著 將 胚 胎 幹 細 胞 片 移 入 第 二 個 孔 中 (C. 0.1Msucrose solution), 計 時 5 分 鐘 。4-well culture dishB.1minC.5minA.5minA.5min6. 再 將 胚 胎 幹 細 胞 片 依 序 移 入 第 三 及 第 四 孔 (A. ES-HEPES medium) 中 各 5 分 鐘 。7. 最 後 就 可 將 細 胞 片 置 入 含 新 鮮 餵 養 細 胞 並 使 用 hES medium( 含 bFGF) 之 培 養 皿 中 。8. 兩 天 後 觀 察 胚 胎 幹 細 胞 是 否 貼 附 完 全 , 並 更 換 培 養 液 , 之 後 每 天 更 換 培 養 液 。* 註 : 胚 胎 幹 細 胞 之 冷 凍 與 解 凍 , 也 可 以 使 用 類 似 一 般 大 量 細 胞 之 冷 凍 法 , 但 仍 須 以 細 胞 片(pieces of colonies), 而 非 單 獨 細 胞 (single cells) 方 式 冷 凍 , 以 提 高 存 活 率 。8

六 、 餵 養 細 胞 (Feeder cells)餵 養 細 胞 可 以 提 供 胚 胎 幹 細 胞 所 需 的 生 長 環 境 並 維 持 不 分 化 的 狀 態 。 一 般 常 用 的 餵 養 細胞 為 小 鼠 胚 胎 纖 維 母 細 胞 (mouse embryonic fibroblasts, MEF) 或 STO 纖 維 母 細 胞 株 ; 另外 , 考 慮 到 動 物 性 污 染 問 題 , 也 可 以 使 用 人 類 包 皮 纖 維 母 細 胞 (human foreskin fibroblast,HFF)( ATCC CRL-1635, Hs68) 或 其 他 來 源 的 細 胞 ( 例 如 human placental fibroblast) 等 ,作 為 餵 養 細 胞 。A. 小 鼠 胚 胎 纖 維 母 細 胞 之 建 立1. 選 用 5 至 6 周 大 的 母 鼠 與 公 鼠 交 配 後 , 將 成 功 配 種 後 出 現 陰 道 栓 的 母 鼠 分 籠 飼 養 。2. 配 種 後 第 13 日 的 懷 孕 母 鼠 經 頸 椎 脫 臼 法 犧 牲 後 , 解 剖 取 下 完 整 子 宮 置 於 磷 酸 緩 衝 溶 液(PBS) 中 。3. 於 解 剖 顯 微 鏡 下 剪 開 子 宮 並 取 出 胎 小 鼠 , 以 鑷 子 撕 開 羊 膜 與 胎 盤 , 再 逐 一 去 除 胎 小 鼠 的頭 、 尾 部 、 四 肢 與 內 部 臟 器 , 並 移 至 10 cm 含 PBS 的 培 養 皿 中 ( 圖 六 )。4. 將 胎 體 置 入 3 ml 注 射 針 筒 中 , 反 覆 通 過 18 號 注 射 針 直 到 胎 體 碎 成 細 胞 團 塊 。5. 將 細 胞 懸 浮 液 靜 置 10 分 鐘 。6. 吸 取 上 層 細 胞 懸 浮 液 加 入 含 餵 養 細 胞 培 養 液 (MEF medium)( 見 附 錄 三 ) 中 , 於 37 ℃培 養 箱 (5 % CO 2 ) 中 培 養 。 調 整 細 胞 數 為 培 養 皿 中 每 毫 升 約 有 10 5 個 細 胞 。7. 翌 日 將 未 能 貼 附 的 細 胞 及 組 織 殘 渣 移 除 , 更 換 新 的 培 養 液 , 並 檢 查 細 胞 貼 附 及 增 殖 情 形 ,待 2 至 3 日 細 胞 長 滿 培 養 皿 時 , 則 可 進 行 繼 代 培 養 。8. 繼 代 培 養 時 , 以 PBS(Ca 2+ /Mg 2+ -free) 清 洗 2 次 , 加 入 1ml 含 0.05% trypsin- EDTA 溶液 , 於 37℃ 培 養 箱 內 培 養 2 分 鐘 , 將 懸 浮 細 胞 打 散 , 再 加 入 MEF medium 中 止trypsin-EDTA 作 用 , 然 後 將 懸 浮 細 胞 以 1:3 進 行 分 盤 。9. 隨 後 每 2 天 更 換 一 次 培 養 液 , 於 細 胞 達 到 90 % 滿 盤 以 上 即 可 繼 代 分 盤 或 進 行 冷 凍 保 存 。實 驗 室 通 常 使 用 繼 代 數 為 5 至 6 代 者 供 胚 胎 幹 細 胞 培 養 。圖 六 、 於 含 PBS 的 培 養 皿 中 去 除 胎 小 鼠 的 頭 、 尾 部 、 四 肢 與 內 部 臟 器9

B. 餵 養 細 胞 的 冷 凍1. 配 製 冷 凍 液 (90% FBS:10% DMSO) 置 於 冷 凍 管 中 , 並 置 於 冰 桶 中 備 用 。2. 培 養 皿 中 加 入 PBS(Ca 2+ /Mg 2+ -free) 清 洗 2 次 , 加 入 1.5 ml 含 0.05% trypsin- EDTA 溶液 , 於 37℃ 培 養 箱 (5 % CO 2 ) 內 培 養 2 分 鐘 , 將 懸 浮 細 胞 打 散 , 再 加 入 MEF medium中 止 trypsin-EDTA 作 用 。3. 吸 取 懸 浮 細 胞 液 至 15 ml 離 心 管 中 , 利 用 血 球 計 數 器 (haemocytometer) 進 行 細 胞 計 數 。4. 於 1000 rpm 離 心 條 件 下 離 心 5 min, 吸 除 上 清 液 。5. 加 入 適 量 的 冷 凍 液 , 調 整 冷 凍 管 中 的 細 胞 數 為 1.5×10 6 細 胞 / 0.5 ml 冷 凍 液 , 置 入 冷 凍 管中 。6. 冷 凍 管 先 放 入 冷 凍 盒 (NALGENE ® Cryo 1℃ Freezing Container) 內 , 置 於 -80℃ 冷 凍 庫中 , 隔 天 再 移 至 液 態 氮 桶 中 長 期 保 存 。C. 餵 養 細 胞 的 解 凍1. 於 液 態 氮 桶 中 取 出 冷 凍 管 , 放 入 37℃ 水 浴 中 進 行 解 凍 至 剩 一 小 塊 冰 塊 。2. 將 冷 凍 管 液 體 移 至 已 加 入 MEF medium 的 15 ml 離 心 管 中 。3. 於 2000 rpm 離 心 條 件 下 離 心 5 min, 吸 除 上 清 液 。4. 加 入 新 的 MEF medium, 混 合 後 移 至 75-cm 2 flask(Falcon) 中 。5. 最 後 移 至 37℃ 培 養 箱 (5 % CO 2 ) 中 培 養 , 之 後 每 2 天 更 換 一 次 MEF medium, 待 細 胞達 到 90% 滿 盤 以 上 即 可 繼 代 。D. 餵 養 細 胞 之 製 備a. 培 養 皿 的 gelatin coating1. gelatin(Sigma) 溶 於 無 菌 水 中 使 其 濃 度 為 0.1%, 滅 菌 後 貯 存 於 -20℃ 冷 凍 庫 中 備 用 。2. 0.1% gelatin 於 室 溫 或 37℃ 回 溫 後 , 注 入 培 養 皿 底 部 , 置 於 37℃ 培 養 箱 中 20 分 鐘 。3. 將 培 養 皿 中 的 gelatin 移 除 , 再 移 至 37℃ 培 養 箱 中 備 用 。b. Mitomycin C 處 理1. 培 養 皿 中 細 胞 長 滿 時 , 將 培 養 液 更 換 為 含 mitomycin C(10 μg/ml) 的 MEF medium, 於37℃ 培 養 箱 培 養 2.5 至 3 小 時 。2. 以 PBS(Ca 2+ /Mg 2+ -free) 清 洗 2 次 , 再 加 入 0.05% trypsin-EDTA 於 37℃ 培 養 箱 內 培 養2 分 鐘 , 將 懸 浮 細 胞 打 散 , 再 額 外 加 入 10 ml 之 MEF medium 中 止 trypsin-EDTA 作 用 。3. 吸 取 懸 浮 細 胞 液 至 15 ml 離 心 管 中 , 於 1000 rpm 離 心 條 件 下 離 心 5 min, 吸 除 上 清 液 ,加 入 5 ml 的 MEF medium, 小 心 混 合 均 勻 。4. 利 用 血 球 計 數 器 進 行 細 胞 計 數 , 取 適 當 濃 度 的 細 胞 數 (1.75×10 5 cells/ ml) 置 於 經 0.1%gelatin 處 理 過 的 器 官 培 養 皿 (OCD) 或 35-mm culture dish 中 。5. 移 至 37℃ 培 養 箱 (5% CO 2 ) 中 進 行 培 養 , 待 細 胞 貼 附 於 培 養 皿 後 ( 約 6 小 時 以 上 ) 即可 作 為 餵 養 細 胞 。6. 培 養 胚 胎 幹 細 胞 前 , 培 養 皿 中 的 培 養 液 需 更 換 為 hES medium( 見 附 錄 三 ), 置 於 37℃ 培10

養 箱 中 至 少 平 衡 1 小 時 方 可 進 行 培 養 ( 圖 七 )。c. γ 射 線 處 理1. 除 了 使 用 Mitomycin C 的 方 法 之 外 , 也 可 以 使 用 γ 射 線 處 理 , 來 使 細 胞 停 止 分 裂 增 生 。 細胞 長 滿 培 養 皿 時 , 加 入 0.05% trypsin-EDTA 溶 液 , 於 37℃ 培 養 箱 內 培 養 2 分 鐘 , 將 懸 浮細 胞 打 散 , 再 額 外 加 入 10 ml 的 MEF medium 中 止 trypsin-EDTA 作 用 。2. 將 細 胞 移 至 Falcon Petri dish, 再 移 至 放 射 線 設 備 以 3000~8000 rad 的 γ 射 線 照 射 ( 條 件需 依 細 胞 濃 度 與 設 備 不 同 而 調 整 )。3. 再 將 γ 射 線 處 理 後 的 細 胞 移 至 培 養 盤 中 。4. 取 細 胞 懸 浮 液 進 行 細 胞 計 數 , 將 適 當 比 例 的 細 胞 數 (1.75×10 5 cells/ml) 置 於 經 0.1%gelatin 處 理 過 的 OCD 或 35-mm culture dish 中 。5. 移 至 37℃ 培 養 箱 (5% CO 2 ) 中 進 行 培 養 , 待 細 胞 貼 附 於 培 養 皿 後 ( 約 6 小 時 以 上 ) 即可 作 為 餵 養 細 胞 之 用 。6. 培 養 胚 胎 幹 細 胞 前 , 需 更 換 為 hES medium, 置 於 37℃ 培 養 箱 中 至 少 平 衡 1 小 時 以 上 方可 進 行 培 養 。E. Extracellar matrix( 細 胞 外 基 質 )plates 之 備 製a. Matrigel( 一 種 細 胞 外 基 質 ) 可 以 取 代 餵 養 細 胞 提 供 胚 胎 幹 細 胞 的 生 長 環 境 :1. Matrigel(Becton Dickinson) 置 於 4℃ 冰 中 隔 夜 解 凍 , 並 將 pipettes 置 於 -20℃ 冷 凍 庫 中預 冷 (Matrigel matrix 在 22~35℃ 下 易 急 速 凝 膠 , 所 以 在 操 作 時 須 維 持 低 溫 )。2. 操 作 當 天 , 過 程 皆 需 使 用 預 冷 的 pipettes 及 離 心 管 。3. 取 無 血 清 (serum-free) 的 DMEM 培 養 液 , 於 冰 中 稀 釋 Matrigel 至 所 需 濃 度 ( 通 常 使 用濃 度 為 5%)。4. 吸 取 Matrigel 覆 蓋 於 培 養 皿 底 部 , 室 溫 靜 置 1 小 時 後 , 吸 除 未 凝 膠 的 Matrigel, 再 以 無血 清 的 MEF medium 洗 滌 後 即 備 製 完 成 ( 可 存 於 4℃ 達 2 個 月 )。5. 以 Matrigel 培 養 胚 胎 幹 細 胞 時 須 每 天 更 換 條 件 化 培 養 液 (conditioned medium)。b. 條 件 化 培 養 液 之 備 製1. 於 含 mitomycin C 處 理 過 的 MEF(3×10 6 cells) 的 75-cm 2 flask 中 , 加 入 20 ml 新 鮮 的MEF medium。2. 移 至 37℃ 培 養 箱 (5% CO 2 ) 中 培 養 24 小 時 後 , 將 flask 中 的 培 養 液 收 回 即 為 條 件 化 培養 液 ( 此 flask 可 回 收 條 件 化 培 養 液 約 7 天 )。3. 條 件 化 培 養 液 過 濾 (0.22 μm filter) 後 , 可 提 供 胚 胎 幹 細 胞 之 培 養 ( 培 養 液 可 存 於 -20 ℃達 1 個 月 )。* 註 : 關 於 人 類 餵 養 細 胞 的 報 告 , 目 前 使 用 較 多 的 包 括 foreskin fibroblast 、 uterineendometrium、placenta, 以 及 由 人 類 胚 胎 幹 細 胞 所 分 化 建 立 而 來 的 纖 維 母 細 胞 等 等4 。 這 些人 類 來 源 的 餵 養 細 胞 不 論 是 使 用 含 血 清 或 不 含 血 清 的 培 養 液 , 都 可 以 有 效 的 維 持 人 類 胚 胎 幹11

細 胞 生 長 。 不 過 , 在 MEF 或 人 類 的 餵 養 細 胞 下 生 長 之 人 類 胚 胎 幹 細 胞 型 態 並 不 完 全 相 同 ,例 如 人 類 胚 胎 幹 細 胞 生 長 在 人 類 餵 養 細 胞 下 會 顯 得 比 較 扁 平 、 比 較 薄 、 單 層 且 細 胞 略 大 , 而在 MEF 上 則 較 厚 。 這 些 差 別 在 人 類 胚 胎 幹 細 胞 的 後 續 分 化 上 之 差 異 , 則 並 不 清 楚 ( 圖 七 )。* 註 : 關 於 人 類 胚 胎 幹 細 胞 之 培 養 環 境 , 除 了 餵 養 細 胞 與 培 養 液 之 外 , 還 有 些 其 他 條 件 也 可 能會 影 響 到 細 胞 的 成 長 。 例 如 培 養 箱 之 CO 2 濃 度 大 部 分 是 設 定 於 5~7%, 但 是 這 一 點 還 需 考 量使 用 的 培 養 液 本 身 最 適 合 的 pH 值 而 定 , 因 此 實 驗 室 對 此 需 做 適 當 的 調 節 。 至 於 是 否 需 使 用高 純 度 的 CO 2 , 或 使 用 特 殊 裝 置 以 減 低 空 氣 中 有 害 的 揮 發 物 質 , 則 同 樣 需 根 據 各 實 驗 室 測 試才 能 得 到 答 案 。 至 於 O 2 濃 度 是 21%, 或 減 低 至 5% 左 右 (hypoxic culture), 同 樣 是 未 決 的議 題 。 過 去 有 數 篇 報 告 顯 示 5% O 2 有 助 於 胚 胎 幹 細 胞 的 建 立 與 維 持 , 但 是 我 們 最 近 詳 盡 的 分析 比 較 卻 發 現 : 在 維 持 人 類 胚 胎 幹 細 胞 於 未 分 化 的 狀 態 下 而 言 , 如 果 繼 代 的 頻 率 是 常 規 的 5~7天 左 右 , 則 使 用 21% O 2 可 能 沒 有 明 顯 壞 處 , 並 且 維 持 的 費 用 也 比 較 低 , 且 不 論 在 各 種 分 化與 未 分 化 之 基 因 的 表 現 上 , 皆 無 明 顯 之 差 異 , 因 此 未 必 需 要 使 用 5% O2。 因 此 實 驗 室 對 於 最適 當 的 人 類 胚 胎 幹 細 胞 培 養 環 境 需 有 其 自 我 的 分 析 與 測 試 , 並 非 一 種 培 養 環 境 可 以 一 體 適 用於 所 有 實 驗 室 。1 23 4圖 七 、 顯 微 鏡 下 觀 察 餵 養 細 胞 貼 附 於 培 養 皿 及 用 於 培 養 胚 胎 幹 細 胞 。1. 小 鼠 胚 胎 纖 維 母 細 胞(mouse embryonic fibroblasts, MEF); 2. 胚 胎 幹 細 胞 培 養 於 MEF; 3. 人 類 包 皮 纖 維 母 細胞 (human foreskin fibroblast, HFF); 4. 胚 胎 幹 細 胞 培 養 於 HFF 之 情 形 。12

七 、 人 類 胚 胎 幹 細 胞 建 立 的 新 發 展有 關 於 人 類 胚 胎 幹 細 胞 的 建 立 與 維 持 , 其 標 準 實 驗 步 驟 皆 已 有 文 獻 可 供 參 考 , 而 實 驗 效果 也 很 好 。 不 過 最 近 數 年 來 , 國 際 間 對 於 人 類 胚 胎 幹 細 胞 之 建 立 與 維 持 有 許 多 新 的 發 展 ; 其最 重 要 的 目 標 不 外 乎 : 首 先 是 朝 向 一 個 非 動 物 餵 養 細 胞4,5 、 無 外 來 非 人 類 物 質 之 介 入 、 無 血清 , 而 尤 其 是 在 一 種 培 養 物 質 完 全 透 明 清 楚 的 培 養 液 (defined medium) 中6,7 , 所 建 立 與 生長 之 人 類 胚 胎 幹 細 胞 株 的 實 驗 方 向 來 發 展 。 另 一 方 向 則 是 朝 向 一 個 減 少 破 壞 胚 胎 的 方 法 來 建立 人 類 胚 胎 幹 細 胞 。對 於 第 一 個 目 標 , 過 去 許 多 研 究 顯 示 人 類 來 源 的 餵 養 細 胞 , 例 human foreskin feeder、human placental fibroblast 等 等 細 胞 , 皆 可 有 效 建 立 與 維 持 人 類 胚 胎 幹 細 胞 之 成 長8 。 進 一步 也 有 研 究 顯 示 : 在 一 個 defined medium 的 環 境 下 建 立 新 的 人 類 胚 胎 幹 細 胞 株6 , 他 們 使 用一 種 稱 為 TeSR1 的 培 養 液 , 內 含 TGFβ、PA、GABA、LiCl、bFGF 等 物 質 , 而 能 達 到 與 MEF的 conditioned medium 相 同 或 更 好 的 效 果 , 而 且 在 配 合 人 類 之 細 胞 外 基 質 (extracellularmatrix)( 包 括 collagen IV、fibronectin、laminin、 與 vitronectin 的 使 用 ) 之 下 , 並 不 需 要 餵養 細 胞 。 在 使 用 這 種 培 養 環 境 的 情 況 之 下 ,Ludwig 的 團 隊 建 立 了 兩 株 新 的 人 類 胚 胎 幹 細 胞株 , 可 惜 其 中 一 株 染 色 體 異 常 , 而 另 一 株 原 為 正 常 , 培 養 7 個 月 之 後 變 成 第 十 二 對 染 色 體 三倍 體 。 因 此 就 這 個 議 題 , 還 有 許 多 研 究 需 要 進 行 , 但 終 極 目 標 是 建 立 一 種 無 餵 養 細 胞 , 且 無外 來 非 人 類 的 物 質 的 培 養 環 境 , 以 便 所 建 立 出 來 的 人 類 胚 胎 幹 細 胞 株 可 以 達 到 臨 床 應 用 之 最基 本 需 求 條 件9 。另 外 關 於 減 少 胚 胎 之 破 壞 , 由 於 傳 統 之 建 立 人 類 胚 胎 幹 細 胞 方 法 , 皆 需 要 破 壞 胚 胎 才 能達 成 。 因 此 在 許 多 國 家 , 或 某 些 宗 教 團 體 的 倫 理 與 道 德 考 量 上 , 常 常 會 衍 生 許 多 爭 議 。 因 此為 了 解 決 這 個 議 題 , 有 數 種 方 法 被 設 計 出 來 以 減 少 破 壞 胚 胎 之 必 要 性 。 其 中 一 種 方 法 是 由10Klimanskaya 團 隊 所 發 表 的 方 法 : 是 把 胚 胎 培 養 至 第 三 天 約 8 細 胞 時 期 , 以 顯 微 操 作 技 術取 出 1~2 個 胚 葉 細 胞 (blastomere), 然 後 藉 由 此 胚 葉 細 胞 與 原 已 形 成 之 胚 胎 幹 細 胞 株 共 同培 養 , 使 此 胚 葉 細 胞 順 利 形 成 新 的 人 類 胚 胎 幹 細 胞 株 。 如 此 不 但 達 到 建 立 新 的 細 胞 株 , 而 且原 來 移 除 1~2 個 胚 葉 細 胞 之 胚 胎 , 仍 能 繼 續 發 育 至 囊 胚 不 受 影 響 。 這 種 技 術 雖 然 還 需 進 一 步精 進 與 改 良 , 但 在 解 除 人 類 胚 胎 幹 細 胞 的 倫 理 爭 議 上 , 無 疑 又 踏 出 一 大 步 。此 外 , 為 了 將 來 臨 床 應 用 的 需 要 , 人 類 胚 胎 幹 細 胞 與 其 培 育 產 生 的 分 化 細 胞 還 需 要 解 決排 斥 的 問 題 。 在 數 種 解 決 的 方 案 當 中 , 近 年 來 為 科 學 家 所 特 別 重 視 的 方 法 之 一 是 : 以 核 轉 殖(nuclear transfer;NT) 的 技 術 , 來 得 到 量 身 訂 做 之 胚 胎 幹 細 胞 株 (nt-hESC)。 由 於 這 種細 胞 株 的 核 是 來 自 核 捐 贈 者 (nuclear donor) 的 體 細 胞 , 因 此 藉 此 技 術 得 到 的 人 類 胚 胎 幹 細胞 之 DNA 與 原 來 捐 贈 者 有 99% 以 上 的 相 似 , 只 有 粒 腺 體 DNA 不 同 。 因 此 一 旦 將 來 這 種 細 胞株 的 產 物 用 於 移 植 回 核 捐 贈 者 身 上 , 應 該 不 會 有 排 斥 問 題 。 可 惜 的 是 這 種 技 術 用 於 建 立 人 類胚 胎 幹 細 胞 的 研 究 上 , 截 至 目 前 為 止 並 沒 有 成 功 的 案 例 。 因 此 由 上 述 的 現 象 , 我 們 可 以 知 道單 單 只 談 人 類 胚 胎 幹 細 胞 的 建 立 , 不 談 其 後 續 的 分 化 , 就 有 許 多 困 難 與 議 題 需 釐 清 與 解 決 。而 這 同 時 , 當 然 也 代 表 人 類 胚 胎 幹 細 胞 的 建 立 也 還 有 無 限 的 可 能 存 在 , 值 得 科 學 家 探 討 。13

八 、 附 錄( 一 ) 建 立 人 類 胚 胎 幹 細 胞 之 效 率這 是 過 去 我 們 已 發 表 關 於 人 類 胚 胎 幹 細 胞 之 建 立 時 , 所 建 立 三 個 細 胞 株 (NTU1、NTU2與 NTU3) 之 基 本 資 料2 。編 號 解 凍 的 胚 囊 胚 等 級 Antiserum 第 一 次 繼 代 天 數 第 二 次 繼 代 天 數 建 立 之 細 胞 株胎 時 期(dilution)1 2PN 2BA2 2PN 3AAHomemade(1:20)Homemade(1:10)1083 6 Cell 4AA Homemade (1:8) 94 6 Cell 4BA Homemade (1:5) 75 2PN 3AA Homemade (1:5) 10 14 NTU16 2PN 3CA Sigma (1:5) 97 2PN 4AA Sigma (1:3) 10 9 NTU28 8 Cell 4CA Sigma (1:3) ****9 2PN 3AB Sigma (1:3) 1210 2PN 4BA Sigma (1:3) 811 2PN 4AB Sigma (1:3) 12 6 NTU3( 二 )Anti-human serum 的 製 備取 1-2×10 7 BeWo cells( 人 類 絨 毛 腺 癌 細 胞 株 CCL-98;ATCC, Rockville, MD) 在 0.5 ml磷 酸 鹽 緩 衝 液 中 , 以 靜 脈 注 射 打 入 紐 西 蘭 (Zew Zealand) 白 兔 體 內 , 每 14 天 施 打 一 次 , 共計 3 次 。 於 最 後 一 次 施 打 後 14 天 收 集 白 兔 血 清 , 再 經 由 BeWo 細 胞 測 試 其 培 養 及 細 胞 溶 解的 成 效 來 決 定 使 用 濃 度 , 完 成 後 儲 存 於 -80℃。 另 外 也 可 以 購 買 Sigma 公 司 的 anti-humanserum。( 三 ) 相 關 培 養 液 配 置名 稱 成 分 比 例DMEM-HEPES medium DMEM 97.5%HEPES 2.5%1M Sucrose mediumSucrose 3.42g( 先 將 sucrose 溶 於 DMEM-HEPES再 調 整 至 8ml 後 加 入 血 清 )DMEM-HEPES6mlFetal Bovine Serum (Hyclone)2ml人 類 胚 胎 幹 細 胞 培 養 液 D-MEM 80%14

(hESC medium)L-glutamine 1%( 亦 可 用 市 售 商 品 取 代 , 如 Penicillin/Streptomycin 0.5%Primate ES Cell Culture Hyclone FBS 20%Medium/ ReproCell)NEAA 1%β-Mercaptoethanol0.1mMbFGF10 ng/mlMEF medium DMEM medium 88.5 %L-Glutamine-200 1 %FBS(Gibco) 10 %Penicillin/Streptomycin 0.5 %( 四 ) 相 關 試 劑試 劑 名 稱廠 牌 型 號DMEMGibco11960-044L-Glutamine-200 Gibco 25030-081Penicillin/Streptomycin Gibco 15070-063non-essential amino acids (NEAA) Gibco 12383-014β-mercaptoethanol Gibco 21985-023PBS+ Gibco 14040-133PBS- Gibco 14190-144Insulun-Transferrin-Selenium (ITS) Gibco 41400-045Collagenase IVGibco17104-019Trypsin/EDTA(0.25%) Gibco 25200-056HEPES Gibco 15630-106Dispase Gibco 17105-041Basic Fibroblast Growth Factor/bFGF human, Gibco 13256-029recombinantFetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140-079Dimethylsulfoxide(DMSO) Sigma D-2650Mitomycin-C Sigma M-4287Gelatin Sigma G-1890Ethylene glycol Sigma E-9129Sucrose Sigma S-7903Fetal Bovine Serum ( FBS)-HycloneHyclone SH30070-03Primate ES Cell Culture MediumReproCeLL RCHEM00115

九 、 參 考 文 獻1. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., et al. Embryonic stem cell lines derivedfrom human blastocysts. Science 282:1145-7 (1998).2. Chen, H. F., Kuo, H. C., Chien, C. L. , Shun, C. T., Yao, Y. L. , Ip, P. L. , Chuang, C. Y., Wang,C. C., Yang, Y. S. & Ho, H. N. Derivation, characterization and differentiation of humanembryonic stem cells: comparing serum-containing versus serum-free media and evidence ofgerm cell differentiation. Human Reproduction 22(2):567-77 (2007).3. Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A. & Bongso, A. Embryonic stem celllines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18(4):399-404(2000).4. Amit, M., Margulets, V., Segev, H., Shariki, K., Laevsky, I., Coleman, R. & Itskovitz-Eldor, J.Human feeder layers for human embryonic stem cells. Biol Reprod. 68(6):2150-6 (2003).5. Klimanskaya, I., Chung, Y., Meisner, L., Johnson, J., West, M. D. & Lanza, R. Humanembryonic stem cells derived without feeder cells. Lancet 365(9471):1636-41 (2005).6. Ludwig, T. E., Levenstein, M. E., Jones, J. M., Berggren, W. T., Mitchen, E. R., Frane, J. L.,Crandall, L. J., Daigh, C. A., Conard, K. R., Piekarczyk, M. S., Llanas, R. A. & Thomson, J. A.Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24(2):185-7(2006).7. Sato, N., Meijer, L., Skaltsounis, L., Greengard, P. & Brivanlou, A. H. Maintenance ofpluripotency in human and mouse embryonic stem cells through activation of Wnt signaling bya pharmacological GSK-3-specific inhibitor. Nat Med. 10(1):55-63 (2004).8. Inzunza, J., Gertow, K., Strömberg, M. A., Matilainen, E., Blennow, E., Skottman, H., Wolbank,S., Ahrlund-Richter, L. & Hovatta, O. Derivation of human embryonic stem cell lines in serumreplacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells. Stem Cells23(4):544-9 (2005).9. Rodriguez, C. I., Galan, A., Valbuena, D. & Simon, C. Derivation of clinical-grade humanembryonic stem cells. Reproductive Biomedicine Online 12(1):112-8 (2006).10. Klimanskaya, I., Chung, Y., Becker, S., Lu, S. J. & Lanza, R. Human embryonic stem cell linesderived from single blastomeres. Nature 444:481-5 (2006).16

第 二 章胚 胎 幹 細 胞 的 鑑 定Characterization of Embryonic Stem Cells郭 紘 志1陳 淑 華1張 為 芳2莊 靜 玉21中 央 研 究 院 細 胞 曁 個 體 生 物 研 究 所2中 央 研 究 院 基 因 體 研 究 中 心一 、 前 言胚 胎 幹 細 胞 (embryonic stem cells) 的 最 重 要 特 質 是 他 們 具 有 無 限 制 增 殖 (proliferation)能 力 , 而 不 分 化 , 即 所 謂 自 我 更 新 (self-renewal) 之 能 力 , 和 具 有 分 化 為 多 重 細 胞 型 態 之 多能 分 化 能 力 (pluripotency) 1,2 。 因 為 胚 胎 幹 細 胞 具 有 以 上 之 能 力 , 所 以 他 們 提 供 了 在 細 胞 性治 療 、 藥 物 開 發 及 基 礎 研 究 方 面 極 佳 的 研 究 平 臺 。 因 此 當 建 立 新 胚 胎 幹 細 胞 株 、 建 立 新 式 之培 養 環 境 , 或 經 長 期 培 養 時 , 適 當 之 細 胞 鑑 定 程 序 是 極 其 重 要 的 。 目 前 對 於 胚 胎 幹 細 胞 之 鑑定 主 要 是 針 對 胚 胎 幹 細 胞 標 誌 物 及 他 們 全 能 分 化 潛 力 之 分 析3,4 , 而 此 類 評 估 之 標 準 包 括 鑑 定其 是 否 表 達 一 些 特 定 之 表 面 抗 原 , 及 它 們 未 分 化 狀 態 相 關 之 一 些 轉 錄 因 子 , 另 外 在 活 體 及 體外 證 明 其 多 能 之 分 化 性 及 增 殖 特 性 也 是 鑑 定 程 序 中 重 要 之 步 驟 , 以 下 將 針 對 各 項 分 析 方 法 進行 介 紹 。二 、 胚 胎 幹 細 胞 之 細 胞 形 態 (cell morphology) 特 徵 分 析在 常 規 及 長 期 之 胚 胎 幹 細 胞 培 養 過 程 中 , 細 胞 之 自 發 性 分 化 (spontaneousdifferentiation) 是 經 常 會 遭 遇 之 情 況 。 因 此 , 有 關 胚 胎 幹 細 胞 分 化 與 否 之 簡 易 、 有 效 之 判 定 ,對 於 維 持 其 良 好 之 培 養 是 非 常 重 要 之 常 規 步 驟 。 正 常 胚 胎 幹 細 胞 之 生 長 需 要 特 定 而 良 好 之 培養 環 境 , 以 避 免 細 胞 產 生 自 發 性 分 化5,6,7 。 然 而 , 在 目 前 一 般 常 規 之 培 養 方 法 下 經 常 會 有 胚胎 幹 細 胞 在 培 養 的 過 程 中 分 化 為 有 別 於 胚 胎 幹 細 胞 形 態 而 具 有 多 重 細 胞 形 態 之 分 化 細 胞 族群 。 因 此 , 在 一 般 常 規 , 長 期 之 胚 胎 幹 細 胞 培 養 過 程 中 , 對 於 胚 胎 幹 細 胞 分 化 與 否 之 形 態 鑑定 是 極 其 重 要 的 。 一 般 而 言 , 未 分 化 之 人 類 胚 胎 幹 細 胞 會 形 成 緊 密 之 細 胞 聚 落 (compactcolonies)( 圖 一 A)。 就 單 一 之 胚 胎 幹 細 胞 而 言 , 他 們 亦 具 有 獨 特 之 細 胞 形 態 , 以 下 是 胚 胎幹 細 胞 通 常 具 有 之 形 態 特 徵 。 一 、 胚 胎 幹 細 胞 具 有 極 高 之 核 質 比 (nuclear to cytoplasmratio), 因 此 , 單 一 之 胚 胎 幹 細 胞 , 看 起 來 像 是 具 有 極 大 之 細 胞 核 和 極 少 之 細 胞 質 ( 圖 一 B)。二 、 其 細 胞 核 中 之 核 仁 (nucleoli) 極 為 明 顯 ( 圖 一 B)。 三 、 具 有 明 顯 之 細 胞 邊 界 (cellboundary)。 相 反 的 , 分 化 之 細 胞 經 常 失 去 以 上 胚 胎 幹 細 胞 形 態 特 徵3,4,8 。 通 常 , 分 化 之 細 胞 ,通 常 具 有 如 扁 平 化 (flatten)、 細 胞 尺 寸 變 大 、 或 形 成 立 體 、 堆 疊 (pile-up) 之 細 胞 群 體 結 構17

5 , 分 化 之 細 胞 通 常 可 在 胚 胎 幹 細 胞 聚 落 之 週 邊 或 中 心 之 區 域 形 成 ( 圖 一 C)。 具 有 良 好 訓 練之 胚 胎 幹 細 胞 培 養 人 員 必 須 對 所 謂 正 常 胚 胎 幹 細 胞 型 態 具 有 判 定 之 能 力 , 並 在 細 胞 繼 代(passage) 時 能 有 效 的 選 擇 並 剃 除 分 化 細 胞 , 否 則 , 則 通 常 會 導 致 分 化 細 胞 之 大 量 生 長 ,最 後 失 去 胚 胎 幹 細 胞 。 當 然 胚 胎 幹 細 胞 在 不 同 的 培 養 環 境 裡 會 呈 現 出 些 許 不 同 之 細 胞 形 態 特徵 , 針 對 不 同 培 養 環 境 培 養 之 細 胞 , 操 作 人 員 必 須 發 展 自 我 之 形 態 特 徵 判 定 標 準 以 符 合 個 別之 情 況4 。 另 外 不 同 物 種 之 胚 胎 幹 細 胞 聚 落 形 態 亦 有 些 許 之 差 異 , 例 如 靈 長 類 ( 包 括 人 類 與猴 類 ) 之 胚 胎 幹 細 胞 通 常 較 為 扁 平 , 而 小 鼠 之 胚 胎 幹 細 胞 則 形 成 如 小 丘 狀 之 結 構 (dome-like)。圖 一 、 分 化 及 未 分 化 人 類 胚 胎 幹 細 胞 之 形 態 特 徵 。A 圖 顯 示 人 類 胚 胎 幹 細 胞 形 成 緊 密 之 細 胞聚 落 。B 圖 顯 示 人 類 胚 胎 幹 細 胞 具 有 極 高 之 核 質 比 (nuclear to cytoplasm ratio), 單 一 之 胚 胎 幹細 胞 , 看 起 來 像 是 具 有 極 大 之 細 胞 核 和 極 少 之 細 胞 質 , 且 其 細 胞 核 中 之 核 仁 (nucleoli) 極 為明 顯 。C 圖 顯 示 在 人 類 胚 胎 幹 細 胞 聚 落 之 週 邊 形 成 分 化 之 細 胞 。三 、 未 分 化 胚 胎 幹 細 胞 之 鑑 定 標 誌 (markers)9,10,11 。有 關 未 分 化 胚 胎 幹 細 胞 之 鑑 定 標 誌 有 以 下 二 種 。a. 胚 胎 幹 細 胞 之 細 胞 膜 表 面 標 誌b. 胚 胎 幹 細 胞 表 達 之 與 全 能 分 化 性 相 關 之 專 一 標 誌12,13,14,15,16 。 未 分 化 之 人 類 胚 胎 幹 細 胞 表達 表 面 抗 原 可 被 抗 體 如 SSEA-3(stage-specific embryonic antigens), SSEA-4 之 醣 脂 類(glycolipids), TRA-1-60 和 TRA-1-81 和 GCTM-2(GCTM2 為 protein core of keratansulfate/chondroitin sulfate pericellular matrix proteoglycan) 等 標 誌 物 偵 測 ( 圖 二 )。18

圖 二 、 免 疫 細 胞 化 學 染 色 (immunocytochemistry staining) 分 析 恆 河 猴 胚 胎 幹 細 胞 表 面 抗 原 標誌 之 表 達 。A 圖 顯 示 恆 河 猴 胚 胎 幹 細 胞 同 時 表 達 表 面 抗 原 標 誌 SSEA3 及 全 能 性 標 誌 蛋 白OCT4。B 圖 顯 示 恆 河 猴 胚 胎 幹 細 胞 同 時 表 達 表 面 抗 原 標 誌 TRA-1-81 及 全 能 性 標 誌 蛋 白OCT4。C 圖 顯 示 恆 河 猴 胚 胎 幹 細 胞 同 時 表 達 表 面 抗 原 標 誌 TRA-1-81 及 全 能 性 標 誌 蛋 白 OCT4。人 類 胚 胎 幹 細 胞 亦 表 達 一 系 列 有 關 全 能 分 化 性 之 分 子 標 誌 。 如 OCT3/4, 是 一 個 POUdomain 之 基 因 轉 錄 因 子 (transcription factor); hTERT、 有 關 端 體 酶 (telomerase) 之 表達 之 重 要 成 分 ;homeobox 轉 錄 因 子 NANOG、HMG-box 轉 錄 因 子 SOX2、 未 分 化 胚 胎 細 胞轉 錄 因 子 (ITF-2C)、 zinc finger 蛋 白 42 REX1( 圖 三 ) 17,18,19 , 除 此 之 外 , 未 分 化 之 胚 胎 幹細 胞 亦 表 達 高 度 之 鹼 性 磷 酸 酶 (alkaline phosphatase) 活 性 。圖 三 、 非 定 量 RT-PCR 之 方 法 分 析 人 類 (A 圖 ) 及 恆 河 猴 (B 圖 ) 胚 胎 幹 細 胞 中 與 全 能 分 化能 力 相 關 之 標 誌 基 因 (pluripotency-related marker genes) 之 表 達 。19

以 上 所 列 舉 之 各 種 胚 胎 幹 細 胞 未 分 化 標 誌 , 會 在 胚 胎 幹 細 胞 開 始 進 行 分 化 的 過 程 中 , 降低 表 達 , 同 時 其 他 與 分 化 細 胞 相 關 之 細 胞 標 記 之 表 達 則 提 高 , 例 如 在 人 類 胚 胎 幹 細 胞 開 始 分化 時 SSEA-1 之 表 達 即 升 高 , 但 其 並 不 表 達 於 未 分 化 細 胞 。 在 通 常 實 務 之 鑑 定 程 序 , 以 上 所列 舉 之 胚 胎 幹 細 胞 標 誌 物 提 供 了 一 個 實 用 之 指 標 以 供 評 估 細 胞 之 狀 態 , 或 比 較 不 同 之 培 養 環境 。雖 然 , 不 同 物 種 之 胚 胎 幹 細 胞 , 大 致 表 達 類 似 與 全 能 分 化 能 力 相 關 之 基 因 , 然 而 在 表 面抗 原 之 表 達 方 面 , 人 類 與 小 鼠 之 胚 胎 幹 細 胞 有 不 同 之 表 現 , 例 如 小 鼠 之 細 胞 表 達 SSEA1, 相反 的 , 人 類 之 胚 胎 幹 細 胞 卻 不 表 達 SSEA1, 唯 有 在 分 化 的 情 況 下 ,SSEA1 才 在 人 類 的 胚 胎幹 細 胞 中 表 達 。對 於 以 上 標 誌 物 表 達 之 分 析 , 可 經 由 免 疫 細 胞 化 學 染 色 (immunocytochemistry), 流 式細 胞 定 量 (flow cytometry) 或 者 / 和 定 量 RT-PCR 和 非 定 量 RT-PCR 之 方 法 分 析 。 免 疫 化 學染 色 法 , 使 用 特 定 之 抗 體 以 偵 測 胚 胎 幹 細 胞 表 達 之 未 分 化 標 誌 , 此 方 法 可 以 同 時 偵 測 細 胞 之形 態 及 未 分 化 標 誌 表 達 位 置 之 界 定 , 以 流 式 細 胞 儀 進 行 分 析 , 則 提 供 了 在 活 細 胞 上 , 經 由 細胞 染 色 以 界 定 及 定 量 胚 胎 幹 細 胞 表 達 未 分 化 標 誌 之 方 法 , 多 種 胚 胎 幹 細 胞 標 誌 可 同 時 在 相 同之 細 胞 上 被 同 時 偵 測 。 當 缺 乏 抗 體 以 提 供 胚 胎 幹 細 胞 之 特 定 標 誌 時 , 定 量 RT-PCR 是 一 個 替代 方 法 , 使 用 定 量 RT-PCR 分 析 , 我 們 可 將 相 同 之 細 胞 族 群 進 行 多 種 標 誌 基 因 之 表 達 鑑 定 ,可 同 時 分 析 與 多 能 分 化 性 相 關 之 基 因 表 達 , 亦 同 時 可 對 與 分 化 細 胞 相 關 之 基 因 進 行 偵 測 , 經由 相 互 比 對 , 未 分 化 與 分 化 基 因 表 達 之 程 度 , 我 們 可 以 藉 此 判 定 受 測 細 胞 之 分 化 / 未 分 化 程 度 。四 、 分 化 潛 力 之 鑑 定 :未 分 化 之 人 類 胚 胎 幹 細 胞 具 有 全 能 之 分 化 潛 力 , 有 關 於 全 能 分 化 潛 力 之 鑑 定 有 下 之 方 法 :A. 畸 胎 瘤 (teratoma) 形 成 之 活 體 全 能 分 化 潛 力 鑑 定經 由 細 胞 注 射 ( 通 常 5x10 6 細 胞 /100 μl/ 每 個 注 射 位 置 ) 進 入 免 疫 缺 乏 之 老 鼠(immuno-deficient mice) 如 SCID/BEIGE 老 鼠 之 肌 肉 ( 圖 四 A-B), 腎 臟 ( kidney capsule)或 者 睪 丸 (testis) 中 , 經 過 數 週 ( 通 常 8-12 週 ) 注 射 位 置 會 形 成 大 小 不 一 定 之 畸 胎 瘤 , 當畸 胎 瘤 大 小 到 達 50-100 mm 3 時 , 將 畸 胎 瘤 從 動 物 取 出 並 進 行 組 織 切 片 之 分 析 。 經 由 病 理 切片 之 分 析 , 在 畸 胎 瘤 之 切 片 中 , 我 們 可 觀 察 到 多 種 細 胞 形 態 , 同 時 存 在 於 畸 胎 瘤 中 , 其 中 應包 含 有 代 表 內 、 中 、 外 三 胚 層 之 細 胞 形 態 ( 圖 四 C-E)( 如 神 經 或 皮 膚 細 胞 — 代 表 外 胚 層 , 胰 、肝 臟 或 腸 胃 道 , 腺 體 細 胞 — 代 表 內 胚 層 細 胞 , 及 如 肌 肉 、 血 液 或 骨 髓 細 胞 — 代 表 中 胚 層 細 胞 )20,21 。20

圖 四 、 畸 胎 瘤 (teratoma) 形 成之 活 體 全 能 分 化 潛 力 鑑 定 。A及 B 圖 顯 示 小 鼠 胚 胎 幹 細 胞 在注 射 進 入 SCID/BEIGE 老 鼠 之後 腿 肌 肉 8 週 後 形 成 畸 胎 瘤 之情 形 。C-D 圖 經 由 組 織 染 色 分析 , 顯 示 人 類 胚 胎 幹 細 胞 形 成之 畸 胎 瘤 中 包 含 有 外 胚 層 之 表皮 組 織 (C)、 中 胚 層 之 硬 骨 組織 (D)、 及 內 胚 層 之 消 化 道 組織 (E)。B. 類 胚 體 之 細 胞 形 成 - 實 驗 室 環 境 之 全 能 細 胞 分 化 測 定 。胚 胎 幹 細 胞 之 自 發 性 分 化 可 經 由 胚 胎 幹 細 胞 之 懸 浮 培 養 (suspension culture) 及 類 胚 體(embryoid bodies) 之 形 成 而 達 成22 , 多 種 之 細 胞 形 態 如 神 經 細 胞 (neural cells)、 心 肌 細胞 (cardiomyocytes)、 內 胚 層 細 胞 (endoderm cells), 如 肝 及 胰 細 胞 和 表 皮 細 胞 (epithelia)均 可 在 類 胚 體 中 被 偵 測 到23-29 。 目 前 對 於 胚 胎 幹 細 胞 分 化 為 特 定 體 細 胞 之 形 態 , 有 多 種 之 方法 ( 請 參 考 其 他 章 節 )。 但 一 般 而 言 , 均 需 使 胚 胎 幹 細 胞 脫 離 原 有 之 培 養 環 境 , 如 剔 除 MEF或 Leukemia inhibitory factor(LIF 小 鼠 胚 胎 幹 細 胞 ) 之 影 響 然 後 形 成 EB, 或 者 直 接 將 胚 胎幹 細 胞 與 特 定 之 細 胞 及 胞 外 基 質 (extracellular matrices) 進 行 共 同 培 養 , 均 會 誘 導 胚 胎 幹 細胞 進 行 自 發 性 分 化 。對 於 此 項 分 析 之 重 點 , 應 是 在 鑑 定 是 否 可 在 胚 胎 幹 細 胞 自 發 性 分 化 細 胞 中 偵 測 出 代 表內 、 中 、 外 三 胚 層 之 分 化 細 胞 , 其 偵 測 方 法 通 常 包 括 對 特 殊 細 胞 如 外 胚 層 之 神 經 , 或 皮 膚 細胞 , 中 胚 層 之 肌 肉 、 骨 骼 細 胞 及 內 胚 層 之 肝 、 胰 細 胞 進 行 特 定 標 誌 物 之 免 疫 螢 光 化 學 物 分 析 ,或 特 定 基 因 表 達 之 RT-PCR 分 析 , 當 然 對 各 項 特 定 細 胞 之 精 密 鑑 定 , 均 有 其 特 定 之 方 法( 請 參 照 其 他 章 節 )。23-29C. 鑲 嵌 體 形 成 (chimera formation)鑲 嵌 體 形 成 之 分 析 是 目 前 有 關 胚 胎 幹 細 胞 全 能 分 化 潛 力 最 有 效 而 直 接 之 驗 證 方 法 , 然 而由 於 倫 理 之 考 量 此 分 析 方 法 只 能 應 用 在 有 關 動 物 胚 胎 幹 細 胞 之 全 能 分 化 潛 力 驗 證 , 而 無 法 使用 於 人 類 胚 胎 幹 細 胞 全 能 分 化 潛 力 驗 證 , 進 行 此 項 分 析 時 通 常 是 在 顯 微 操 作 器(micromanipulator) 的 幫 忙 下 將 胚 胎 幹 細 胞 打 入 3.5 天 大 的 囊 胚 (blastocysts)( 圖 五 A-B)30中 或 者 將 桑 椹 胚 時 期 之 胚 胎 和 胚 胎 幹 細 胞 進 行 聚 合 形 成 聚 合 體 (aggregates) 31 , 若 胚 胎幹 細 胞 的 來 源 為 黑 毛 之 小 鼠 ( 如 B6) 則 將 其 注 射 進 有 白 毛 來 源 ( 如 strain 129) 之 胚 胎 中 ,反 之 亦 然 。 在 胚 胎 移 植 至 代 理 孕 母 鼠 後 , 並 讓 此 鑲 嵌 胎 兒 出 生 後 , 如 打 入 之 胚 胎 幹 細 胞 具 有好 的 分 化 潛 力 , 即 可 觀 察 到 此 鑲 嵌 小 鼠 具 有 黑 白 毛 色 混 雜 之 情 形 , 如 胚 胎 幹 細 胞 具 有 極 高 之21

鑲 嵌 率 時 , 此 細 胞 株 即 可 判 定 為 優 良 之 細 胞 株 , 反 之 , 則 非 具 有 高 度 發 育 潛 力 之 細 胞 株 。 通常 , 優 良 之 細 胞 株 不 但 能 貢 獻 至 各 種 不 同 體 組 織 及 器 官 ( 圖 五 C-F), 其 亦 能 分 佈 至 各 項 組 織而 生 長 成 成 熟 之 配 子 , 如 卵 子 及 精 子 , 因 此 可 被 有 效 利 用 於 生 產 轉 殖 基 因 鼠 。圖 五 、 以 鑲 嵌 體 形 成 分 析 小 鼠胚 胎 幹 細 胞 全 能 分 化 潛 力 。 圖A-B 顯 示 將 表 達 綠 色 螢 光 蛋 白之 小 鼠 胚 胎 幹 細 胞 經 由 顯 微 操作 器 打 入 3.5 天 大 的 囊 胚(blastocysts) 中 。 圖 C-D 顯 示具 有 高 鑲 嵌 率 之 小 鼠 胚 胎 幹 細胞 在 鑲 嵌 胎 兒 中 之 高 度 貢 獻 。圖 E-F 顯 示 具 有 低 或 無 鑲 嵌 能力 之 小 鼠 胚 胎 幹 細 胞 在 鑲 嵌 胎兒 中 之 分 佈 情 形 。五 、 細 胞 遺 傳 分 析 (cytogenetic analysis)細 胞 遺 傳 之 分 析 , 在 目 前 有 關 胚 胎 幹 細 胞 之 鑑 定 程 序 中 扮 演 一 個 重 要 之 角 色 , 雖 然 前 述有 關 分 化 潛 力 及 標 定 物 之 表 達 測 試 已 足 夠 用 以 鑒 定 胚 胎 幹 細 胞 之 身 分 , 然 而 , 當 一 胚 胎 幹 細胞 具 有 不 正 常 之 遺 傳 組 成 時 , 卻 會 影 響 細 胞 株 使 用 者 對 該 細 胞 株 應 用 之 考 量 , 因 此 在 分 離 新細 胞 株 或 細 胞 株 經 長 期 培 養 後 , 適 當 的 染 色 體 分 析 及 監 測 是 必 要 的 。 目 前 對 於 細 胞 遺 傳 分 析 ,有 不 同 之 方 法 , 從 傳 統 之 G-banding 分 析 到 CGH(comparative genome hybridization) 或SKY(spectral karyotyping) 均 是 可 供 選 擇 的 方 法 , 然 其 各 有 優 缺 點 ,G-babding 可 提 供 快速 且 便 宜 之 染 色 體 檢 定 , 然 其 所 能 偵 測 之 異 常 型 態 有 其 限 制 , 雖 然 CGH 及 SKY 可 提 供 較 高解 析 度 之 分 析 , 但 其 檢 測 所 需 之 費 用 高 昂 , 並 不 是 一 般 實 驗 室 可 容 易 進 行 之 選 項 , 因 此 , 目前 較 常 用 之 方 法 仍 是 G-banding 之 分 析 。22

六 、 結 語以 上 簡 單 的 提 供 有 關 胚 胎 幹 細 胞 鑑 定 之 介 紹 及 方 法 , 以 提 供 各 位 讀 者 在 面 對 胚 細 胞 之 領域 知 識 時 相 關 之 參 考 知 識 , 雖 然 在 本 文 中 , 我 們 歸 納 了 幾 個 有 關 目 前 胚 胎 幹 細 胞 鑑 定 之 基 本程 序 , 但 各 位 讀 者 必 須 明 瞭 , 在 本 文 撰 寫 時 , 國 際 上 並 無 一 特 定 之 胚 胎 幹 細 胞 鑑 定 標 準 以 供參 考 , 個 人 相 信 , 隨 著 科 技 的 日 新 月 異 及 相 關 研 究 之 進 展 , 日 後 , 必 定 有 更 精 密 而 標 準 化 之鑑 定 程 序 以 供 各 研 究 人 員 參 考 。七 、 參 考 文 獻1. Thomson, J. A., Itskovitz‐Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S.& Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282:1145–1147 (1998).2. Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A. & Bongso, A. Embryonic stem cell linesfrom human blastocysts: Somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18:399–404 (2000).3. Xu, C. Characterization and evaluation of human embryonic stem cells. Methods in Enzymology420:18-37 (2006).4. Hoffman, L. M. & Carpenter, M. K. Characterization and culture of human embryonic stem cells.Nat. Biotechnol. 23:699–708 (2005).5. James, D., Levine, A. J., Besser, D. & Hemmati‐Brivanlou, A. TGF{beta}/activin/ nodal signalingis necessary for the maintenance of pluripotency in human embryonic stem cells. Development132:273–1282 (2005).6. Vallier, L., Alexander, M. & Pedersen, R. A. Activin/Nodal and FGF pathways cooperate tomaintain pluripotency of human embryonic stem cells. J. Cell Sci. 118:4495–4509 (2005).7. Vallier, L., Reynolds, D. & Pedersen, R. A. Nodal inhibits differentiation of human embryonicstem cells along the neuroectodermal default pathway. Dev. Biol. 275:403–421 (2004).8. Amit, M. & Itskovitz‐Eldor, J. Derivation and spontaneous differentiation of human embryonicstem cells. J. Anat. 200:225–232 (2002).9. Henderson, J. K., Draper, J. S., Baillie, H. S., Fishel, S., Thomson, J. A., Moore, H. & Andrews,P. W. Preimplantation human embryos and embryonic stem cells show comparable expressionof stage‐specific embryonic antigens. Stem Cells 20:329–337 (2002).10. Badcock, G., Pigott, C., Goepel, J. & Andrews, P. W. The human embryonal carcinoma markerantigen TRA‐1–60 is a sialylated keratan sulfate proteoglycan. Cancer Res. 59:4715–4719(1999).11. Draper, J. S., Pigott, C., Thomson, J. A. & Andrews, P.W. Surface antigens of human embryonicstem cells: Changes upon differentiation in culture. J. Anat. 200:249–258 (2002).12. Sperger, J. M., Chen, X., Draper, J. S., Antosiewicz, J. E., Chon, C. H., Jones, S. B., Brooks, J.D., Andrews, P. W., Brown, P. O. & Thomson, J. A. Gene expression patterns in humanembryonic stem cells and human pluripotent germ cell tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.23

100:13350–13355 (2003).13. Brandenberger, R., Khrebtukova, I., Thies, R. S., Miura, T., Jingli, C., Puri, R., Vasicek,T.,Lebkowski, J. & Rao, M. MPSS profiling of human embryonic stem cells. BMCDev. Biol. 4:10(2004a).14. Abeyta, M. J., Clark, A. T., Rodriguez, R. T., Bodnar, M. S., Pera, R. A. & Firpo, M. T. Uniquegene expression signatures of independently‐derived human embryonic stem cell lines. Hum.Mol. Genet. 13:601–608 (2004).15. Brandenberger, R., Wei, H., Zhang, S., Lei, S., Murage, J., Fisk, G. J., Li, Y., Xu, C., Fang,R.,Guegler, K., Rao, M. S., Mandalam, R., Lebkowski, J. & Stanton, L. W. Transcriptomecharacterization elucidates signaling networks that control human ES cell growth anddifferentiation. Nat. Biotechnol. 22:707–716 (2004b).16. Bhattacharya, B., Miura, T., Brandenberger, R., Mejido, J., Luo, Y., Yang, A. X., Joshi, B.H.,Ginis, I., Thies, R. S., Amit, M., Lyons, I., Condie, B. G., Itskovitz‐Eldor, J., Rao, M. S. & Puri,R. K. Gene expression in human embryonic stem cell lines: Unique molecular signature. Blood.103:2956–2964 (2004).17. Boyer, L. A., Lee, T. I., Cole, M. F., Johnstone, S. E., Levine, S. S., Zucker, J. P., Guenther,M.G., Kumar, R. M., Murray, H. L., Jenner, R. G., Gifford, D. K., Melton, D. A., Joenisch, R. &Young, R. A. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell 122:947–956 (2005).18. Masui, S., Nakatake, Y., Toyooka, Y., Shimosato, D., Yagi, R., Takahashi, K., Okochi, H., Okuda,A., Matoba, R., Sharov, A. A., Ko, M. S. & Niwa, H. Pluripotency governed by Sox2 viaregulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells. Nat Cell Biol 9(6):625-35(2007).19. Niwa, H. How is pluripotency determined and maintained? Development 134(4):635-46 (2007).20. Pryzborski, S. A. Differentiation of human embryonic stem cells after transplantation inimmune-deficient mice. Stem Cells 23(9):1242-50 (2005).21. Asano, T., Sasaki, K., Kitano, Y., Terao, K. & Hanazono, Y. In vivo tumor formation from primateembryonic stem cells. Methods Mol Biol. 329:459-67 (2006).22. Odorico, J. S., Kaufman, D. S. & Thomson, J. A. Multilineage differentiation from humanembryonic stem cell lines. Stem Cells. 19:193–204 (2001).23. Assady, S., Maor, G., Amit, M., Itskovitz‐Eldor, J., Skorecki, K. L. & Tzukerman, M. Insulinproduction by human embryonic stem cells. Diabetes. 50:1691–1697 (2001).24. Draper, J. S., Smith, K., Gokhale, P., Moore, H. D., Maltby, E., Johnson, J., Meisner, L., Zwaka,T. P., Thomson, J. A. & Andrews, P.W. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in culturedhuman embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 22:53–54 (2004).25. Mummery, C., Ward, D., van den Brink, C. E., Bird, S. D., Doevendans, P. A., Opthof, T., Brutelde la Riviere, A., Tertoolen, L., van der Heyden, M. & Pera, M. Cardiomyocyte differentiation ofmouse and human embryonic stem cells. J. Anat. 200:233–242 (2002).26. Nistor, I. G., Totoiu, M. O., Haque, N., Carpenter, M. K. & Keirstead, H. S. Human embryonic24

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第 三 章胚 幹 細 胞 體 外 培 養 與 定 向 誘 導 分 化Cultivation and Differentiation of Embryonic Stem Cells沈 家 寧 林 宇 星 張 曉 旻 陳 志 龍 簡 皎 芸中 央 研 究 院 基 因 體 研 究 中 心一 、 前 言幹 細 胞 (stem cells), 是 屬 於 發 育 初 期 的 原 始 細 胞 , 它 之 所 以 廣 受 矚 目 在 於 能 夠 自 我更 新 , 並 且 具 有 分 化 (differentiation) 成 為 各 式 各 樣 細 胞 的 潛 力 。 早 在 19 世 紀 末 , 人 們 在研 究 海 膽 的 胚 胎 發 育 時 , 就 發 現 早 期 的 胚 胎 細 胞 能 分 化 生 成 海 膽 各 式 各 樣 的 細 胞 的 潛 力 , 當時 這 些 細 胞 被 稱 做 「 未 決 定 」 細 胞 。 隨 著 生 物 學 的 發 展 , 科 學 家 發 現 這 些 發 育 初 期 的 原 始 細胞 是 各 種 細 胞 的 發 源 之 幹 , 因 此 就 稱 這 些 原 始 細 胞 為 幹 細 胞1 。 近 年 來 , 科 學 家 發 現 幹 細 胞 不僅 存 在 於 早 期 的 胚 胎 中 , 也 可 以 在 許 多 的 組 織 中 找 到 , 因 此 把 從 早 期 胚 胎 分 離 出 來 的 幹 細 胞命 名 為 胚 幹 細 胞 (embryonic stem cells), 而 從 皮 膚 、 骨 髓 、 臍 帶 血 、 角 膜 等 成 體 組 織 所 得到 的 幹 細 胞 , 就 稱 為 成 體 幹 細 胞 (adult stem cells) 或 體 幹 細 胞 (somatic stem cells)。目 前 研 究 發 現 大 部 分 從 組 織 分 離 出 來 的 幹 細 胞 , 只 能 變 成 有 限 的 幾 種 組 織 細 胞 ; 但 是從 早 期 發 育 的 囊 胚 所 分 離 出 來 的 胚 幹 細 胞 就 是 所 謂 的 多 潛 能 幹 細 胞 (pluripotent stem cells)2 , 能 夠 分 化 成 為 各 式 各 樣 的 細 胞 。 這 些 細 胞 在 體 外 與 纖 維 母 細 胞 共 同 培 養 之 後 , 能 「 長 生 不老 地 」 在 體 外 不 斷 增 生 , 同 時 長 期 維 持 多 潛 能 分 化 的 特 性 及 正 常 的 遺 傳 組 成 ; 相 反 地 , 在 體外 培 養 時 施 以 適 當 的 誘 導 條 件 下 , 多 潛 能 胚 幹 細 胞 就 能 夠 分 化 成 三 胚 層 及 生 殖 細 胞 , 進 一 步地 這 些 幹 細 胞 若 移 植 至 實 驗 動 物 體 內 , 可 以 分 化 成 多 種 器 官 組 織 細 胞 , 例 如 最 近 發 現 顯 示 胚幹 細 胞 可 以 分 化 成 為 神 經 細 胞 , 並 且 在 移 植 到 神 經 損 傷 的 小 鼠 後 , 可 以 產 生 新 的 神 經 細 胞 以修 復 小 鼠 腦 部 組 織 的 損 傷 , 顯 示 幹 細 胞 可 以 應 用 在 修 復 人 類 受 損 的 組 織 和 治 療 棘 手 的 退 化 性疾 病 上 , 未 來 並 預 期 可 應 用 在 器 官 移 植 、 新 藥 開 發 、 基 因 療 法 、 治 療 癌 症 等 方 面 的 發 展2 。二 、 體 外 培 養 胚 幹 細 胞1. 什 麼 是 胚 幹 細 胞在 胚 胎 發 育 過 程 中 , 受 精 卵 (zygote) 會 經 過 卵 裂 (cleavage), 即 經 歷 二 細 胞 時 期 (twocell stage)、 四 細 胞 時 期 (four cell stage)、 八 細 胞 時 期 (eight cell stage) 再 分 化 形 成 囊 胚(blastocyst); 在 囊 胚 著 床 後 (postimplantation) 鼠 胚 會 開 始 腔 腸 化 (gastrulation), 在 腔腸 化 時 期 上 胚 板 細 胞 (epiblast cell) 會 分 化 形 成 三 胚 層 (three germ layer), 即 外 胚 層27

(ectoderm)、 中 胚 層 (mesoderm)、 內 胚 層 (endoderm), 最 終 會 發 育 形 成 完 整 的 個 體 。胚 幹 細 胞 主 要 的 發 現 與 分 離 培 養 的 研 究 主 要 源 自 於 畸 胎 瘤 (teratoma) 的 研 究 中 3 , 為 了 分 析胚 胎 發 育 初 期 何 種 細 胞 可 以 形 成 畸 胎 瘤 , 在 利 用 移 植 小 鼠 後 產 生 畸 胎 瘤 的 方 式 , 發 現 在 胚 胎第 3.5 天 時 , 囊 胚 期 的 內 細 胞 團 (inner cell mass, ICM) 可 形 成 畸 胎 瘤 。 最 早 的 小 鼠 胚 幹 細 胞株 在 1981 年 由 馬 丁 博 士 利 用 培 養 惡 性 胚 胎 瘤 細 胞 的 方 法 建 立 出 來 4 , 囊 胚 主 要 分 成 兩 群 細 胞 ,外 圍 的 胚 胎 滋 養 層 (trophectoderm) 以 及 內 部 的 內 細 胞 團 。 在 囊 胚 未 著 床 前 , 可 將 內 細 胞 團分 離 出 來 , 在 體 外 與 胚 胎 纖 維 母 細 胞 (embryonic fibroblast) 共 同 培 養 後 成 為 具 有 近 乎 無 限增 殖 能 力 的 細 胞 株 , 維 持 自 我 更 新 (self-renewal) 狀 態 。 鼠 胚 幹 細 胞 在 體 外 適 當 培 養 之 後 ,可 植 入 囊 胚 產 生 嵌 合 鼠 (chimera mice), 而 胚 幹 細 胞 可 發 育 成 包 括 生 殖 細 胞 在 內 的 所 有 體 細胞 , 因 此 美 國 科 學 家 卡 佩 奇 (Mario R. Capecchi)、 史 密 迪 斯 (Oliver Smithies) 及 英 國 科 學家 艾 萬 斯 (Martin J. Evans) 等 人 就 利 用 老 鼠 胚 幹 細 胞 的 能 形 成 嵌 合 鼠 特 性 , 發 展 基 因 剔 除技 術 (gene knock-out) 得 2007 年 的 諾 貝 爾 醫 學 獎 。 雖 然 在 1981 年 小 鼠 胚 幹 細 胞 株 就 培 養 建立 出 來 , 但 一 直 到 1998 年 美 國 科 學 家 湯 姆 森 (James Thomson) 才 首 次 建 立 人 類 的 胚 幹 細胞 。 在 體 外 培 養 胚 幹 細 胞 株 , 最 重 要 的 就 是 維 持 其 多 潛 能 分 化 特 性 (pluripotency), 具 體 的說 , 即 維 持 胚 幹 細 胞 株 具 有 分 化 成 三 胚 層 細 胞 的 能 力 。 雖 然 分 離 人 類 的 胚 幹 細 胞 的 方 式 與 早年 馬 丁 博 士 的 方 法 類 似 , 但 最 近 研 究 報 告 指 出 , 小 鼠 胚 幹 細 胞 與 人 類 胚 幹 細 胞 的 基 因 表 現 有極 大 的 差 異 , 某 些 基 因 的 表 現 量 從 相 差 2 倍 到 50 倍 不 等 5 , 顯 示 在 人 類 胚 幹 細 胞 的 培 養 上 必 須利 用 不 同 的 因 子 來 達 成 維 持 多 潛 能 分 化 特 性 。2. 調 節 胚 幹 細 胞 自 我 更 新 的 因 子 與 多 潛 能 分 化 特 性 的 維 持因 為 胚 幹 細 胞 具 有 多 潛 能 分 化 特 性 , 所 以 如 何 經 由 不 同 的 訊 息 傳 遞 路 徑 , 來 調 控 胚 幹 細胞 的 多 潛 能 性 , 是 非 常 重 要 的 。 胚 幹 細 胞 欲 維 持 不 分 化 的 狀 態 同 時 又 必 須 進 行 自 我 更 新 的 過程 , 致 使 胚 幹 細 胞 有 不 同 於 分 化 細 胞 的 特 有 的 轉 錄 因 子 , 由 這 些 分 子 間 的 交 互 作 用 及 訊 息 傳導 , 來 維 持 胚 幹 細 胞 的 特 性 , 以 下 將 區 分 成 胚 幹 細 胞 本 身 的 轉 錄 因 子 (transcription factor)及 外 部 的 自 我 更 新 調 控 因 子 分 別 來 說 明 :(a) 調 節 胚 幹 細 胞 自 我 更 新 與 多 潛 能 分 化 特 性 的 轉 錄 因 子目 前 對 胚 幹 細 胞 的 研 究 發 現 有 一 些 特 定 轉 錄 因 子 參 與 調 控 胚 幹 細 胞 多 潛 能 性 及 自我 更 新 的 特 性 。 這 些 轉 錄 因 子 包 括 Oct-4、Nanog、Sox-2 及 FoxD3 等 。 在 轉 錄 調 控 方面 ,Oct-4 及 Sox2 扮 演 重 要 的 樞 紐 角 色 ,Oct-4 是 具 有 POU domain 的 一 類 轉 錄 蛋 白 ,Oct-4 能 抑 制 胚 胎 滋 養 層 細 胞 之 分 化 , 並 藉 由 辨 認 與 結 合 啟 動 子 (promoter) 上AGTCAAAT 等 8 個 特 定 核 苷 酸 的 重 覆 序 列 , 與 具 有 HMG box 的 Sox2 結 合 , 同 時 調 控胚 幹 細 胞 主 要 的 自 我 更 新 基 因 如 FGF4, 藉 以 維 持 細 胞 的 多 能 性6 ; 另 一 個 重 要 的 轉 錄 因子 Nanog, 則 具 有 homeobox domain,Nanog 表 現 則 可 抑 制 胚 幹 細 胞 之 分 化 與 內 胚 層細 胞 之 發 育6 ; 此 外 研 究 也 發 現 缺 乏 FoxD3 基 因 的 小 鼠 胚 胎 存 活 率 很 低 , 同 時 發 現 在 胚胎 發 育 的 過 程 中 , 如 果 缺 乏 FoxD3 基 因 , 就 無 法 維 持 幹 細 胞 在 最 原 始 未 分 化 的 狀 態進 一 步 最 近 日 本 京 都 大 學 的 山 中 教 授 (Shinya Yamanaka) 的 研 究 發 現 , 將 四 個 與 「 調控 胚 幹 細 胞 特 性 」 有 關 的 轉 錄 因 子 -Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4, 送 入 纖 維 母 細 胞 , 就 可以 使 成 年 小 鼠 皮 膚 纖 維 細 胞 具 有 多 潛 能 分 化 的 幹 細 胞 特 性7,8 。6 。28

(b) 調 節 胚 幹 細 胞 自 我 更 新 與 多 潛 能 分 化 特 性 的 環 境 訊 息 傳 遞 因 子在 1988 年 威 廉 博 士 (Williams RL) 的 團 隊 發 現 在 體 外 培 養 小 鼠 胚 幹 細 胞 , 白 血 病抑 制 因 子 (leukemia inhibitory factor, LIF) 在 維 持 其 多 潛 能 分 化 特 性 上 , 扮 演 十 分 重 要的 角 色9,10 ;LIF 會 經 由 與 細 胞 激 素 受 體 gp130 與 其 受 體 (LIF receptor, LIFR) 結 合 活化 下 游 的 訊 息 傳 遞 途 徑 JAK/STAT 及 ERK 來 維 持 小 鼠 胚 幹 細 胞 的 特 性 。 一 方 面 ,LIF 藉同 時 與 gp130 與 LIFR 等 2 個 穿 膜 蛋 白 結 合 , 活 化 細 胞 內 JAK/STAT 的 訊 號 傳 導 (signaltransduction), 以 控 制 自 我 更 新 基 因 的 活 化 ; 另 一 方 面 ,gp130 的 SH2 domain 自 動 磷酸 化 會 引 發 Grb2-SOS 聚 集 活 化 造 成 ERK 磷 酸 化 , 並 啟 動 增 生 與 分 化 的 基 因 , 因 此 LIF的 訊 息 傳 導 同 時 具 有 調 控 自 我 更 新 基 因 與 分 化 基 因 的 雙 重 角 色 , 所 以 JAK/STAT 及 ERK訊 息 傳 導 路 徑 之 間 的 平 衡 , 對 於 維 持 小 鼠 胚 幹 細 胞 的 自 我 更 新 相 當 重 要 。 但 相 較 於 小 鼠胚 幹 細 胞 ,LIF 所 誘 導 的 JAK/STAT 訊 息 傳 遞 途 徑 , 在 維 持 靈 長 類 胚 幹 細 胞 的 多 潛 能 分化 特 性 上 並 不 重 要11,12 , 人 類 胚 幹 細 胞 雖 然 也 具 有 相 同 的 訊 號 傳 導 , 但 是 LIF 所 活 化 的因 子 卻 不 足 以 維 持 其 自 我 更 新 的 能 力 。相 反 的 Wnt/β-catenin 的 訊 息 傳 遞 途 徑 , 在 維 持 胚 幹 細 胞 的 多 潛 能 分 化 特 性 上 , 不論 對 小 鼠 胚 幹 細 胞 或 靈 長 類 ( 包 括 人 類 ) 的 胚 幹 細 胞 , 都 扮 演 了 十 分 重 要 的 角 色 ;2004年 的 文 獻 指 出 ,Wnt 在 小 鼠 胚 胎 幹 細 胞 和 人 類 胚 幹 細 胞 , 可 經 由 抑 制 GSK-3β(glycogensynthase kinase-3b) 來 活 化 β-catenin, 而 能 有 效 的 維 持 胚 幹 細 胞 處 於 未 分 化 的 狀 態Wnt 是 一 種 富 含 半 胱 胺 酸 的 醣 蛋 白 與 其 受 體 Frizzled(Frz) 的 結 合 會 活 化 Dishevelled(Dsh), 進 而 抑 制 GSK3β-APC-Axin 複 合 物 的 活 性 , 使 得 β-catenin 不 會 被 分 解 而 有 機會 進 入 核 內 進 行 基 因 轉 錄 。 所 以 當 Wnt/β-catenin 的 訊 息 傳 遞 途 徑 被 活 化 時 , 可 使 小 鼠胚 幹 細 胞 與 人 類 胚 幹 細 胞 即 使 在 無 滋 養 層 細 胞 的 培 養 下 , 也 能 保 持 在 不 分 化 的 狀 態 。 除此 之 外 , 研 究 也 發 現 PI3K/Akt 訊 息 傳 遞 途 徑 的 活 化 也 會 抑 制 GSK3β 的 活 性 , 同 時 使β-catenin 不 會 被 分 解 , 而 有 機 會 進 入 核 內 進 行 基 因 轉 錄 , 在 調 控 胚 幹 細 胞 自 我 更 新 的 研究 中 發 現 ,PI3K/Akt 訊 息 傳 遞 途 徑 不 單 可 以 調 控 胚 幹 細 胞 的 生 長 (proliferation), 如 果在 PI3K/Akt 訊 息 傳 遞 途 徑 被 抑 制 時 ,Nanog 基 因 的 表 現 也 會 降 低 並 影 響 到 胚 幹 細 胞 的自 我 更 新 , 相 反 地 , 如 果 將 持 續 活 化 態 的 Akt 送 入 胚 幹 細 胞 , 發 現 這 將 足 以 維 持 胚 幹 細胞 的 多 潛 能 分 化 特 性14,15 。另 外 , 研 究 也 發 現 鹼 性 纖 維 母 細 胞 生 長 因 子 (basic fibroblast growth factor,bFGF)、 乙 型 腫 瘤 生 長 因 子 (tumor growth factor β, TGF β)、Nodal、 骨 形 態 發 生 蛋白 (bone morphogenesis protein, BMP) 等 訊 息 傳 遞 因 子 也 參 與 維 持 胚 幹 細 胞 的 多 潛 能分 化 特 性 。 如 bFGF 在 培 養 人 類 胚 胎 幹 細 胞 常 用 的 添 加 物 , 一 般 認 為 bFGF 可 活 化PI3K/Akt 訊 號 傳 導 維 持 胚 胎 幹 細 胞 的 自 我 更 新 , 在 培 養 液 中 移 除 bFGF 會 使 得 Oct-4 表現 量 減 低 , 而 使 得 人 類 胚 胎 幹 細 胞 開 始 分 化16 。 而 TGF-β 透 過 Smad2/3 的 磷 酸 化 活 化來 控 制 下 游 基 因 轉 錄 , 如 果 抑 制 Smad2/3 磷 酸 化 會 使 得 人 類 胚 幹 細 胞 減 少 自 我 更 新 的能 力 , 並 造 成 Oct-4 的 表 現 量 降 低17 。Nodal 對 於 脊 椎 動 物 左 右 對 稱 性 (left-right axis)與 中 胚 層 及 內 胚 層 組 織 的 形 成 相 當 重 要 , 藉 由 第 一 型 (ALK4/7) 與 第 二 型 Activin 受 器結 合 , 活 化 Smad2/3 媒 介 的 訊 號 傳 導 , 實 驗 證 實 小 鼠 與 人 類 胚 幹 細 胞 均 具 有 高 量 Nodal表 現17,18 , 當 胚 幹 細 胞 分 化 時 ,Nodal 的 表 現 量 即 減 低 , 顯 示 Nodal 與 自 我 更 新 的 相 關13 。29

性 。 而 在 小 鼠 胚 幹 細 胞 培 養 中 ,BMP 也 是 不 可 或 缺 的 調 控 因 子19 ,BMP 透 過 其 受 體BMPR1a、1b 與 BMPR2 造 成 Smad1/5/8 與 Smad4 磷 酸 化 來 傳 遞 訊 息 , 以 參 與 調 控 胚幹 細 胞 的 多 潛 能 分 化 特 性 ; 但 是 相 反 地 在 人 類 胚 幹 細 胞 培 養 中 , 加 入 BMP 卻 會 促 使Nanog 與 Oct-4 表 現 量 減 低 , 進 而 造 成 人 類 胚 幹 細 胞 分 化6,16 。3. 體 外 培 養 胚 幹 細 胞因 為 胚 幹 細 胞 具 有 多 潛 能 分 化 特 性 , 所 以 在 培 養 胚 幹 細 胞 之 前 , 基 本 上 必 須 了 解 如 何 經 由不 同 的 訊 息 傳 遞 路 徑 , 來 調 控 胚 幹 細 胞 的 多 潛 能 分 化 特 性 並 維 持 細 胞 的 增 生 與 自 我 更 新 , 胚幹 細 胞 欲 維 持 不 分 化 的 狀 態 , 同 時 又 必 須 進 行 自 我 更 新 的 過 程 , 致 使 胚 幹 細 胞 有 不 同 於 分 化細 胞 的 特 有 的 轉 錄 因 子 , 由 這 些 分 子 間 的 交 互 作 用 及 訊 息 傳 導 , 來 維 持 胚 幹 細 胞 的 特 性 。 目前 鼠 胚 幹 細 胞 株 培 養 方 法 還 是 參 照 1981 年 由 馬 丁 博 士 從 培 養 惡 性 胚 胎 瘤 細 胞 的 經 驗 中 所 建立 出 來4 , 在 體 外 透 過 與 胚 胎 纖 維 母 細 胞 共 同 培 養 , 來 維 持 胚 幹 細 胞 自 我 更 新 狀 態 。 小 鼠 胚胎 幹 細 胞 可 以 培 養 在 經 過 絲 裂 黴 素 -C(mitomycin C) 處 理 或 是 照 射 γ 射 線 的 胚 胎 纖 維 母 細胞 或 STO 細 胞 株 上 , 所 使 用 的 老 鼠 胚 胎 纖 維 母 細 胞 分 離 自 E13.5-E15.5 老 鼠 胚 胎 ; 最 近 的研 究 發 現 小 鼠 胚 幹 細 胞 也 可 以 培 養 在 無 滋 養 層 甚 至 無 血 清 的 條 件 下 , 透 過 在 培 養 基 添 加LIF、BMP 及 B27 等 血 清 替 代 因 子 或 培 養 皿 預 先 以 Matrigel 或 是 膠 原 蛋 白 (collagen) 等 塗層 處 理 下 , 使 大 部 份 小 鼠 胚 幹 細 胞 能 自 我 更 新 , 並 保 有 其 多 潛 能 分 化 特 性 ,( 培 養 流 程 請 參 考圖 一 )。 胚 幹 細 胞 繼 代 培 養 , 通 常 利 用 酵 素 如 膠 原 蛋 白 酶 ( collagenase) 或 胰 蛋 白 酶 ( trypsin)處 理 後 , 使 胚 幹 細 胞 團 自 滋 養 層 脫 落 , 並 分 解 成 較 小 的 細 胞 團 , 移 至 新 的 培 養 皿 繼 續 培 養 。圖 一 、 胚 幹 細 胞 培 養 在 絲 裂 黴 素 C 處 理 過 的 纖 維 母 細 胞 上 ; 繼 代 培 養 時 需 預 先 以 玻 璃 刀 將 胚幹 細 胞 切 割 成 小 團 塊 來 培 養 ( 圖 : 林 宇 星 ( 中 央 研 究 院 基 因 體 研 究 中 心 ) 提 供 )30

培 養 人 類 胚 幹 細 胞 的 方 式 類 似 小 鼠 胚 胎 幹 細 胞 , 可 以 培 養 在 經 過 絲 裂 黴 素 -C 處 理 或 是 照射 γ 射 線 的 鼠 胚 胎 纖 維 母 細 胞 或 是 人 類 纖 維 母 細 胞 上 ( 圖 一 ), 目 前 也 發 現 Hs-68、Detroit551、STO 等 纖 維 母 細 胞 株 也 可 以 當 作 人 類 胚 幹 細 胞 滋 養 細 胞20 , 與 鼠 胚 幹 細 胞 培 養 不 同 的是 , 透 過 在 培 養 基 添 加 LIF 或 BMP 並 不 足 以 維 持 胚 幹 細 胞 自 我 更 新 狀 態 , 並 保 有 其 多 潛 能分 化 特 性 ; 相 反 地 可 添 加 bFGF 來 維 持 不 分 化 的 狀 態 。 然 而 現 有 人 類 胚 幹 細 胞 的 培 養 和 誘 導分 化 , 大 都 離 不 開 動 物 源 培 養 基 , 比 如 從 實 驗 鼠 身 上 分 離 出 來 的 纖 維 母 組 織 細 胞 和 牛 胚 胎 血清 等 。 美 國 加 州 的 科 學 家 發 現 動 物 細 胞 中 含 有 N- 羥 乙 酰 神 經 氨 酸 的 硅 鋁 酸 ( Neu5Gc),而 這 種 物 質 在 人 類 遺 傳 上 是 不 能 合 成 的 。 如 果 幹 細 胞 被 含 有 N- 羥 乙 酰 神 經 氨 酸 的 細 胞 污染 , 那 麼 將 其 植 入 人 體 後 就 很 容 易 被 人 類 免 疫 系 統 識 別 和 攻 擊 , 產 生 排 斥 反 應21 。 此 項 研 究引 發 了 科 學 家 對 幹 細 胞 安 全 性 的 擔 憂 , 也 讓 人 們 對 幹 細 胞 療 法 的 醫 學 前 景 充 滿 疑 慮 。 因 此 研究 人 員 嘗 試 發 展 無 動 物 滋 養 層 及 無 動 物 血 清 培 養 人 類 胚 幹 細 胞 的 系 統 , 添 加 的 物 質 都 是 已 知的 重 組 蛋 白 及 化 合 物 , 預 期 將 可 直 接 應 用 於 醫 學 移 植 的 用 途 , 目 前 的 缺 點 是 花 費 太 大 , 且 培養 液 中 需 加 入 高 濃 度 的 生 長 激 素 , 才 足 以 維 持 人 類 幹 細 胞 自 我 更 新 的 狀 態22-23 。 至 於 人 類 胚幹 細 胞 繼 代 培 養 , 研 究 發 現 如 果 用 酵 素 分 解 細 胞 團 塊 容 易 造 成 細 胞 染 色 體 異 常 , 目 前 常 用 的方 式 還 是 利 用 玻 璃 刀 將 人 類 胚 幹 細 胞 團 切 割 成 小 團 塊 之 後 在 進 行 繼 代 培 養 , 此 方 式 不 會 有 因酵 素 處 理 胚 幹 細 胞 許 多 代 之 後 , 產 生 染 色 體 異 常 的 情 況 , 但 缺 點 是 效 率 比 較 不 佳 。為 鑑 定 胚 幹 細 胞 在 培 養 後 , 是 否 維 持 在 未 分 化 的 狀 態 並 保 有 多 潛 能 分 化 特 性 , 一 般 可 利 用胚 幹 細 胞 未 分 化 狀 態 所 表 現 的 分 子 標 誌 來 鑑 定 , 包 括 (a) 鹼 性 磷 酸 酶 (Alkaline Phosphatase)的 活 性 (b)Oct-4、Nanog、Sox2 等 基 因 的 表 現 , 以 及 ( c) 階 段 特 異 性 胚 胎 抗 原 (stages-specificembryonic antigen, SSEA) 的 表 現 來 鑑 定 胚 幹 細 胞 是 否 處 於 未 分 化 狀 態 ( 已 知 SSEA1 為 小鼠 胚 幹 細 胞 特 有 的 , 而 SSEA2/3/4 為 人 類 胚 幹 細 胞 特 有 的 )。三 、 定 向 誘 導 胚 幹 細 胞 分 化1. 誘 導 胚 幹 細 胞 分 化相 較 於 胚 幹 細 胞 在 培 養 時 , 透 過 在 培 養 基 添 加 LIF、BMP 及 Wnt 等 因 子 或 利 用 與 胚 胎 纖維 母 細 胞 共 同 培 養 , 來 維 持 在 未 分 化 的 狀 態 並 保 有 多 潛 能 分 化 特 性 ; 胚 幹 細 胞 在 單 獨 培 養且 不 添 加 LIF、BMP 及 Wnt 等 因 子 時 , 則 會 很 容 易 地 進 行 隨 機 的 分 化 ; 因 此 為 了 有 效 率 地誘 導 胚 幹 細 胞 分 化 , 所 以 會 讓 胚 幹 細 胞 在 懸 浮 的 狀 態 下 培 養 , 在 此 狀 態 下 培 養 的 鼠 胚 幹 細胞 會 形 成 球 狀 的 胚 胎 小 體 (embryoid body), 並 逐 漸 分 化 出 三 胚 層 : 分 別 為 外 胚 層 、 中 胚層 及 內 胚 層 的 前 驅 細 胞 (progenitor) 24 。 此 外 要 誘 導 胚 幹 細 胞 分 化 , 也 可 以 採 用 不 經 過 胚胎 小 體 的 培 育 過 程 , 直 接 將 胚 幹 細 胞 培 養 在 基 質 細 胞 (stromal cell) 上 , 或 是 將 胚 幹 細 胞培 養 於 細 胞 外 基 質 (extracellular matrix) 上 , 胚 幹 細 胞 會 因 不 同 的 基 質 細 胞 , 或 是 細 胞 外基 質 的 影 響 , 進 而 分 化 成 各 種 不 同 的 前 驅 細 胞25 。 在 利 用 不 同 的 誘 導 方 式 下 , 胚 幹 細 胞 已發 現 至 少 可 於 體 外 分 化 成 外 胚 層 的 表 皮 角 質 細 胞 系 (keratinocyte lineage)、 神 經 膠 質 前 驅細 胞 (glial precursor)、 多 巴 胺 神 經 元 (dopaminergic neuron)、 中 胚 層 的 心 肌 細 胞(cardiomyocyte)、 內 胚 層 的 肝 細 胞 (hepatocyte) 等 ; 進 一 步 地 研 究 都 希 望 可 以 利 用 胚幹 細 胞 的 分 化 而 來 的 組 織 細 胞 進 行 移 植 , 用 以 治 療 了 許 多 損 壞 性 、 功 能 障 礙 、 退 化 性 , 或31

是 目 前 手 術 開 刀 無 法 治 癒 之 疾 病 , 因 此 如 何 定 向 誘 導 胚 幹 細 胞 分 化 , 進 而 應 用 到 人 類 的 疾病 治 療 上 , 是 十 分 重 要 的 課 題 。2. 誘 導 胚 幹 細 胞 分 化 為 外 胚 層 神 經 細 胞 及 皮 膚 細 胞(a) 外 胚 層 發 育 與 相 關 因 子 調 控早 期 胚 胎 發 育 時 期 , 外 胚 層 細 胞 主 要 發 育 為 神 經 系 統 以 及 皮 膚 上 皮 系 統 , 外 胚 層 細胞 若 未 分 化 為 表 皮 組 織 即 分 化 為 神 經 組 織 , 在 脊 椎 動 物 的 囊 胚 時 期 , 外 胚 層 腹 側 主 要 形成 表 皮 前 驅 細 胞 , 背 側 主 要 誘 發 為 神 經 前 驅 細 胞 , 早 期 研 究 青 蛙 外 胚 層 發 育 結 果 指 出 ,若 將 背 側 與 腹 側 外 胚 層 取 出 作 體 外 培 養 則 兩 者 皆 分 化 形 成 表 皮 , 另 一 項 在 蠑 螈 胚 胎 發 育研 究 指 出 , 若 將 與 背 側 相 鄰 的 間 葉 組 織 (mesenchymal tissue) 細 胞 取 出 植 入 外 胚 層 腹側 , 則 使 得 原 先 即 將 分 化 成 表 皮 的 細 胞 轉 而 分 化 成 神 經 細 胞 系 , 顯 示 外 胚 層 的 分 化 方 向與 其 環 境 所 釋 放 的 因 子 息 息 相 關26 。早 期 針 對 脊 椎 動 物 研 究 中 發 現 , 神 經 誘 導 主 要 來 自 於 其 周 圍 環 境 所 釋 放 的 訊 息 傳 遞因 子 所 調 控 , 其 中 稱 之 為 神 經 誘 導 因 子 包 含 noggin、follistatin、chordin 等27-29 , 由 背側 中 胚 層 細 胞 所 分 泌 , 並 且 可 在 體 外 培 養 的 條 件 中 誘 導 外 胚 層 分 化 為 神 經 細 胞 。 另 外 亦有 相 關 研 究 指 出 bFGF 在 神 經 誘 導 上 亦 扮 演 相 當 重 要 角 色 , 在 體 外 培 養 外 胚 層 細 胞 中 以含 有 bFGF 的 低 鈣 離 子 及 鎂 離 子 濃 度 的 培 養 液 中 可 誘 導 細 胞 分 化 具 有 神 經 活 性30 , 另 在缺 乏 功 能 的 纖 維 母 細 胞 生 長 因 子 受 體 蛋 白 (FGF receptor) 的 青 蛙 顯 示 在 胚 胎 時 期 無 法誘 導 神 經 的 形 成31 , 而 bFGF 亦 參 與 調 控 特 定 神 經 細 胞 晚 期 分 化 的 過 程32 。Wnt 蛋 白 所 主 導 的 訊 息 傳 遞 在 神 經 發 育 中 亦 扮 演 相 當 重 要 的 角 色 , 在 Wnt 與 Frz 受體 結 合 後 會 促 使 β-catenin 進 入 細 胞 核 中 與 其 他 蛋 白 結 合 形 成 複 合 體 以 調 控 下 游 基 因 表現 。 在 早 期 神 經 管 特 化 過 程 中 ,Wnt 蛋 白 會 由 前 側 至 後 側 神 經 管 (anterior-posteriorneural tube) 產 生 濃 度 梯 度 以 調 節 相 關 區 域 分 別 產 生 前 腦 , 後 腦 及 脊 椎 神 經 , 另 也 控 制神 經 傳 導 中 軸 突 (axon)、 樹 突 (dendrite) 以 及 胞 突 接 合 (synapse) 功 能 的 調 控在 皮 膚 發 育 過 程 中 ,Wnt 訊 息 傳 遞 也 控 制 皮 膚 中 附 屬 器 官 毛 髮 的 發 育 與 成 熟 , 若 Wnt訊 息 下 游 的 分 子 無 法 進 行 傳 遞 時 , 即 造 成 毛 髮 無 法 形 成34-35 。BMP 為 屬 於 TGF-β 家 族 中 的 一 員 , 經 由 和 BMP 受 體 結 合 來 啟 動 下 游 基 因 表 現 。 根據 研 究 指 出 , 在 胚 胎 早 期 BMP-4 可 抑 制 神 經 並 誘 導 外 胚 層 往 上 皮 細 胞 (epithelial cells)分 化36 , 當 進 入 胚 胎 晚 期 ,BMP 可 協 同 其 拮 抗 分 子 與 Smad 蛋 白 調 節 表 皮 與 毛 囊 細 胞的 增 生 與 分 化 。 胚 胎 幹 細 胞 體 外 誘 導 分 化 為 外 胚 層 組 織 所 參 與 的 訊 息 調 控 主 要 與 胚 胎 發育 過 程 相 似 , 因 此 根 據 胚 胎 發 育 研 究 結 果 顯 示 參 與 調 控 的 生 長 因 子 可 有 助 於 探 討 胚 幹 細胞 以 體 外 培 養 方 式 誘 導 出 特 定 的 細 胞 的 可 能 性 , 而 研 究 胚 幹 細 胞 分 化 過 程 的 現 象 與 參 與的 訊 息 調 控 也 可 助 於 了 解 胚 胎 發 育 過 程 中 是 經 由 哪 些 訊 息 調 控 來 形 成 各 種 組 織 與 器 官 。33 。(b) 胚 幹 細 胞 體 外 誘 導 分 化 為 外 胚 層 組 織在 正 常 的 胚 胎 發 育 過 程 中 , 外 胚 層 可 分 化 成 數 種 組 織 細 胞 , 包 含 中 樞 神 經 細 胞 、 周邊 神 經 細 胞 、 皮 膚 上 皮 細 胞 等 , 由 近 十 年 研 究 發 展 顯 示 可 經 由 體 外 培 養 的 方 式 成 功 誘 導出 許 多 特 定 的 神 經 細 胞 以 及 皮 膚 角 質 細 胞 , 以 下 就 分 成 皮 膚 上 皮 細 胞 系 以 及 神 經 細 胞 系32

的 分 化 來 說 明 。(1) 胚 幹 細 胞 分 化 為 皮 膚 上 皮 細 胞 系在 胚 胎 發 育 過 程 中 , 皮 膚 的 形 成 須 經 由 一 連 串 與 其 相 鄰 的 間 質 細 胞 訊 息 交 換 過 程後 , 誘 導 器 官 發 育 (organogenesis), 而 此 訊 息 交 換 過 程 稱 為 epithelial-mesenchymalinteraction(EMI), 因 此 在 皮 膚 上 皮 細 胞 系 的 研 究 中 , 主 要 利 用 皮 膚 纖 維 母 細 胞 提 供 皮膚 上 皮 組 織 發 育 所 需 的 生 長 因 子 , 或 利 用 塗 覆 有 不 同 細 胞 外 基 質 的 培 養 盤 , 並 在 培 養 液中 加 入 相 關 生 長 因 子 來 誘 導 胚 幹 細 胞 分 化 成 皮 膚 角 質 細 胞 , 再 經 由 鑑 定 細 胞 是 否 表 現 特定 細 胞 角 質 素 (cytokeratin) 如 CK10 以 及 involucrin 來 判 斷 作 為 胚 幹 細 胞 是 否 分 化 為表 皮 細 胞 。 在 近 幾 年 關 於 胚 幹 細 胞 誘 導 成 表 皮 細 胞 的 方 法 主 要 有 兩 種 ..(i) 利 用 細 胞 分 泌 的 細 胞 外 基 質 (extracellular matrix, ECM) 來 誘 導 胚 幹 細 胞 分化 .. 將 人 類 纖 維 母 細 胞 先 培 養 於 培 養 盤 上 , 待 長 滿 後 以 EGTA/EDTA 溶 液 將 纖 維 母 細 胞除 去 , 則 培 養 盤 即 存 在 纖 維 母 細 胞 所 分 泌 的 細 胞 外 基 質 , 此 時 再 將 胚 幹 細 胞 培 養 於 此 培養 盤 上 , 於 培 養 液 中 加 入 BMP-4 或 維 生 素 C, 可 偵 測 到 將 近 10% 的 細 胞 表 現 細 胞 角 質素 CK14, 將 上 述 得 到 的 細 胞 收 集 , 轉 而 養 在 塗 覆 有 膠 原 蛋 白 的 表 面 上 , 並 以 氣 體 - 液 體介 面 (air-liquid interface) 培 養 系 統 使 培 養 的 角 質 細 胞 下 方 接 觸 培 養 液 , 上 方 則 與 空 氣接 觸 , 可 分 化 成 複 層 結 構 , 分 析 其 型 態 構 造 類 似 正 常 胚 胎 發 育 中 的 皮 膚 , 此 外 這 些 分 層的 細 胞 中 亦 表 現 分 化 成 熟 的 角 質 素 蛋 白 , 而 基 底 細 胞 表 現 纖 維 母 細 胞 的 細 胞 標 誌 , 證 明胚 幹 細 胞 具 有 分 化 形 成 表 皮 移 植 物 的 潛 力37 。(ii) 先 是 胚 幹 細 胞 培 養 成 胚 胎 小 體 後 , 使 胚 胎 小 體 貼 附 培 養 於 塗 覆 有 細 胞 外 基 質 的培 養 盤 上 , 即 可 誘 導 細 胞 分 化 為 皮 膚 上 皮 細 胞38 , 表 現 細 胞 角 質 素 CK8、14、17, 並 可更 進 ㄧ 步 分 化 表 現 成 熟 的 細 胞 標 誌 細 胞 角 質 素 CK10、Involucrin、Filaggrin 等 ( 圖 二 )。圖 二 、 誘 導 鼠 胚 幹 細 胞 分 化 為 皮 膚 上 皮 細 胞 系 的 兩 種 方 式 , 並 組 織 染 色 分 析 細 胞 分 化 後的 角 質 素 蛋 白 表 現 情 形 ( 圖 : 鄭 凱 文 ( 中 央 研 究 院 基 因 體 研 究 中 心 ) 提 供 )33

(2) 胚 幹 細 胞 分 化 為 神 經 細 胞 系另 一 項 重 要 的 胚 幹 細 胞 分 化 研 究 方 向 為 胚 幹 細 胞 分 化 為 神 經 細 胞 系 , 這 將 可 以 應 用在 一 些 神 經 退 化 性 疾 病 治 療 上 , 近 十 年 來 已 有 多 項 研 究 方 法 證 實 能 將 胚 幹 細 胞 誘 導 分 化為 神 經 外 胚 層 細 胞 , 包 含 以 下 由 不 同 研 究 團 體 所 發 表 的 培 養 條 件 :(i) 將 胚 幹 細 胞 懸 浮 培 養 四 天 形 成 胚 胎 小 體 後 , 以 含 有 維 甲 酸 (retinoic acid) 培養 液 誘 導 四 天 , 再 使 胚 胎 小 體 貼 附 培 養 數 天 後 , 即 可 得 到 表 現 TuJ 以 及 neurofilament的 神 經 細 胞39 。(ii) 胚 胎 小 體 先 培 養 在 含 有 血 清 的 培 養 液 並 使 之 貼 附 於 培 養 盤 24 小 時 後 , 轉 而 培養 於 不 含 血 清 的 環 境 中 6-8 天 後 可 分 化 為 神 經 前 驅 細 胞(iii) 直 接 將 胚 幹 細 胞 培 養 於 不 含 滋 養 細 胞 、 不 含 血 清 的 培 養 液 來 誘 導 分 化 胚 幹 細胞 , 數 天 後 約 大 於 60% 細 胞 表 現 胚 胎 早 期 神 經 外 胚 層 的 細 胞 標 誌 Sox1 41 。(iv) 將 胚 幹 細 胞 與 PA6 基 質 細 胞 共 同 培 養 , 加 入 不 含 血 清 的 培 養 液 , 結 果 顯 示 大於 90% 的 細 胞 群 落 表 現 TuJ 42 。由 以 上 方 法 可 誘 導 部 分 胚 幹 細 胞 分 化 為 神 經 外 胚 層 , 而 近 幾 年 來 則 有 許 多 研 究 可 更進 一 步 分 化 出 某 些 特 定 的 神 經 細 胞 , 例 如 中 樞 神 經 中 三 種 主 要 的 神 經 細 胞 種 類 : 神 經 元(neuron)、 星 狀 細 胞 (astrocyte), 寡 突 細 胞 (oligodendrocyte), 經 由 適 當 環 境 的 誘導 可 產 生 分 離 出 高 純 度 特 定 的 神 經 細 胞40,43 , 除 上 述 例 子 以 外 , 另 有 研 究 結 果 指 出 , 在胚 胎 小 體 的 培 養 系 統 中 使 細 胞 過 度 表 現 轉 錄 調 節 因 子 Nurr1(nuclear-receptor-relatedfactor 1), 並 於 培 養 環 境 中 加 入 SHH (sonic hedgehog) 以 及 FGF8 (fibroblast growthfactor-8) 可 產 生 中 腦 多 巴 胺 神 經 元44 , 顯 示 早 期 胚 胎 發 育 時 , 此 種 神 經 的 形 成 即 需 要SHH、FGF8、Nurr1 的 調 控45,46 。 若 將 胚 幹 細 胞 與 MS5 基 質 細 胞 共 同 培 養 , 加 入 不 同的 細 胞 激 素 則 可 刺 激 其 它 神 經 細 胞 的 分 化 , 包 括 膽 鹼 性 神 經 元 (cholinergic neuron)、血 清 素 神 經 元 (serotonergic neuron) 等43 。除 了 成 功 誘 導 特 定 神 經 細 胞 分 化 之 外 , 亦 有 些 研 究 顯 示 這 些 從 胚 幹 細 胞 分 化 而 來 的神 經 細 胞 具 有 治 療 一 些 神 經 退 化 性 疾 病 的 功 效 , 其 中 巴 金 森 氏 症 為 相 當 重 要 的 一 種 神 經退 化 性 疾 病 , 在 大 鼠 模 式 的 研 究 中 証 實 , 由 胚 幹 細 胞 誘 導 分 化 的 多 巴 胺 神 經 元 在 移 植 回大 鼠 身 上 後 仍 可 存 活 , 並 產 生 功 能 性 的 突 觸 以 及 電 生 理 特 性 , 若 移 植 以 Nurr1 過 度 表 現的 細 胞 顯 示 在 動 物 身 上 有 更 好 的 治 療 效 果44 。 另 也 有 研 究 指 出 , 將 胚 幹 細 胞 誘 導 成 神 經細 胞 、 星 狀 細 胞 、 寡 突 細 胞 後 移 植 入 大 鼠 腦 中 , 植 入 細 胞 可 遷 移 到 終 腦 、 間 腦 以 及 中 腦的 區 域47 ; 若 將 寡 突 細 胞 植 入 因 髓 鞘 缺 損 造 成 多 發 性 硬 化 的 大 鼠 脊 椎 中 , 植 入 的 細 胞 可在 脊 椎 形 成 髓 鞘48 , 顯 示 胚 幹 細 胞 在 將 來 有 機 會 可 應 用 在 移 植 修 復 缺 損 神 經 的 細 胞 來 源 。40 。3. 誘 導 胚 幹 細 胞 分 化 為 中 胚 層 血 液 細 胞 及 心 肌 細 胞(a) 中 胚 層 發 育 與 相 關 調 控 因 子胚 胎 發 育 經 由 腔 腸 化 時 期 開 始 形 成 中 胚 層 。 中 胚 層 形 成 後 會 分 化 成 為 造 血 細 胞(hematopoietic cells)、 成 骨 細 胞 (osteocyte)、 血 管 內 皮 細 胞 (vascular endothelialcells)、 肌 肉 細 胞 (muscle cells) 等 , 這 些 細 胞 組 成 了 體 內 的 循 環 系 統 。 細 胞 外 基 質 與參 與 細 胞 訊 息 傳 遞 的 分 子 如 TGF-ß、BMP4 以 及 Wnt 蛋 白 皆 參 與 了 胚 胎 分 化 成 中 胚 層34

的 過 程 , 當 β1-integrin 被 剔 除 時 , 胚 胎 發 育 至 第 5.5 天 時 死 亡49 , 此 時 胚 胎 的 中 胚 層 發育 延 遲 且 不 全 , 神 經 外 胚 層 發 育 加 快 , 其 中 BMP-4 基 因 表 現 降 低 而 Wnt-1 表 現 量 增加 。BMP-4 是 調 控 中 胚 層 形 成 的 重 要 基 因 , 缺 乏 BMP-4 或 加 入 noggin 會 抑 制 中 胚 層形 成 或 抑 制 分 化 為 心 肌 細 胞 。(b) 胚 幹 細 胞 體 外 誘 導 分 化 為 中 胚 層 組 織在 探 討 基 因 在 細 胞 分 化 過 程 中 的 功 能 時 , 我 們 通 常 採 用 兩 種 方 法 :(1) 減 少 基 因 表現 (lose-of-function);(2) 增 加 基 因 表 現 (gain-of-function)。 主 要 是 因 為 基 因 表 現 的些 許 差 異 便 會 影 響 胚 胎 發 育 , 藉 由 這 些 差 異 我 們 可 以 了 解 基 因 在 分 化 過 程 中 的 功 能 , 但是 由 於 胚 胎 內 特 定 細 胞 數 很 少 因 此 在 研 究 基 因 與 專 一 細 胞 分 化 的 過 程 較 困 難 。 在 此 胚 胎幹 細 胞 提 供 了 解 決 方 法 , 由 於 胚 幹 細 胞 具 有 分 化 為 原 始 三 胚 層 的 能 力 , 細 胞 數 目 眾 多 ,因 此 可 用 來 研 究 胚 胎 時 期 時 各 因 子 在 細 胞 分 化 過 程 中 所 扮 演 角 色 , 但 是 利 用 胚 幹 細 胞 研究 中 胚 層 的 發 育 , 是 否 能 真 實 的 反 應 出 胚 胎 中 胚 層 的 發 育 呢 ? 以 胚 幹 細 胞 分 化 為 血 液 細胞 為 例 , 胚 幹 細 胞 形 成 胚 胎 小 體 約 四 天 後 開 始 出 現 原 始 紅 血 球 細 胞 , 之 後 陸 續 出 現 巨 噬細 胞 (macrophage) 與 肥 大 細 胞 (mast cells), 顯 示 胚 幹 細 胞 分 化 過 程 中 細 胞 分 化 的順 序 與 胚 胎 發 育 早 期 造 血 系 統 的 順 序 相 似50 。 胚 幹 細 胞 在 體 外 分 化 為 內 皮 細 胞 的 過 程 與胚 胎 內 皮 細 胞 出 現 順 序 相 似 , 在 胚 小 體 形 成 後 第 三 天 開 始 表 現 FLK1, 第 四 天 表 現PECAM、tie-2, 第 五 天 表 現 VE-cadherin、tie-1 51 。 胚 幹 細 胞 在 體 外 分 化 為 肌 肉 細 胞 的過 程 , 基 因 表 現 的 順 序 為 Myf5→myogenin→myoD→myf6, 基 因 出 現 的 模 式 與 胚 胎 相同 , 例 如 Myf5 出 現 在 單 核 的 肌 母 細 胞 (myoblast), myoD 出 現 在 多 核 的 肌 肉 細 胞 。 除此 之 外 , 在 誘 導 分 化 的 過 程 中 可 成 功 的 分 化 成 骨 骼 肌 肉 細 胞 與 具 有 律 動 的 心 肌 細 胞這 些 結 果 說 明 利 用 胚 幹 細 胞 研 究 細 胞 發 育 可 以 獲 得 胚 胎 發 育 相 似 的 結 果 。在 正 常 的 胚 胎 發 育 過 程 中 , 中 胚 層 可 分 化 成 數 種 組 織 , 包 含 血 液 及 淋 巴 細 胞 、 肌 肉組 織 與 血 管 組 織 等 , 由 近 十 年 研 究 發 展 顯 示 可 經 由 體 外 培 養 的 方 式 成 功 誘 導 胚 幹 細 胞 出許 多 特 定 的 血 液 細 胞 以 及 心 肌 細 胞 , 以 下 就 此 進 一 步 來 說 明 。(1) 胚 幹 細 胞 分 化 為 血 液 細 胞 系以 小 鼠 為 例 , 血 液 細 胞 最 早 出 現 於 小 鼠 胚 胎 時 期 7.5 天 , 在 卵 黃 囊 內 的 血 島 區 域 發現 具 有 細 胞 核 的 原 始 紅 血 球 細 胞 (primitive erythocytes) 以 及 巨 噬 細 胞5 , 此 時 期 的 細胞 不 具 有 造 血 幹 細 胞 的 功 能 , 因 為 將 這 個 時 期 的 血 液 細 胞 進 行 體 內 移 植 並 無 法 重 建 長 期造 血 系 統 , 而 真 正 的 造 血 幹 細 胞 被 發 現 在 胚 胎 第 十 天 於 胚 胎 AGM(aotra, gonads andmesonephroi) 區 域 , 在 胚 胎 時 期 第 十 一 天 時 胎 兒 肝 臟 中 也 發 現 造 血 幹 細 胞 , 之 後 造 血幹 細 胞 在 骨 髓 出 現 , 出 生 後 漸 由 骨 髓 負 責 產 生 血 液 細 胞胚 幹 細 胞 可 以 分 化 為 許 多 種 血 液 細 胞 , 例 如 ; 紅 血 球 細 胞 、 巨 噬 細 胞 、T 細 胞 、B細 胞 與 漿 細 胞 等 。 胚 幹 細 胞 形 成 胚 胎 小 體 約 四 天 後 開 始 分 化 形 成 原 始 紅 血 球 細 胞 , 之 後陸 續 分 化 成 為 巨 噬 細 胞 與 肥 大 細 胞50 ; 如 將 胚 幹 細 胞 與 基 質 細 胞 OP9 細 胞 株 共 同 培 養後 可 以 促 使 胚 幹 細 胞 在 分 化 的 早 期 階 段 產 生 NK 細 胞 (natural killer cell) 與B 細 胞 。 進 一 步 地 如 果 在 OP9 細 胞 株 表 達 Delta-1, 被 誘 導 分 化 的 條 件 和胸 腺 環 境 相 似 , 因 此 透 過 活 化 Notch 之 後 胚 幹 細 胞 可 分 化 為 T 細 胞 , 藉 由 這 些54 。52 ,35

分 化 的 過 程 我 們 可 以 研 究 各 種 基 因 在 細 胞 分 化 過 程 中 的 功 能 , 並 觀 察 細 胞 分 化 的 順 序55-56 , 例 如 :GATA-1-/- 的 胚 幹 細 胞 無 法 分 化 成 為 紅 血 球 細 胞 , 但 仍 可 分 化 為 其 他 血 球 細胞 , 顯 示 GATA-1 的 功 能 是 參 與 調 控 紅 血 球 的 發 育 過 程 ; 此 外 利 用 中 胚 層 特 定 表 現 的 基因 brachyury 以 及 內 皮 前 驅 細 胞 標 記 flk-1(VEGFR-2) 這 兩 個 基 因 的 表 現 可 以 清 楚 了解 中 胚 層 細 胞 分 化 成 血 液 血 管 母 細 胞 (hemangioblast) 的 過 程 , 是 由 中 胚 層 前 驅 細 胞分 化 為 血 液 血 管 中 胚 層 , 最 後 分 化 為 血 液 血 管 母 細 胞除 了 GATA-1 之 外 ,BMP-4、GATA-2、SCL 基 因 的 功 能 也 藉 由 胚 胎 幹 細 胞 的 研 究而 更 為 清 楚 。BMP-4 參 與 調 節 胚 胎 分 化 成 為 中 胚 層 ,BMP4-/- 胚 胎 僅 能 存 活 至 胚 胎 時 期6.5~9.5 天 , 其 中 最 明 顯 的 特 徵 便 是 缺 乏 中 胚 層 的 發 育58 ,BMP4 訊 息 路 徑 活 化 GATA2的 表 現 , 而 GATA2 可 以 增 加 Bmp4、Flk1 和 Scl 基 因 表 現59 。 其 中 SCL 參 與 血 液 血 管母 細 胞 分 化 為 造 血 幹 細 胞 (hematopoietic stem cells) 與 內 皮 前 驅 細 胞 (endothelialprogenitor) 的 過 程60 ,Scl-/- 胚 幹 細 胞 研 究 顯 示 仍 然 能 分 化 為 血 液 血 管 母 細 胞 , 因 此 推測 SCL 不 參 與 早 期 血 液 血 管 母 細 胞 的 形 成 過 程 , 已 知 Scl-/- 胚 胎 僅 能 存 活 至 胚 胎 時 期9.5 天 , 這 時 期 的 胚 胎 在 卵 黃 囊 區 域 缺 乏 任 何 造 血 相 關 的 細 胞 , 此 外 亦 缺 乏 血 管 新 生 的結 構 , 顯 示 SCL 參 與 血 管 形 成 , 但 造 血 相 關 基 因 如 GATA1、EKLF、PU.1 以 及 球 蛋 白等 皆 不 表 現61 。(2) 胚 幹 細 胞 分 化 為 心 肌 細 胞胚 幹 細 胞 分 化 為 心 肌 細 胞 的 過 程 中 , 心 肌 細 胞 會 產 生 規 率 的 收 縮 , 因 此 是 所 有 分 化過 程 中 最 容 易 觀 察 的 細 胞 , 胚 幹 細 胞 理 論 上 能 分 化 成 各 種 類 型 的 細 胞 , 但 在 實 際 操 作 時 ,通 常 僅 有 不 到 1% 的 胚 幹 細 胞 能 分 化 為 心 肌 細 胞 , 因 此 克 拉 格 博 士 曾 嘗 試 用 遺 傳 性 篩 擇(genetic selection), 使 胚 幹 細 胞 能 大 量 分 化 為 心 肌 細 胞 , 然 後 用 抗 藥 性 篩 選 形 成 的 心肌 細 胞 , 最 後 把 這 些 細 胞 注 入 患 有 心 臟 病 的 小 鼠 心 室 肌 內 , 發 現 足 以 使 病 鼠 存 活 下 來 。其 篩 選 效 率 可 達 99.6%, 相 對 於 單 獨 使 用 細 胞 形 態 來 分 離 只 有 3.4% 來 看 , 分 離 細 胞 的效 率 的 確 相 當 不 錯62 。 此 外 在 心 肌 分 化 過 程 中 Wnt 蛋 白 扮 演 重 要 的 角 色 , 由 於 Wnt 的家 族 超 過 17 個 成 員 , 藉 由 活 化 下 游 的 對 象 β-catenin 或 c-Jun N-terminal kinase(JNK)來 調 節 細 胞 生 理 。 基 本 上 Wnt 的 家 族 可 分 為 兩 群 , 其 中 Wnt3a、Wnt8a 抑 制 下 游 GSK3藉 此 活 化 β-catenin 以 調 節 分 化 為 心 肌 的 過 程 , 基 本 目 前 認 為 Wnt3a 在 胚 胎 發 育 初 期 會促 進 中 胚 層 形 成 , 但 在 發 育 後 期 會 抑 制 中 胚 層 分 化 成 心 肌 細 胞63 。 而 在 不 同 的 動 物 模 式中 抑 制 Wnt/β-catenin 的 訊 息 傳 遞 路 徑 , 例 如 表 現 Wnt 的 抑 制 物 Dkk1 與 Crescent 於前 側 內 胚 層 (anterior endoderm) 而 非 心 臟 生 成 區 域 , 能 促 進 心 肌 的 發 育 , 另 外 添 加 Wnt則 會 抑 制 前 側 中 胚 層 (anterior mesoderm) 的 心 臟 生 成 的 區 域 的 心 肌 形 成64 。 另 外 ,Wnt11 表 現 於 早 期 中 胚 層 中 前 驅 心 肌 生 成 的 區 域 (precardiac region), 研 究 發 現 表 現Wnt11 於 非 心 肌 生 成 的 區 域 可 以 促 進 心 肌 生 成 , 也 可 以 調 控 胚 幹 細 胞 分 化 為 心 肌65-66 。此 外 ,TGF-β 家 族 中 Activin、BMP2 及 TGF-b2 皆 會 促 進 胚 幹 細 胞 分 化 為 心 肌 細 胞 ,例 如 在 中 胚 層 分 化 過 程 中 , 高 濃 度 的 Activin 會 促 進 分 化 為 心 肌 細 胞 , 相 反 地 低 濃 度 的Activin 則 會 促 進 分 化 為 造 血 與 內 皮 細 胞26 , 另 外 , 如 在 胚 幹 細 胞 分 化 的 前 三 天 添 加 BMP的 競 爭 抑 制 蛋 白 Noggin, 會 增 加 中 胚 層 的 細 胞 並 且 增 加 100 倍 的 心 肌 細 胞 生 成 ; 相 反地 ,BMP-4 則 會 抑 制 中 胚 層 分 化 為 心 肌 細 胞 , 因 此 可 能 當 Noggin 抑 制 BMP-4 時 會 因57 。36

此 阻 斷 造 血 細 胞 系 的 分 化 並 促 進 細 胞 往 心 肌 方 面 分 化68 。4. 誘 導 胚 幹 細 胞 分 化 為 內 胚 層 胰 島 細 胞 及 肝 臟 細 胞(a) 內 胚 層 發 育 與 相 關 調 控 因 子為 了 能 夠 有 效 的 分 化 胚 幹 細 胞 形 成 內 胚 層 組 織 , 清 楚 的 了 解 體 內 訊 息 調 控 內 胚 層 分化 機 制 將 是 必 要 的 。 以 小 鼠 模 式 為 例 , 受 精 後 6.5 天 , 上 胚 板 細 胞 經 由 腔 腸 化 過 程 分 化形 成 內 胚 層 與 中 胚 層69 。 內 胚 層 的 分 化 一 開 始 主 要 由 Nodal 信 號 負 責 調 控 , 研 究 顯 示 當加 入 Activin/Nodal 的 競 爭 性 拮 抗 劑 antivin 時 , 內 胚 層 的 分 化 為 完 全 消 失 70 , 而 此 外 Nodal的 訊 息 發 現 是 藉 由 VegT(Brachyury) 來 調 控 ,VegT 是 屬 於 轉 錄 因 子 , 除 了 可 控 制 Nodal基 因 的 表 現 外 , 還 可 直 接 活 化 其 他 內 胚 層 的 轉 錄 因 子 。Nodal 除 了 受 到 VegT 的 調 控 外 ,同 時 能 活 化 並 維 持 VegT 的 表 現 , 兩 者 間 具 正 向 回 饋 機 制 而 得 以 促 進 內 胚 層 的 分 化 ; 除了 Nodal 訊 號 參 與 內 胚 層 的 形 成 外 ,BMP 與 Wnt 等 因 子 也 參 與 內 胚 層 的 調 控 , 但 詳 細的 機 制 仍 待 進 一 步 的 研 究 。Foxa2、Gata4、Sox17、 及 Mixl1 等 轉 錄 因 子 亦 已 知 參 與 內胚 層 的 形 成 , 常 作 為 內 胚 層 的 標 誌 , 主 要 是 因 為 內 胚 層 的 基 因 表 現 在 發 育 早 期 並 不 具 有獨 特 性 , 如 在 腔 內 內 胚 層 (visceral endoderm) 同 時 也 可 能 表 現 這 些 基 因 , 因 此 並 不 易區 分 。 內 胚 層 發 育 形 成 身 體 各 個 重 要 器 官 , 包 含 肺 、 肝 、 胃 、 胰 與 腸 等 , 在 目 前 胚 幹 細胞 分 化 為 內 胚 層 組 織 領 域 的 研 究 中 , 主 要 焦 點 在 於 分 化 胚 幹 細 胞 形 成 成 熟 的 胰 島 β 細 胞與 肝 細 胞 , 期 待 用 以 治 療 第 一 型 糖 尿 病 (Type I Diabetes) 與 急 性 肝 臟 受 損 (acute liverfailure) 等 相 關 疾 病 。(b) 胚 幹 細 胞 體 外 誘 導 分 化 為 內 胚 層 組 織(1) 胚 幹 細 胞 分 化 為 胰 島 細 胞 系胰 臟 發 育 是 由 一 連 串 轉 錄 因 子 的 調 控 所 主 導 , 例 如 Pdx1(pancreatic-duodenalhomeobox 1) 是 胰 臟 發 育 過 程 中 最 關 鍵 的 基 因 , 對 於 早 期 胰 芽 (pancreatic bud) 的 發育 相 當 重 要 , 約 胚 胎 期 8.5 天 即 可 測 得 Pdx1 的 表 現71-72 。 隨 著 胰 臟 的 分 化 與 成 熟 , 最後 將 僅 侷 限 製 造 胰 島 素 (insulin) 的 β 細 胞 與 多 肽 細 胞 表 現 Pdx1 73 , 實 驗 結 果 發 現 , 在早 期 胰 芽 形 成 後 , 若 抑 制 Pdx1 基 因 的 表 現 , 會 使 得 胰 臟 的 發 育 停 止 , 胚 胎 出 生 後 將 不具 有 胰 臟 , 顯 示 Pdx1 的 表 現 對 於 早 期 胰 臟 發 育 調 控 是 必 要 的74 。 同 時 , 胰 臟 上 皮 細 胞也 會 表 現 其 他 轉 錄 因 子 , 包 括 Hlxb9,Hnf6,Ptf1a 與 Nkx6.1, 對 於 胰 臟 的 早 期 發 育 均扮 演 重 要 角 色75 。 接 下 來 胰 臟 的 發 育 進 展 為 內 分 泌 細 胞 的 特 異 化 (specification) 時 期 ,轉 錄 因 子 Neurogenin 3(Ngn3) 會 開 始 表 現 , 以 小 鼠 發 育 為 例 ,Ngn3 於 胚 胎 期 第 9.5天 開 始 表 現 , 直 到 第 15.5 天 達 到 最 高 值76 ; 藉 由 基 因 轉 殖 鼠 的 實 驗 結 果 發 現 Ngn3 基 因被 剃 除 後 , 胰 臟 的 內 分 泌 組 織 發 育 將 受 到 影 響77 ; 因 此 ,Ngn3 的 表 現 可 視 為 內 分 泌 前驅 細 胞 的 發 生 。 接 下 來 Ngn3 會 引 發 一 連 串 轉 錄 因 子 的 表 現 來 調 控 內 分 泌 細 胞 的 分 化 ,包 括 Nkx2.2、NeuroD1、Pax4、Pax6, 這 些 轉 錄 因 子 均 參 與 調 控 胰 幹 細 胞 分 化 形 成 胰島 的 過 程78 。2000 年 索 利 亞 博 士 成 功 地 誘 導 胚 幹 細 胞 分 化 為 胰 島 素 製 造 細 胞 , 所 採 用 的 方 式 是 將含 胰 島 素 啟 動 子 的 載 體 送 入 分 化 中 的 胚 幹 細 胞 內 , 篩 選 帶 有 抗 藥 性 基 因 表 現 的 細 胞 , 選擇 穩 定 表 現 胰 島 素 啟 動 子 的 細 胞 , 將 其 移 植 入 糖 尿 病 老 鼠 體 內 , 發 現 當 這 群 細 胞 植 入 老37

鼠 體 內 後 , 老 鼠 的 血 糖 值 則 可 正 常 受 到 調 控 , 然 而 這 群 細 胞 無 法 提 供 長 期 類 胰 島 細 胞 的功 能 來 使 得 血 糖 維 持 恆 定79 。 在 2001 年 馬 偕 博 士 團 隊 則 發 表 新 的 方 法 來 分 化 胚 幹 細 胞成 為 類 胰 島 細 胞 , 他 們 所 採 用 的 方 法 是 改 良 自 神 經 細 胞 的 分 化 方 式 , 先 使 胚 幹 細 胞 進 一步 形 成 胚 胎 小 體 , 之 後 將 細 胞 轉 換 到 不 含 血 清 的 培 養 環 境 中 進 行 細 胞 的 篩 選 得 到 一 群 帶有 Nestin 基 因 表 現 的 細 胞 , 再 利 用 FGF 與 B27 等 誘 導 因 子 進 一 步 促 進 細 胞 的 分 化 與 成熟 。 經 過 實 驗 分 析 結 果 顯 示 , 從 細 胞 型 態 上 來 看 , 似 乎 胚 幹 細 胞 進 一 步 形 成 類 似 胰 島 的形 態 , 免 疫 組 織 染 色 則 可 測 得 胰 島 素 、 昇 糖 素 (glucagon) 與 體 抑 素 (somatostatin)的 表 現 ; 同 時 , 體 外 實 驗 顯 示 這 群 細 胞 能 分 泌 胰 島 素 來 調 控 血 糖 。 然 而 , 若 將 細 胞 移 植入 糖 尿 病 小 鼠 體 內 , 卻 沒 有 辦 法 矯 正 高 血 糖 的 現 象80 。 進 一 步 研 究 分 析 發 現 , 表 現 胰 島素 的 細 胞 其 形 態 分 顯 示 出 現 濃 縮 的 細 胞 核 , 進 行 細 胞 凋 亡 , 所 以 研 究 人 員 發 現 所 測 得 分泌 胰 島 素 的 程 度 大 多 是 細 胞 自 培 養 液 吸 收 取 得 , 而 非 自 行 分 泌 所 致81 。 因 此 , 之 後 有 許多 研 究 團 隊 相 繼 依 據 其 方 法 進 行 改 良 , 包 括 持 續 表 現 轉 錄 因 子 Pax4 82 、 採 誘 發 系 統 表 現Pdx1 83 或 是 在 最 後 分 化 階 段 加 入 PI3K 的 抑 制 劑 LY294002 等84 , 然 後 再 將 這 些 細 胞 移植 入 糖 尿 病 小 鼠 的 體 內 , 發 現 高 血 糖 的 現 象 能 得 到 改 善 , 顯 示 確 實 有 少 量 胚 幹 細 胞 能 分化 成 胰 島 素 製 造 細 胞 。 直 到 2006 年 , 達 模 博 士 團 隊 改 採 模 仿 體 內 胰 島 細 胞 發 育 的 過 程 ,加 入 包 括 Activin、 Wnt、FGF10、 維 甲 酸 等 多 種 生 長 因 子 使 人 類 胚 幹 細 胞 依 序 進 行 分化 , 在 不 同 的 階 段 表 現 依 不 同 發 育 的 標 誌 來 篩 檢 , 最 後 分 化 出 能 夠 表 現 內 分 泌 荷 爾 蒙 的細 胞 。 利 用 針 對 能 夠 分 泌 胰 島 素 的 細 胞 來 分 析 , 發 現 其 相 近 於 胚 胎 時 期 的 β 細 胞 能 感 測血 糖 濃 度 的 改 變 , 進 而 釋 放 出 胰 島 素 與 C 胜 肽 (C-peptide), 但 所 表 現 的 量 卻 未 達 成 熟β 細 胞 的 標 準85 , 顯 示 仍 有 相 當 的 改 善 空 間 , 但 這 樣 的 模 式 證 明 了 確 實 我 們 可 以 依 據 胚胎 組 織 發 育 的 模 式 來 進 一 步 分 化 胚 幹 細 胞 成 為 胰 島 β 細 胞 。(2) 胚 幹 細 胞 分 化 為 肝 臟 細 胞 系肝 臟 的 發 育 主 要 是 起 源 於 前 腸 管 內 胚 層 (foregut endoderm) 細 胞 , 在 接 收 到 來 自鄰 近 的 心 臟 中 胚 層 與 間 葉 組 織 細 胞 所 傳 遞 的 訊 息 FGF 與 BMP2/4 86-87 , 細 胞 進 一 步 從 前腸 管 背 部 向 外 生 長 形 成 早 期 的 肝 芽 (liver bud ), 此 時 的 細 胞 稱 為 肝 原 母 細 胞(hepatoblast), 這 群 細 胞 是 具 有 雙 潛 能 分 化 特 性 , 能 夠 分 化 為 肝 細 胞 與 膽 管 細 胞(cholangiocyte) 88 。 以 小 鼠 發 育 為 例 , 胚 胎 發 育 第 9.5 天 , 肝 原 母 細 胞 開 始 移 行 , 穿過 橫 膈 間 葉 (transversum mesenchyme), 橫 膈 間 質 由 鬆 散 的 結 締 組 織 構 成 , 主 要 成 分為 膠 原 蛋 白 , 所 以 胎 原 母 細 胞 在 移 行 可 與 橫 膈 間 質 直 接 接 觸 , 並 排 列 呈 繩 索 狀 , 再 透 過其 表 現 的 肝 生 長 因 子 (hepatocyte growth factor, HGF) 來 調 控 肝 原 母 細 胞 生 長 ; 同 時內 皮 細 胞 在 其 間 形 成 微 血 管 狀 的 結 構89 。 胚 胎 發 育 期 第 12 天 到 第 16 天 , 血 液 細 胞 會 進到 肝 芽 , 進 一 步 的 增 生 製 造 抑 瘤 素 (Oncostatin M, OSM) 傳 送 下 游 訊 息 來 促 進 肝 臟 的生 長 與 成 熟90 , 而 在 此 之 前 , 肝 原 母 細 胞 尚 未 進 行 分 化 , 當 血 液 細 胞 遷 移 至 其 他 地 方 後 ,肝 細 胞 便 開 始 成 熟 產 生 代 謝 的 酵 素 , 以 調 控 體 內 的 代 謝 作 用 、 血 液 血 清 蛋 白 的 濃 度 以 及儲 存 肝 醣 與 解 毒 作 用 。早 期 研 究 胚 幹 細 胞 分 化 成 肝 細 胞 使 是 採 取 自 發 性 的 分 化 , 也 就 是 將 胚 胎 幹 細 胞 以 懸浮 狀 態 方 式 培 養 , 形 成 具 有 三 胚 層 結 構 的 胚 胎 小 體 , 於 不 同 的 時 間 點 收 集 分 化 的 胚 胎 體 ,檢 測 肝 細 胞 的 基 因 與 蛋 白 質 相 關 標 誌 的 表 現91 。 但 這 樣 的 分 化 方 式 僅 能 得 到 0.1~0.5%38

的 細 胞 為 肝 細 胞 , 因 此 許 多 研 究 團 隊 發 展 不 同 的 方 法 來 促 使 胚 胎 幹 細 胞 往 肝 族 系 方 面 分化 。 在 2001 年 , 濱 崎 博 士 研 究 團 隊 也 同 樣 利 用 形 成 胚 胎 小 體 的 分 化 方 式 來 進 行 分 化 成肝 細 胞 的 研 究 , 但 在 不 同 的 天 數 中 加 入 特 定 調 控 肝 發 育 的 生 長 因 子 , 包 括 FGF、HGF、OSM 來 促 使 幹 細 胞 往 肝 細 胞 生 長 與 分 化 ( 圖 三 ), 實 驗 結 果 分 析 顯 示 相 關 肝 臟 基 因 的 表現 類 似 於 肝 發 育 的 狀 態92 ;圖 三 、 誘 導 鼠 胚 幹 細 胞 分 化 為 肝 臟 細 胞 系 , 並 組 織 染 色 分 析 細 胞 分 化 後 的 蛋 白 表 現 情 形( 圖 : 簡 皎 芸 ( 中 央 研 究 院 基 因 體 研 究 中 心 ) 提 供 )在 2002 年 , 鎮 西 博 士 研 究 團 隊 將 其 進 一 步 的 改 良 後 , 發 現 這 些 由 胚 幹 細 胞 發 育 而來 的 肝 細 胞 能 表 現 白 蛋 白 (albumin) 且 能 夠 製 造 尿 素 , 如 果 將 這 群 細 胞 移 植 到 小 鼠 肝 內 ,發 現 在 小 鼠 肝 臟 內 可 發 現 移 植 細 胞 能 夠 表 現 白 蛋 白 , 顯 示 這 群 細 胞 在 體 內 應 是 有 作 用 的93 。 接 下 來 , 研 究 者 希 望 能 進 一 步 觀 察 肝 細 胞 在 體 外 的 發 育 狀 況 , 並 能 夠 直 接 分 離 出 這群 成 熟 的 肝 細 胞 。 為 了 分 析 胚 幹 細 胞 發 育 而 來 的 肝 細 胞 是 否 具 有 能 修 復 受 損 肝 臟 的 功能 , 在 2002 年 , 伊 博 士 等 人 將 綠 色 螢 光 蛋 白 (green fluorescence protein, GFP) 置 入胎 兒 蛋 白 (alpha fetal protein, AFP) 啟 動 子 控 制 的 載 體 並 送 入 胚 幹 細 胞 , 在 誘 導 胚 幹 細胞 往 肝 族 系 分 化 後 , 如 胎 兒 蛋 白 持 續 表 現 時 , 細 胞 會 表 現 綠 色 螢 光 , 利 用 流 式 細 胞 儀 將帶 有 綠 色 螢 光 的 細 胞 分 離 出 來 , 移 植 到 三 種 小 鼠 體 內 , 第 一 群 小 鼠 體 內 可 表 現 β- 半 乳 糖苷 酶 基 因 (β-galactosidase), 第 二 群 小 鼠 為 載 脂 蛋 白 E (apolipoprotein E, ApoE) 缺失 , 載 脂 蛋 白 主 要 在 肝 臟 合 成 , 可 將 中 密 度 脂 蛋 白 轉 成 低 密 度 脂 蛋 白 , 第 三 群 小 鼠 則 是結 合 素 (haptoglobin) 缺 失 , 結 合 素 經 由 和 血 清 中 游 離 的 血 紅 蛋 白 (hemoglobin) 形 成穩 定 的 複 合 物 而 得 以 快 速 清 除 血 清 中 的 血 紅 蛋 白 , 避 免 其 浸 潤 腎 絲 球 ; 這 些 小 鼠 在 移 植前 , 先 進 行 部 分 肝 切 割 手 術 , 藉 以 測 量 細 胞 再 生 的 情 形 , 實 驗 結 果 發 現 移 植 入 小 鼠 體 內的 細 胞 均 可 在 小 鼠 肝 臟 內 被 偵 測 到 , 並 表 現 肝 細 胞 的 載 脂 蛋 白 E 或 結 合 素 , 修 補 肝 功 能94 。 在 2003 年 , 日 本 科 學 山 本 教 授 等 人 則 是 送 入 帶 有 綠 色 螢 光 標 定 胚 幹 細 胞 分 化 形 成 的肝 細 胞 , 將 這 群 細 胞 移 植 入 經 四 氯 化 碳 所 造 成 的 肝 損 傷 小 鼠 體 內 , 實 驗 結 果 發 現 細 胞 能夠 併 入 肝 組 織 中 , 表 現 肝 細 胞 成 熟 的 標 誌 並 改 善 肝 損 傷 情 形95 。 山 本 教 授 團 隊 在 200539

年 研 究 中 , 還 進 一 步 的 發 現 這 些 分 化 後 的 肝 細 胞 除 了 能 改 善 肝 功 能 外 , 還 能 夠 延 長 肝 纖維 化 小 鼠 的 存 活 天 數96 。四 、 結 語有 關 人 類 多 潛 能 胚 幹 細 胞 研 究 是 否 違 反 道 德 倫 理 和 社 會 法 律 等 問 題 , 一 直 以 來 都 引 起 很大 的 爭 議 。 因 為 基 本 上 都 是 使 用 人 體 的 卵 子 細 胞 , 或 者 直 接 製 造 胚 胎 組 織 來 進 行 相 關 多 潛 能胚 幹 細 胞 的 科 學 研 究 。 因 此 許 多 保 守 人 士 認 為 , 即 使 是 以 治 療 疾 病 和 推 動 科 學 發 展 為 目 的 人類 多 潛 能 胚 幹 細 胞 的 研 究 , 其 破 壞 人 類 胚 胎 組 織 的 行 為 仍 然 是 有 違 人 倫 道 德 的 , 是 無 法 被 接受 的 ! 因 此 人 類 多 潛 能 胚 幹 細 胞 技 術 研 究 的 一 大 障 礙 就 是 必 須 先 製 造 人 類 胚 胎 才 能 抽 取 胚 胎幹 細 胞 , 然 後 再 銷 毀 胚 胎 , 所 以 世 界 許 多 國 家 都 對 人 類 多 潛 能 胚 幹 細 胞 的 研 究 工 作 進 行 限 制 。為 了 迴 避 摧 毀 胚 胎 的 爭 議 , 最 近 先 進 細 胞 科 技 的 團 隊 , 研 發 出 一 種 新 方 法 , 趕 在 在 受 精 卵 第三 次 分 裂 的 八 細 胞 階 段 , 從 其 中 取 出 一 顆 胚 葉 細 胞 , 以 現 有 的 胚 胎 幹 細 胞 株 加 以 培 養 , 然 後分 離 形 成 新 的 胚 胎 幹 細 胞 株 。 剩 下 七 個 細 胞 的 受 精 卵 仍 然 可 以 繼 續 發 育 , 植 入 子 宮 內 著 床 ,產 下 健 康 的 個 體97 。 此 外 , 最 近 由 日 本 山 中 教 授 所 發 展 將 成 熟 的 細 胞 直 接 轉 變 為 多 潛 能 幹 細胞 的 方 式 , 這 樣 也 不 需 破 壞 胚 胎 , 這 將 可 以 為 許 多 疾 病 提 供 一 個 可 能 的 治 療 方 法 , 將 有 助 於跨 過 那 些 一 直 以 來 阻 礙 幹 細 胞 科 學 發 展 的 法 律 和 道 德 門 檻 , 其 對 推 動 細 胞 治 療 發 展 上 有 其 重要 意 義 。在 適 當 的 培 養 條 件 下 , 多 潛 能 細 胞 可 以 分 化 成 多 種 器 官 組 織 細 胞 , 例 如 最 近 發 現 顯 示 胚幹 細 胞 可 以 分 化 成 為 神 經 細 胞 , 並 且 在 移 植 到 神 經 損 傷 的 小 鼠 後 , 可 以 產 生 新 的 神 經 細 胞 以修 復 小 鼠 腦 部 組 織 的 損 傷 , 顯 示 幹 細 胞 可 以 應 用 在 修 復 人 類 受 損 的 組 織 和 治 療 棘 手 的 退 化 性疾 病 上 , 未 來 並 預 期 可 應 用 在 器 官 移 植 、 新 藥 開 發 、 基 因 療 法 與 治 療 癌 症 等 方 面 的 發 展3 。但 這 些 從 胚 幹 細 胞 所 分 化 而 來 的 組 織 細 胞 如 心 肌 細 胞 , 在 實 際 應 用 上 會 面 臨 兩 個 問 題 :(a)在 胚 幹 細 胞 分 化 為 心 肌 細 胞 的 過 程 中 , 心 肌 細 胞 的 比 例 很 低 ;(b) 移 植 成 功 的 心 肌 細 胞 存 活的 時 間 不 長 。 針 對 這 樣 的 困 難 , 必 須 發 展 一 些 解 決 方 案 , 例 如 , 利 用 心 肌 專 一 表 現 基 因 啟 動子 表 現 抗 藥 基 因 來 幫 助 以 抗 生 素 篩 選 , 就 可 以 得 到 純 度 很 高 的 心 肌 細 胞 , 將 這 些 細 胞 移 植 到心 肌 受 損 的 小 鼠 中 可 以 成 功 的 進 行 細 胞 移 植96 ; 此 外 於 移 植 的 心 肌 細 胞 中 表 現 血 管 內 皮 生 長因 子 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 可 以 促 進 新 血 管 生 成 並 且 改 善 心 臟 的 功 能98 。 藉 由 這 些 發 現 我 們 可 以 了 解 , 在 現 階 段 仍 必 須 藉 由 調 控 其 他 基 因 表 現 來 彌 補 胚 幹 細 胞 分化 的 完 整 性 不 足 , 因 此 了 解 這 些 胚 幹 細 胞 分 化 系 統 間 的 差 異 , 並 結 合 其 他 較 安 全 的 方 法 , 才可 能 有 機 會 應 用 在 修 復 人 類 受 損 的 組 織 和 治 療 棘 手 的 退 化 性 疾 病 上 。五 、 參 考 文 獻1. Ramalho-Santos, M. & Willenbring, H. On the Origin of the Term Stem Cell. Cell Stem Cell 1:35-38 (2007).2. Wobus, A. M., & Boheler, K. R. Embryonic stem cells: prospects for developmental biology and cell therapy.Physiology Review 85:635-78 (2005).3. Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annual Review of Cell and Developmental Biology17:435-62 (2001).40

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第 四 章成 體 幹 細 胞 分 離 培 養 擴 增 及 體 外 分 化Isolation, Expansion, and Differentiation of Adult Stem Cells李 光 申1許 素 菁2何 慧 君31國 立 陽 明 大 學 臨 床 醫 學 研 究 所2國 家 衛 生 研 究 院 感 染 症 與 疫 苗 研 究 所3臺 北 醫 學 大 學 臨 床 醫 學 研 究 所一 、 前 言幹 細 胞 對 於 生 物 體 由 胚 胎 到 成 熟 個 體 過 程 中 之 細 胞 增 生 、 分 化 以 及 組 織 修 復 等 作 用 有 著極 大 的 重 要 性 。 除 了 胚 胎 是 幹 細 胞 豐 富 的 來 源 之 外 , 個 體 發 育 後 仍 有 相 當 數 量 之 未 分 化 的 幹細 胞 存 在 成 熟 組 織 器 官 中 以 擔 負 各 組 織 或 器 官 細 胞 更 新 與 受 傷 修 復 的 功 能 , 因 此 我 們 可 依 據細 胞 分 離 來 源 與 潛 能 性 之 不 同 將 幹 細 胞 大 致 分 為 胚 胎 幹 細 胞 (embryonic stem cells) 和 成 體幹 細 胞 (adult stem cells) 兩 大 類 。 越 來 越 多 實 驗 結 果 顯 示 , 存 在 血 液 、 骨 骼 、 肌 肉 、 乃 至於 中 樞 或 周 邊 神 經 系 統 的 特 定 細 胞 群 , 具 有 自 幹 原 細 胞 形 成 先 驅 細 胞 再 成 為 成 熟 功 能 細 胞 的分 化 能 力1 , 這 提 供 了 組 織 工 程 與 再 生 醫 學 上 對 於 成 體 幹 細 胞 在 組 織 修 復 、 再 生 能 力 的 維 持與 運 用 上 提 供 了 許 多 思 考 的 新 契 機 。 本 章 節 乃 針 對 目 前 被 研 究 較 多 且 臨 床 運 用 上 較 為 重 視 的間 葉 系 幹 細 胞 (mesenchymal stem cells)、 造 血 幹 細 胞 (hematopoietic stem cells) 及 神 經幹 細 胞 (neural stem cells) 等 成 體 幹 細 胞 之 分 離 培 養 的 技 術 、 醫 療 應 用 的 潛 能 與 臨 床 治 療 上的 開 發 做 整 體 性 的 介 紹 。二 、 成 體 幹 細 胞在 人 類 幹 細 胞 研 究 尚 未 如 此 蓬 勃 發 展 且 無 法 在 許 多 組 織 器 官 中 找 到 相 對 應 的 幹 細 胞 存 在時 , 大 多 數 人 都 相 信 從 各 組 織 中 所 分 離 而 得 的 多 潛 能 幹 細 胞 只 能 繼 續 分 化 成 該 特 定 組 織 功 能相 關 的 細 胞 , 因 此 認 定 成 體 幹 細 胞 的 能 力 和 定 位 遠 不 如 胚 胎 幹 細 胞 來 得 重 要 。 然 而 即 使 胚 胎幹 細 胞 具 備 能 分 化 成 所 有 組 織 器 官 細 胞 的 能 力 , 但 是 欲 達 到 利 用 胚 胎 幹 細 胞 來 治 療 人 類 疾 病的 廣 泛 效 用 則 仍 有 許 多 問 題 亟 待 克 服 。 近 幾 年 來 科 學 家 在 成 體 幹 細 胞 的 研 究 中 已 證 明 , 只 要47

找 到 適 合 幹 細 胞 體 外 培 養 與 分 化 的 條 件 , 不 僅 細 胞 數 目 的 有 限 性 可 以 獲 得 解 決 且 能 維 持 幹 細胞 的 潛 能 並 具 有 可 分 化 成 多 種 不 同 胚 層 來 源 的 組 織 功 能 性 細 胞 的 能 力 , 而 不 限 定 只 能 作 用 成與 來 源 組 織 相 關 的 細 胞 種 類 。 除 此 之 外 , 由 於 成 體 幹 細 胞 已 在 臨 床 治 療 使 用 上 有 許 多 成 功 的經 驗 , 在 許 多 疾 病 上 若 能 採 用 適 當 的 患 者 自 體 幹 細 胞 進 行 體 外 培 養 、 擴 增 後 再 植 回 該 病 患 體內 進 行 疾 病 的 治 療 , 不 僅 可 避 免 胚 胎 幹 細 胞 目 前 來 源 取 得 上 倫 理 道 德 之 爭 議 , 也 較 無 免 疫 排斥 性 等 問 題 的 發 生 , 因 此 利 用 成 體 幹 細 胞 作 為 細 胞 治 療 的 臨 床 使 用 價 值 與 實 際 案 例 也 就 日 益增 加 。 表 一 乃 將 胚 胎 幹 細 胞 與 成 體 幹 細 胞 的 許 多 特 性 和 實 際 運 用 上 之 優 劣 性 做 一 比 較 , 在 此我 們 將 以 成 體 幹 細 胞 為 討 論 的 對 象 , 就 骨 髓 幹 細 胞 與 神 經 幹 細 胞 在 研 究 與 臨 床 上 的 特 性 與 發展 進 程 做 說 明 , 並 就 目 前 成 體 幹 細 胞 仍 待 解 決 的 問 題 做 更 深 入 的 討 論 。表 一 、 胚 胎 幹 細 胞 與 成 體 幹 細 胞 之 比 較 。細 胞 種 類 特 性 胚 胎 幹 細 胞 成 體 幹 細 胞來 源 (SOURCE)早 期 之 胚 胎 組 織成 體 組 織( 囊 胚 的 內 細 胞 質 團 )可 塑 性 (PLASTICITY) pluripotent multipotent可 分 化 分 化 生 成 之 細 胞種 類個 體 內 除 胚 胎 外 組 織 的 所有 細 胞有 限 制 性 的 細 胞 種 類 , 通常 與 其 所 分 離 出 之 組 織系 統 相 關優 點增 生 能 力 強分 化 潛 能 大較 無 道 德 爭 議自 體 移 植 使 用 時 較 無 免疫 排 斥 問 題缺 點有 道 德 爭 議須 考 慮 免 疫 排 斥 問 題有 形 成 腫 瘤 之 潛 在 危 險 性增 生 與 特 定 分 化 能 力 有所 限 制1. 骨 髓 幹 細 胞 (Bone marrow-derived stem cell):幹 細 胞 與 原 始 先 驅 細 胞 的 臨 床 運 用 始 於 1950 年 代2-3 。 利 用 致 死 劑 量 的 輻 射 線 照 射(irradiation) 實 驗 的 老 鼠 後 , 把 正 常 老 鼠 的 骨 髓 移 入 輻 射 處 理 過 的 鼠 體 內 , 發 現 正 常 的 骨 髓細 胞 能 提 供 輻 射 老 鼠 新 的 血 液 系 統 之 建 立 而 避 免 死 亡 。 第 一 個 以 骨 髓 移 植 來 從 事 人 類 疾 病 的臨 床 治 療 是 用 於 因 骨 髓 功 能 異 常 所 導 致 的 先 天 性 再 生 不 良 貧 血 症 (aplastic anemia), 而 第 一個 利 用 骨 髓 移 植 治 癒 的 癌 症 是 淋 巴 癌 。 我 們 已 經 明 瞭 骨 髓 移 植 之 所 以 使 病 人 有 重 生 機 會 , 主要 是 因 為 骨 髓 內 含 有 間 葉 系 幹 細 胞 與 造 血 幹 細 胞 的 緣 故4 。 間 葉 系 幹 細 胞 為 近 年 來 熱 門 之 研究 課 題 之 一 , 主 要 原 因 乃 在 於 間 葉 系 幹 細 胞 之 體 外 增 殖 及 多 重 分 化 能 力 相 當 強 , 使 得 許 多 原本 臨 床 上 無 法 輕 易 解 決 的 疑 難 雜 症 , 可 以 藉 由 大 量 的 體 外 培 養 技 術 獲 得 適 當 的 成 體 幹 細 胞 而改 變 組 織 工 程 及 細 胞 治 療 的 方 式 進 一 步 在 疾 病 的 處 理 上 得 到 良 好 治 療 。 骨 髓 中 除 了 間 葉 系 幹48

細 胞 與 造 血 幹 細 胞 之 外 , 還 可 能 有 其 他 型 態 的 成 體 幹 細 胞 存 在 , 但 目 前 對 於 其 他 種 類 的 成 體幹 細 胞 特 性 的 了 解 以 及 臨 床 使 用 價 值 還 不 十 分 明 確 , 我 們 將 只 針 對 MSC 與 HSC 做 說 明 。(a) 間 葉 系 幹 細 胞 (Mesenchymal stem cell, 簡 稱 MSC)自 從 1961 年 加 拿 大 多 倫 多 大 學 的 科 學 家 James Till 及 Ernest McCullough 發 表 人類 骨 髓 中 存 有 造 血 幹 細 胞 以 來 , 骨 髓 在 當 時 變 被 廣 泛 研 究 , 但 研 究 的 重 點 主 要 是 利 用 骨髓 移 植 治 療 各 種 血 液 疾 病 。 直 到 1970 年 代 美 國 國 家 衛 生 總 署 (NIH) 的 科 學 家 AlexFriedenstein 發 現 若 將 大 鼠 的 骨 髓 移 植 到 另 一 隻 同 品 系 大 鼠 的 腎 臟 內 , 所 移 植 的 骨 髓 會有 骨 骼 及 軟 骨 組 織 的 形 成 , 於 是 證 實 了 骨 髓 當 中 除 了 造 血 細 胞 以 外 , 亦 存 有 一 些 中 胚 層結 締 組 織 之 前 驅 細 胞 , 這 在 當 時 可 是 石 破 天 驚 的 發 現 。 到 了 1980 年 代 , 英 國 牛 津 大 學的 女 性 科 學 家 Professor Maureen Owen 更 進 一 步 發 現 將 骨 髓 做 體 外 培 養 時 , 造 血 幹 細胞 及 血 液 幹 細 胞 乃 懸 浮 在 培 養 系 統 中 而 不 貼 附 於 培 養 皿 的 底 部 , 但 骨 髓 中 卻 存 有 另 一 群會 貼 附 於 培 養 皿 底 部 之 貼 附 型 細 胞 。 她 針 對 這 些 貼 附 型 的 細 胞 做 進 一 步 的 研 究 發 現 持 續不 斷 培 養 這 些 細 胞 時 會 形 成 一 個 個 的 細 胞 群 落 , 而 這 些 細 胞 群 落 , 竟 然 就 是 成 骨 細 胞 !Professor Owen 的 發 現 更 進 一 步 的 證 實 了 骨 髓 中 不 但 含 有 造 血 幹 細 胞 也 可 能 含 有 其 它種 類 的 幹 細 胞 。圖 一 、 體 外 培 養 骨 髓 中 的 間 葉 系 幹 細 胞到 了 1990 年 代 , 美 國 Case Western Reserve University 的 Professor ArnoldCaplan 首 度 將 骨 髓 中 存 有 的 這 群 非 造 血 系 統 的 幹 細 胞 稱 之 為 間 葉 系 幹 細 胞5 。 間 葉 系幹 細 胞 其 實 並 不 是 個 新 名 詞 , 早 在 19 世 紀 的 西 文 文 獻 當 中 , 便 有 科 學 家 使 用 這 個 名 詞 ,只 是 對 間 葉 系 幹 細 胞 一 詞 並 沒 有 清 楚 具 體 的 描 述 , 因 此 ,Professor Caplan 的 貢 獻 便 是給 了 骨 髓 中 這 一 群 特 殊 的 幹 細 胞 一 個 清 楚 的 名 詞 定 義 。1999 年 4 月 2 日 這 項 研 究 正 式 揭 露 於 美 國 的 權 威 期 刊 科 學 雜 誌 (Science49

Magazine)。 這 篇 文 獻 指 出 人 類 骨 髓 中 有 一 群 特 殊 的 幹 細 胞 , 雖 然 數 目 不 多 , 但 是 這 些間 葉 系 幹 細 胞 的 生 長 和 分 化 能 力 卻 極 為 優 異 , 能 夠 在 體 外 大 量 增 殖6 , 並 偵 測 到 CD29、CD44、CD73、CD105( 圖 二 ) 等 標 記 分 子 表 現 在 培 養 後 的 間 葉 系 幹 細 胞 表 面 。 早 期 科學 界 相 信 間 葉 系 幹 細 胞 主 要 存 在 於 人 體 骨 髓 之 中 , 這 些 細 胞 能 夠 分 化 成 源 自 胚 胎 時 期 中胚 層 的 各 種 組 織 細 胞 , 包 括 : 成 骨 細 胞 、 軟 骨 細 胞 、 脂 肪 細 胞 及 肌 肉 細 胞 等 ( 圖 三 )。圖 二 、 間 葉 系 幹 細 胞 細 胞 表 面 之 標 誌 分 子圖 三 、 間 葉 系 幹 細 胞 之 細 胞 分 化 。(A) 脂 肪 細 胞 (B) 軟 骨 細 胞 (C) 成 骨 細 胞從 發 生 學 (ontogeny) 的 角 度 來 說 , 雖 然 這 些 間 葉 系 幹 細 胞 究 竟 源 自 胚 胎 時 期 的何 種 細 胞 尚 屬 未 知 , 但 一 般 相 信 間 葉 系 幹 細 胞 的 確 存 在 於 所 有 成 體 骨 髓 中 , 數 量 隨 成 體年 齡 而 減 少 。 隨 著 年 紀 的 增 長 , 生 物 體 逐 漸 有 老 化 現 象 , 目 前 科 學 家 相 信 生 物 體 老 化 後器 官 及 組 織 修 復 能 力 之 所 以 降 低 的 原 因 主 要 是 體 內 成 體 幹 細 胞 數 目 減 少 所 致 。 就 以 骨 折的 例 子 來 說 明 。 一 般 而 言 年 輕 人 發 生 骨 折 時 較 容 易 癒 合 , 而 老 年 人 的 骨 折 則 有 不 易 癒 合的 現 象 , 其 中 的 一 個 原 因 即 是 老 年 人 的 間 葉 系 幹 細 胞 數 目 較 少 , 導 致 骨 骼 組 織 自 我 修 復50

的 能 力 下 降 的 影 響 。 另 外 , 老 年 人 較 易 得 骨 質 疏 鬆 症 的 原 因 也 可 能 和 間 葉 系 幹 細 胞 的 數目 及 能 力 下 降 有 關 。對 絕 大 多 數 的 細 胞 來 說 , 細 胞 採 對 稱 分 裂 產 生 兩 個 相 同 的 子 代 細 胞 而 讓 細 胞 的 數 目增 加 。 然 而 對 具 有 自 我 更 新 能 力 的 幹 細 胞 而 言 為 保 持 其 細 胞 的 潛 能 性 並 維 持 身 體 修 復 機轉 的 恆 定 性 而 於 是 有 不 對 稱 細 胞 分 裂 (asymmetrical cell division) 的 能 力 , 藉 由 不 對稱 分 裂 的 機 轉 , 意 即 幹 細 胞 分 裂 時 並 非 產 生 兩 個 相 同 的 子 代 , 而 是 產 生 一 個 幹 細 胞 及 一個 前 驅 細 胞 (progenitor cell), 又 稱 暫 時 性 增 殖 細 胞 (transit amplify cell, TA cell) 7-9 ,如 此 , 幹 細 胞 方 能 維 持 其 在 成 體 內 數 目 的 恆 定 。 成 體 幹 細 胞 便 利 用 不 對 稱 分 裂 中 產 生 的暫 時 性 增 殖 細 胞 提 供 負 責 分 化 成 修 復 各 式 各 樣 的 組 織 及 器 官 當 中 所 需 的 細 胞 。科 學 家 發 現 除 了 骨 髓 是 間 葉 系 幹 細 胞 的 來 源 之 外 , 目 前 也 可 自 許 多 不 同 的 組 織 , 包括 : 髓 質 骨 (trabecular bone) 10 、 關 節 中 之 清 液 組 織 (synovial tissues) 11 、 以 及 美容 手 術 中 抽 取 的 脂 肪 (liposuction fat) 12 等 組 織 中 獲 得 MSC。 最 近 , 有 些 科 學 家 更 進一 步 指 出 , 間 葉 系 幹 細 胞 極 可 能 存 在 於 人 類 所 有 組 織 當 中 , 他 們 存 在 的 目 的 即 是 為 了 維持 各 組 織 及 器 官 的 恆 定 , 亦 即 許 多 器 官 組 織 之 中 細 胞 的 老 化 及 凋 亡 必 須 進 行 補 充 , 而 這些 間 葉 系 幹 細 胞 極 可 能 在 器 官 組 織 恆 定 的 維 持 及 更 新 細 胞 的 補 充 上 扮 演 極 重 要 的 角 色 。除 了 上 述 這 些 成 體 來 源 之 外 , 間 葉 系 幹 細 胞 尚 可 自 臍 帶 血 中 取 得 , 筆 者 們 的 研 究 結果 顯 示 , 源 自 臍 帶 血 的 間 葉 系 幹 細 胞 增 殖 及 分 化 能 力 均 佳13 , 除 中 胚 層 組 織 細 胞 外 , 亦可 分 化 成 源 自 外 胚 層 的 神 經 細 胞 ( 圖 四 ), 這 些 神 經 細 胞 在 體 外 確 實 具 有 各 式 各 樣 成 熟神 經 細 胞 之 功 能 表 現14 。 我 們 更 進 一 步 地 發 現 , 間 葉 系 幹 細 胞 亦 可 分 化 成 源 自 於 內 胚 層的 肝 臟 細 胞 ( 圖 五 ), 這 些 分 化 的 肝 臟 細 胞 具 有 各 式 各 樣 正 常 肝 臟 細 胞 所 應 具 有 的 功 能 ,包 括 : 製 造 白 蛋 白 、 儲 存 肝 醣 、 代 謝 含 氮 廢 物 以 及 解 毒 等 等15 。 不 難 想 見 , 這 項 發 現 將可 能 為 各 種 肝 臟 疾 病 的 治 療 帶 來 新 的 曙 光 。 因 為 , 臺 灣 仍 是 病 毒 性 肝 炎 高 盛 行 的 區 域 ,而 病 毒 性 肝 炎 經 常 造 成 肝 硬 化 以 及 肝 癌 的 發 生 , 或 許 日 後 可 以 使 用 間 葉 系 幹 細 胞 來 治 療肝 臟 疾 患 , 目 前 我 們 實 驗 室 也 正 在 朝 這 方 向 積 極 進 行 研 究 當 中 。圖 四 、 間 葉 系 幹 細 胞 體 外 分 化 成 神 經 細 胞 的 分 子 改 變 型 態 圖51

圖 五 、 骨 髓 間 葉 系 幹 細 胞 進 行 體 外 肝 臟 細 胞 分 化 之 細 胞 型 態 圖臍 帶 血 中 含 有 造 血 幹 細 胞 是 科 學 家 公 認 的 事 實 。1989 年 起 臍 帶 血 便 被 法 國 醫 師 用來 移 植 治 療 血 液 疾 病 , 至 今 世 界 上 已 有 數 千 例 臍 帶 血 移 植 成 功 治 療 各 種 血 液 疾 患 的 案例 。 我 們 的 研 究 更 進 一 步 的 顯 示 , 臍 帶 血 中 不 但 存 有 造 血 幹 細 胞 , 也 存 有 間 葉 系 幹 細 胞 ,這 些 臍 帶 血 在 醫 療 運 用 上 具 有 相 當 大 的 潛 力 。 因 此 , 臍 帶 血 不 應 當 作 醫 療 廢 棄 物 被 丟棄 , 應 可 作 為 私 人 儲 存 或 是 捐 贈 至 公 益 臍 帶 血 庫 進 一 步 用 於 幹 細 胞 研 究 與 疾 病 醫 療 的 開發 。近 年 來 隨 著 分 子 生 物 學 及 細 胞 生 物 學 的 快 速 進 展 , 間 葉 系 幹 細 胞 的 研 究 也 有 許 多 的突 破 。 自 從 九 十 年 代 末 期 間 葉 系 幹 細 胞 自 人 體 骨 髓 的 分 離 方 法 被 確 定 後 , 許 多 的 動 物 實驗 及 前 臨 床 研 究 已 將 間 葉 系 幹 細 胞 的 應 用 推 向 臨 床 治 療 。 茲 就 近 年 世 界 各 國 發 表 之 臨 床人 體 試 驗 結 果 整 理 如 下 。在 異 體 間 葉 系 幹 細 胞 移 植 方 面 ,2004 年 韓 國 醫 師 為 一 位 37 歲 因 為 車 禍 導 致 第 十胸 椎 骨 折 合 併 脊 髓 損 傷 導 致 下 肢 癱 瘓 的 女 性 進 行 世 界 第 一 例 的 配 對 異 體 臍 帶 血 幹 細 胞移 植 , 手 術 之 後 病 患 確 實 在 癱 瘓 19 年 之 後 能 夠 站 起 來 走 了 幾 步 , 這 樣 初 步 的 研 究 結 果 ,也 受 到 世 界 媒 體 的 重 視 以 及 廣 泛 報 導 , 然 而 這 病 患 在 幹 細 胞 移 植 術 後 幾 個 月 並 無 法 再 行走 , 並 且 伴 隨 有 無 法 忍 受 的 疼 痛 , 這 個 教 訓 告 訴 我 們 任 何 的 臨 床 研 究 都 不 可 冒 進 , 必 須要 有 充 足 的 前 臨 床 科 學 實 驗 以 證 明 創 新 治 療 方 法 的 有 效 性 及 安 全 性 。 雖 然 如 此 , 近 兩 年來 在 異 體 間 葉 系 幹 細 胞 移 植 的 研 究 與 臨 床 試 驗 上 也 有 成 功 的 案 例 。 另 一 組 韓 國 醫 師 使 用異 體 配 對 間 葉 系 幹 細 胞 移 植 手 術 成 功 的 治 療 了 四 例 患 有 烏 腳 病 需 要 截 肢 的 病 患 。 烏 腳 病的 發 生 和 砷 中 毒 以 及 抽 煙 有 關 , 這 些 病 患 的 肢 體 小 動 脈 造 成 阻 塞 , 最 後 導 致 肢 體 缺 血 發黑 , 這 就 是 烏 腳 病 名 稱 的 由 來 。 嚴 重 的 烏 腳 病 患 者 在 四 肢 部 位 常 因 組 織 壞 死 而 需 要 截肢 , 病 患 負 擔 著 極 為 強 大 的 疼 痛 與 生 活 上 的 不 方 便 。 韓 國 進 行 此 項 成 功 的 細 胞 移 植 經驗 , 值 得 作 為 烏 腳 病 治 療 的 重 要 參 考 。2005 年 韓 國 的 醫 師 及 科 學 家 報 告 , 針 對 急 性 中 風 的 患 者 以 自 體 骨 髓 純 化 間 葉 系 幹細 胞 經 由 靜 脈 注 射 輸 入 病 患 體 內 , 此 臨 床 試 驗 雖 然 實 驗 組 病 患 只 有 五 人 , 但 以 靜 脈 注 射經 體 外 培 養 的 自 體 間 葉 系 幹 細 胞 的 安 全 性 得 到 證 實 , 提 供 了 間 葉 系 幹 細 胞 在 臨 床 一 期 試驗 (phase I clinical trial) 上 極 為 重 要 的 研 究 結 果 與 未 來 幹 細 胞 治 療 開 發 成 功 的 信 心 。52

在 許 多 的 器 官 移 植 的 案 例 中 , 常 發 生 移 植 組 織 對 接 受 者 的 排 斥 (Graft Versus HostDisease,GVHD) 的 併 發 症16 。GVHD 的 發 生 是 因 為 移 植 組 織 當 中 的 免 疫 細 胞 , 主 要是 T 淋 巴 球 , 攻 擊 接 受 者 的 組 織 而 造 成 個 體 的 損 害 而 發 生 的 疾 病 , 目 前 臨 床 上 對 於 移 植組 織 的 處 理 與 GVHD 的 發 生 仍 以 免 疫 抑 制 劑 來 進 行 控 制 , 但 免 疫 抑 制 劑 的 副 作 用 常 給病 患 極 大 的 副 作 用 且 無 法 有 效 治 癒 該 疾 病 的 發 生 而 在 治 療 面 臨 極 大 的 挑 戰 。 近 年 來 由 間葉 系 幹 細 胞 的 基 礎 研 究 中 發 現 該 類 成 體 幹 細 胞 不 但 能 分 化 成 許 多 不 同 的 組 織 細 胞 , 它 們還 具 有 免 疫 調 節 的 功 能 , 並 且 能 夠 有 效 調 控 抑 制 T 淋 巴 球 細 胞 的 活 化 與 增 生17 。2004年 瑞 典 卡 洛 琳 斯 卡 大 學 的 醫 師 首 度 使 用 患 者 母 親 的 異 體 間 葉 系 幹 細 胞 移 植 成 功 地 治 療了 一 位 因 為 白 血 病 接 受 異 體 骨 髓 移 植 而 產 生 急 性 GVHD 的 男 孩18 。2006 年 同 一 個 研 究團 隊 更 進 一 步 的 報 告 了 他 們 擴 大 使 用 異 體 間 葉 系 幹 細 胞 移 植 規 模 治 療 急 性 嚴 重 GVHD的 經 驗 , 在 這 個 研 究 當 中 有 八 位 病 患 接 受 了 異 體 間 葉 系 幹 細 胞 移 植 治 療 急 性 嚴 重 GVHD而 有 六 位 患 者 治 療 成 功19 , 這 些 相 關 的 臨 床 病 例 報 告 給 與 研 究 者 與 臨 床 工 作 者 極 大 的 鼓舞 。除 此 之 外 , 異 體 間 葉 系 幹 細 胞 在 骨 科 疾 病 的 治 療 , 亦 有 相 當 大 的 應 用 。 成 骨 不 全 症(osteogenesis imperfecta) 是 一 種 先 天 遺 傳 性 疾 病 , 也 就 是 俗 稱 的 玻 璃 娃 娃 , 這 些 病患 的 骨 骼 組 織 無 法 產 生 正 常 的 第 一 型 膠 原 蛋 白 (type I collagen), 導 致 骨 骼 相 當 脆 弱 ,十 分 容 易 發 生 骨 折 。 美 國 的 醫 師 便 使 用 配 對 異 體 間 葉 系 幹 細 胞 移 植 治 療 成 骨 不 全 症 , 有初 步 的 成 果 。 隨 著 周 產 期 醫 學 的 進 步 , 成 骨 不 全 症 在 精 密 的 超 音 波 檢 查 下 , 產 前 診 斷 亦非 難 事 , 配 合 子 宮 內 移 植 (in utero transplantation) 的 技 術20 , 間 葉 系 幹 細 胞 的 移 植 也被 許 多 玻 璃 娃 娃 的 治 療 帶 來 一 絲 新 曙 光 。在 骨 骼 組 織 的 創 傷 修 復 方 面 , 英 國 的 醫 師 已 經 開 始 臨 床 試 驗 使 用 自 體 骨 髓 間 葉 系 幹細 胞 進 行 關 節 軟 骨 的 修 復 和 再 生 , 這 項 技 術 如 果 獲 得 成 功 , 將 可 免 去 許 多 病 患 的 關 節 炎之 苦 。 因 為 目 前 關 節 炎 是 高 齡 化 社 會 中 一 個 相 當 盛 行 的 疾 病 , 許 多 病 患 因 為 關 節 炎 導 致行 動 不 便 , 必 須 接 受 人 工 關 節 手 術 。 而 這 些 關 節 炎 常 與 早 年 軟 骨 的 損 傷 有 關 , 若 能 夠 使用 自 體 骨 髓 間 葉 系 幹 細 胞 在 受 傷 早 期 便 進 行 軟 骨 修 復 , 促 進 軟 骨 再 生 , 相 信 可 延 緩 關 節炎 的 發 生 。 此 外 , 澳 大 利 亞 的 醫 師 也 開 始 進 行 使 用 自 體 骨 髓 間 葉 系 幹 細 胞 幫 助 骨 折 癒 合的 臨 床 實 驗 。 我 們 都 知 道 , 並 不 是 所 有 的 骨 折 都 能 夠 順 利 癒 合 , 在 一 些 情 形 之 下 , 例 如 :骨 折 太 粉 碎 、 或 是 開 放 性 骨 折 合 併 感 染 造 成 骨 髓 炎 , 較 易 導 致 骨 折 不 癒 合 的 發 生 , 臨 床上 對 骨 折 不 癒 合 的 治 療 常 常 必 須 「 挖 東 牆 補 西 牆 」, 意 即 從 骨 盆 骨 挖 取 較 不 重 要 的 部 分來 填 補 骨 骼 的 缺 損 , 若 能 使 用 間 葉 系 幹 細 胞 來 幫 助 骨 骼 組 織 的 再 生 , 則 可 免 去 挖 取 自 體之 苦 。由 於 MSC 具 有 多 元 而 廣 泛 的 可 塑 性 , 改 變 了 世 人 原 先 對 於 成 體 幹 細 胞 分 化 能 力 受限 制 的 看 法 , 也 使 得 MSC 未 來 在 細 胞 療 法 、 組 織 工 程 及 再 生 醫 學 的 研 究 上 有 機 會 用 於修 復 或 更 換 受 傷 與 發 生 病 變 的 細 胞 或 組 織 , 對 目 前 脊 髓 損 傷 (spinal cord injury)、 中 風(stroke)、 老 年 失 智 的 阿 茲 海 默 症 (Alzheimer’s disease)、 帕 金 森 氏 症 (Parkinson’s53

disease) 等 難 以 治 癒 的 疾 病 , 提 供 了 治 療 的 新 契 機 。 目 前 臨 床 試 驗 顯 示 , 將 MSC 與 造血 幹 細 胞 共 同 注 射 入 體 內 後 可 以 加 入 血 液 系 統 恢 復 的 速 度 , 說 明 MSC 不 僅 本 身 具 有 調節 體 內 細 胞 修 復 的 能 力 , 同 時 也 扮 演 調 節 其 他 幹 細 胞 功 能 的 可 能 性21-22 。(b) 造 血 幹 細 胞 (Hematopoiesis stem cell, 簡 稱 HSC)1961 年 ,Till 和 McCulloch 證 實 了 存 在 於 骨 髓 的 先 驅 細 胞 可 在 脾 臟 形 成 多 源 性 血球 細 胞 株 (multilineage hematopoietic clonies), 其 中 有 一 群 細 胞 具 有 可 複 製 成 更 多 脾臟 細 胞 株 的 能 力 , 當 時 他 們 便 猜 測 在 人 體 中 應 該 有 所 謂 的 多 能 性 血 球 幹 細 胞 存 在 。HSC和 MSC 一 樣 可 從 骨 髓 、 嬰 兒 臍 帶 血 、 成 人 周 邊 血 液 與 胎 盤 中 分 離 出 來 , 它 們 在 骨 髓 中持 續 自 我 增 生 及 能 夠 分 化 出 所 有 在 血 液 中 所 有 細 胞 成 分 的 能 力 , 使 HSC 不 僅 能 分 化 成所 有 血 液 組 成 細 胞 ( 圖 六 )( 來 自 胚 胎 中 胚 層 ), 在 適 當 的 培 養 條 件 下 這 些 細 胞 也 能 夠 分化 成 為 不 同 胚 層 組 織 的 細 胞 , 如 肺 臟 或 腸 組 織 的 表 皮 細 胞 ( 內 胚 層 ), 或 是 皮 膚 組 織 ( 外胚 層 )。 相 較 於 其 他 種 成 體 幹 細 胞 而 言 , 由 於 血 液 幹 細 胞 的 懸 浮 性 以 及 被 研 究 與 操 作 的時 間 較 為 久 遠 ,HSC 有 較 為 明 確 的 細 胞 表 面 分 子 可 供 辨 識 , 最 常 用 來 分 離 人 體 HSC 的細 胞 標 誌 為 CD34、CD38 及 CD133 23 , 但 由 於 這 些 細 胞 在 體 外 培 養 擴 增 時 常 伴 隨 細 胞分 化 力 的 降 低 使 得 臨 床 使 用 上 有 極 大 的 限 制 性 , 研 究 人 員 目 前 仍 試 圖 希 望 找 出 能 分 離 更早 期 HSC 的 細 胞 表 現 分 子 。 過 去 十 年 來 , 由 於 對 血 液 幹 細 胞 和 許 多 不 同 血 液 生 長 激 素的 研 究 有 更 多 的 瞭 解 , 造 血 幹 細 胞 的 移 植 在 手 續 上 比 骨 髓 移 植 要 來 的 簡 化 許 多 , 移 植 的副 作 用 也 遠 較 骨 髓 移 植 來 的 輕 微 , 因 此 利 用 血 液 幹 細 胞 做 體 外 培 養 後 的 幹 細 胞 移 植 比 例有 與 日 遽 增 的 趨 勢 , 但 仍 須 克 服 體 外 培 養 增 生 HSC 時 CD34 + 表 現 細 胞 的 比 例 與 細 胞 分化 能 力 降 低 的 困 境 與 限 制 。圖 六 、 血 液 幹 細 胞 之 分 化 組 織 圖54

1988 年 法 國 第 一 次 以 臍 帶 血 (umbilical cord blood) 成 功 替 罹 患 再 生 不 良 貧 血 症的 5 歲 男 童 施 行 移 植 手 術 後24 , 臍 帶 血 幹 細 胞 由 於 來 源 容 易 、 成 本 低 廉 、 移 植 配 對 要 求較 骨 髓 取 得 的 幹 細 胞 來 的 低 , 且 臍 帶 所 含 的 幹 細 胞 數 目 也 遠 較 原 始 骨 髓 和 血 液 樣 本 內 含量 來 的 高 , 因 此 臍 帶 血 幹 細 胞 的 研 究 與 使 用 日 益 受 到 重 視 。 雖 然 目 前 並 不 清 楚 臍 帶 中 除了 可 以 分 離 出 MSC 與 HSC 之 外 , 是 否 還 存 有 功 能 上 更 強 大 的 幹 細 胞 , 但 研 究 顯 示 從臍 帶 血 所 獲 得 的 HSC 或 MSC 其 體 外 增 生 的 能 力 比 從 骨 髓 或 血 液 取 得 的 幹 細 胞 要 來高 , 並 且 由 於 該 細 胞 群 表 面 表 現 影 響 免 疫 反 應 的 分 子 極 少 因 此 移 植 時 所 產 生 的 宿 主 排 斥現 象 也 較 小 , 所 以 可 取 代 骨 髓 移 植 使 用 , 並 且 以 這 樣 方 式 取 得 的 細 胞 並 不 會 引 發 胚 胎 使用 的 爭 議 , 此 乃 近 幾 年 臍 帶 血 幹 細 胞 受 矚 目 的 原 因 。2. 神 經 幹 細 胞 (Neural stem cell, 簡 稱 NSC):早 期 由 於 我 們 對 於 神 經 細 胞 培 養 與 分 化 的 條 件 掌 控 能 力 不 足 以 至 於 認 為 神 經 組 織 的 細 胞不 再 能 夠 分 化 因 而 相 信 神 經 細 胞 並 不 具 有 再 生 能 力 , 一 旦 細 胞 遭 受 到 破 壞 後 便 很 難 修 復 或 治療 , 這 是 許 久 以 來 神 經 醫 學 上 的 困 境 。 目 前 研 究 人 員 已 能 在 中 樞 神 經 系 統 中 找 到 神 經 幹 細 胞(neural stem cells), 可 進 一 步 分 化 產 生 成 神 經 (neruon)、 星 狀 細 胞 (astrocyte)、 寡 突 膠質 細 胞 (oligodendrocyte) 等 不 同 形 態 的 神 經 細 胞 , 對 於 帕 金 森 氏 症25 、 老 年 失 智 症 、 脊 髓26損 傷 等 這 類 因 神 經 系 統 病 變 或 損 害 的 疾 病 提 供 修 復 治 療 的 可 能 。 目 前 用 以 分 離 或 區 分 神 經幹 細 胞 的 方 式 不 外 乎 是 從 腦 部 組 織 或 神 經 球 體 (neurosphere) 中 利 用 辨 識 低 親 和 性 趨 神 經受 體 抗 原 (low-affinity neurotrophin receptor)、 p75、 周 邊 髓 質 蛋 白 (peripheral myelinprotein) 或 是 直 接 培 養 表 達 CD133 + 、5E12 + 、CD34 - 、CD45 - 、CD24 - / lo 的 細 胞27 。 這 些 神經 幹 細 胞 能 夠 在 老 鼠 體 內 表 現 出 長 效 移 植 生 長 的 能 力 , 具 有 自 我 更 生 、 移 動 (migration) 和多 細 胞 系 分 化 等 的 特 性 。 有 研 究 顯 示 將 神 經 幹 細 胞 植 入 腫 瘤 形 成 的 小 鼠 後 , 這 些 幹 細 胞 因 具備 特 殊 的 細 胞 表 現 分 子 與 移 動 力 而 能 夠 趨 向 於 腫 瘤 形 成 部 位 的 特 性 , 未 來 我 們 如 何 運 用 這 些幹 細 胞 的 特 性 進 一 步 從 事 癌 症 治 療 與 相 關 藥 物 開 發 將 是 值 得 注 意 的 焦 點 。三 、 成 體 幹 細 胞 的 分 化成 體 幹 細 胞 在 適 當 的 體 外 培 養 環 境 下 , 能 夠 分 化 成 為 許 多 不 同 種 類 的 成 熟 體 細 胞 。 以 間葉 系 幹 細 胞 分 化 成 為 骨 細 胞 為 例 , 培 養 基 中 需 加 入 beta-glycerophosphate、ascorbic acid及 dexamethasone; 分 化 成 軟 骨 細 胞 時 , 則 需 以 transforming growth factor beta 或 bonemorphogenetic protein 引 導 分 化 。 造 血 幹 細 胞 在 適 當 的 引 導 下 , 可 分 化 成 為 淋 巴 球 、 血 液 顆粒 球 、 吞 噬 細 胞 、 紅 血 球 及 血 小 板 等 細 胞 。 神 經 幹 細 胞 則 可 引 導 分 化 成 神 經 元 細 胞 、 星 狀 細胞 及 膠 質 細 胞 等 。 綜 觀 文 獻 中 許 多 體 外 實 驗 及 動 物 實 驗 的 結 果 , 關 於 成 體 細 胞 的 分 化 潛 能 ,或 稱 可 塑 性 (plasticity) 28 有 下 列 五 種 學 說 。55

1. 成 體 幹 細 胞 有 一 些 類 似 胚 胎 幹 細 胞 特 性 的 細 胞 , 分 化 能 力 非 常 強 , 它 們 能 夠 分 化 為各 式 各 樣 的 成 體 組 織 , 這 樣 的 細 胞 被 發 現 存 在 人 類 及 小 鼠 的 骨 髓 及 肌 肉 中 。2. 成 體 幹 細 胞 的 分 化 能 力 較 胚 胎 幹 細 胞 為 差 , 成 體 中 存 有 不 同 種 類 的 成 體 幹 細 胞 , 分化 成 不 同 的 子 代 , 各 司 其 職 。3. 成 體 幹 細 胞 中 有 逆 分 化 的 現 象 (de-differentiation) 29 , 意 即 某 些 特 定 情 形 下 , 已 經分 化 的 子 代 細 胞 會 逆 分 化 回 幹 細 胞 的 狀 態 。 以 神 經 系 統 大 腦 中 的 細 胞 為 例 , 有 一 些星 狀 細 胞 在 體 外 實 驗 及 動 物 實 驗 中 均 被 證 實 有 逆 分 化 為 原 始 神 經 幹 細 胞 的 現 象 。4. 轉 分 化 (trans-differentiation) 30 的 現 象 , 意 即 某 些 特 定 組 織 分 離 出 的 成 體 幹 細 胞 在特 定 的 情 形 下 , 會 分 化 為 原 來 不 會 分 化 的 組 織 。 例 如 造 血 幹 細 胞 在 正 常 情 形 下 不 會分 化 成 肌 肉 細 胞 , 但 在 小 鼠 實 驗 中 , 若 對 小 鼠 的 前 脛 肌 (tibialis anterior muscle)製 造 壓 傷 (crushing injury), 則 造 血 幹 細 胞 會 經 由 Myeloid intermediate 分 化 成 肌 肉細 胞 。5. 細 胞 融 合 (cell fusion) 31 。 在 2000 年 前 後 , 許 多 分 化 潛 能 (plasticity) 的 實 驗 欲 證明 成 體 幹 細 胞 具 有 多 功 能 潛 能 的 特 性 , 其 中 有 許 多 的 實 驗 提 出 這 些 分 化 的 潛 能 極 可能 證 明 是 經 由 幹 細 胞 與 特 定 組 織 細 胞 發 生 細 胞 融 合 的 結 果 , 其 中 較 著 名 的 是 造 血 幹細 胞 在 動 物 實 驗 中 分 化 成 肝 臟 組 織 。 許 多 人 擔 心 細 胞 融 合 可 能 導 致 細 胞 癌 化 的 發生 , 這 使 得 成 體 幹 細 胞 的 臨 床 運 用 風 險 再 度 被 廣 泛 的 討 論 。 事 實 上 人 體 內 的 骨 骼 肌肉 細 胞 、 吞 噬 細 胞 以 及 肝 臟 細 胞 都 會 進 行 細 胞 融 合 的 反 應 , 這 樣 的 作 用 也 是 一 種 正常 的 生 理 現 象 , 我 們 需 要 對 進 行 融 合 的 細 胞 做 更 多 的 研 究 與 了 解 才 能 真 正 的 去 明 白這 些 反 應 的 生 理 意 義 而 非 一 味 否 定 這 些 細 胞 作 用 機 轉 的 可 能 與 應 用 。五 、 成 體 幹 細 胞 使 用 的 限 制 性 及 需 要 解 決 的 障 礙現 階 段 除 了 血 液 幹 細 胞 移 植 較 不 傾 向 體 外 培 養 的 使 用 方 式 之 外 , 欲 使 用 幹 細 胞 做 治 療 應用 時 都 需 要 從 事 細 胞 分 離 、 進 行 體 外 擴 增 等 放 大 細 胞 數 目 的 程 序 以 做 後 續 的 利 用 , 研 究 人 員必 須 確 保 體 外 增 生 所 獲 得 的 幹 細 胞 仍 具 有 成 功 分 化 進 而 修 復 組 織 的 特 性 , 因 此 必 須 確 切 掌 握以 下 所 列 幾 項 特 質 , 方 可 提 高 幹 細 胞 於 臨 床 使 用 安 全 性 與 價 值 :1. 產 生 足 夠 量 的 細 胞 與 組 織 。2. 分 化 後 的 特 定 性 細 胞 具 備 所 需 要 的 功 能 。3. 細 胞 移 植 後 仍 能 病 患 體 內 存 活 , 避 免 多 次 進 行 移 植 手 術 。4. 細 胞 移 植 時 不 引 發 接 受 者 體 內 之 免 疫 排 斥 性 。56

目 前 不 論 是 利 用 骨 髓 或 是 血 液 等 成 體 幹 細 胞 從 事 移 植 手 術 , 都 遭 遇 到 下 列 幾 項 困 難 :1. 並 非 所 有 成 人 的 組 織 器 官 都 可 以 分 離 出 特 定 系 統 的 幹 細 胞 。 許 多 器 官 組 織 , 如 心 臟 或 胰 島內 仍 無 法 找 到 功 能 上 對 應 分 化 的 幹 細 胞 。 目 前 利 用 不 同 組 織 轉 分 化 而 得 的 特 殊 功 能 性 細 胞 在疾 病 治 療 的 效 用 以 及 長 時 間 能 否 真 正 取 代 受 損 細 胞 而 正 常 執 行 細 胞 功 能 仍 有 待 我 們 進 一 步 的研 究 。 近 來 有 實 驗 發 現 , 以 MSC 或 HSC 分 化 而 來 的 類 神 經 細 胞 , 其 在 體 內 的 移 植 率 和 功 能性 遠 較 直 接 由 神 經 組 織 取 得 NSC 所 分 化 的 神 經 細 胞 要 來 的 低27,30 , 這 是 我 們 在 使 用 細 胞 做為 疾 病 治 療 上 需 要 多 留 意 的 現 象 。 而 自 不 同 組 織 所 分 離 的 同 一 種 成 體 幹 細 胞 也 已 被 證 實 彼 此間 所 保 有 的 細 胞 特 性 還 是 存 有 極 大 的 不 同 , 怎 麼 樣 的 疾 病 狀 況 適 合 取 用 那 一 類 的 幹 細 胞 做 為治 療 的 材 料 則 需 要 我 們 更 進 一 步 的 研 究 它 們 的 異 同 才 能 確 定 細 胞 的 培 養 條 件 而 達 到 最 佳 的 使用 效 能 。2. 成 人 幹 細 胞 在 體 內 的 數 量 極 為 稀 少 。 以 骨 髓 幹 細 胞 來 說 , 約 略 10,000~100,000 顆 骨 髓 細胞 中 才 有 一 顆 幹 細 胞 , 這 樣 少 的 比 例 並 不 容 易 分 離 或 純 化 。 臨 床 上 為 取 得 更 為 多 量 的 血 球 幹細 胞 會 讓 細 胞 捐 贈 者 或 病 患 先 施 打 G-CSF 使 得 血 液 幹 細 胞 離 開 組 織 而 跑 到 循 環 系 統 內 而 增加 能 夠 收 集 的 幹 細 胞 數 量 , 但 這 樣 的 方 式 所 耗 費 的 醫 療 成 本 較 高 , 而 且 不 是 每 一 種 我 們 所 需要 的 成 體 幹 細 胞 都 能 用 同 樣 的 方 式 增 加 收 集 的 數 量 。 科 學 家 雖 致 力 於 找 尋 出 可 用 以 辨 識 幹 細胞 的 標 誌 , 以 便 藉 著 這 些 特 殊 分 子 的 表 現 利 用 螢 光 激 發 細 胞 收 集 (fluorescence-activated cellsorting) 或 是 磁 性 活 化 細 胞 收 集 (magnetic-activated cell sorting) 的 方 式 將 所 要 的 幹 細 胞 分離 出 來 , 但 這 些 工 作 遇 到 相 當 大 的 挑 戰 , 原 因 在 於 一 旦 將 幹 細 胞 從 體 內 分 離 出 來 培 養 之 後 ,並 不 容 易 保 持 原 本 在 生 物 體 內 的 細 胞 特 性 , 而 許 多 細 胞 表 面 標 誌 分 子 在 不 同 的 培 養 時 間 和 培養 條 件 都 會 改 變 , 也 不 容 易 找 到 真 正 存 在 體 內 的 幹 細 胞 標 誌 , 這 是 目 前 科 學 家 急 欲 解 決 的 一個 問 題 。 以 最 常 被 當 作 血 液 幹 細 胞 分 離 的 標 誌 CD34 分 子 來 說 , 以 往 大 家 都 認 為 只 要 設 法 取出 表 現 有 CD34 的 血 球 細 胞 加 以 體 外 分 化 培 養 就 可 以 獲 得 大 部 分 血 液 的 細 胞 成 分 , 因 此 早 期幾 乎 就 把 CD34 + 血 球 細 胞 視 為 HSC, 但 目 前 由 於 細 胞 分 離 技 術 的 進 步 , 已 有 研 究 發 現 有 許多 處 於 休 止 期 的 細 胞 是 不 表 現 CD34 分 子 的 , 但 這 些 細 胞 仍 具 有 重 新 構 成 血 液 細 胞 組 成 的 能力 , 而 由 更 多 的 實 驗 證 明 HSC 的 潛 能 性 不 僅 和 CD34 分 子 的 表 達 相 關 , 也 需 要 一 同 考 慮 CD38以 及 CD133 等 分 子 的 表 現 作 用 才 能 獲 得 最 大 的 幹 細 胞 潛 能 。 因 此 如 何 找 到 真 正 可 辨 識 不 同幹 細 胞 的 標 誌 , 用 以 分 離 獲 取 更 高 潛 能 的 細 胞 仍 是 未 來 幹 細 胞 研 究 的 一 大 重 心 。3. 因 為 成 體 幹 細 胞 的 數 目 極 為 稀 少 , 目 前 科 學 家 多 著 重 於 發 展 利 用 體 外 增 殖 技 術 來 維 持 並 增生 具 有 移 植 活 性 幹 細 胞 的 技 術 。 然 而 幹 細 胞 的 數 目 雖 可 以 利 用 體 外 培 養 的 方 式 而 獲 得 增 加 ,但 目 前 在 這 樣 培 養 系 統 中 養 成 的 細 胞 卻 往 往 因 為 離 開 體 內 的 調 節 而 失 去 了 原 來 移 植 活 性 而 無法 達 到 臨 床 使 用 上 的 價 值 , 其 主 要 原 因 可 能 有 下 列 幾 點 。(a) 幹 細 胞 表 面 分 子 表 達 與 分 佈 的 改 變 :體 外 細 胞 培 養 的 環 境 容 易 改 變 細 胞 表 面 分 子 的 表 現 和 分 佈 性 , 而 讓 幹 細 胞 進 入 細 胞分 化 的 狀 況 , 一 旦 細 胞 失 去 某 些 重 要 的 表 達 分 子 或 進 入 分 化 狀 況 後 , 對 環 境 或 訊 息 傳 遞的 能 力 也 會 隨 之 改 變 而 影 響 細 胞 的 特 性 。(b) 細 胞 週 期 的 改 變 :57

為 了 要 獲 得 足 夠 的 細 胞 數 目 從 事 醫 療 作 用 , 具 細 胞 增 殖 效 果 的 體 外 細 胞 培 養 通 常 會改 變 細 胞 週 期 的 進 行 。 以 造 血 幹 細 胞 而 言 , 其 在 體 內 骨 髓 的 微 環 境 中 是 處 於 細 胞 的 休 眠狀 態 , 但 在 體 外 培 養 的 過 程 中 , 許 多 被 用 來 促 進 細 胞 增 生 能 力 的 生 長 激 素 會 讓 細 胞 進 入活 化 的 狀 態 , 使 細 胞 性 質 因 而 改 變 。 因 此 我 們 需 要 對 經 過 體 外 培 養 後 的 細 胞 所 可 能 改 變的 細 胞 特 性 做 更 深 入 的 研 究 與 了 解 以 調 整 未 來 從 事 細 胞 治 療 上 更 精 準 的 操 控 。(c) 缺 乏 體 內 利 基 (niche) 32 的 支 持 :許 多 實 驗 證 實 在 生 物 體 內 的 微 環 境 (microenvironment) 中 有 能 夠 維 持 幹 細 胞 特 性的 利 基 存 在 著 。 不 論 是 細 胞 間 的 接 觸 或 是 分 泌 重 要 的 介 質 分 子 , 利 基 提 供 了 幹 細 胞 在 體內 維 持 更 生 能 力 與 保 持 細 胞 分 化 力 的 調 控 環 境 。 在 體 外 培 養 擴 增 的 幹 細 胞 失 去 與 天 然 利基 的 交 互 作 用 , 便 很 容 易 喪 失 掉 幹 細 胞 的 特 性 或 進 行 不 正 常 的 細 胞 分 化 , 我 們 需 要 更 多的 研 究 與 實 證 資 料 以 提 高 細 胞 治 療 的 安 全 性 。4. 從 病 人 體 內 取 得 的 成 體 幹 細 胞 可 能 會 帶 有 不 正 常 表 現 的 癌 細 胞33 , 用 這 些 帶 有 癌 細 胞 的 幹細 胞 來 從 事 移 植 的 操 作 是 沒 有 實 際 的 價 值 的 。 然 而 若 無 法 直 接 從 病 人 身 上 取 得 幹 細 胞 做 為 自體 移 植 (autologous transplant) 之 用 , 那 麼 便 需 要 由 適 當 的 抗 原 配 對 (HLA matched) 給予 者 (donor) 提 供 幹 細 胞 。 抗 原 配 對 手 續 須 要 耗 掉 許 多 時 間 , 在 時 間 成 本 與 醫 療 使 用 效 應上 有 其 限 制 性 , 並 且 目 前 仍 有 70% 的 病 人 無 法 從 現 有 的 骨 髓 庫 中 獲 得 適 當 的 幹 細 胞 進 行 移 植治 療 , 這 些 都 是 限 制 成 體 幹 細 胞 使 用 的 因 素 。六 、 結 語幹 細 胞 研 究 的 發 展 對 於 我 們 在 個 體 發 育 的 了 解 、 醫 療 行 為 的 改 變 、 倫 理 道 德 的 要 求 與 省思 以 及 物 種 演 化 與 改 造 等 問 題 上 都 產 生 了 極 大 的 衝 擊 與 影 響 , 在 目 前 尚 無 法 對 於 胚 胎 幹 細 胞所 引 發 道 德 與 社 會 問 題 較 有 一 致 性 看 法 之 時 , 成 體 幹 細 胞 的 研 究 與 應 用 相 對 的 提 供 我 們 在 臨床 診 療 與 科 技 開 發 上 更 多 的 契 機 。 幹 細 胞 提 供 了 我 們 探 索 生 命 起 源 與 運 作 的 平 臺 , 在 那 些 尚未 被 開 啟 的 潛 藏 未 知 中 , 期 待 更 多 有 志 之 士 走 入 這 扇 門 窗 去 感 受 更 多 的 驚 奇 而 獲 得 更 多 生 命的 啟 發 與 感 動 。七 、 參 考 文 獻1. Serafini, M. & Verfaillie, C. M. Pluripotency in adult stem cells: state of the art. Semin ReprodMed. 24:379-88 (2006).2. Jacobson, L. O., Marks, E. K., Robson, M. J., Gaston, E. O. & Zirkle, R. E. Effect of spleen58

protection on mortality following x-irradiation. J Lab Clin Med. 34:1538–1543 (1949).3. Lorenz, E., Uphoff, D., Reid, T. R. & Shelton, E. Modification of irradiation injury in mice andguinea pigs by bone marrow injections. J Natl Cancer Inst. 12:197–201 (1951).4. Herzog, E. L., Chai, L. & Krause, D. S. Plasticity of marrow-derived stem cells. Blood102:3483-93 (2003).5. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9:641-50 (1991).6. Pittenger, M. F., Mackay, A.M., Beck, S.C., Jaiswal, R.K., Douglas, R., Mosca, J.D., Moorman,M.A., Simonetti, D.W., Craig, S. & Marshak, D.R. Multilineage potential of adult humanmesenchymal stem cells. Science 284:143-7 (1999).7. Yamashita, Y. M., Mahowald, A. P., Perlin, J. R. & Fuller, M. T. Asymmetric inheritance ofmother versus daughter centrosome in stem cell division. Science 315:518-21 (2007).8. Smith, G. H. Label-retaining epithelial cells in mouse mammary gland divide asymmetricallyand retain their template DNA strands. Development 132:681-7 (2005).9. Mitsiadis, T. A., Barrandon, O., Rochat, A., Barrandon, Y. & De Bari, C. Stem cell niches inmammals. Exp Cell Res. 313:3377-85 (2007).10. Song, L., Young, N. J., Webb, N. E. & Tuan, R. S. Origin and characterization of multipotentialmesenchymal stem cells derived from adult human trabecular bone. Stem Cells Dev. 14:712-21(2005).11. Jones, E. A., English, A., Henshaw, K., Kinsey, S. E., Markham, A. F., Emery, P. & McGonagle,D. Enumeration and phenotypic characterization of synovial fluid multipotential mesenchymalprogenitor cells in inflammatory and degenerative arthritis. Arthritis Rheum. 50:817-27 (2004).12. Im, G. I., Shin, Y. W. & Lee, K. B. Do adipose tissue-derived mesenchymal stem cells have thesame osteogenic and chondrogenic potential as bone marrow-derived cells? OsteoarthritisCartilage 13:845-53 (2005).13. Lee, O. K., Kuo, T. K., Chen, W. M., Lee, K. D., Hsieh, S. L. & Chen, T. H. Isolation ofmultipotent mesenchymal stem cells from umbilical cord blood. Blood 103:1669-75 (2004).14. Lee, O. K., Ko, Y. C., Kuo, T. K., Chou, S. H., Li, H. J., Chen, W. M., Chen, T. H. & Su, Y.Fluvastatin and lovastatin but not pravastatin induce neuroglial differentiation in humanmesenchymal stem cells. J Cell Biochem. 93:917-28 (2004).15. Lee, K. D., Kuo, T. K., Whang-Peng, J., Chung, Y. F., Lin, C.T., Chou, S. H., Chen, J. R., Chen,Y. P. & Lee, O. K. In vitro hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells. Hepatology40:1275-84 (2004).16. Ringden, O. Immunotherapy by Allogeneic Stem Cell Transplantation. Adv Cancer Res.97C:25-60 (2007).17. Uccelli, A., Pistoia, V. & Moretta, L. Mesenchymal stem cells: a new strategy forimmunosuppression? Trends Immunol. 28:219-26 (2007).18. Le Blanc, K., Rasmusson, I., Sundberg, B., Götherström, C., Hassan, M., Uzunel, M. & Ringdén,O. Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidenticalmesenchymal stem cells. Lancet 363(9419):1439-41(2004).59

19. Ringdén, O., Uzunel, M., Rasmusson, I., Remberger, M., Sundberg, B., Lönnies, H., Marschall,H. U., Dlugosz, A., Szakos, A., Hassan, Z., Omazic, B., Aschan, J., Barkholt, L. & Le Blanc, K.Mesenchymal stem cells for treatment of therapy-resistant graft-versus-host disease.Transplantation 81:1390-7 (2006).20. Le Blanc, K., Gotherstrom, C., Ringden, O., Hassan, M., McMahon, R., Horwitz, E., Anneren,G., Axelsson, O., Nunn, J., Ewald, U., Norden-Lindeberg, S., Jansson, M., Dalton, A., Astrom, E.& Westgren, M. Fetal mesenchymal stem-cell engraftment in bone after in utero transplantationin a patient with severe osteogenesis imperfecta. Transplantation 79:1607-14 (2005).21. Chen, X., Xu, H., Wan, C., McCaigue, M. & Li, G. Bioreactor expansion of human adult bonemarrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells 24:2052-9 (2006).22. Benvenuto, F., Ferrari, S., Gerdoni, E., Gualandi, F., Frassoni, F., Pistoia, V., Mancardi, G. &Uccelli, A. Human mesenchymal stem cells promote survival of T cells in a quiescent state.Stem Cells 25:1753-60 (2007).23. Wagner, W., Ansorge, A., Wirkner, U., Eckstein, V., Schwager, C., Blake, J., Miesala, K., Selig,J., Saffrich, R., Ansorge, W. & Ho, A.D. Molecular evidence for stem cell function of theslow-dividing fraction among human hematopoietic progenitor cells by genome-wide analysis.Blood 104:675-86 (2004).24. Bacigalupo, A., Hows, J., Gordon-Smith, E. C., Gluckman, E., Van Lint, M. T., Congiu, M.,James, D. C., Barrett, A. J., Gmur, J., De Planque, M. M., et al. Bone marrow transplantation forsevere aplastic anemia from donors other than HLA identical siblings: a report of the BMTWorking Party. Bone Marrow Transplant 3:531-5 (1988).25. Geraerts, M., Krylyshkina, O., Debyser, Z. & Baekelandt, V. Concise review: therapeuticstrategies for Parkinson disease based on the modulation of adult neurogenesis. Stem Cells25:263-70 (2007).26. Garbossa, D., Fontanella, M., Fronda, C., Benevello, C., Muraca, G., Ducati, A. & Vercelli, A.New strategies for repairing the injured spinal cord: the role of stem cells. Neurol Res. 28:500-4(2006).27. Tamaki, S., Eckert, K., He, D., Sutton, R., Doshe, M., Jain, G., Tushinski, R., Reitsma, M.,Harris, B., Tsukamoto, A., Gage, F., Weissman, I. & Uchida, N. Engraftment ofsorted/expanded human central nervous system stem cells from fetal brain. J Neurosci Res.69:976-86 (2002).28. Goodell, M. A. Stem-cell "plasticity": befuddled by the muddle. Curr Opin Hematol. 10:208-13(2003).29. Kai, T. & Spradling, A. Differentiating germ cells can revert into functional stem cells inDrosophila melanogaster ovaries. Nature 428:564-9 (2004).30. Vieyra, D. S., Jackson, K. A. & Goodell, M. A. Plasticity and tissue regenerative potential ofbone marrow-derived cells. Stem Cell Rev. 1:65-9 (2005).31. Wurmser, A. E., Nakashima, K., Summers, R. G., Toni, N., D'Amour, K. A., Lie, D. C. & Gage, F.H. Cell fusion-independent differentiation of neural stem cells to the endothelial lineage. Nature60

430:350-6 (2004).32. Lensch, M. W., Daheron, L. & Schlaeger, T. M. Pluripotent stem cells and their niches. StemCell Rev. 2:185-201 (2006).33. Filip, S., Mokry, J. & English, D. Stem cell plasticity and carcinogenesis. Neoplasma. 53:87-91(2006).61

第 五 章奈 米 科 技 於 幹 細 胞 生 物 學 之 應 用The Application of Nanotechnology on Stem Cell Biology何 嘉 倫 、 王 僅 文 、 邱 智 東 、 謝 清 河國 立 成 功 大 學 臨 床 醫 學 研 究 所 、 醫 學 工 程 研 究 所 、 微 奈 米 科 技 研 究 中 心一 、 前 言奈 米 科 技 (nanotechnology) 為 一 門 整 合 物 理 、 化 學 、 工 程 、 生 物 、 生 命 科 學 及 醫 學 等跨 領 域 的 科 學 , 透 過 各 學 科 間 知 識 及 技 術 的 交 流 , 奈 米 科 技 成 功 的 破 除 了 各 學 門 的 傳 統 巢 臼 ,建 立 了 一 個 多 重 領 域 的 研 究 技 術 及 知 識 平 臺 。 奈 米 科 技 泛 指 透 過 以 設 計 、 特 徵 化 、 製 造 等 方法 , 在 奈 米 尺 度 (10 -9 m) 的 範 圍 內 控 制 物 體 的 尺 寸 及 形 態 , 以 創 造 出 新 穎 物 理 、 化 學 及 生物 性 質 結 構 、 器 材 以 及 系 統 的 專 門 技 術1 。 近 年 來 奈 米 科 技 的 應 用 已 由 基 礎 科 學 延 伸 至 生 物醫 學 的 範 疇 , 為 因 應 各 領 域 對 奈 米 科 技 的 需 求 遽 增 , 微 小 化 科 技 與 材 料 的 發 展 於 是 由 微 米(micrometer) 的 範 圍 進 入 了 奈 米 (nanometer) 的 範 圍 。 奈 米 生 醫 材 料 (nano-biomaterials)有 別 於 傳 統 生 物 材 料 之 特 性 , 其 擁 有 許 多 獨 特 的 物 理 、 化 學 以 及 生 物 特 徵 , 所 以 被 廣 泛 的 運用 在 跨 領 域 的 研 究 及 產 業 。 近 年 來 生 物 醫 學 融 合 了 各 領 域 的 精 髓 , 演 化 成 一 門 具 有 高 度 發 展潛 力 的 新 領 域 , 其 中 幹 細 胞 生 物 學 (stem cell biology) 更 是 科 學 家 積 極 研 究 的 主 題 , 而 對 幹細 胞 的 研 究 也 因 為 有 奈 米 科 技 的 優 勢 挹 注 下 , 成 為 二 十 一 世 紀 研 究 發 展 的 主 要 重 點 之 一 。 奈米 科 技 應 用 於 幹 細 胞 生 物 學 的 構 想 , 主 要 來 自 於 奈 米 材 料 擁 有 獨 特 的 專 一 性 (specificity)、生 物 相 容 性 (biocompatibility)、 水 溶 性 (water-solubility), 且 具 較 低 之 細 胞 毒 性 (cytotoxicity)等 特 性 , 由 於 這 些 得 天 獨 厚 的 性 質 , 使 得 奈 米 材 料 能 夠 較 安 全 地 被 運 用 在 活 體 實 驗 中 , 減 少對 細 胞 造 成 非 預 期 的 傷 害 或 損 壞 。 利 用 奈 米 材 料 的 特 性 來 輔 助 幹 細 胞 於 醫 學 上 的 診 斷 及 治 療等 應 用 , 已 逐 漸 發 展 成 為 一 個 相 當 具 有 前 瞻 性 的 生 物 醫 學 研 究 領 域 。二 、 奈 米 生 醫 材 料1. 簡 介奈 米 材 料 是 奈 米 科 學 的 基 礎 , 泛 指 結 構 中 之 晶 粒 大 小 介 於 1 至 100 nm 之 間 的 粉 末 、 顆粒 、 纖 維 、 薄 膜 或 塊 體 。 由 於 奈 米 材 料 的 表 面 面 積 較 大 且 擁 有 特 殊 的 量 子 效 應 , 其 光 學 、 熱學 、 電 學 、 磁 學 、 力 學 甚 至 化 學 性 質 亦 與 微 米 尺 度 以 下 之 材 料 性 質 大 相 逕 庭 。 傳 統 物 質 經 過奈 米 化 處 理 後 , 會 產 生 許 多 不 同 的 效 應 , 其 中 包 括 所 謂 的 表 面 效 應 , 也 就 是 表 面 原 子 數 與 總63

原 子 數 比 例 劇 增 而 引 發 的 化 學 活 性 、 光 學 、 熱 性 質 等 之 改 變2 , 另 外 還 有 光 電 磁 學 上 所 定 義的 量 子 尺 寸 效 應 (quantum size effects), 也 就 是 金 屬 和 半 導 體 之 價 帶 (valence band) 和能 帶 (energy band) 的 帶 隙 變 寬 , 而 展 現 絕 緣 的 效 應 。不 同 的 奈 米 材 料 , 在 不 同 的 外 加 場 效 作 用 下 ( 例 如 : 電 場 、 磁 場 ), 會 呈 現 不 同 的 性 能 及效 應 。 透 過 奈 米 生 物 科 技 的 技 術 , 奈 米 材 料 應 用 的 範 疇 已 被 延 伸 至 半 導 體 科 技 、 電 子 材 料 、光 學 材 料 以 及 生 物 醫 學 材 料 。 舉 例 來 說 , 金 奈 米 微 粒 可 被 應 用 於 DNA 的 診 斷3 , 而 利 用 鎘 化硒 (CdSe) 備 製 的 量 子 點 (quantum dots, QD) 則 因 具 有 較 強 的 螢 光 強 度 、 較 窄 的 發 射 光譜 (emission spectrum) 以 及 較 長 的 生 命 週 期 ( 半 衰 期 ) 等 特 徵 , 因 此 可 被 利 用 於 分 子 影 像4之 擷 取 。 另 外 氧 化 鐵 奈 米 顆 粒 (iron oxide nanoparticles ) 因 為 擁 有 超 順 磁( superparamagnetic ) 特 性 , 因 此 近 年 來 亦 被 運 用 於 磁 核 共 振 影 像 系 統 (MagneticResonance Imaging, MRI) 5 。 除 此 之 外 , 隨 著 奈 米 科 技 的 蓬 勃 發 展 , 傳 統 醫 學 也 有 了 突 破性 的 進 展 , 特 別 是 有 關 創 新 生 醫 奈 米 材 料 的 研 發 , 例 如 微 脂 粒 (liposomes) 樹 狀 聚 合 物(dendrimers) 提 供 了 新 穎 的 藥 物 傳 遞 (drug delivery) 及 控 制 釋 放 (control release) 的 機67,8制 , 可 被 應 用 於 協 助 診 斷 及 改 善 治 療 的 方 法 , 這 也 使 得 現 今 許 多 必 須 借 重 手 術 治 療 才 能痊 癒 的 重 大 疾 病 , 將 來 藉 由 奈 米 生 醫 材 料 的 應 用 , 臨 床 醫 師 可 以 採 用 較 低 侵 入 性 的 治 療 方 法 ,來 降 低 病 患 對 手 術 治 療 的 依 賴 性 並 減 少 術 後 病 人 之 復 健 需 求 。2. 目 前 之 應 用目 前 奈 米 生 醫 材 料 已 被 廣 泛 的 應 用 於 不 同 領 域 的 研 究 , 其 中 較 常 見 的 包 括 : 顯 影 劑(contrast agents)、 分 子 影 像 (molecule image)、 分 子 診 斷 (molecule diagnosis)、 生 物感 測 器 (biosensor)、 生 物 標 記 (bio-targeting)、 基 質 (substrate) 運 輸 及 藥 物 控 制 釋 放 等 ,其 中 較 具 代 表 性 的 是 應 用 奈 米 材 料 於 光 學 分 子 及 細 胞 影 像 (optical molecular and cellularimaging) 之 偵 測 及 磁 核 共 振 顯 影 劑 (MRI contrast agents):(1) 光 學 分 子 及 細 胞 影 像 之 偵 測近 年 來 奈 米 科 技 將 半 導 體 材 料 表 面 修 飾 量 子 點 與 生 物 辨 識 分 子 (biorecognitionmolecules), 創 造 出 了 新 的 奈 米 螢 光 標 示 材 料 。 相 較 於 傳 統 的 有 機 染 劑 (organic dyes), 這些 量 子 點 具 有 高 度 的 水 溶 性 及 生 物 相 容 性 , 且 透 過 控 制 其 尺 寸 大 小 可 調 整 其 波 長 , 因 此 藉 由單 一 的 光 源 可 同 時 激 發 好 幾 個 不 同 尺 寸 大 小 的 量 子 點9 , 而 量 子 點 的 重 要 優 勢 在 於 其 發 光 週期 (luminescence lifetime) 以 及 抗 光 褪 現 象 (photo bleaching) 的 時 間 較 長 , 所 以 在 測 量活 體 樣 品 時 可 利 用 時 間 閘 控 (time-gating) 的 方 式 來 解 決 自 體 螢 光 的 問 題 。 另 外 量 子 點 的 光譜 發 射 峰 (emission band) 較 窄 , 因 此 可 以 透 過 調 整 其 組 成 以 及 物 理 維 度 (physical10dimension), 來 決 定 其 在 光 譜 上 的 位 置 。 由 於 上 述 光 學 的 特 性 , 近 年 來 在 分 子 影 像 的 技 術9領 域 , 量 子 點 已 漸 漸 取 代 傳 統 的 有 機 染 劑 。 目 前 許 多 利 用 量 子 點 的 生 物 分 析 技 術 已 陸 續 的被 研 發 出 來 , 例 如 :(a) 量 子 點 結 合 抗 體 (Antibody-conjugated quantum dots) 11 :將 量 子 點 結 合 抗 體 , 透 過 靜 脈 注 射 方 式 注 入 老 鼠 體 內 , 再 進 行 幹 細 胞 的 影 像 擷 取 。 由 於64

是 透 過 抗 體 與 抗 原 的 結 合 , 這 種 量 子 點 可 具 專 一 性 的 被 吸 附 於 特 定 幹 細 胞 的 表 面 , 來 達 到 影像 擷 取 之 功 效 , 此 法 不 僅 可 提 高 影 像 之 敏 感 度 , 亦 可 利 用 量 子 點 來 進 行 癌 細 胞 之 追 蹤 。(b) 螢 光 共 振 能 量 轉 移 (fluorescence resonance energy transfer, FRET) 連 結 量 子 點 之 生物 感 測 器12 :FRET 是 一 種 螢 光 光 譜 技 術 , 利 用 donor 及 acceptor 的 電 子 能 量 轉 換 , 來 量 測 分 子 或 蛋白 質 之 間 的 距 離 、 交 互 作 用 以 及 其 形 態 改 變 。 由 於 量 子 點 是 很 好 的 能 量 提 供 donor, 所 以 利用 量 子 點 可 以 非 常 有 效 的 達 到 FRET 之 效 果 。此 外 , 另 一 個 常 被 利 用 於 生 醫 影 像 觀 察 之 奈 米 材 料 為 金 奈 米 顆 粒 (gold nanoparticles),透 過 表 面 電 漿 共 振 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 的 技 術 , 金 奈 米 顆 粒 可 被 用 於 色度 顯 影 劑 (colorimetric contrasts) 13 , 而 決 定 這 些 金 奈 米 顆 粒 的 表 面 電 漿 共 振 頻 率 的 因 素 有很 多 , 包 括 : 顆 粒 形 狀 、 大 小 、 介 電 性 質 (dielectric properties)、 溶 劑 ( solvent)、 配 體 ( ligand)、集 結 狀 態 (aggregate morphology)、 表 面 功 能 化 (surface functionalization) 以 及 周 圍 液 體的 折 射 率 (refractive index)。 與 其 它 標 示 試 劑 比 起 來 , 金 奈 米 顆 粒 有 比 較 優 異 的 特 性 , 其 不會 產 生 一 般 螢 光 染 劑 常 見 的 光 解 效 應 (photo decomposition), 且 除 了 較 穩 定 且 毒 性 較 低 外 ,金 奈 米 顆 粒 也 可 以 依 照 需 求 來 調 整 其 表 面 電 漿 共 振 的 頻 率 至 特 定 的 光 譜 區 域 , 以 促 進 其 作 為光 學 生 物 影 像 與 奈 米 級 生 物 感 測 的 應 用(2) 磁 核 共 振 顯 影 劑14 。目 前 已 知 以 磁 鐵 礦 (magnetite, Fe 3 O 4 )、 磁 赤 鐵 礦 (maghemite, Fe 2 O 3 ) 或 其 他 鐵 磁體 ( ferrite) 為 核 心 之 奈 米 顆 粒 , 皆 可 作 為 超 順 磁 顯 影 劑 (superparamagnetic contrast agents)的 材 料 , 此 類 奈 米 顆 粒 統 稱 為 超 順 磁 性 氧 化 鐵 奈 米 粒 子 (superparamagnetic iron oxideparticles, SPIO) 15 。 由 於 MRI 可 偵 測 SPIO 的 濃 度 至 微 莫 耳 級 (micromolar level), 所 以SPIO 可 提 供 具 有 良 好 敏 感 性 的 MRI 顯 影 劑 。 另 外 , 也 可 在 奈 米 顆 粒 外 圍 塗 抹 一 層 親 水 性 的聚 合 物 (hydrophilic polymer), 令 其 變 成 水 溶 性 , 此 法 會 使 其 在 體 內 的 分 佈 以 及 藥 物 動 力 特性 隨 之 改 變 。 依 據 需 求 , 我 們 可 以 將 配 體 修 飾 於 SPIO 的 表 面 來 做 選 擇 性 結 合 (selectivebinding), 此 法 除 可 用 來 偵 測 特 定 的 分 子 之 外 , 亦 能 夠 降 低 非 選 擇 性 結 合 所 造 成 的 背 景 雜 訊(background noise) 與 組 織 毒 性 (toxicity)。近 年 來 有 關 SPIO 的 研 究 已 經 激 起 眾 多 學 者 的 興 趣 , 主 要 原 因 有 以 下 幾 點 :(a) 與 其 他 顯 影 劑 相 比 , 每 一 單 位 的 SPIO 可 提 供 較 顯 著 的 訊 號 變 化 。(b) 氧 化 鐵 奈 米 粒 子 可 被 細 胞 代 謝 吸 收 , 相 較 於 其 他 金 屬 材 料 , 更 適 合 被 運 用 在 活 體 動 物試 驗 。(c) 藉 由 表 面 塗 層 (coating) 可 直 接 於 SPIO 表 面 結 合 配 體 及 官 能 基 (functional groups)而 達 到 選 擇 性 結 合 的 效 果 。(d) 可 直 接 使 用 光 學 及 電 子 顯 微 鏡 偵 測 SPIO。(e)SPIO 的 磁 性 可 透 過 控 制 其 尺 寸 大 小 來 做 調 整 。(f) 目 前 尚 無 研 究 發 現 SPIO 會 對 人 體 造 成 傷 害 。65

三 、 奈 米 材 料 之 種 類 與 特 性奈 米 材 料 的 種 類 繁 多 , 較 常 見 的 有 三 種 : 奈 米 微 粒 (nanoparticles )、 奈 米 纖 維(nanofibers)、 奈 米 線 材 (nanowires), 這 幾 種 材 質 的 特 性 各 有 特 色 , 且 可 被 應 用 的 領 域 及範 疇 均 不 同 。1. 奈 米 微 粒奈 米 微 粒 的 製 備 可 利 用 高 分 子 聚 合 物 (polymers) 16 、 樹 突 狀 高 分 子 (dendrimers) 17 、微 乳 劑 (microemulsions) 18 等 材 料 , 其 優 勢 來 自 於 其 組 成 結 構 , 包 含 一 個 核 心 以 及 外 鞘 ,因 此 當 被 用 做 藥 物 釋 放 載 具 時 , 其 所 運 輸 的 基 因 或 藥 物 可 被 包 覆 在 奈 米 微 粒 的 核 心 內 , 以 與外 界 微 環 境 (microenvironment) 如 酸 鹼 值 (pH)、 離 子 強 度 (ionic strength)、 化 學 氧 化 或還 原 (chemical oxidation or reduction)、 催 化 酵 素 (catalytic enzymes) 等 隔 絕 , 如 此 除 可避 免 基 因 或 藥 物 在 被 運 送 至 目 的 地 前 受 到 周 圍 環 境 的 破 壞 , 亦 可 避 免 與 其 他 不 相 關 的 細 胞 或組 織 進 行 非 必 要 的 接 觸 , 以 減 少 其 副 作 用 。 至 於 微 脂 粒 (liposomes) 是 指 脂 質 所 形 成 的 空 心微 球 , 可 懸 浮 於 水 相 中 , 其 脂 質 膜 表 面 主 要 是 由 磷 脂 質 所 構 成 的 脂 質 雙 層 (lipid bilayers),其 結 構 安 排 與 正 常 的 細 胞 膜 十 分 近 似 , 如 此 便 具 有 可 與 細 胞 膜 融 合 或 被 細 胞 吞 食 的 特 性 , 同時 也 可 依 不 同 用 途 量 身 裁 製 以 被 運 用 在 生 物 體 內 分 子 辨 識 、 訊 號 以 及 通 透 性 的 控 制19,20 。 再者 , 奈 米 微 粒 亦 可 在 其 外 鞘 表 面 進 行 修 飾 , 結 合 配 體 或 是 抗 體 , 透 過 與 接 受 器 (receptor) 的專 一 性 結 合 , 將 被 運 輸 的 基 因 或 藥 物 引 導 至 特 定 的 細 胞 , 再 進 行 控 制 性 的 釋 放 以 產 生 作 用 ( 圖一 )。圖 一 、 奈 米 微 粒 核 心 裝 載 藥 物 / 表 面 連 結 基 體 示 意 圖 。66

2. 奈 米 纖 維奈 米 纖 維 是 利 用 奈 米 生 化 技 術 所 開 發 出 來 的 新 材 料 之 ㄧ, 其 主 要 的 製 造 方 式 包 括 三 種 :電 紡 絲 法 (electrospinning)、 自 我 組 裝 (self-assembly) 以 及 相 分 離 法 (phase seperation),其 中 最 常 用 到 的 方 法 是 電 紡 絲 法21 。 一 般 而 言 , 奈 米 纖 維 具 備 高 度 生 物 相 容 性(biocompatible) 及 生 物 可 溶 解 性 (biodegradable) 等 優 點 , 因 此 可 藉 由 體 內 正 常 的 新 陳 代謝 加 以 分 解 、 吸 收 或 是 排 出 體 外 。 不 僅 如 此 , 由 於 奈 米 纖 維 具 有 特 大 表 面 積 與 高 孔 隙 性 的 特性 , 因 此 在 許 多 不 同 的 領 域 都 有 非 常 廣 泛 的 用 途 , 其 中 包 括 :(1) 細 胞 支 架 (cell scaffold) 材 料 :運 用 於 骨 骼 肌 肉 、 皮 膚 、 血 管 、 神 經 等 組 織 工 程 (tissue engineering) 21 或 是 人 工 敷 料 、植 入 體 表 面 鍍 層 等 。(2) 藥 物 、 蛋 白 質 、DNA 或 細 胞 運 輸 的 載 體21 。(3) 電 子 材 料 :奈 米 纖 維 可 作 為 高 效 能 儲 氫 材 料 、 感 應 器 與 感 光 材 料 , 而 利 用 導 電 高 分 子 可 製 作 具 有 導 體與 半 導 體 特 性 的 分 子 纖 維 , 取 代 一 般 電 路 所 用 的 導 電 材 料 。(4) 負 離 子 纖 維 材 料 用 於 高 效 率 過 濾 材 , 有 防 靜 電 、 除 塵 、 除 臭 等 防 治 空 氣 污 染 的 用 途 。22(5) 光 子 晶 體 纖 維 (photonic crystal fiber), 其 光 傳 遞 功 率 高 可 取 代 傳 統 的 光 纖 。3. 奈 米 線 材奈 米 線 材 可 被 用 於 製 作 奈 米 線 感 測 器 , 這 是 利 用 具 有 分 子 辨 識 功 能 的 生 物 分 子 來 改 變 奈米 線 材 的 表 面 性 質 , 以 偵 測 與 其 具 有 專 一 性 交 互 作 用 的 分 子 。 由 於 奈 米 線 材 的 尺 寸 極 小 且 敏感 度 極 高 , 因 此 受 測 物 之 濃 度 與 數 量 閥 值 均 可 降 至 最 低 , 這 便 是 所 謂 的 超 感 度 偵 測 器23 , 可用 來 做 早 期 疾 病 的 偵 測 。 此 外 , 奈 米 線 偵 測 器 也 可 被 植 入 微 整 合 型 生 物 晶 片 (lab-on-a-chip)中 作 為 疾 病 診 斷 以 及 藥 物 傳 輸 的 用 途 , 更 有 文 獻 指 出 利 用 奈 米 線 材 的 高 表 面 積 以 及 良 好 電 子通 路 的 特 色 可 應 用 在 DNA 的 偵 測24 。 因 此 , 利 用 奈 米 線 材 體 積 小 且 敏 感 度 高 的 特 性 , 將 其植 入 儀 器 或 是 與 其 它 系 統 整 合 , 可 針 對 不 同 目 的 做 高 敏 感 度 偵 測 , 其 未 來 應 用 的 範 圍 將 十 分廣 泛 。四 、 奈 米 生 醫 材 料 於 幹 細 胞 生 物 醫 學 之 應 用1. 疾 病 的 診 斷目 前 在 醫 療 院 所 診 斷 疾 病 時 較 常 使 用 的 先 進 影 像 掃 描 儀 器 , 包 括 核 磁 共 振 影 像 掃 描(MRI) 及 正 子 放 射 型 斷 層 掃 描 術 (Positron Emission Tomography, PET)。 MRI 是 目 前 較先 進 的 人 體 掃 描 方 法 , 可 取 得 相 當 清 晰 的 影 像 , 且 無 需 使 用 任 何 放 射 性 物 質 , 檢 查 過 程 安 全且 舒 適 , 對 人 體 不 會 造 成 傷 害 。 而 PET 則 是 一 種 非 侵 入 性 之 核 子 醫 學 造 影 技 術 , 正 子 放 射 藥物 可 經 由 吸 入 、 吞 食 或 注 射 進 入 體 內 , 再 以 PET 偵 測 此 放 射 藥 物 在 體 內 之 分 佈 , 進 行 全 身 器官 組 織 之 功 能 性 造 影 檢 查 。 以 上 兩 種 造 影 技 術 之 原 理 相 近 , 皆 可 用 於 疾 病 之 診 斷 。 但 現 在 病患 又 多 了 一 個 新 的 選 擇 , 可 利 用 奈 米 生 醫 材 料 來 做 影 像 擷 取 。 目 前 最 常 用 於 造 影 的 奈 米 生 醫67

材 料 即 為 上 述 之 SPIO, 主 要 用 來 診 斷 發 炎 性 疾 病 (inflammatory disease) 及 退 化 性 疾 病(degenerative disease), 例 如 局 部 腦 缺 血 (focal ischemic lesions) 25,26 、 動 脈 硬 化(atherosclerosis) 27 、 多 發 性 硬 化 (multiple sclerosis) 28 、 腎 臟 疾 病 (kidney disease) 29 、骨 關 節 炎 (osteoarthritis) 30 等 , 均 可 利 用 SPIO 做 為 MRI 顯 影 劑 的 功 能 , 來 達 到 診 斷 的 目的 。 除 此 之 外 , 利 用 奈 米 線 材 研 發 而 成 的 超 感 度 偵 測 器23 , 除 了 能 提 供 早 期 的 診 斷 外 , 亦 能夠 提 供 更 準 確 及 精 準 的 結 果 。另 一 種 應 用 則 是 對 於 特 定 疾 病 細 胞 的 偵 測 , 透 過 表 面 修 飾 方 法 將 螢 光 分 子 以 及 抗 體 以 聚合 分 子 鏈 (polymer chain) 修 飾 於 奈 米 材 料 表 面 , 經 由 抗 體 及 抗 原 間 的 特 定 結 合 (specificbinding), 將 帶 有 螢 光 抗 體 的 奈 米 材 料 連 結 到 專 一 的 結 合 器 或 抗 原 上 , 透 過 特 定 的 偵 測 法 ,可 以 偵 測 到 體 內 特 定 細 胞 如 癌 幹 細 胞 (cancer stem cells) 的 分 佈 及 含 量 , 近 一 步 瞭 解 疾 病的 嚴 重 程 度 與 發 展 , 以 利 擬 定 治 療 方 針 與 術 後 照 護 。2. 疾 病 的 治 療 與 組 織 的 修 復奈 米 生 醫 材 料 應 用 於 疾 病 的 治 療 與 組 織 的 修 復 , 除 可 利 用 其 細 胞 追 蹤 (cell tracking)及 分 子 標 示 (molecular targeting) 的 功 能 來 達 到 標 靶 治 療 (targeted therapy) 的 目 的 外 ,藥 物 傳 遞 及 控 制 釋 放 的 機 制 亦 是 治 療 的 重 點 之 一 。 奈 米 材 料 之 應 用 除 了 疾 病 的 診 斷 外 , 另 一個 重 點 是 癌 症 的 治 療 , 近 年 來 這 種 利 用 分 子 標 示 的 方 法 進 行 標 靶 性 治 療 已 逐 漸 發 展 成 為 一 個熱 門 的 領 域 。 除 此 之 外 , 過 去 慣 用 的 系 統 性 的 給 藥 常 常 無 法 達 到 有 效 治 療 的 需 求 , 為 了 更 準確 的 將 藥 物 、 幹 細 胞 或 是 基 因 傳 遞 至 發 炎 、 損 壞 、 或 需 要 修 復 的 組 織 與 細 胞 上 , 奈 米 生 醫 材料 的 出 現 , 提 供 了 標 靶 治 療 及 控 制 性 藥 物 釋 放 的 極 佳 工 具 。(a) 針 對 癌 幹 細 胞 的 治 療目 前 盛 行 的 癌 症 治 療 主 要 是 透 過 全 身 性 的 化 學 治 療 , 此 治 療 方 式 常 不 具 專 一 性 , 除 了 會使 癌 細 胞 死 亡 之 外 , 在 治 療 的 過 程 中 也 會 導 致 正 常 的 細 胞 一 併 被 破 壞 , 造 成 許 多 癌 症 患 者 最後 不 是 因 為 癌 症 的 惡 化 而 死 亡 , 反 而 是 因 化 療 的 副 作 用 而 失 去 生 命 。 科 學 家 為 了 提 升 癌 症 病人 的 生 活 品 質 以 及 治 療 的 效 果 , 不 斷 地 在 尋 找 新 的 治 療 方 式 。 深 入 的 研 究 發 現 , 癌 組 織 多 數是 由 異 質 細 胞 族 群 (heterogeneous cell population) 所 形 成 , 除 了 癌 細 胞 外 , 在 癌 組 織 內 另存 有 一 小 部 分 含 有 幹 細 胞 特 性 的 癌 幹 細 胞31 。 近 年 來 有 許 多 研 究 指 出 , 癌 幹 細 胞 可 能 是 癌 組織 中 少 數 具 有 無 限 增 殖 潛 能 的 癌 生 成 細 胞 , 而 癌 症 的 形 成 與 復 發 很 可 能 是 由 於 這 些 極 少 數 的癌 幹 細 胞 不 斷 增 生 或 復 育 出 癌 細 胞 所 造 成 的32 。 如 吾 人 所 知 , 幹 細 胞 的 特 徵 在 於 它 們 會 進 行不 對 稱 分 裂 (asymmetric division), 形 成 新 的 幹 細 胞 以 及 分 化 的 細 胞31-33 。 正 常 幹 細 胞 的 分裂 會 受 到 生 物 機 制 的 控 制 , 透 過 有 限 度 的 增 生 來 修 補 受 傷 或 凋 亡 的 細 胞 , 而 癌 幹 細 胞 的 特 徵則 是 在 於 它 們 會 不 正 常 的 增 生 , 形 成 大 量 的 癌 細 胞31 。 許 多 研 究 已 在 身 體 不 同 部 位 的 癌 細 胞中 發 現 癌 幹 細 胞 的 存 在 , 包 括 : 血 液 、 乳 房 、 中 樞 神 經 、 胰 臟 、 皮 膚 、 腦 部 、 頸 部 、 直 腸 、以 及 前 列 腺 等 部 位31,34 。 目 前 的 研 究 認 為 如 果 只 是 把 分 化 的 癌 細 胞 移 除 , 殘 留 下 來 的 癌 幹 細胞 仍 會 繼 續 不 斷 增 生 , 所 以 如 果 無 法 徹 底 清 除 體 內 的 癌 幹 細 胞 , 對 癌 症 的 治 療 就 無 法 達 到 百分 之 百 的 效 果 或 是 有 復 發 、 轉 移 之 可 能 , 而 目 前 傳 統 化 學 療 法 最 大 的 困 難 之 一 就 是 無 法 針 對68

癌 幹 細 胞 進 行 百 分 之 百 移 除 或 消 滅 的 動 作 , 因 此 利 用 奈 米 材 料 進 行 腫 瘤 幹 細 胞 的 追 蹤 觀 察 或標 靶 治 療 , 在 癌 症 的 治 療 與 診 斷 上 十 分 具 有 潛 力 。 舉 例 而 言 , 許 多 癌 幹 細 胞 擁 有 特 殊 的 CD133抗 原35 , 因 此 在 奈 米 材 料 上 修 飾 CD133 抗 體 及 螢 光 材 料 或 抗 癌 藥 物 , 透 過 抗 體 與 抗 原 的 特定 結 合 可 以 辨 識 及 標 定 癌 幹 細 胞 的 位 置 與 分 布 , 再 利 用 奈 米 微 粒 將 藥 物 包 覆 在 核 心 內 , 直 接運 送 到 癌 幹 細 胞 的 位 置 , 以 進 行 特 定 部 位 的 抗 癌 治 療 , 其 優 點 除 可 提 高 治 療 的 效 果 外 , 亦 可避 免 藥 物 與 一 般 正 常 細 胞 的 接 觸 , 以 減 低 正 常 細 胞 的 死 亡 率 與 降 低 藥 物 的 作 用 。(b) 奈 米 微 粒 之 藥 物 傳 遞隨 著 科 技 的 進 展 , 臨 床 藥 物 的 治 療 需 求 亦 需 提 高 其 精 準 度 , 藥 物 若 直 接 以 全 身 性 的 方 式給 藥 如 注 射 或 口 服 , 無 法 達 成 精 準 的 控 制 , 因 為 藥 物 經 注 射 或 口 服 後 , 會 經 由 血 液 循 環 被 運輸 至 全 身 各 個 器 官 , 如 此 除 了 需 接 受 治 療 的 組 織 或 細 胞 可 能 因 為 大 部 分 藥 物 被 稀 釋 至 其 他 部位 而 導 致 劑 量 、 作 用 濃 度 不 足 以 外 , 也 容 易 造 成 其 他 組 織 的 不 良 反 應 或 副 作 用 , 為 改 善 此 缺點 , 許 多 研 究 將 藥 物 包 覆 在 奈 米 微 粒 內 , 並 視 目 標 細 胞 表 面 之 抗 原 及 接 受 器 , 決 定 要 在 奈 米微 粒 上 結 合 相 對 應 之 抗 體 以 增 加 其 專 一 性 。 如 前 所 述 , 若 在 奈 米 微 粒 表 面 修 飾 特 定 的 抗 體 ,這 些 抗 體 將 會 指 引 奈 米 微 粒 鏈 結 至 細 胞 膜 表 面 含 特 定 接 受 器 的 細 胞 , 再 透 過 與 周 邊 環 境 的 影響 與 互 動 , 可 將 藥 物 釋 放 至 細 胞 , 而 當 藥 物 被 運 輸 至 特 定 細 胞 之 前 , 奈 米 微 粒 會 保 護 這 些 藥物 不 受 破 壞 或 分 解 , 以 確 保 藥 物 在 到 達 特 定 組 織 前 不 會 失 去 其 原 本 活 性 , 而 降 低 該 藥 物 之 療效 。(c) 奈 米 纖 維 之 藥 物 投 遞 與 控 制 釋 放 機 制奈 米 纖 維 的 優 勢 是 在 於 它 能 與 細 胞 或 藥 物 結 合 , 形 成 支 架 (scaffold) 作 為 細 胞 貼 附 與 生長 的 基 質 , 並 且 提 供 藥 物 控 制 釋 放 的 機 制36 。 奈 米 纖 維 已 被 運 用 在 藥 物 的 投 遞 與 組 織 工 程 的研 究 , 在 藥 物 投 遞 方 面 , 利 用 將 藥 物 包 覆 在 奈 米 纖 維 形 成 的 水 膠 (hydrogel) 之 內 , 活 體 注射 後 可 以 延 長 藥 物 在 組 織 內 與 細 胞 接 觸 的 時 間 , 以 提 高 藥 物 的 吸 收 效 率 。 尤 有 甚 者 , 透 過 表面 修 飾 與 基 因 重 組 的 技 術 , 更 可 以 進 一 步 提 高 奈 米 纖 維 的 水 溶 性 、 免 疫 相 容 性(immunocompatibility) 以 及 細 胞 吸 收 率 的 專 一 性 , 因 此 可 改 善 傳 統 藥 物 投 藥 的 一 些 問 題 ,例 如 有 限 的 生 體 可 用 率 (bioavailability)、 標 靶 投 藥 的 準 確 度 以 及 全 身 性 的 不 良 反 應 或 副 作 用36 。奈 米 纖 維 能 夠 裝 載 的 藥 物 十 分 多 元 , 包 括 大 、 小 分 子 藥 物 如 胺 基 酸 、 蛋 白 質 、DNA、siRNA、 以 及 小 分 子 化 合 物 (small molecules)。 另 外 在 組 織 工 程 方 面 的 應 用 , 奈 米 纖 維 可 結合 幹 細 胞 或 生 長 因 子 , 如 血 管 內 皮 生 長 因 子 (Vascular Endothelial Growth Factors, VEGFs)及 血 小 板 衍 生 生 長 因 子 (Platelet Derived Growth Factors, PDGFs), 形 成 一 個 複 合 式 支 架(complex scaffold), 透 過 直 接 注 射 至 須 進 行 修 復 的 受 損 組 織 位 置 , 可 以 幫 助 肌 肉 、 皮 膚 、血 管 以 及 神 經 等 組 織 進 行 修 復 與 再 生21 。 不 同 的 生 長 因 子 因 為 與 奈 米 纖 維 連 結 親 和 力(binding affinity) 之 強 弱 不 同 , 其 擴 散 (diffuse) 出 去 乃 至 為 細 胞 所 吸 收 的 時 間 長 短 亦 不 同 ,因 此 依 據 奈 米 纖 維 所 要 攜 帶 的 生 長 因 子 之 不 同 , 就 必 須 設 計 不 同 的 控 制 釋 放 機 制 , 以 達 到 最佳 的 釋 放 時 間 與 速 率37 。 過 去 我 們 的 研 究 曾 利 用 自 組 裝 的 胜 肽 奈 米 纖 維 (self-assemblingpeptide nanofibers) 攜 帶 PDGF 進 行 受 損 心 肌 的 修 復36,38 , 其 效 果 與 直 接 將 PDGF 注 入69

心 肌 有 相 當 顯 著 的 差 異 , 主 要 的 原 因 即 在 於 奈 米 纖 維 與 PDGF 形 成 的 複 合 式 支 架 能 夠 將PDGF 保 留 在 受 損 的 心 肌 上 , 而 不 被 血 液 循 環 所 移 除 , 因 此 可 以 延 長 PDGF 心 肌 修 復 的 時 間 ,而 提 高 其 治 療 效 果 。一 般 而 言 , 利 用 奈 米 纖 維 進 行 控 制 性 藥 物 釋 放 其 主 要 的 機 制 有 三 種 , 第 一 種 是 奈 米 纖 維隨 時 間 自 我 分 解 而 釋 放 出 包 覆 在 內 層 的 藥 物 或 生 長 因 子 , 第 二 種 是 透 過 化 學 鍵 結 裂 解 的 方 式來 釋 放 所 攜 帶 的 藥 物 或 生 長 因 子 , 第 三 種 則 是 利 用 自 發 性 蛋 白 質 分 解 酵 素 (protease) 來 切斷 奈 米 纖 維 與 藥 物 或 生 長 因 子 的 鍵 結37 。 第 一 種 釋 放 方 式 主 要 運 用 於 藥 物 被 包 覆 在 奈 米 纖 維支 架 內 部 但 不 被 鏈 結 , 藥 物 到 達 目 的 地 後 會 隨 著 濃 度 的 梯 度 由 支 架 內 被 釋 放 , 其 所 需 要 的 藥物 釋 放 時 間 最 為 短 暫 。 第 二 種 釋 放 機 制 是 以 離 子 或 共 價 鏈 結 藥 物 在 奈 米 纖 維 支 架 上 , 鏈 結 周圍 的 奈 米 纖 維 自 我 分 解 後 , 被 鏈 結 住 的 物 質 就 會 被 釋 放 , 但 周 邊 的 微 環 境 也 會 影 響 釋 放 的 速率 與 時 間 , 一 般 來 說 此 種 釋 放 機 制 所 需 的 時 間 最 長 , 亦 最 不 受 控 制 。 最 後 一 種 則 是 利 用 酵 素切 斷 鏈 結 的 奈 米 支 架 , 此 類 鏈 結 需 要 透 過 蛋 白 分 解 酵 素 的 作 用 才 會 被 剪 斷 , 因 此 只 有 在 有 酵素 存 在 的 狀 況 下 , 藥 物 才 會 被 釋 放 出 來 。 根 據 不 同 的 需 求 , 這 些 釋 放 的 機 制 可 以 單 獨 被 應 用 ,或 甚 至 經 過 處 理 成 為 多 功 能 性 的 釋 放 , 在 同 樣 的 奈 米 纖 維 上 以 多 重 釋 放 機 制 來 進 行 細 胞 或 組織 之 修 復 。(d) 奈 米 材 料 與 幹 細 胞 之 結 合幹 細 胞 治 療 最 大 的 限 制 主 要 在 於 它 的 體 內 保 留 率 (retention rate) 與 存 活 率 (survivalrate) 過 低 。 過 去 許 多 研 究 將 幹 細 胞 直 接 注 入 體 內 後 , 發 現 大 多 數 幹 細 胞 會 馬 上 死 亡 , 而 存活 下 來 的 幹 細 胞 在 需 要 修 復 的 組 織 上 停 留 的 時 間 也 極 短 , 往 往 會 隨 著 血 液 循 環 漂 流 至 其 他 組織 部 位 , 因 此 透 過 與 奈 米 材 料 結 合 後 , 將 幹 細 胞 與 奈 米 材 料 的 支 架 注 射 至 急 需 修 復 的 部 位 ,如 心 肌 梗 塞 後 受 損 之 心 臟 肌 肉 ( 圖 二 ), 可 大 大 提 升 移 植 幹 細 胞 的 存 活 率 與 保 留 率 , 以 促 進 幹細 胞 治 療 的 效 果 。 除 此 之 外 , 上 述 提 及 的 奈 米 纖 維 結 合 幹 細 胞 或 生 長 因 子 之 控 制 釋 放 機 制 及標 靶 投 遞 的 特 性 , 亦 可 被 應 用 於 幹 細 胞 的 研 究 與 治 療 。 例 如 , 由 於 胜 肽 奈 米 纖 維 本 身 會 自 行降 解 且 其 生 物 相 容 性 也 相 當 高 , 既 不 會 造 成 宿 主 免 疫 反 應 也 不 會 增 加 組 織 發 炎 程 度 , 因 此 與傳 統 生 醫 材 料 相 比 較 , 具 有 相 當 高 的 優 勢 。五 、 未 來 展 望奈 米 科 技 於 幹 細 胞 生 物 學 的 應 用 主 要 目 的 在 達 到 疾 病 早 期 的 診 斷 、 提 高 診 斷 結 果 的 靈 敏度 、 精 準 的 控 制 與 釋 放 機 制 進 行 藥 物 投 遞 及 利 用 標 靶 治 療 的 方 法 來 提 升 治 療 效 果 , 為 在 精 準控 制 的 狀 況 下 達 成 此 目 標 , 必 須 廣 泛 的 利 用 上 述 所 提 及 的 生 醫 奈 米 材 料 特 色 , 來 研 發 出 高 專一 度 、 高 準 確 度 以 及 高 敏 感 度 的 診 斷 、 治 療 技 術 及 工 具 。 幹 細 胞 研 究 及 奈 米 科 技 發 展 二 者 均需 要 大 量 的 研 究 人 才 及 資 金 不 斷 的 注 入 , 各 領 域 對 幹 細 胞 的 了 解 日 益 加 深 , 再 加 上 創 新 奈 米技 術 的 配 合 及 輔 助 下 , 讓 研 究 人 員 可 以 在 奈 米 的 尺 度 下 探 討 生 醫 奈 米 材 料 與 幹 細 胞 之 間 的 交互 作 用 機 制 , 這 是 過 去 所 無 法 達 成 的 , 因 此 奈 米 技 術 水 準 與 研 究 平 臺 的 開 發 , 是 未 來 幹 細 胞研 究 的 重 點 發 展 方 向 之 一 , 希 望 藉 由 這 些 跨 領 域 的 結 合 , 能 激 發 出 新 的 火 花 , 提 供 臨 床 診 斷與 治 療 的 新 契 機 。70

圖 二 、 利 用 自 組 裝 胜 肽 奈 米 纖 維 結 合 生 長 因 子 藥 物 釋 放 與 幹 細 胞 治 療 , 可 以 提 升 幹 細胞 注 射 至 受 損 心 肌 後 的 存 活 率 與 保 留 率 , 以 促 進 心 肌 再 生 。六 、 參 考 文 獻1. Ebbesen, M. & Jensen, T. G. Nanomedicine: techniques, potentials, and ethical implications.J Biomed Biotechnol. 2006:51516 (2006).2. 高 逢 時 . 科 學 發 展 , ( 行 政 院 國 家 科 學 委 員 會 , 臺 灣 , 2005).3. Csaki, A., Moller, R. & Fritzsche, W. Gold nanoparticles as novel label for DNA diagnostics.Expert Rev Mol Diagn 2:187-193 (2002).4. Chan, W.C. & Nie, S. Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection.Science 281:2016-2018 (1998).5. Weissleder, R., Moore, A., Mahmood, U., Bhorade, R., Benveniste, H., Chiocca, E. A. &Basilion, J. P. In vivo magnetic resonance imaging of transgene expression. Nat Med.6:351-355 (2000).6. Winter, P. M., Morawski, A. M., Caruthers, S. D., Fuhrhop, R.W., Zhang, H., Williams, T. A.,Allen, J. S., Lacy, E. K., Robertson, J. D., Lanza, G. M. & Wickline, S. A. Molecular imagingof angiogenesis in early-stage atherosclerosis with alpha(v)beta3-integrin-targetednanoparticles. Circulation 108:2270-2274 (2003).7. Roco, M. C. Nanotechnology: convergence with modern biology and medicine. Curr OpinBiotechnol. 14:337-346 (2003).8. Vinogradov, S. The second annual symposium on nanomedicine and drug delivery:exploring recent developments and assessing major advances. 19-20 August 2004,Polytechnic University, Brooklyn, NY, USA. Expert Opin Drug Deliv. 1:181-184 (2004).9. Chan, W. C., Maxwell, D. J., Gao, X., Bailey, R. E., Han, M. & Nie, S. Luminescent quantumdots for multiplexed biological detection and imaging. Curr Opin Biotechnol. 13:40-46(2002).71

10. Raymo, F.M. & Yildiz, I. Luminescent chemosensors based on semiconductor quantum dots.Phys Chem Chem Phys. 9:2036-2043 (2007).11. Goldman, E. R., Balighian, E. D., Mattoussi, H., Kuno, M. K., Mauro, J. M., Tran, P. T. &Anderson, G. P. Avidin: a natural bridge for quantum dot-antibody conjugates. J Am ChemSoc. 124:6378-6382 (2002).12. Medintz, I. L., Clapp, A. R., Mattoussi, H., Goldman, E. R., Fisher, B. & Mauro, J. M.Self-assembled nanoscale biosensors based on quantum dot FRET donors. Nat Mater2:630-638 (2003).13. Jin, R., Cao, Y., Mirkin, C. A., Kelly, K. L., Schatz, G. C. & Zheng, J. G. Photoinducedconversion of silver nanospheres to nanoprisms. Science 294:1901-1903 (2001).14. Kim, S., Lim, Y. T., Soltesz, E. G., De Grand, A. M., Lee, J., Nakayama, A., Parker, J. A.,Mihaljevic, T., Laurence, R. G., Dor, D. M., Cohn, L. H., Bawendi, M. G. & Frangioni, J. V.Near-infrared fluorescent type II quantum dots for sentinel lymph node mapping. NatBiotechnol. 22:93-97 (2004).15. Cheng, F. Y., Su, C. H., Yang, Y. S., Yeh, C. S., Tsai, C. Y., Wu, C. L., Wu, M. T. & Shieh, D.B. Characterization of aqueous dispersions of Fe(3)O(4) nanoparticles and their biomedicalapplications. Biomaterials 26:729-738 (2005).16. Kuang, M., Duan, H., Wang, J., Chen, D. & Jiang, M. A novel approach to polymeric hollownanospheres with stabilized structure. Chem Commun (Camb), 496-497 (2003).17. Nakajima, R., Tsuruta, M., Higuchi, M. & Yamamoto, K. Fine control of the release andencapsulation of Fe ions in dendrimers through ferritin-like redox switching. J Am Chem Soc.126:1630-1631 (2004).18. Zarur, A. J. & Ying, J. Y. Reverse microemulsion synthesis of nanostructured complexoxides for catalytic combustion. Nature 403:65-67 (2000).19. 余 秀 瑛 . 微 脂 粒 為 基 因 媒 傳 之 研 究 . 國 科 會 生 命 科 學 簡 訊 第 15 卷 (2001).20. Cortesi, R. & Nastruzzi, C. Liposomes, micelles and microemulsions as new deliverysystems for cytotoxic alkaloids. Pharm Sci Technolo Today 2:288-298 (1999).21. Vasita, R. & Katti, D.S. Nanofibers and their applications in tissue engineering. Int JNanomedicine 1:15-30 (2006).22. 工 研 院 化 工 所 企 推 組 研 發 室 聞 勛 琪 經 理 . 奈 米 化 學 之 發 展 潛 力 . 化 工 產 業 技 術 知 識 網http://www.chemtech.com.tw/Column.php?mode=detail&id=32.23. Cui, Y., Wei, Q., Park, H. & Lieber, C.M. Nanowire nanosensors for highly sensitive andselective detection of biological and chemical species. Science 293:1289-1292 (2001).24. Li, Z., Chen, Y., Li, X., Kamins, T., Nauka, K. & Williams, R. S. Sequence-SpecificLabel-Free DNA Sensors Based on Silicon Nanowires. Nano Letters 4:245-247 (2004).25. Saleh, A., Wiedermann, D., Schroeter, M., Jonkmanns, C., Jander, S. & Hoehn, M. Centralnervous system inflammatory response after cerebral infarction as detected by magneticresonance imaging. NMR Biomed. 17:163-169 (2004).26. Saleh, A., Schroeter, M., Jonkmanns, C., Hartung, H. P., Mödder, U. & Jander, S. In vivo72

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第 六 章複 製 動 物 技 術 在 幹 細 胞 相 關 研 究 之 應 用Application of Animal Cloning Technologies inStudies Related to Stem Cells吳 信 志1,2鄭 登 貴1,21臺 灣 大 學 動 物 科 學 技 術 學 系 2 臺 灣 大 學 生 物 科 技 研 究 所一 、 前 言近 十 餘 年 來 , 有 關 動 物 複 製 (animal cloning)、 基 因 轉 殖 (transgenesis)、 及 幹 細 胞(stem cells) 之 分 離 、 建 立 和 再 生 醫 學 (regenerative medicine) 等 相 關 領 域 研 究 之 進 展 殊為 快 速 ; 其 中 若 干 特 定 技 術 , 諸 如 : 治 療 用 複 製 技 術 (therapeutic cloning)、 胚 幹 細 胞(embryonic stem cells, ESCs) 及 成 體 幹 細 胞 (adult stem cells, ASCs) 之 建 立 、 報 導 基 因轉 殖 (reporter gene transfer)、 幹 細 胞 誘 導 分 化 、 生 物 可 降 解 性 (biodegradable) 之 組 織工 程 材 料 , 與 細 胞 移 植 等 相 關 技 術 之 發 展 , 促 使 人 類 遺 傳 性 及 非 遺 傳 性 疾 病 之 治 療 增 添 了 許多 新 方 法 。 然 而 迄 今 上 述 領 域 部 分 已 建 立 之 技 術 尚 未 臻 成 熟 階 段 , 仍 有 待 進 一 步 之 研 究 結 果驗 證 及 經 驗 之 累 積 才 能 進 入 臨 床 應 用 , 其 間 之 動 物 模 式 研 究 更 存 在 許 多 有 關 倫 理 道 德 、 宗 教 、法 令 規 範 及 動 物 福 利 等 方 面 之 爭 議 問 題 需 逐 一 克 服 。取 自 病 人 之 體 細 胞 做 為 細 胞 核 之 來 源 , 藉 由 體 細 胞 核 移 植 (somatic cell nuclear transfer,SCNT) 技 術 生 產 病 人 基 因 組 一 致 性 之 複 製 囊 胚 , 再 建 立 源 自 該 囊 胚 內 細 胞 群 之 胚 幹 細 胞 ,即 所 謂 之 核 移 植 胚 幹 細 胞 (ntESCs), 將 ntESCs 進 一 步 於 體 外 誘 導 分 化 為 病 人 治 療 所 需 要之 細 胞 , 即 可 進 行 自 體 細 胞 移 植 (autograft), 此 法 具 遺 傳 一 致 性 及 免 疫 相 容 性 之 優 點 , 可將 細 胞 移 植 後 之 排 斥 問 題 降 至 最 低 , 即 人 類 治 療 用 複 製 之 策 略 應 用1 。 此 外 , 結 合 細 胞 之 基因 轉 殖 及 SCNT 技 術 , 可 產 製 基 因 轉 殖 複 製 囊 胚 , 於 體 外 適 當 培 養 條 件 下 可 建 立 轉 基 因 之 胚幹 細 胞 , 甚 至 將 此 複 製 胚 經 移 置 同 期 化 處 理 之 受 胚 動 物 後 , 可 獲 得 攜 帶 轉 殖 基 因 之 複 製 個 體(transgenic cloned individuals), 尤 其 產 製 全 身 性 或 組 織 專 一 性 表 現 報 導 基 因 (reportergene) 之 轉 基 因 動 物 , 進 一 步 分 離 其 成 體 幹 細 胞 , 將 其 誘 導 分 化 後 或 直 接 進 行 體 內 移 植 , 做為 再 生 醫 學 之 動 物 模 式 研 究 的 可 追 蹤 性 細 胞 來 源 , 應 用 此 基 因 轉 殖 及 複 製 技 術 平 臺 , 未 來 在許 多 人 類 疾 病 之 細 胞 治 療 (cell therapy)、 基 因 治 療 (gene therapy) 及 損 傷 組 織 之 修 補 上皆 具 極 大 之 應 用 潛 力 。75

二 、 幹 細 胞 之 分 類 及 應 用舉 凡 具 自 我 更 新 (self renewal) 能 力 並 於 體 內 和 / 或 體 外 適 當 環 境 調 節 下 , 可 分 化 為 不同 成 熟 細 胞 系 (cell lineage) 之 細 胞 即 稱 為 幹 細 胞 。 依 幹 細 胞 之 來 源 區 分 為 胚 源 性 幹 細 胞 及體 源 性 幹 細 胞 (somatic stem cells), 依 幹 細 胞 之 分 化 潛 能 , 可 分 為 1. 全 能 性 幹 細 胞(totipotent stem cells, TSCs): 每 一 個 全 能 性 幹 細 胞 有 能 力 可 發 育 成 一 個 完 整 的 生 物 個 體 ,包 括 胎 兒 及 胎 盤 二 部 分 , 如 精 子 和 卵 子 結 合 成 為 受 精 卵 後 , 一 個 受 精 卵 分 裂 成 為 二 個 完 全 相同 的 胚 葉 細 胞 (blastomere), 二 個 細 胞 再 分 裂 成 為 四 個 細 胞 , 在 此 時 期 每 個 細 胞 中 任 何 一 個細 胞 被 移 置 於 同 期 化 之 生 殖 道 中 均 具 有 發 育 成 為 單 獨 且 完 整 個 體 之 能 力 , 此 種 細 胞 即 稱 為 全能 性 幹 細 胞 。 2. 多 能 性 幹 細 胞 (pluripotent stem cells, PSCs): 細 胞 具 有 分 化 成 多 種 細 胞 或組 織 能 力 者 稱 之 , 該 種 幹 細 胞 可 發 育 成 胎 兒 , 但 無 法 發 育 成 胎 盤 組 織 部 份 。 如 由 早 期 囊 胚 之內 細 胞 群 所 分 離 及 建 立 之 胚 幹 細 胞 株 即 屬 多 能 性 幹 細 胞 。 此 細 胞 必 須 與 可 發 育 成 胎 盤 之 全 能性 宿 主 胚 或 滋 養 層 細 胞 結 合 , 由 胎 盤 組 織 供 應 胚 胎 發 育 所 需 之 營 養 , 才 能 發 育 成 完 整 個 體 。此 外 , 源 自 胚 胎 性 腺 之 始 基 生 殖 細 胞 (primordial germ cells, PGCs) 者 如 胚 生 殖 細 胞 及 胚 胎瘤 細 胞 (embryonal carcinoma cells, ECs) 亦 具 有 分 化 成 內 胚 層 、 中 胚 層 及 外 胚 層 等 三 種 胚層 細 胞 之 潛 能 。 3. 複 能 性 幹 細 胞 (multipotent stem cells, MSCs): 指 可 以 分 化 成 特 異 性 組織 之 不 同 細 胞 , 但 卻 失 去 了 發 育 成 完 整 個 體 之 能 力 , 包 括 造 血 幹 細 胞 、MSCs 及 神 經 幹 細 胞等 。 4. 單 能 性 幹 細 胞 (unipotent stem cells, USCs): 此 種 幹 細 胞 只 能 分 化 成 單 一 種 類 型 或與 其 相 關 之 多 種 類 型 之 細 胞 , 如 上 皮 組 織 基 底 層 之 幹 細 胞 、 肌 肉 中 之 成 肌 細 胞 、 成 熟 前 之 T-細 胞 及 B- 細 胞 等 。 其 中 由 早 期 胚 分 離 之 胚 幹 細 胞 最 具 研 發 潛 力 , 然 而 受 限 於 各 物 種 胚 幹 細 胞之 分 離 及 培 養 技 術 尚 未 完 全 建 立 , 以 嵌 合 體 動 物 之 產 製 為 標 準 , 目 前 只 有 小 鼠2 3、 大 鼠 及 豬4之 胚 幹 細 胞 首 次 被 證 實 成 功 建 立 ; 其 他 種 別 哺 乳 動 物 如 牛 、 羊 兔 、 倉 鼠 及 雪 貂 等 之 胚 幹 細胞 則 緊 及 類 胚 幹 細 胞 之 發 展 階 段 , 至 於 人 之 胚 幹 細 胞 株 最 早 由 Thomson et al. 所 發 表5 , 雖 於體 外 試 驗 已 證 明 其 為 分 化 多 能 性 細 胞 , 然 亦 僅 止 於 類 胚 幹 細 胞 階 段 。 因 此 , 由 攜 報 導 基 因 之體 細 胞 複 製 動 物 以 複 能 性 或 單 能 性 之 幹 細 胞 取 代 胚 幹 細 胞 , 做 為 體 外 誘 導 分 化 之 細 胞 來 源 ,就 細 胞 移 植 後 之 生 物 安 全 性 而 言 , 未 來 在 再 生 醫 學 之 應 用 似 乎 可 取 代 胚 幹 細 胞 所 扮 演 之 角 色 。三 、 複 製 動 物 的 方 法複 製 (clone) 之 定 義 一 般 指 遺 傳 物 質 完 全 相 同 之 個 體 或 產 生 遺 傳 物 質 完 全 相 同 個 體 之過 程 。 其 中 之 個 體 , 可 以 是 特 定 之 去 氧 核 糖 核 酸 (deoxyribonucleic acid, DNA) 片 段 、 單 一細 胞 、 或 為 完 整 之 多 細 胞 生 物6 。 截 至 目 前 為 止 , 曾 被 發 表 之 複 製 動 物 產 製 方 法 有 三 種 , 第一 種 方 法 為 早 期 胚 分 切 法 (embryo splitting), 將 2 至 16 細 胞 期 之 早 期 胚 細 胞 分 離 成 二 組 細胞 , 或 桑 椹 期 及 囊 胚 期 豬 胚 被 均 分 成 二 等 分 後 , 被 移 置 於 同 期 化 處 理 之 受 胚 動 物 生 殖 道 後 ,可 產 製 獨 立 雙 胞 胎 , 然 以 此 法 所 得 之 複 製 動 物 頭 數 僅 限 於 兩 頭 ; 第 二 種 方 法 為 胚 幹 細 胞 與 四倍 體 胚 之 配 合 使 用 , 胚 源 性 幹 細 胞 在 體 外 具 增 殖 及 分 化 成 完 整 個 體 不 同 種 類 細 胞 之 能 力 , 當與 早 期 胚 凝 聚 (aggregate) 或 注 入 四 倍 體 囊 胚 腔 後 , 均 可 與 之 形 成 嵌 合 胚 體 (chimericconceptus), 因 四 倍 體 胚 細 胞 僅 發 育 成 胎 盤 組 織 , 胎 兒 組 織 之 基 因 組 均 源 自 胚 幹 細 胞 已 被 證76

實 , 經 胚 移 置 後 所 出 生 之 個 體 可 直 接 進 行 配 種 及 分 析 其 性 腺 傳 承 率 (germ linetransmission), 此 法 可 篩 選 出 源 自 胚 幹 細 胞 基 因 組 傳 承 之 複 製 個 體 , 雖 然 多 種 哺 乳 動 物 如 小鼠 、 倉 鼠 、 美 洲 貂 、 兔 子 、 大 鼠 、 牛 、 豬 、 恆 河 猴 及 人 等 均 有 成 功 建 立 胚 幹 細 胞 及 類 胚 幹 細胞 之 報 導 , 惟 以 胚 幹 細 胞 成 功 以 此 法 成 功 複 製 動 物 並 具 性 腺 傳 承 能 力 者 , 只 有 小 鼠 首 次 成 功被 Wagayama et al. 所 發 表7 。 第 三 種 方 法 係 使 用 幹 細 胞 或 已 分 化 之 成 年 體 細 胞 直 接 作 為 供 核者 , 試 驗 流 程 未 經 嵌 合 體 動 物 之 產 製 , 此 法 自 桃 莉 羊 誕 生 證 實 了 已 分 化 之 體 細 胞 可 被 回 復 至分 化 前 之 狀 態 後 , 胎 源 性 成 纖 維 母 細 胞 及 成 年 體 細 胞 逐 漸 取 代 胚 幹 細 胞 在 指 定 位 置 基 因 轉 殖89,10及 基 因 剔 除 之 優 勢 , 以 體 細 胞 核 移 植 方 式 進 行 指 定 位 置 基 因 轉 殖 綿 羊 及 基 因 剔 除 豬 等 試驗 被 宣 告 成 功 。 于 豬 胚 幹 細 胞 被 證 實 成 功 建 立 之 前 , 複 製 動 物 之 產 製 策 略 主 要 決 定 於 供 核 細胞 之 選 擇 , 目 前 有 三 種 不 同 來 源 之 供 核 細 胞 可 被 應 用 於 核 移 植 試 驗 , 包 括 胚 源 性 細 胞 、 胎 兒纖 維 母 細 胞 及 成 年 體 細 胞 等 均 有 成 功 產 製 複 製 動 物 之 例 , 理 論 上 後 二 種 細 胞 均 較 易 取 得 及 培養 , 而 胚 源 性 細 胞 增 殖 能 力 強 , 較 適 宜 進 行 指 定 位 置 基 因 轉 殖 及 基 因 剔 除 之 研 究 , 惟 目 前 之細 胞 培 養 技 術 、 遺 傳 工 程 技 術 及 核 移 植 技 術 之 快 速 進 展 , 已 克 服 了 許 多 複 製 試 驗 瓶 頸 , 只 要具 有 適 當 之 可 繼 代 性 或 增 殖 能 力 佳 之 任 何 種 類 細 胞 , 均 具 有 複 製 成 完 整 個 體 之 潛 力 , 未 來 以此 複 製 囊 胚 進 行 胚 幹 細 胞 之 建 立 或 分 離 技 術 平 臺 , 將 可 作 為 人 類 疾 病 治 療 用 複 製 之 基 礎 。三 、 複 製 動 物 技 術 之 研 究 進 展1. 國 外 體 細 胞 複 製 動 物 之 研 究 進 展脊 椎 動 物 複 製 之 研 究 , 首 由 美 國 科 學 家 Briggs & King 11 成 功 地 自 青 蛙 的 胚 (2n) 細 胞 成功 複 製 青 蛙 , 開 啟 脊 椎 動 物 複 製 之 門 。 而 1962 至 1975 年 Gurdon 嘗 試 將 已 分 化 之 腸 道 上 皮 細胞 核 及 成 蛙 之 角 化 皮 膚 細 胞 進 行 核 移 植 , 並 探 討 其 發 育 潛 能 , 結 果 發 現 在 經 紫 外 線 照 射 後 之卵 細 胞 質 內 的 未 知 影 響 因 子 調 節 下 , 得 到 發 育 正 長 之 成 蛙 , 此 結 果 更 震 憾 全 球 生 命 科 學 界12,13 。 從 此 觸 發 無 數 研 究 人 員 探 討 複 製 哺 乳 動 物 之 興 趣 , 試 驗 之 初 係 以 哺 乳 動 物 為 對 象 , 重複 Gurdon 之 試 驗 , 但 均 未 能 獲 得 具 體 之 成 果 , 直 至 1986 年 Willadsen 首 次 將 綿 羊 八 細 胞 階 段之 胚 葉 細 胞 核 轉 殖 入 另 一 去 核 卵 細 胞 , 成 功 複 製 綿 羊 , 創 造 了 以 哺 乳 動 物 早 期 胚 細 胞 複 製 成功 之 首 例 14 。 在 複 製 豬 研 究 方 面 , 于 1989 年 Prather 等 以 4- 細 胞 期 豬 胚 經 核 移 植 過 程 獲 得 一 頭仔 豬 , 此 乃 最 早 複 製 豬 隻 成 功 之 例 15 ; 至 1990 年 以 早 期 胚 細 胞 當 供 核 細 胞 成 功 產 製 核 移 植 之16動 物 包 括 兔 子 及 牛17 。 直 至 Wilmut et al. 18 進 一 步 將 成 年 綿 羊 之 乳 腺 上 皮 細 胞 株 , 以 逐 漸 降低 培 養 液 中 血 清 含 量 之 方 式 , 將 其 細 胞 周 期 回 歸 至 G0 期 後 作 為 供 核 細 胞 , 成 功 獲 得 核 移 植 綿羊 (Dolly), 此 結 果 提 示 , 分 化 後 之 細 胞 核 可 透 過 人 為 之 處 理 方 式 , 促 使 回 復 (reprogram)至 分 化 前 之 狀 態 , 同 時 突 破 了 家 畜 核 移 置 及 基 因 剔 除 技 術 之 研 究 瓶 頸 。 隨 後 ,Schnieke et al.19即 以 攜 人 類 第 九 凝 血 因 子 基 因 之 綿 羊 成 纖 維 母 細 胞 作 為 供 核 者 , 結 果 獲 得 人 類 第 九 凝 血 因子 基 因 轉 殖 綿 羊 -Polly, 可 謂 集 核 移 置 及 基 因 轉 殖 技 術 研 究 之 大 成 。 再 者 Wakayama et al. 20使 用 已 分 化 之 成 年 母 小 鼠 之 自 然 排 出 卵 丘 細 胞 (cumulus cells)、 賽 托 力 氏 細 胞 (Sertoli cells)及 腦 神 經 細 胞 (brain neuronal cells), 以 預 先 製 備 之 不 同 直 徑 大 小 玻 璃 針 , 將 細 胞 質 去 除 後所 得 之 細 胞 核 作 為 供 核 者 , 經 注 射 於 去 核 卵 母 細 胞 質 後 證 實 均 具 有 發 育 成 胎 兒 之 潛 能 , 尤 其以 卵 丘 細 胞 核 當 供 核 者 之 試 驗 結 果 更 進 一 步 證 明 可 發 育 成 完 整 個 體 , 再 次 證 實 體 細 胞 再 程 序77

化 後 之 發 育 潛 能 。 以 綿 羊 體 細 胞 核 移 植 配 合 指 定 位 置 基 因 轉 殖 技 術 亦 於 2000 年 被 McCreath etal. 研 發 成 功 8 ; 以 體 細 胞 當 供 核 者 進 行 複 製 豬 研 究 之 三 個 團 隊 , 幾 乎 同 時 發 表 複 製 成 功 之 結21,2223果 , 其 中 不 乏 以 體 內 成 熟 與 體 外 成 熟 之 卵 母 細 胞 當 受 核 者 , 且 皆 成 功 地 獲 得 複 製 豬 。 更新 進 者 , 係 以 豬 之 α-1,3- 半 乳 醣 基 因 轉 移 酵 素 基 因 剔 除 之 豬 胎 兒 成 纖 維 母 細 胞 當 供 核 者 進 行核 移 植 試 驗 , 成 功 獲 得 基 因 剔 除 複 製 豬 之 結 果 , 于 2002 年 相 繼 由 密 蘇 里 大 學 Lai et al. 9 及 PPL公 司 Dai et al. 10 所 發 表 , 甚 至 基 因 座 上 的 成 對 α-1,3- 半 乳 醣 基 因 轉 移 酵 素 基 因 剔 除 豬 亦 被Phelps et al.(2003) 成 功 獲 得 24 , 此 特 性 在 家 畜 基 因 轉 殖 之 研 究 及 應 用 領 域 上 , 極 具 發 展 潛力 及 經 濟 價 值 。 前 述 研 究 成 果 依 專 家 評 估 其 在 人 體 器 官 移 植 應 用 之 臨 床 試 驗 , 所 需 時 間 評 估指 稱 , 未 來 四 至 六 年 內 可 能 完 成 豬 器 官 移 植 於 人 體 之 試 驗 目 標 , 這 項 成 果 可 在 解 決 全 世 界 器官 短 缺 危 機 問 題 上 , 可 提 供 近 期 解 決 之 道 , 惟 迄 今 仍 有 許 多 瓶 頸 尚 待 克 服 , 主 要 係 可 能 造 成異 種 器 官 移 植 後 之 排 斥 問 題 ( 超 急 性 排 斥 , 急 性 排 斥 及 慢 性 排 斥 等 ) 所 涉 及 之 基 因 未 能 完 全釐 清 所 致 。 以 成 年 體 細 胞 成 功 複 製 優 良 遺 傳 性 能 之 種 公 豬 于 2002 年 3 月 首 由 Infigen 和Genmark 公 司 共 同 發 表 。 之 後 , 複 製 貓 25 、 兔 26 、 騾 子 27 、 馬 28 、 大 鼠 29 30 31、 狗 及 狼 等 , 均 陸續 被 成 功 複 製 。 上 述 結 果 提 示 , 體 細 胞 複 製 動 物 技 術 已 逐 漸 成 熟 , 幾 乎 達 可 例 行 化 產 製 之 境界 , 惟 複 製 胚 之 產 製 效 率 及 胚 移 置 後 發 育 成 完 整 個 體 之 百 分 率 仍 低 , 約 0.1~6%, 其 原 因 有 待進 一 步 試 驗 之 結 果 謀 求 解 決 。2. 國 內 複 製 動 物 之 研 究 進 展早 期 臺 灣 複 製 哺 乳 動 物 之 研 究 始 於 小 鼠 及 牛 胚 分 割 所 產 製 之 同 卵 雙 胞 胎 (identicaltwins) 或 三 胞 胎 (triplet); 而 應 用 核 移 植 技 術 產 製 複 製 動 物 之 研 究 分 為 二 個 階 段 , 第 一 階 段4 32係 以 早 期 全 能 性 之 胚 葉 細 胞 當 供 核 細 胞 所 獲 得 之 核 移 植 豬 及 兔 二 個 成 功 之 例 。 畜 產 試 驗所 1992 年 發 表 小 耳 種 迷 你 豬 4 細 胞 期 胚 葉 細 胞 核 移 植 於 雜 種 豬 之 去 核 卵 質 中 , 結 果 成 功 獲得 8 頭 核 移 植 仔 豬 , 其 中 存 活 6 頭 ,2 頭 死 產 , 最 後 育 成 5 頭 , 此 核 移 植 小 耳 種 迷 你 豬 之 出生 體 重 為 小 耳 種 豬 之 145.45 %。 離 乳 體 重 為 純 小 耳 豬 之 199.36 %, 顯 示 此 等 操 作 策 略 對 豬隻 之 出 生 及 離 乳 體 重 有 改 進 之 效 果 , 惟 六 頭 核 移 植 豬 之 核 內 遺 傳 組 成 僅 部 分 豬 隻 係 完 全 相同 ; 另 於 胚 葉 細 胞 核 移 植 兔 之 試 驗 中 證 實 , 以 八 細 胞 期 胚 之 胚 葉 細 胞 進 行 核 移 植 可 獲 得 核 移植 仔 兔 。 臺 灣 動 物 科 技 研 究 所 、 臺 灣 大 學 及 美 國 康 乃 迪 克 大 學 所 組 成 之 研 究 團 隊 於 2001 年 1月 開 始 採 用 新 的 核 移 植 流 程 進 行 複 製 豬 之 研 究 , 首 次 以 成 年 母 豬 耳 皮 膚 成 纖 維 母 細 胞 作 為 供核 者 進 行 完 整 細 胞 之 核 移 植 , 執 行 11 次 之 複 製 豬 試 驗 , 合 計 產 製 795 個 外 觀 形 態 完 整 之 複製 胚 , 經 胚 移 置 於 11 頭 同 期 發 情 處 理 之 受 胚 豬 , 其 懷 孕 率 可 達 55 %(6/11), 其 中 三 頭 受 胚豬 發 生 早 期 流 產 , 合 計 流 產 出 6 個 已 成 形 之 複 製 豬 胎 兒 , 另 3 頭 受 胚 豬 則 順 利 懷 孕 至 預 產 期 ,其 中 第 一 頭 受 胚 豬 並 於 2002 年 2 月 15 日 以 剖 腹 產 方 式 成 功 獲 得 全 球 第 一 頭 攜 雙 轉 殖 基 因 之複 製 豬 , 其 本 尊 為 一 頭 高 繁 殖 性 能 之 基 因 轉 殖 母 豬 , 總 計 7 胎 之 平 均 產 子 頭 數 12.14 頭 , 每胎 平 均 活 仔 頭 數 10.30 頭 , 活 仔 育 成 率 100%, 更 難 得 者 係 同 時 於 其 泌 乳 期 之 乳 腺 同 時 表 現豬 乳 鐵 蛋 白 及 人 類 第 九 凝 血 因 子 二 種 重 組 蛋 白 質 , 外 源 性 豬 乳 鐵 蛋 白 及 人 類 第 九 凝 血 因 子 之表 現 量 均 可 達 200-500 μg/ml, 人 類 第 九 凝 血 因 子 之 表 現 量 為 正 常 人 血 漿 中 含 量 (5μg/ml) 之40-100 倍 , 這 不 僅 是 臺 灣 第 一 例 以 成 年 母 豬 體 細 胞 核 移 置 方 式 所 產 製 的 複 製 豬 , 並 為 全 球 首例 以 成 年 母 豬 耳 皮 膚 細 胞 作 為 供 核 者 複 製 之 母 豬 , 同 時 也 是 全 球 第 一 例 雙 基 因 轉 殖 複 製 豬78

33 。 截 至 目 前 為 止 , 除 雙 基 因 轉 殖 複 製 豬 之 外 , 相 同 研 究 團 隊 另 複 製 九 頭 優 良 種 公 豬 及 五 頭斑 點 迷 你 豬 , 且 證 實 有 後 代 之 傳 承 , 同 時 亦 將 國 內 體 細 胞 複 製 動 物 之 效 率 由 雙 基 因 轉 殖 複 製豬 之 0.4% 提 升 十 倍 至 優 良 種 公 豬 之 4%; 另 於 2001 年 由 臺 灣 大 學 與 畜 產 試 驗 所 共 創 體 細 胞複 製 牛 - 畜 寶 成 功 之 首 例 , 雖 只 存 活 一 週 , 確 奠 定 了 體 細 胞 複 製 家 畜 之 基 礎 , 隔 年 二 月 又 以轉 染 人 類 凝 血 第 八 因 子 之 單 株 化 體 細 胞 成 功 產 製 基 因 轉 殖 複 製 牛 - 如 意 , 同 年 七 月 相 同 研 發團 隊 再 創 下 國 內 第 一 例 體 細 胞 複 製 羊 - 寶 吉 、 寶 祥34 。 此 結 果 提 示 臺 灣 之 生 物 科 技 發 展 , 部分 領 域 已 趕 上 國 際 先 進 國 家 , 此 家 畜 核 移 植 技 術 未 來 可 應 用 於 農 業 及 生 物 醫 學 領 域 , 如 複 製遺 傳 背 景 一 致 性 的 動 物 、 表 現 性 能 優 越 之 基 因 轉 殖 動 物 , 生 產 單 一 性 別 家 畜 及 高 生 產 性 能 之優 良 種 畜 , 甚 至 瀕 臨 絕 種 野 生 哺 乳 動 物 之 復 育 , 以 及 將 來 豬 隻 之 基 因 定 位 轉 殖 或 基 因 剔 除 之研 究 功 異 種 器 官 移 植 及 以 非 繁 殖 性 複 製 技 術 生 產 人 之 囊 胚 , 並 建 立 人 類 胚 幹 細 胞 , 經 誘 導 分化 後 產 生 病 人 自 體 細 胞 或 組 織 , 作 為 細 胞 或 組 織 移 植 之 用 。四 、 核 移 植 技 術 在 幹 細 胞 領 域 之 應 用1. 攜 報 導 基 因 幹 細 胞 之 建 立核 移 植 技 術 除 應 用 於 農 業 外 , 未 來 可 展 望 於 生 物 醫 學 領 域 之 應 用 , 包 括 以 家 畜 作 為 生 產醫 藥 蛋 白 之 工 廠 、 動 物 模 式 之 研 究 、 基 因 轉 殖 複 製 、 自 體 細 胞 移 植 及 將 來 豬 隻 之 基 因 定 位 轉殖 (gene targeting) 或 基 因 剔 除 (gene knock out) 之 研 究 , 以 解 決 豬 器 官 應 用 於 人 類 異 種器 官 移 植 之 排 斥 問 題 。 由 於 體 細 胞 核 之 再 程 序 化 機 制 目 前 尚 待 釐 清 , 核 移 植 技 術 被 應 用 於 生物 醫 學 及 農 業 之 前 , 效 率 如 何 提 升 及 改 善 複 製 動 物 之 健 康 狀 況 , 實 為 為 當 前 面 對 之 最 嚴 格 挑戰 。 哺 乳 動 物 之 基 因 轉 殖 已 執 行 二 十 年 以 上 , 外 源 基 因 嵌 入 仍 為 逢 機 方 式 , 體 細 胞 核 移 植 技術 配 合 同 源 基 因 組 合 (homologous recombination) 之 基 因 轉 染 策 略 , 可 使 用 經 篩 選 確 認 為指 定 位 置 基 因 轉 殖 及 剔 除 之 體 細 胞 進 行 核 移 植 , 此 法 產 製 之 動 物 近 乎 100% 為 基 因 轉 殖 動物 , 此 技 術 已 被 應 用 於 豬 之 基 因 轉 殖 及 複 製 , 未 來 擬 人 化 之 基 因 轉 殖 複 製 豬 器 官 供 人 類 器 官移 植 之 器 官 來 源 是 可 預 期 者 。 而 在 幹 細 胞 領 域 之 應 用 主 要 以 攜 報 導 基 因 之 轉 基 因 動 物 之 自 體胚 幹 細 胞 建 立 及 誘 導 分 化 為 特 定 之 細 胞 系 , 做 為 自 體 細 胞 移 植 及 配 合 基 因 轉 殖 技 術 應 用 於 基因 治 療 , 做 為 動 物 模 式 研 究 之 用 ; 另 可 配 合 基 因 轉 殖 複 製 技 術 產 製 攜 帶 及 表 現 報 導 基 因 之 基因 轉 殖 個 體 , 再 由 此 基 因 轉 殖 個 體 之 組 織 分 離 成 體 幹 細 胞 , 取 得 之 成 體 幹 細 胞 可 做 為 體 外 誘導 分 化 及 體 內 移 植 之 可 追 蹤 性 幹 細 胞 來 源 , 此 策 略 最 大 之 優 點 即 單 株 化 成 體 幹 細 胞 及 轉 殖 之報 導 基 因 之 穩 定 表 現 。2. 核 移 植 胚 幹 細 胞 (nuclear-transfer embryonic stem cells, ntESCs) 之 建 立胚 幹 細 胞 株 在 桃 莉 羊 出 生 之 前 係 唯 一 被 認 為 可 應 用 於 指 定 位 置 基 因 轉 殖 者 , 以 小 鼠 胚 幹細 胞 進 行 基 因 組 之 遺 傳 修 飾 後 , 經 與 宿 主 胚 融 合 及 胚 移 置 後 所 生 下 之 嵌 合 體 小 鼠 已 被 證 實 可性 腺 傳 承 至 後 代 , 然 而 除 小 鼠 外 並 無 其 他 哺 乳 動 物 之 胚 幹 細 胞 被 證 實 具 相 同 之 全 能 性 分 化 能力 , 所 幸 者 乃 體 細 胞 之 核 移 植 技 術 至 桃 莉 羊 誕 生 後 被 證 實 可 行 , 單 獨 體 細 胞 雖 不 具 胚 幹 細 胞之 全 能 性 分 化 能 力 , 然 而 藉 由 去 核 (enucleated ) 之 成 熟 卵 母 細 胞 質 之 再 程 序 化79

(reprogramming) 因 子 之 作 用 即 可 回 復 分 化 之 全 能 性 。 顯 示 , 體 細 胞 核 移 植 技 術 成 功 後 ,體 細 胞 將 取 代 胚 幹 細 胞 在 指 定 位 置 基 因 轉 殖 所 扮 演 之 角 色 。 此 外 , 以 體 細 胞 經 核 移 植 後 之 早期 胚 建 立 胚 幹 細 胞 之 技 術 平 臺 , 未 來 在 細 胞 治 療 及 自 體 細 胞 移 植 領 域 將 扮 演 重 要 角 色 。 在 生命 起 源 及 分 化 之 研 究 進 展 中 發 現 , 胚 幹 細 胞 建 立 及 培 養 技 術 當 與 複 製 動 物 技 術 結 合 後 , 可 提供 新 的 治 療 疾 病 之 方 法 , 如 藉 由 成 年 人 體 細 胞 之 核 移 植 胚 產 生 自 體 幹 細 胞 , 或 經 體 外 誘 導 分化 後 生 成 各 式 個 樣 組 織 方 式 , 以 提 供 自 體 細 胞 或 組 織 移 植 所 需 之 材 料 。 惟 同 時 也 引 起 科 學 團體 、 立 法 機 構 及 許 多 社 會 團 體 如 宗 教 及 動 物 保 護 團 體 等 之 爭 議 , 未 來 將 如 何 合 法 地 應 用 核 移殖 技 術 及 有 效 率 地 促 進 人 類 醫 學 領 域 發 展 , 仍 有 待 產 、 官 、 學 、 研 之 共 同 努 力 以 謀 求 解 決 。3. 自 體 細 胞 或 組 織 移 植自 第 一 頭 成 年 母 綿 羊 體 細 胞 複 製 羊 ― 桃 莉 於 1997 年 被 報 導 後 , 迄 今 取 自 胎 兒 時 期 及 成 年動 物 之 體 細 胞 複 製 哺 乳 動 物 合 計 13 種 動 物 種 別 陸 續 被 產 製 , 甚 至 藉 由 體 細 胞 複 製 小 鼠 囊 胚之 體 外 培 養 , 亦 證 實 可 成 功 建 立 具 多 分 化 潛 能 之 小 鼠 胚 幹 細 胞 株 , 此 技 術 之 成 功 發 展 已 奠 定了 人 類 治 療 用 複 製 (human therapeutic cloning) 之 臨 床 應 用 基 礎 , 除 可 應 用 病 人 本 身 之 體細 胞 進 行 非 生 殖 性 複 製 (nonreproductive cloning) 囊 胚 之 產 製 外 , 尚 能 以 該 囊 胚 建 立 源 自病 人 體 細 胞 基 因 組 之 胚 幹 細 胞 株 , 將 其 誘 導 分 化 為 病 人 所 需 治 療 或 修 補 之 細 胞 後 , 即 可 進 行自 體 細 胞 移 植 , 此 技 術 流 程 就 免 疫 學 觀 點 而 言 , 將 可 提 高 移 植 用 細 胞 與 宿 主 之 遺 傳 相 容 性(genetic compatibility)。 此 外 , 藉 由 複 製 動 物 技 術 亦 可 先 於 體 外 進 行 細 胞 層 次 之 基 因 組 改造 (genome modification), 甚 至 進 行 細 胞 之 指 定 位 置 基 因 轉 殖 , 包 括 外 源 報 導 基 因 、 正 常基 因 組 序 列 及 組 織 專 一 性 表 現 基 因 的 構 築 策 略 , 同 時 可 促 進 幹 細 胞 研 究 之 動 物 模 式 進 展 及 早日 達 成 先 天 性 遺 傳 缺 陷 病 人 之 基 因 治 療 目 標 ; 胚 幹 細 胞 及 諸 多 不 同 組 織 來 源 之 成 體 幹 細 胞 均已 被 成 功 分 離 、 純 化 與 定 性 , 除 ESCs 於 體 內 及 體 外 試 驗 證 明 確 實 具 備 多 分 化 潛 能 之 特 性 外 ,原 認 定 於 體 內 自 然 環 境 下 屬 於 複 分 化 或 單 分 化 潛 能 之 ASCs, 亦 陸 續 於 體 外 特 定 誘 導 分 化 培養 條 件 下 , 被 證 明 可 能 具 分 化 為 多 種 細 胞 系 之 潛 能 , 甚 至 藉 由 體 內 之 試 驗 證 明 ASCs 可 參 與早 期 哺 乳 動 物 胚 及 胎 兒 組 織 之 分 化35 , 未 來 將 複 製 動 物 技 術 結 合 不 同 來 源 之 體 細 胞 、 幹 細 胞與 生 醫 材 料 及 組 織 工 程 產 品 等 之 應 用 , 預 期 對 於 修 復 及 更 新 人 類 受 損 組 織 之 構 造 及 功 能 , 將極 具 產 業 化 及 臨 床 之 應 用 價 值 。胚 幹 細 胞 培 育 成 功 促 使 許 多 藥 廠 對 其 具 有 極 高 之 憧 憬 , 主 要 係 為 利 用 胚 幹 細 胞 分 化 成 特定 組 織 或 器 官 之 細 胞 特 性 , 另 可 開 發 誘 導 或 阻 礙 分 化 之 醫 療 藥 物 ; 同 時 在 研 究 或 測 試 之 正 常細 胞 來 源 上 亦 不 再 依 賴 由 活 體 組 織 取 得 有 限 且 少 量 之 限 制 , 同 時 在 藥 物 開 發 過 程 中 , 藥 物 安全 性 的 分 析 , 亦 可 由 特 定 幹 細 胞 或 由 幹 細 胞 分 化 之 專 一 細 胞 作 為 試 驗 之 目 的 , 而 非 傳 統 上 必須 進 行 耗 時 費 力 又 昂 貴 的 動 物 實 驗 。 例 如 利 用 幹 細 胞 測 試 藥 物 對 於 細 胞 生 長 和 細 胞 發 育 之 影響 , 即 可 推 估 知 此 藥 物 是 否 對 於 懷 孕 中 之 胎 兒 有 安 全 性 之 考 量 等 。 因 此 , 胚 幹 細 胞 及 細 胞 核移 轉 技 術 可 應 用 於 研 究 人 類 基 因 表 現 , 個 體 發 育 、 疾 病 及 癌 症 發 生 原 因 等 , 以 及 開 發 新 藥 、分 析 及 篩 選 有 效 成 份 及 安 全 評 估 , 生 產 特 定 細 胞 組 織 , 作 為 移 植 、 更 新 及 治 療 人 類 疾 病 如 帕金 森 症 (Parkinson’s disease)、 中 風 (stroke)、 心 臟 血 管 疾 病 (cardiovascular disease)、脊 椎 神 經 受 傷 (spinal cord injury)、 肝 硬 化 及 糖 尿 病 等 。80

4. 治 療 用 複 製 所 面 臨 之 問 題複 製 動 物 之 技 術 迄 今 雖 已 發 展 至 例 行 化 階 段 , 然 而 以 核 移 植 技 術 所 產 製 之 複 製 動 物 常發 生 健 康 狀 況 異 常 之 問 題 , 因 此 以 體 細 胞 核 移 植 技 術 所 產 生 之 囊 胚 , 未 來 是 否 發 展 為 健 康 之個 體 , 亦 為 人 類 治 療 用 複 製 過 程 所 建 立 之 病 人 專 一 性 胚 幹 細 胞 正 常 與 否 之 關 鍵 , 此 胚 幹 細 胞經 誘 導 分 化 後 之 標 的 細 胞 經 移 植 於 病 人 體 內 進 行 組 織 修 補 或 基 因 治 療 之 過 程 是 否 具 造 成 畸胎 瘤 (teratoma) 之 風 險 , 均 為 臨 床 應 用 前 所 應 關 心 之 重 要 課 題 。有 可 將 已 分 化 之 體 細 胞 再 程 序 化 迄 全 能 性 細 胞 狀 態 之 方 法 , 係 藉 由 成 熟 未 受 精 卵 母 細胞 質 完 成 之 , 再 進 一 步 分 離 其 多 分 化 潛 能 之 胚 幹 細 胞 。 然 而 卵 母 細 胞 質 之 取 得 困 難 並 牽 涉 到倫 理 道 德 及 法 令 規 範 問 題 , 且 捐 卵 者 亦 可 能 承 擔 取 卵 及 麻 醉 之 風 險 。 另 以 種 間 核 移 植 之 策略 , 即 藉 由 非 人 類 之 成 熟 卵 母 細 胞 進 行 再 程 序 化 為 全 能 性 細 胞 之 過 程 , 然 此 策 略 亦 需 考 慮 細胞 質 粒 線 體 DNA 之 優 勢 與 否 及 其 相 關 基 因 之 後 續 影 響 層 面 問 題 , 且 在 法 令 及 宗 教 團 體 之 爭議 亦 需 克 服 。 因 此 , 最 好 之 策 略 係 將 已 分 化 之 體 細 胞 核 直 接 再 程 序 化 至 多 分 化 潛 能 之 細 胞 ,新 近 雖 有 報 告 發 表 已 透 過 指 標 基 因 轉 殖 方 式 成 功 地 將 小 鼠 體 細 胞 於 體 外 培 養 迄 多 分 化 潛 能之 類 胚 幹 細 胞36 , 然 欲 將 此 細 胞 應 用 於 人 類 之 臨 床 上 , 尚 需 考 量 人 類 細 胞 基 因 改 造 之 影 響 效應 及 可 行 性 , 此 策 略 產 生 胚 幹 細 胞 之 品 質 、 分 化 潛 能 及 生 物 安 全 性 均 需 慎 重 考 量 。由 複 製 胚 體 (conceptus) 之 許 多 生 理 學 的 觀 察 證 據 顯 示 其 胎 盤 功 能 問 題 , 另 有 關 複 製胚 發 育 銘 印 基 因 表 現 之 研 究 結 果 顯 示 , 胎 兒 之 銘 印 基 因 表 現 傾 向 於 正 常 過 程 , 惟 胎 盤 之 銘 印基 因 表 現 常 出 現 脫 軌 現 象 。 複 製 胚 發 育 最 早 的 異 常 現 象 係 發 現 於 早 期 囊 胚 期 之 滋 養 外 胚 層 細胞 之 過 度 基 因 甲 基 化 作 用 (hypermethylation), 雖 然 於 胎 盤 之 X 染 色 體 上 許 多 基 因 之 表 現被 發 現 有 異 常 現 象 發 生 , 然 而 於 內 細 胞 群 之 X 染 色 體 不 活 化 作 用 似 乎 是 正 常 者 。 複 製 胚 之內 細 胞 群 及 胎 兒 發 育 傾 向 於 正 常 之 再 程 序 化 過 程 , 而 其 滋 養 層 細 胞 及 胎 盤 發 育 則 常 發 現 異 常之 再 程 序 化 現 象 。 因 此 由 內 細 胞 群 所 所 建 立 之 胚 幹 細 胞 將 可 能 較 傾 向 於 正 常 者37 。五 、 結 語 及 未 來 展 望過 程 生 物 技 術 係 二 十 一 世 紀 全 球 重 點 發 展 科 技 , 而 複 製 科 技 更 結 合 組 織 及 細 胞 培 養 技術 、 核 移 植 技 術 、 遺 傳 工 程 、 基 因 轉 殖 及 胚 移 置 技 術 等 發 展 生 物 技 術 之 關 鍵 性 平 臺 技 術 , 亦為 現 今 哺 乳 動 物 基 因 工 程 必 備 之 技 術 。 在 人 類 醫 學 之 研 究 上 , 與 複 製 科 技 有 關 之 體 細 胞 核 移植 技 術 配 合 基 因 轉 殖 技 術 與 胚 幹 細 胞 培 養 技 術 , 將 在 異 種 器 官 移 植 及 基 因 治 療 上 扮 演 舉 足 輕重 之 角 色 , 同 時 在 研 究 人 類 基 因 表 現 , 個 體 發 育 、 疾 病 及 癌 症 發 生 原 因 等 均 可 提 供 完 整 之 研究 模 式 , 因 此 被 認 為 係 未 來 深 具 潛 力 之 生 物 科 技 。 過 去 部 份 之 研 究 結 果 呈 現 複 製 動 物 高 死 亡 、高 異 常 發 生 的 風 險 , 常 導 致 複 製 動 物 技 術 對 人 類 所 可 能 帶 來 之 貢 獻 被 重 新 評 估 。 雖 然 如 此 ,大 部 份 複 製 動 物 發 育 不 正 常 之 概 念 , 在 科 學 領 域 中 是 無 法 被 信 服 的 , 就 上 述 核 移 植 技 術 在 未來 生 物 醫 學 可 能 發 展 之 潛 力 及 目 前 國 內 外 之 研 究 進 展 , 此 領 域 仍 具 持 續 發 展 價 值 , 期 待 能 產生 健 康 及 功 能 性 替 代 細 胞 、 組 織 或 擬 人 化 豬 器 官 作 為 治 療 或 移 植 之 用 。81

六 、 參 考 文 獻1. Lanza, R. P., Cibelli, J.B. & West, M. D. Human therapeutic cloning. Nature Medicine 5:975-977(1999).2. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos culture in mediumcondition by teratocacinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 78:7634-7638 (1981).3. Iannaccone, P. M., Taborn, G. U., Garton, R. L., Caplice, M. D. & Brenin, D. R. Pluripotentembryonic stem cells from the rat are capable of producing chimeras. Dev. Biol. 163:288-292(1994).4. Chen, L. R., Wu, M. C. & Shiue, Y. L. The cytoplasmic effect of enucleated Landrace oocyte onthe expression of small ear nucleus in nuclear transplanted pigs. Proc 12th ICAR 1992; ShortCommunication No. 375 (1992).5. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Wakitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S. &Jones, J.M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282:1145-1147(1998).6. Smith, L. C. & Wilmut, I. Influence of nuclear and cytoplasmic activity on the development in vivoof sheep embryos after nuclear transplantation. Biol. Reprod. 40:1027-1035 (1989).7. Wakayama, T., Tabar, V., Rodriguez, I., Perry, A. C., Studer, L. & Mombaert, P. Differentiation ofembryonic stem cell lines generated from adult somatic cells by nuclear transfer. Science 292:740-743 (2001).8. McCreath, K. J., Howcroft, J., Campbell, K. H. S., Colman, A., Schnieke, A. E. & Kind, A. J.Production of gene-targeted sheep by nuclear transfer from cultured somatic cells. Nature405:1066-1069 (2000).9. Lai, L., Kolber-Simonds, D., Park, K. W., Cheong, H. T., Greenstein, J. L., Im, G. S., Samuel, M.,Bonk, A., Rieke, A., Day, B. N., Murphy, C. N., Carter, D. B., Hawley, R. J. & Prather, R. S.Production of α-1,3-Galactosyltransferase Knockout Pigs by Nuclear Transfer Cloning. Science295:1089-1092 (2002).10. Dai, Y., Vaught, T. D., Boone, J., Chen, S. H., Phelps, C., Ball, J. S, Monahan, J. A., Jobst, P.M., McCreath, K. J., Lamborn, A. E., Cowell-Lucero, J. L., Wells, K. D., Colman, A., Polejaeva,I.A. & Ayares, D.L. Targeted disruption of the 1,3-galactosyltransferase gene in cloned pigs.Nature Biotechnol. 20:251 – 255 (2002).11. Briggs, R. & King, T. J. Transplanation of living cell nuclei from blastula cells into nucleated frogeggs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 38:455-463 (1952).12. Gurdon, J. B. The developmental capacity of nuclei taken from intestinal epithelium cells offeeding tadpoles. J. Embryol. Exp. Morphol. 10:622-640 (1962).82

13. Gurdon, J. B., Laskey, R. A. & Reeves, O. R. The developmental capacity of nuclei transplantedfrom keratinized skin cell of adult frogs. J. Embryol. Exp. Morph. 34: 93-112 (1975).14. Willadsen, S. M. Nuclear transplantation in sheep embryos. Nature 320:63-65 (1986).15. Prather, R. S., Sims, M. M. & First, N. L. Nuclear transplantation in early pig embryos. Biol.Reprod. 41:414-418 (1989).16. Collas, P. & Robl, J. M. Factors affecting the efficiency of nuclear transplantation in the rabbitembryo. Biol. Reprod. 43:877-884 (1990).17. Bondioli, K. R., Westhusin, M. E. & Looney, C. R. Production of identical bovine offspring bynuclear transfer. Theriogenology 33:165-174 (1990).18. Wilmut, I., Schnieke, A. E., McWhir, J., Kind, A. J. & Campbell, K. H. S. Viable offspring derivedfrom fetal and adult mammalian cells. Nature 385:810-813 (1997).19. Schnieke, A. E., Kind, A. J., Ritchie, W. A., Mycock, K., Scott, A. R., Ritchie, M., Wilmut, I.,Colman, A. & Campbell, K. H. S. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer ofnuclei from transfected fetal fibroblasts. Science 278:2130-2133 (1997).20. Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R. & Yanagimachi, R. Full-termdevelopment of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature 394:369-374 (1998).21. Polejaeva, I. A., Chen, S. H., Vaught, T. D., Page, R. L., Mullins, J., Ball, S., Dai, Y., Boone, J.,Walker, S., Ayares, D. L., Colman, A. & Campbell, K. H. S. Cloned pigs produced by nucleartransfer from adult somatic cells. Nature 407: 86-90 (2000).22. Onishi, A., Iwamoto, M., Akita, T., Mikawa, S., Takeda, K., Awata, T., Hanada, H. & Perry, A. C.F. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science 289:1188-1190 (2000).23. Betthauser, J., Forsberg, E., Augenstein, M., Childs, L., Eilertsen, K.& Enos, J. Production ofcloned pigs from in vitro systems. Nature Biotechnol. 18:1055-1059 (2000).24. Phelps, C. J., Koike, C., Vaught, T. D., Boone, J., Well, K. D., Chen, S. H., Ball, S., Specht, S.M., Polejaeva, I. A., Monahan, J. A., Jobst, P. M., Sharma, S. B., Lamborn, A. E., Garst, A. S.,Moore, M., Demetis, A. J., Rudert, W. A., Bottino, R., Bertera, Trucco, S., M., Starzl, T. E., Dai,Y. & Ayares, D. L. Production of_1,3-Galactosyltransferase–Deficient Pigs. Science 299:411-414 (2003).25. Shin, T., Kraemer, D., Pryor, J., Liu, L., Rugila, J., Howe, L., Buck, S., Murphy, K., Lyons, L. &Westhusin, M. A cat cloned by nuclear transplantation. Nature 415:859 (2002).26. Chesne, P, Adenot, P. G. Viglietta, C., Baratte, M., Boulanger, L. & Renard, J. P. Cloned rabbitsproduced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nat. Biotechnol. 20(4):366-369 (2002).27. Woods, G. L., White, K. L., Vanderwall, D. K., Li, G. P., Aston, K. I., Bunch, T. D., Meerdo, L. N.& Pate, B. J. A mule cloned from fetal cells by nuclear transfer. Science 301:1063-1064 (2003).83

28. Galli, C., Lagutina, I., Crotti, G., Colleoni, S., Turini, P., Ponderato, N., Duchi, R. & Lazzari, G. Acloned horse born to its dam twin. Nature 424:635-636 (2003).29. Zhou, Q., Renard, J. P., Le Friec, G., Brochard, V., Beaujean, N., Cherifi, Y., Fraichard, A. &Cozzi, J. Generation of fertile cloned rats by regulating oocyte activation. Science 302:1179(2003).30. Lee, B.C., Kim, M. K., Jang, G., Oh, H. J., Yuda, F., Kim, H. J., Hossein, M. S., Kim, J. J., Kang,S. K., Schatten, G. & Hwang, W. S. Dogs cloned from adult somatic cells. Nature 436:641(2005).31. Kim, M. K., Jang, G., Oh, H. J., Yuda, F., Hwang, W. S., Hossein, M. S., Kim, J., Shin, N. S.,Kang, S. K. & Lee, B. C. Endangered wolves cloned from adult somatic cells. Cloning StemCells 9(1):130-7 (2007).33. Lee, J. W., Wu, S. C. Tian, X. C., Barber, M., Hoagland, T., Riesen, J., Tu, C. F., Lee, K. H.,Cheng, W. T. K. & Yang, X. Production of cloned pigs by whole cell intracytoplasmicmicroinjection. Biol. Reprod. 69:995-1001 (2003).32. Shen, P.C. The in vitro and in vivo development of NT reconstructed rabbit oocytes: First NTrabbit produced in Taiwan from 8-cell stage blastomere. J Chin Soc Anim Sci 25 (Suppl.):62(1996). (in Chinese)34. Shen, P. C., Lee, S. N., Wu, J. S., Huang, J. C., Chu, F. H., Chang, C. C., Kung, J.C., Lin, H. H.,Chen, L. R., Shiau, J. W., Yen, N. T. & Cheng, W. T. K. The effect of electrical field strength onactivation and development of cloned caprine embryos. Anim. Reprod. Sci. 92(3-4):310-20(2006).35. Jiang, Y., Jahagirdar, B. N., Reinhardt, R. L., Schwartz, R. E., Keene, C.D., Ortiz-Gonzalez, X.R., Reyes, M., Lenvik, T., Lund, T, Blackstad, M, Du, J., Aldrich, S., Lisberg, A., Low, W. C.,Largaespada, D. A. & Verfaillie, C. M. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived fromadult marrow. Nature 418:41-49 (2002).36. Zaehres, H. H. & Scholer, R. Induction of pluripotency: from mouse to human. Cell131(5):834-835 (2007).37. Yang, X, Smith, S. L., Tian, C. X., Lewin, H. A., Renard, J. P. & Wakayama, T. Nuclearreprogramming of cloned embryos and its implications for therapeutic cloning. Nature Genetics39:295-302 (2007).84

第 七 章組 織 工 程 在 幹 細 胞 研 究 之 運 用Tissue Engineering Technique in Stem Cell Research徐 善 慧臺 灣 大 學 高 分 子 科 學 與 工 程 學 研 究 所 教 授一 、 前 言在 前 面 的 幾 章 中 介 紹 幹 細 胞 的 基 礎 知 識 。 本 章 將 描 述 幹 細 胞 結 合 組 織 工 程 技 術 的 一 些運 用 。 在 這 一 章 節 中 將 包 涵 一 些 工 程 的 觀 念 , 也 更 說 明 了 幹 細 胞 為 一 跨 領 域 的 研 究 。二 、 定 義1. 再 生 醫 學上 個 世 紀 的 後 期 , 醫 學 界 有 一 種 新 的 觀 念 產 生 , 因 為 它 有 別 於 已 現 存 於 醫 學 界 的 「 治 療醫 學 」 與 「 預 防 醫 學 」 兩 種 概 念 , 所 以 稱 為 第 三 類 醫 學 。 也 就 是 「 再 生 醫 學 」(regenerativemedicine), 顧 名 思 義 , 再 生 指 的 是 讓 因 病 變 或 損 傷 而 已 經 失 去 作 用 的 器 官 或 組 織 再 重 新 生 長出 來 、 扮 演 原 先 的 生 理 功 能 。 引 起 了 廣 泛 的 重 視 與 討 論 的 「 再 生 醫 學 」 可 以 大 分 為 兩 個 部 分 :第 一 個 部 分 就 是 「 幹 細 胞 療 法 」, 利 用 具 有 多 種 分 化 潛 力 的 幹 細 胞 來 補 充 因 為 疾 病 或 受 傷 而 無法 作 用 的 細 胞 ; 而 第 二 個 部 分 就 是 「 組 織 工 程 」(tissue engineering)。2. 組 織 工 程「 組 織 工 程 」 這 個 詞 中 的 工 程 二 字 , 與 「 基 因 工 程 」 一 詞 中 的 工 程 二 字 相 同 , 指 的 並 不是 「 工 程 學 科 」 的 意 思 , 而 是 殫 思 竭 慮 的 去 設 計 以 強 化 特 殊 功 能 。「 組 織 工 程 」 的 定 義 是 , 不僅 利 用 細 胞 來 達 到 再 生 的 功 能 , 而 是 利 用 活 體 取 出 的 細 胞 , 進 一 步 結 合 適 當 的 可 分 解 材 料 、或 甚 至 包 括 其 他 生 物 分 子 , 一 同 努 力 , 再 生 出 新 的 組 織 出 來 , 以 取 代 無 法 工 作 的 組 織 。 組 織工 程 技 術 包 含 細 胞 作 為 其 一 元 件 , 此 細 胞 可 以 是 幹 細 胞 , 也 可 以 是 組 織 細 胞 , 當 使 用 幹 細 胞時 , 就 是 將 組 織 工 程 技 術 運 用 到 幹 細 胞 療 法 中 。雖 然 在 使 用 的 策 略 上 有 所 不 同 ,「 再 生 醫 學 」 中 的 「 幹 細 胞 療 法 」 與 「 組 織 工 程 」 結 合之 後 將 更 能 達 到 組 織 再 生 的 目 的 。3. 支 架在 「 組 織 工 程 」 中 , 細 胞 是 與 適 當 的 可 分 解 材 料 一 同 培 養 後 , 產 生 再 生 組 織 。 這 些 可 分85

解 材 料 一 般 是 先 加 工 成 為 組 織 的 形 狀 , 有 許 多 的 孔 洞 , 細 胞 就 可 以 像 播 種 一 般 灑 進 去 , 這 個可 分 解 材 料 被 叫 做 「 支 架 」(scaffold), 其 名 稱 來 自 功 能 類 似 建 築 時 候 暫 時 撐 住 大 樓 的 鷹 架 。由 下 面 的 例 子 可 看 出 組 織 工 程 的 觀 念 。 若 有 一 位 小 耳 症 的 病 人 想 要 重 建 缺 陷 的 耳 朵 , 此時 可 用 可 分 解 材 料 , 先 經 過 加 工 做 成 這 位 病 人 正 常 耳 朵 的 樣 子 ( 就 是 耳 朵 「 支 架 」), 然 後 在病 人 的 耳 朵 上 挖 個 幾 乎 看 不 見 的 小 傷 口 , 取 出 一 點 耳 朵 軟 骨 細 胞 , 在 體 外 複 製 大 量 的 軟 骨 細胞 做 為 種 子 , 再 播 種 回 到 耳 朵 「 支 架 」 中 ; 種 到 耳 朵 「 支 架 」 去 的 軟 骨 細 胞 若 在 體 外 有 合 適的 環 境 , 經 過 一 段 時 間 ( 例 如 一 兩 個 月 ) 就 會 長 出 真 正 的 耳 朵 軟 骨 出 來 , 這 時 再 把 長 出 來 的再 生 組 織 移 回 到 病 人 的 身 上 。 由 於 耳 朵 的 軟 骨 是 彈 性 軟 骨 , 與 關 節 的 透 明 軟 骨 不 同 , 在 做 軟骨 組 織 工 程 時 , 需 要 依 修 復 部 位 的 不 同 來 選 擇 細 胞 來 源 , 這 時 的 組 織 工 程 「 支 架 」 材 料 上 面可 以 改 播 種 幹 細 胞 , 而 且 在 很 多 情 況 下 , 幹 細 胞 較 原 組 織 細 胞 的 活 性 更 高 , 會 使 再 生 出 來 的組 織 功 能 上 更 為 接 近 原 來 想 要 的 組 織 。 但 是 在 另 一 方 面 , 幹 細 胞 對 於 「 支 架 」 材 料 也 是 更 加挑 剔 , 材 料 的 選 擇 往 往 影 響 了 幹 細 胞 的 分 化 與 它 們 未 來 的 命 運 。 在 最 近 , 有 人 更 把 奈 米 材 料的 理 念 引 入 了 「 支 架 」 材 料 的 設 計 中 , 也 就 是 希 望 利 用 奈 米 材 料 具 有 仿 生 ( 模 擬 生 物 體 ) 的特 性 , 來 加 強 幹 細 胞 的 性 質 。 這 些 研 究 也 引 發 了 許 多 結 合 奈 米 醫 學 與 再 生 醫 學 的 聯 想 。除 此 之 外 ,「 幹 細 胞 療 法 」 中 的 幹 細 胞 在 進 行 治 療 時 , 常 是 以 注 射 入 靜 脈 、 或 是 在 受 損的 細 胞 附 近 直 接 注 入 的 方 式 來 進 行 , 這 些 注 入 的 幹 細 胞 雖 然 具 有 找 到 受 傷 部 分 的 細 胞 予 以 修復 的 能 力 , 在 很 多 時 候 仍 會 流 失 到 其 他 地 方 。 於 是 ,「 支 架 」 材 料 提 供 了 保 護 「 幹 細 胞 」 的 另一 項 選 擇 。4. 生 物 反 應 器 (Bioreactors)生 物 反 應 器 的 功 能 是 提 供 一 種 人 工 模 擬 體 內 的 培 養 環 境 而 設 計 , 除 了 可 以 增 加 組 織 細 胞的 大 量 增 殖 , 生 物 反 應 器 亦 可 對 培 養 之 組 織 細 胞 藉 由 流 體 之 流 動 提 供 養 分 與 氧 氣 之 置 換 及 代謝 物 之 移 除 , 再 者 結 合 不 同 的 物 理 刺 激 如 剪 切 力 (shear-stress)、 流 場 (fluid-flow)、 壓 縮(compression) 或 張 力 (tension) 以 模 擬 人 體 環 境 的 培 養 系 統 。三 、 支 架 設 計在 這 個 過 程 中 , 工 程 師 能 為 細 胞 做 些 什 麼 事 呢 ? 首 先 , 材 料 工 程 師 / 高 分 子 科 學 家 必 須 先出 面 , 對 於 承 載 細 胞 的 「 支 架 」 材 料 做 出 完 美 的 設 計 , 讓 這 些 細 胞 能 高 高 興 興 的 在 「 支 架 」材 料 上 面 成 家 立 業 。 包 括 :「 支 架 」 材 料 上 孔 洞 的 大 小 要 讓 細 胞 播 種 得 進 去 , 也 能 進 一 步 複 製及 生 長 , 還 有 ,「 支 架 」 材 料 在 細 胞 生 長 出 真 正 的 組 織 後 , 必 須 功 成 身 退 分 解 掉 。 這 個 過 程 若不 控 制 得 當 , 細 胞 就 會 拒 絕 工 作 , 組 織 再 生 就 無 法 成 功 。一 般 組 織 工 程 「 支 架 」 除 了 須 具 備 三 維 空 間 的 架 構 , 尚 需 具 備 一 定 的 條 件 及 功 能 , 提 供細 胞 一 個 良 好 的 生 長 環 境1-2 :(1) 「 支 架 」 材 料 需 具 有 良 好 的 生 物 相 容 性 , 以 利 細 胞 可 以 順 利 地 貼 附 、 生 長 及 行 使 其 功 能 。(2) 「 支 架 」 需 具 有 適 當 的 孔 洞 大 小 及 高 度 的 孔 洞 連 通 性 , 不 同 細 胞 生 長 所 需 的 環 境 不 同 ,所 設 計 的 「 支 架 」 孔 洞 大 小 也 會 不 同 ; 高 度 的 孔 洞 連 通 性 有 利 於 細 胞 所 需 養 分 以 及 代 謝後 所 產 生 廢 物 的 質 傳 , 以 便 細 胞 可 在 良 好 的 環 境 中 生 長 。86

(3) 「 支 架 」 材 料 需 具 有 生 物 可 降 解 性 , 其 降 解 時 間 能 與 細 胞 生 長 的 速 度 相 匹 配 , 隨 著 細 胞的 生 長 而 逐 漸 分 解 消 失 , 分 解 後 的 產 物 可 經 由 體 內 代 謝 吸 收 。(4) 「 支 架 」 需 具 有 一 定 的 機 械 性 質 , 一 方 面 能 保 護 細 胞 於 「 支 架 」 中 生 長 , 另 一 方 面 與 修復 組 織 相 近 的 機 械 性 質 , 可 避 免 應 力 遮 蔽 效 應 的 產 生 , 提 供 正 確 的 力 學 訊 號 , 有 利 細 胞的 生 長 及 組 織 修 復 。作 為 組 織 工 程 「 支 架 」 的 材 料 主 要 分 為 天 然 高 分 子 材 料 及 合 成 高 分 子 材 料3 。 常 用 的 天然 高 分 子 材 料 包 括 膠 原 蛋 白 (collagen)、 動 物 明 膠 (gelatin)、 透 明 質 酸 (hyaluronic acid)、幾 丁 聚 醣 (chitosan) 及 褐 藻 酸 鹽 (alginate) 等 , 這 些 天 然 材 料 通 常 具 有 良 好 的 生 物 相 容 性及 親 水 性 , 結 構 上 也 較 具 生 物 活 性 , 細 胞 容 易 在 這 些 材 料 上 貼 附 生 長 , 而 且 降 解 後 的 產 物 較不 具 毒 性 , 可 被 人 體 吸 收 , 但 以 一 般 天 然 高 分 子 材 料 所 製 成 的 「 支 架 」, 機 械 性 質 較 弱 , 不 適合 單 獨 用 於 高 負 荷 重 或 硬 組 織 ( 如 軟 骨 組 織 或 硬 骨 組 織 ), 通 常 需 搭 配 機 械 性 質 較 佳 的 合 成 材料 或 陶 瓷 材 料 ; 常 用 的 合 成 高 分 子 材 料 包 括 聚 乳 酸 (polylactide)、 聚 甘 醇 酸 (polyglycolide)、前 兩 者 的 共 聚 物 聚 乳 酸 - 甘 醇 酸 (polylactide-co-glycolide) 及 聚 己 內 酯 (polycaprolactone)等 , 合 成 材 料 通 常 較 天 然 材 料 疏 水 , 其 降 解 速 率 可 依 不 同 的 分 子 量 、 共 聚 合 比 例 或 混 滲 比 例來 調 控 , 降 解 後 的 產 物 為 羧 酸 類 及 醇 類 , 經 由 生 物 體 代 謝 後 形 成 二 氧 化 碳 及 水 分 子 而 排 出 體外 , 但 這 些 酸 性 的 降 解 產 物 也 會 造 成 細 胞 凋 亡 或 引 起 體 內 的 免 疫 反 應4 , 為 合 成 材 料 較 大 的缺 點 。以 下 分 別 為 幾 種 常 用 高 分 子 材 料 的 介 紹 :1. 天 然 高 分 子 材 料(a) 膠 原 蛋 白膠 原 蛋 白 為 生 物 組 織 中 含 量 最 豐 富 的 蛋 白 質 , 由 三 條 多 胜 肽 鏈 所 組 成 , 靠 著 彼 此 鏈 間 的氫 鍵 , 形 成 三 股 螺 旋 結 構 , 可 提 供 組 織 所 需 的 強 度 。 隨 著 人 體 不 同 的 組 織 所 含 的 膠 原 蛋 白 類型 也 不 同 , 目 前 約 有 20 幾 種 被 定 義 , 其 中 含 量 最 大 的 為 第 一 型 膠 原 蛋 白 , 主 要 分 布 於 皮 膚 、骨 組 織 、 肌 腱 及 大 部 分 的 器 官 中 。 膠 原 蛋 白 可 從 生 物 體 組 織 經 由 萃 取 純 化 , 去 除 會 引 起 免 疫排 斥 的 官 能 基 後 , 經 由 重 組 或 交 聯 劑 交 聯 處 理 , 可 製 作 成 多 孔 性 的 「 支 架 」 材 料 。 由 於 膠 原蛋 白 具 有 極 佳 的 生 物 相 容 性 , 目 前 在 生 物 醫 學 材 料 上 用 途 最 為 廣 泛 , 包 括 創 傷 敷 料 ( 圖 一 )、人 工 皮 膚 、 骨 骼 填 補 材 、 人 工 軟 骨 、 人 工 角 膜 及 神 經 導 管 等 。圖 一 、 國 內 臺 鹽 生 技 所 研 發 的 膠 原 蛋 白 敷 料87

(b) 動 物 明 膠明 膠 基 本 上 為 變 性 (denature) 的 膠 原 蛋 白 , 組 成 與 膠 原 蛋 白 類 似 , 但 為 單 股 結 構 , 通常 由 牛 或 豬 的 皮 膚 或 骨 頭 中 萃 取 出 , 為 水 溶 性 的 蛋 白 質 , 高 溫 下 為 水 溶 液 , 低 溫 時 呈 現 膠 狀 ,經 交 聯 修 飾 後 使 用 , 價 格 較 膠 原 蛋 白 便 宜 許 多 , 可 作 為 替 代 膠 原 蛋 白 的 材 料 。(c) 透 明 質 酸透 明 質 酸 為 一 種 帶 負 電 荷 、 以 重 複 性 雙 醣 單 元 所 組 成 的 天 然 高 分 子 , 存 在 於 結 締 組 織 中 ,為 一 種 具 有 黏 彈 性 的 水 膠 , 可 潤 滑 、 吸 震 及 保 護 細 胞 , 取 得 來 源 主 要 分 為 兩 大 類 , 一 是 由 雞冠 或 動 物 體 的 關 節 滑 液 或 水 晶 體 中 取 得 , 另 一 種 是 利 用 生 化 工 程 技 術 , 由 微 生 物 發 酵 產 生 。醫 學 上 使 用 大 多 將 高 分 子 量 的 透 明 質 酸 直 接 注 入 關 節 中 , 增 加 潤 滑 的 作 用 , 減 輕 關 節 炎 的 疼痛 。 近 幾 年 透 明 質 酸 也 被 運 用 於 組 織 工 程 材 料 中 , 配 合 其 他 高 分 子 材 料 , 可 用 作 人 工 軟 骨 或創 傷 敷 料 。(d) 幾 丁 聚 醣幾 丁 聚 醣 是 從 甲 殼 類 動 物 中 的 幾 丁 質 去 乙 醯 化 反 應 (deacetylation) 後 所 形 成 的 多 醣 聚合 體 , 可 溶 解 於 稀 的 有 機 酸 中 , 化 學 結 構 與 透 明 質 酸 類 似 , 結 構 中 的 胺 基 通 常 帶 有 正 電 荷 。幾 丁 聚 醣 除 了 具 有 生 物 相 容 性 及 降 解 性 外 , 還 具 有 獨 特 的 抗 菌 性 , 因 此 被 廣 泛 的 利 用 在 各 方面 , 比 如 具 有 抗 菌 效 果 的 傷 口 敷 料 ( 圖 二 ); 然 而 , 幾 丁 聚 醣 單 獨 存 在 時 , 機 械 強 度 較 差 且 脆 ,可 依 用 途 添 加 其 他 高 分 子 材 料 ( 如 明 膠 ) 改 善 其 物 理 機 械 性 質 ; 也 可 搭 配 陶 瓷 材 料 運 用 於 骨骼 修 復 上 , 具 有 明 顯 的 骨 誘 導 效 果 。 因 其 來 源 易 取 得 且 價 格 便 宜 , 使 得 幾 丁 聚 醣 近 幾 年 在 生醫 材 料 上 的 應 用 頗 受 重 視 。圖 二 、 幾 丁 聚 醣 敷 料(e) 褐 藻 酸 鹽褐 藻 酸 鹽 是 從 褐 藻 類 植 物 中 萃 取 , 為 帶 有 陰 電 荷 的 天 然 多 醣 類 高 分 子 , 可 溶 解 於 水 中 形成 黏 稠 溶 液 態 , 經 由 二 價 離 子 ( 如 鈣 、 鎂 ) 進 行 物 理 交 聯 , 形 成 高 含 水 率 之 膠 狀 載 體 ( 圖 三 ),可 用 於 包 覆 細 胞 或 藥 物 , 例 如 以 褐 藻 酸 鹽 包 覆 軟 骨 細 胞 進 行 培 養 , 在 褐 藻 酸 鹽 膠 體 中 , 被 包覆 的 軟 骨 細 胞 可 維 持 原 有 的 細 胞 形 態 , 有 助 於 保 持 軟 骨 細 胞 活 性 及 促 進 胞 外 基 質 的 分 泌 。 但褐 藻 酸 鹽 所 形 成 的 載 體 , 因 含 水 率 高 , 機 械 性 質 明 顯 不 足 , 且 應 用 於 大 體 積 的 載 體 會 有 質 傳的 問 題 , 故 褐 藻 酸 鹽 大 多 製 備 成 微 載 體 , 應 用 有 限 。88

圖 三 、 褐 藻 酸 鹽 細 胞 載 體2. 合 成 高 分 子 材 料(a) 聚 乳 酸聚 乳 酸 為 一 種 人 造 合 成 的 可 降 解 材 料 且 具 有 良 好 的 生 物 相 容 性 , 降 解 速 度 慢 , 約 需 要 1~2年 ; 具 有 左 旋 光 性 的 聚 乳 酸 , 機 械 強 度 高 , 目 前 主 要 應 用 於 醫 用 縫 線 及 骨 釘 骨 板 等 骨 修 復 材料 , 可 於 體 內 中 分 解 , 患 者 不 必 經 二 次 手 術 將 材 料 取 出 ,, 但 此 類 聚 乳 酸 材 料 降 解 後 的 酸 性產 物 容 易 引 起 局 部 pH 值 下 降 , 在 臨 床 上 患 者 易 引 起 發 炎 反 應 。(b) 聚 甘 醇 酸具 有 優 於 聚 乳 酸 的 生 物 相 容 性 , 降 解 產 物 也 可 被 人 體 代 謝 , 但 降 解 時 間 太 快 (1~2 個 月 ),導 致 「 支 架 」 崩 解 , 局 部 降 解 產 物 羥 基 乙 酸 迅 速 累 積 , 造 成 pH 值 下 降 , 容 易 導 致 細 胞 的 凋亡 。 故 通 常 使 用 上 會 混 入 一 定 比 例 的 聚 乳 酸 , 此 類 「 支 架 」 材 料 常 用 於 骨 或 軟 骨 組 織 工 程 上 。(c) 聚 乳 酸 - 甘 醇 酸為 聚 乳 酸 與 聚 甘 醇 酸 的 共 聚 物 , 可 以 兩 者 的 分 子 量 、 結 晶 性 及 共 聚 合 比 例 , 聚 合 出 不 同強 度 及 降 解 速 率 的 高 分 子 , 較 具 發 展 潛 力 。 在 醫 療 材 料 上 已 運 用 於 缝 線 及 骨 修 復 材 料 , 也 被廣 泛 使 用 於 組 織 工 程 上 , 如 軟 骨 支 架 、 硬 骨 修 復 材 料 、 人 工 皮 膚 、 牙 科 材 料 及 神 經 導 管 等 ,皆 有 不 錯 的 成 果 。介 紹 完 常 用 的 「 支 架 」 材 料 , 要 製 做 出 適 合 各 式 各 樣 組 織 所 需 的 組 織 工 程 「 支 架 」, 一 般可 利 用 冷 凍 乾 燥 法 (freeze-drying )、 微 粒 造 孔 (particulate leaching )、 纖 維 鍵 結(fiber-bonding)、 三 度 空 間 列 印 (three-dimensional printing) 及 快 速 成 型 法 (rapid prototype)等5 。1. 冷 凍 乾 燥 法主 要 是 將 高 分 子 溶 液 在 低 溫 下 凝 固 , 溶 劑 會 形 成 不 同 大 小 的 冰 晶 , 然 後 在 真 空 下 以 冷 凍乾 燥 機 將 溶 劑 移 除 , 主 要 影 響 「 支 架 」 孔 洞 大 小 的 因 素 , 為 高 分 子 溶 液 的 濃 度 及 降 溫 的 過 程 ,在 濃 度 較 高 或 降 溫 速 度 較 快 的 情 況 下 , 會 形 成 較 小 的 孔 洞 結 構 , 反 之 , 則 會 形 成 較 大 的 孔 洞 。利 用 此 法 可 得 到 高 孔 隙 度 的 「 支 架 」( 圖 四 、a), 但 其 缺 點 為 機 械 性 質 弱 , 有 溶 劑 殘 留 的 疑慮 , 且 製 作 大 體 積 「 支 架 」 較 為 困 難 。2. 微 粒 造 孔此 種 方 法 是 將 高 分 子 溶 液 中 添 加 入 篩 選 過 的 鹽 粉 顆 粒 , 混 合 均 勻 後 , 將 高 分 子 溶 液 中 的溶 劑 移 除 後 , 再 將 此 塊 材 置 入 水 中 將 顆 粒 溶 解 , 形 成 孔 洞 。「 支 架 」 的 孔 洞 結 構 依 添 加 入 的 鹽89

粉 顆 粒 大 小 及 多 寡 , 可 製 作 出 不 同 孔 洞 及 孔 隙 度 的 「 支 架 」, 其 缺 點 與 冷 凍 乾 燥 法 類 似 , 機 械性 質 弱 及 無 法 製 作 大 體 積 的 「 支 架 」。3. 纖 維 鍵 結利 用 電 氣 紡 織 (non-woven)( 圖 四 、b) 或 編 織 (woven) 的 方 法 來 製 作 「 支 架 」, 前 者原 理 為 將 高 分 子 溶 液 通 過 一 高 壓 電 場 , 形 成 微 米 級 甚 至 奈 米 級 的 細 絲 , 隨 機 堆 疊 成 一 塊 高 孔隙 度 的 「 支 架 」, 此 法 所 製 作 出 的 「 支 架 」 具 有 完 全 連 通 的 孔 洞 , 但 其 機 械 性 質 低 且 受 限 於 材料 種 類 ; 後 者 是 將 高 分 子 做 成 細 絲 , 進 而 編 織 成 所 設 計 的 「 支 架 」, 但 此 法 步 驟 較 繁 複 , 且 也局 限 於 高 分 子 種 類 。4. 三 度 空 間 列 印利 用 噴 墨 印 表 機 的 原 理 , 配 合 電 腦 控 制 , 將 材 料 顆 粒 與 溶 劑 依 設 計 的 路 徑 , 噴 出 進 行 堆疊 , 可 經 由 電 腦 設 計 出 各 式 各 樣 形 狀 的 「 支 架 」, 但 孔 洞 連 通 性 及 溶 劑 的 殘 留 為 其 缺 點 。5. 快 速 成 型 法將 材 料 加 熱 熔 融 後 , 以 機 器 手 臂 連 結 電 腦 系 統 , 依 照 電 腦 中 所 設 計 的 路 徑 , 加 壓 射 出 堆疊 成 所 設 計 的 「 支 架 」 形 狀 。 此 法 所 製 作 出 「 支 架 」 的 孔 洞 大 小 及 結 構 , 皆 可 隨 需 求 而 改 變 ,孔 洞 為 完 全 連 通 , 機 械 性 質 佳 , 但 因 過 程 需 要 經 過 熱 熔 融 加 工 , 容 易 破 壞 材 料 性 質 。ab圖 四 、(a) 聚 乳 酸 - 聚 甘 醇 酸 冷 凍 乾 燥 法 支 架 ;(b) 聚 甘 醇 酸 電 氣 紡 織 支 架四 、 生 物 反 應 器 設 計由 於 「 支 架 」 材 料 上 面 還 沒 有 血 管 幫 細 胞 去 運 送 營 養 與 廢 物 , 所 以 化 學 工 程 師 / 機 械 工 程師 這 時 要 介 入 幫 忙 。 化 學 工 程 師 要 設 計 與 身 體 情 況 相 仿 的 動 態 流 體 系 統 , 例 如 利 用 外 在 流 場等 , 促 進 細 胞 在 「 支 架 」 材 料 中 營 養 的 進 入 與 廢 物 的 排 除 ; 機 械 工 程 師 要 計 算 出 動 態 系 統 中( 如 流 場 ) 是 否 具 有 合 適 的 力 場 , 能 促 進 細 胞 功 能 健 全 , 此 外 機 械 工 程 師 還 要 進 行 良 好 的 支架 外 觀 設 計 與 製 造 過 程 等 工 作 。 這 些 都 會 使 得 細 胞 與 「 支 架 」 材 料 共 培 養 長 出 組 織 的 過 程 更加 順 利 。 同 樣 的 , 在 「 支 架 」 材 料 與 幹 細 胞 共 培 養 中 系 統 中 力 場 與 流 場 的 設 計 , 也 會 影 響 幹細 胞 的 未 來 走 向 。 生 物 機 械 學 家 推 測 , 間 葉 幹 細 胞 雖 然 具 有 多 才 多 藝 、 分 化 成 不 同 組 織 細 胞90

的 特 性 , 但 若 施 以 壓 力 比 較 容 易 變 成 軟 骨 、 改 用 剪 切 力 比 較 容 易 變 成 硬 骨 、 施 以 張 力 則 容 易變 成 韌 帶 等 。 這 些 知 識 的 建 立 尚 需 要 龐 大 的 研 究 去 釐 清 真 相 。目 前 常 見 的 生 物 反 應 器 形 式 計 有 :(a) 灌 流 式 生 物 反 應 器 (perfusion bioreactors)灌 流 式 生 物 反 應 器 如 圖 五 所 示6 , 其 作 用 方 式 為 利 用 幫 浦 帶 動 培 養 液 , 並 連 續 通 過 培 養細 胞 的 支 架 中 , 均 勻 的 將 養 分 傳 輸 及 代 謝 物 移 除 。 此 培 養 方 式 細 胞 容 易 植 覆 及 均 勻 分 布 在 支架 上 , 並 可 以 調 整 不 同 壓 力 、 脈 衝 等 方 式 模 擬 體 內 環 境 , 惟 受 限 於 支 架 之 孔 洞 分 佈 之 均 勻 性 ,易 造 成 隧 道 效 應 (channeling effect), 因 培 養 液 會 容 易 往 支 架 大 孔 洞 的 方 向 流 動 , 而 造 成 局部 養 份 供 應 不 足 的 現 象 。 此 培 養 方 式 最 常 用 於 硬 骨 細 胞 之 培 養 。圖 五 、 灌 流 式 生 物 反 應 器 圖 示(b) 攪 拌 式 生 物 反 應 器 (spinner flask bioreactor)攪 拌 式 生 物 反 應 器 如 圖 六 所 示7 , 是 利 用 攪 拌 方 式 來 帶 動 培 養 液 之 流 動 , 以 增 加 質 傳 效果 , 然 而 形 成 之 流 體 易 呈 現 紊 流 (turbulent flow), 流 體 所 產 生 之 較 大 剪 切 力 對 細 胞 不 利 。 其支 架 被 線 懸 掛 固 定 於 攪 拌 瓶 內 , 細 胞 植 入 方 式 是 藉 由 流 體 對 流 將 細 胞 植 覆 於 支 架 上 , 因 此 細胞 植 覆 率 高 , 但 細 胞 普 遍 分 布 於 支 架 外 圍 , 較 常 應 用 於 培 養 軟 骨 細 胞 。圖 六 、 攪 拌 式 生 物 反 應 器 圖 示91

(c) 旋 轉 式 生 物 反 應 器 (rotating-wall vessels)滾 筒 式 生 物 反 應 器 是 利 用 同 心 圓 旋 轉 的 方 式 運 行 , 藉 由 帶 動 培 養 液 的 流 動 形 成 不 同 的 剪切 力 。 此 反 應 器 是 目 前 較 為 大 眾 所 常 用 之 反 應 器 類 型 , 相 較 於 其 他 類 型 反 應 器 旋 轉 式 生 物 反應 器 能 提 供 較 低 的 剪 切 力 。 由 美 國 太 空 總 署 NASA 所 開 發 的 微 重 力 反 應 器8 , 其 作 用 原 理 是藉 由 轉 動 培 養 液 所 產 生 的 剪 切 力 、 重 力 達 到 平 衡 , 使 培 養 細 胞 之 支 架 懸 浮 於 培 養 液 中 , 呈 現微 重 力 狀 態 , 而 不 致 掉 落 碰 壁 , 並 以 膜 式 交 換 器 來 進 行 氧 氣 與 二 氧 化 碳 之 交 換 , 但 隨 著 培 養時 間 增 加 , 組 織 之 密 度 增 加 此 時 將 會 無 法 抵 抗 重 力 而 掉 落 至 瓶 壁 。 本 實 驗 室 所 開 發 之 生 物 反應 器 如 圖 七 所 示 , 應 用 於 培 養 氣 管 之 軟 骨 組 織 , 亦 是 以 同 心 圓 旋 轉 之 方 式 帶 動 培 養 液 , 並 於培 養 室 製 造 出 液 - 氣 介 面 提 供 氧 氣 之 置 換 來 培 養 氣 管 組 織 。圖 七 、 滾 筒 式 生 物 反 應 器 圖 示(d) 壓 縮 式 生 物 反 應 器 (dynamic compression bioreactor)壓 縮 式 生 物 反 應 器 如 圖 八 所 示9 , 是 利 用 給 予 一 壓 縮 力 施 予 支 架 上 , 透 過 改 變 支 架 的 形變 而 將 應 力 傳 輸 到 細 胞 上 , 以 達 到 力 學 刺 激 之 效 果 。 此 反 應 器 功 能 類 似 模 擬 人 體 之 關 節 環 境受 力 方 式 。 另 一 種 反 應 器 是 針 對 肌 腱 或 韌 帶 所 設 計 , 其 作 用 方 式 是 對 組 織 週 期 性 的 施 加 應 力及 張 力 來 刺 激 組 織 。圖 八 、 動 態 壓 縮 生 物 反 應 器92

(e) 悸 動 式 生 物 反 應 器 (pulsatile flow reactor)10悸 動 式 生 物 反 應 器 如 圖 九 所 示 是 以 脈 衝 式 幫 浦 帶 動 培 養 液 以 固 定 的 頻 率 通 過 管 狀 血 管支 架 , 模 擬 類 似 人 體 血 液 流 動 的 方 式 , 對 管 腔 內 的 內 皮 細 胞 產 生 刺 激 。Pulsatilepump圖 九 、 悸 動 式 生 物 反 應 器各 種 組 織 都 有 其 適 合 的 反 應 器 來 進 行 培 養 , 主 要 是 因 應 各 個 體 內 組 織 之 不 同 環 境 。 表 一為 各 種 反 應 器 之 應 力 分 布 與 培 養 組 織 。表 一 、 為 不 同 反 應 器 之 應 用 於 軟 骨 組 織 培 養 之 剪 切 力 分 布反 應 器 類 型 流 體 之 流 速 及 攪 動 速 度 剪 應 力 範 圍 (dyn/cm 2 ) 培 養 組 織 種 類灌 流 式 生 物 反 應 器 0.5 ml/min 0~0.8 骨 骼攪 拌 式 生 物 反 應 器 50 rpm 0~1.2 軟 骨 、 皮 膚滾 筒 式 生 物 反 應 器 13, 37 rpm 0~0.8 軟 骨 、 心 血 管11在 應 力 ( 流 體 剪 切 力 、 機 械 之 張 力 及 壓 力 ) 對 細 胞 之 功 能 的 影 響 方 面 如 表 二 所 示 : 應 力會 導 致 細 胞 骨 架 之 重 組 進 而 影 響 到 細 胞 的 型 態 , 如 血 管 內 的 內 皮 細 胞 會 因 流 體 的 帶 動 而 沿 著流 體 方 向 排 列 , 並 促 進 一 氧 化 氮 、 凝 血 調 節 蛋 白 的 分 泌 ; 細 胞 的 增 殖 、 分 化 與 功 能 的 發 揮 都是 受 基 因 調 控 , 因 此 藉 由 應 力 之 刺 激 可 促 進 蛋 白 質 的 分 泌 及 轉 譯 。表 二 、 為 各 種 機 械 力 對 細 胞 的 刺 激12細 胞 類 型 刺 激 方 式 條 件 參 數平 滑 肌 細 胞 流 體 與 壓 力 120/60mm Hg 0.1 L/min10mm Hg 0.6/1.2 L/min軟 骨 細 胞 靜 水 壓 0.55–5.03MPa/1Hz內 皮 細 胞 流 體 的 剪 切 力 15 dyne/cm 2綜 合 以 上 所 述 , 反 應 器 的 設 計 無 非 是 要 模 擬 人 體 各 部 位 之 體 內 環 境 所 建 造 , 並 藉 由 不 同之 流 體 流 動 方 式 來 帶 動 養 分 的 傳 輸 供 應 與 均 勻 的 溶 氧 濃 度 , 並 將 代 謝 物 排 出 , 以 確 保 生 長 在支 架 內 部 的 細 胞 旺 盛 的 代 謝 活 性 , 更 近 一 步 透 過 物 理 性 刺 激 如 改 變 流 體 之 流 動 製 造 出 不 同 的93

剪 應 力 、 流 場 或 結 合 間 歇 性 的 壓 縮 或 張 力 的 往 復 刺 激 , 以 誘 發 細 胞 基 質 之 分 泌 , 使 培 養 之 組織 較 具 有 功 能 性 。五 、 結 語幹 細 胞 科 技 為 一 新 興 科 技 , 因 此 許 多 工 程 的 觀 念 在 幹 細 胞 科 技 中 扮 演 的 角 色 至 今 都 還屬 於 初 期 發 展 階 段 , 也 因 此 值 得 開 拓 。 而 且 , 一 般 學 者 都 相 信 , 因 為 幹 細 胞 屬 於 較 年 輕 的 細胞 , 其 具 有 多 種 分 化 潛 力 的 本 質 , 應 該 會 使 工 程 師 與 幹 細 胞 此 次 的 相 遇 , 比 起 前 面 工 程 師 與細 胞 的 第 一 類 接 觸 , 激 發 出 更 多 的 火 花 出 來 。* 感 謝 本 人 研 究 生 嚴 鴻 仁 與 林 振 寰 整 理 支 架 與 生 物 反 應 器 資 料 。六 、 參 考 文 獻1. Thomson, R. C., Wake, M. C., Yaszemski, M. J. & Mikos, A. G. Biodegradable polymerscaffolds to regenerate organs. Adv Polym Sci. 122:245-74 (1995).2. Vacanti, C. A. & Vacanti, J. P. Bone and cartilage reconstruction. In: Lanza, R., Langer,R., Chick, W. (eds.) Principles of Tissue Engineering. New York: R.G. Landes Co., p.619-31 (1997).3. Perrin, D. E. & English, J. P. Polycaprolactone. In: Domb, A. J., Kost, J. & Wiseman, D.M., editors. Handbook of Biodegradable Polymers. Australia: Harwood Academic; p.63-77 (1998).4. Babensee, J. E., Anderson, J. M., Melntire, L. V. & Mikos, A. G. Host response to tissueengineered devices. Adv Drug Deliv Rev. 33:111-39 (1998).5. Widmer, M. S. & Mikos, A. G. Fabrication of biodegradable polymer scaffolds for tissueengineering. In: Patrick, Jr. C. W., Mikos, A. G. & McIntire, L. V., editors. Frontiers inTissue Engineering. New York: Elsevier Science; p. 107-20 (1998).6. Mahmoudifar, N. & Doran, P. M. Tissue engineering of human cartilage in bioreactorsusing single and composite cell-seeded scaffolds. Biotechnology and Bioengineering91(3):338-55 (2005).7. Martin, Y. & Vermette, P. Bioreactors for tissue mass culture: design, characterization,and recent advances. Biomaterials. 26(35):7481-503 (2005).8. Begley, C. M. & Kleis, S. J. The fluid dynamic and shear environment in the NASA/JSCrotating-wall perfused-vessel bioreactor. Biotechnology and Bioengineering.70(1):32-40 (2000).9. Martin, I., Wendt, D. & Heberer, M. The role of bioreactors in tissue engineering. Trendsin Biotechnology. 22(2):80-6 (2004).94

10. Chen, H. C. & Hu, Y. C. Bioreactors for tissue engineering. Biotechnology Letters.28(18):1415-23 (2006).11. Bilgen, B. & Barabino, G. A. Location of scaffolds in bioreactors modulates thehydrodynamic environment experienced by engineered tissues. Biotechnology andBioengineering. 98(1):282-94 (2007).12. Engelmayr, Jr. G. C., Sales, V. L., Mayer, Jr. J. E. & Sacks, M. S. Cyclic flexure andlaminar flow synergistically accelerate mesenchymal stem cell-mediated engineeredtissue formation: Implications for engineered heart valve tissues. Biomaterials27(36):6083-95 (2006).95

第 八 章幹 細 胞 的 保 存 與 復 甦Cryopreservation and Re-cultivation of Stem Cells黃 效 民食 品 工 業 發 展 研 究 所 生 物 資 源 保 存 及 研 究 中 心一 、 前 言幹 細 胞 (stem cells) 之 冷 凍 保 存 , 基 本 上 就 是 將 具 有 分 裂 能 力 的 幹 細 胞 利 用 科 學 方 法 ,添 加 冷 凍 保 護 劑 和 一 定 的 冷 凍 條 件 , 置 於 低 溫 環 境 中 , 長 期 保 存 下 來 ; 當 需 要 時 加 以 解 凍 ,仍 能 恢 復 原 有 冷 凍 保 存 前 之 生 長 特 性 和 生 理 功 能 。 由 於 目 前 幹 細 胞 之 研 究 和 發 展 極 為 快 速 ,如 何 將 已 建 立 之 幹 細 胞 完 整 的 長 期 保 存 , 成 為 極 為 重 要 之 課 題 。 細 胞 冷 凍 保 存 之 優 點 , 顯 而易 見 的 諸 如 1) 不 需 要 長 期 維 持 細 胞 的 生 長 ,2) 節 省 人 力 、 時 間 、 培 養 基 和 試 劑 之 消 耗 ,3)防 止 細 胞 持 續 生 長 所 造 成 的 細 胞 變 異 、 老 化 、 微 生 物 污 染 等 的 機 會 ,4) 方 便 細 胞 寄 送 和 運輸 ,5) 在 不 同 時 間 和 地 點 , 提 供 相 同 生 理 年 齡 和 品 質 的 細 胞 ,6) 長 期 以 後 之 使 用 等 等 。 然而 細 胞 冷 凍 也 有 實 際 操 作 上 之 缺 點 和 注 意 事 項 必 須 事 先 了 解 , 例 如 冷 凍 後 之 細 胞 存 活 率 、 冷凍 過 程 對 細 胞 之 可 回 復 與 不 可 回 復 之 傷 害 、 冷 凍 保 護 劑 對 細 胞 之 選 擇 性 傷 害 等 等 。事 實 上 , 冷 凍 保 存 技 術 已 經 發 展 數 十 年 , 對 於 細 胞 本 身 之 長 期 保 存 , 已 頗 為 成 熟 , 尤 其是 成 體 幹 細 胞 (adult stem cells), 細 胞 均 呈 單 一 小 球 , 對 於 熱 傳 導 和 冷 凍 保 護 劑 之 浸 潤 作 用均 極 為 有 效 , 冷 凍 後 細 胞 之 傷 害 較 低 , 存 活 率 極 高 ; 然 對 於 以 細 胞 群 塊 方 式 保 存 之 胚 胎 幹 細胞 (embryonic stem cells), 則 仍 有 極 大 之 發 展 空 間 。二 、 冷 凍 保 存 學1. 基 本 觀 念冷 凍 保 存 最 基 本 的 關 鍵 , 就 是 如 何 降 低 冷 凍 過 程 時 對 細 胞 所 產 生 的 直 接 和 間 接 傷 害 ,讓 細 胞 解 凍 後 , 仍 保 有 該 有 的 活 性 和 特 徵 。 實 際 操 作 上 即 在 冷 凍 操 作 前 或 冷 凍 過 程 中 , 將保 存 之 細 胞 適 度 脫 水 , 以 減 少 細 胞 內 大 的 冰 晶 之 形 成 , 因 為 水 形 成 冰 體 積 會 膨 大 , 造 成 細胞 物 理 性 的 損 傷 ; 另 一 方 面 , 若 細 胞 脫 水 太 嚴 重 , 將 形 成 所 謂 溶 質 效 應 (solute effect), 細胞 內 滲 透 壓 太 高 , 細 胞 皺 縮 太 嚴 重 , 解 凍 後 無 法 恢 復 。 利 用 添 加 適 當 濃 度 的 冷 凍 保 護 劑 和97

適 當 的 降 溫 方 式 , 使 細 胞 在 冷 凍 時 之 傷 害 降 至 最 小 , 細 胞 解 凍 後 之 存 活 率 就 會 提 高 。 另 一種 方 式 為 完 全 避 免 冰 晶 之 形 成 , 由 於 冰 晶 之 形 成 需 要 所 謂 結 晶 核 , 再 慢 慢 長 晶 , 我 們 可 以利 用 物 理 原 理 , 使 用 較 高 濃 度 的 冷 凍 保 護 劑 , 急 速 降 溫 ( 直 接 由 室 溫 或 4°C 急 速 降 至-196°C), 此 時 原 為 液 態 之 物 質 將 轉 化 為 非 晶 型 類 似 玻 璃 之 固 體 狀 態 (glass-like amorphoussolid state), 沒 有 冰 晶 之 形 成 時 間 , 而 避 免 冷 凍 過 程 冰 晶 之 傷 害 。2. 冷 凍 保 護 劑5% 至 10% 的 甘 油 (glycerol) 或 DMSO(dimethyl sulfoxide) 是 最 常 用 的 冷 凍 保 護 劑 ,雖 然 DMSO 對 細 胞 有 毒 性 , 但 卻 比 甘 油 能 更 快 穿 透 細 胞 且 結 果 的 再 現 性 也 較 佳 , 適 用 性 較廣 , 然 DMSO 可 能 會 促 進 某 些 細 胞 的 分 化 , 以 及 對 一 些 細 胞 毒 性 太 強 , 若 測 試 數 次 後 細 胞 冷凍 後 之 存 活 率 均 不 佳 , 此 時 可 以 考 慮 使 用 甘 油 作 為 替 代 。 甘 油 可 以 高 溫 滅 菌 , 而 DMSO 則 必須 以 過 濾 方 式 除 菌 , 在 使 用 DMSO 時 要 格 外 小 心 , 因 為 它 可 快 速 穿 透 接 觸 的 皮 膚 , 破 壞 皮 膚之 通 透 和 完 整 性 。 一 般 而 言 , 建 議 可 以 考 慮 購 買 已 滅 菌 之 DMSO, 特 別 需 注 意 的 是 , 必 須 使用 細 胞 培 養 等 級 或 符 合 臨 床 使 用 的 DMSO 或 甘 油 ( 經 過 測 試 以 確 保 其 無 毒 性 , 並 且 沒 有endotoxin 殘 留 ), 開 瓶 後 需 分 裝 儲 存 且 避 光 。目 前 對 於 冷 凍 保 護 劑 的 保 護 機 制 上 並 不 明 瞭 , 推 論 一 冷 凍 保 護 劑 可 通 過 細 胞 膜 , 對 細 胞內 水 分 的 移 出 速 率 和 均 一 性 提 供 適 當 之 保 護 ; 推 論 二 直 接 作 用 於 細 胞 膜 上 , 使 細 胞 膜 之 流 動性 提 高 , 當 環 境 由 液 態 變 成 固 態 或 解 凍 時 由 固 態 變 成 液 態 時 , 降 低 細 胞 膜 之 傷 害 。一 般 而 言 , 我 們 建 議 冷 凍 培 養 基 的 配 方 為 90-95% 的 正 常 細 胞 培 養 基 添 加 5-10%DMSO; 其 他 的 冷 凍 培 養 基 配 方 , 則 包 括 了 提 高 血 清 濃 度 ( 如 20-90% 血 清 ) 等 , 然 對 每 一株 特 定 細 胞 最 適 合 的 配 方 , 必 須 實 際 實 驗 測 試 。 特 別 提 醒 的 是 , 添 加 DMSO 的 冷 凍 培 養 基 必須 新 鮮 配 製 , 並 放 置 於 4°C 下 備 用 ; 因 為 將 DMSO 加 入 培 養 基 的 過 程 會 釋 放 多 量 熱 能 , 而將 培 養 基 的 溫 度 提 高 至 超 過 37°C, 另 放 置 過 久 的 冷 凍 培 養 基 , 因 為 DMSO 易 產 生 過 氧 化 物質 和 自 由 基 等 , 對 細 胞 均 有 毒 性 , 故 必 須 新 鮮 配 製 。3. 人 類 胚 胎 幹 細 胞 製 備人 類 胚 胎 幹 細 胞 於 培 養 盤 上 生 長 約 一 週 後 , 細 胞 團 塊 之 大 小 和 數 目 均 達 到 適 當 且 必 須 繼代 時 , 目 前 有 二 種 方 式 可 將 細 胞 處 理 下 來 , 一 為 機 械 式 切 割 法 (mechanical dissection), 另一 種 為 酵 素 處 理 法 (enzyme digestion) 1 。 機 械 式 切 割 法 主 要 是 利 用 玻 璃 刀 , 將 人 類 胚 胎 幹細 胞 團 塊 於 解 剖 顯 微 鏡 下 , 小 心 地 將 團 塊 切 割 成 數 小 塊 到 數 十 小 塊 , 每 小 塊 約 為 100-200 個細 胞 數 , 再 將 此 些 小 塊 收 集 後 , 置 於 冷 凍 培 養 基 中 , 此 方 式 最 大 之 優 點 為 可 以 將 已 分 化 的 胚胎 幹 細 胞 部 分 加 以 剔 除 , 而 將 外 型 健 康 看 似 未 分 化 之 胚 胎 幹 細 胞 團 塊 , 有 選 擇 性 的 收 集 ( 圖一 ); 然 而 此 種 方 式 之 缺 點 為 時 間 和 人 力 消 耗 極 大 , 加 上 必 須 由 有 經 驗 和 訓 練 之 嫻 熟 技 術 人 員98

為 之 , 且 每 次 可 以 處 理 的 細 胞 數 量 無 法 太 多 。 機 械 式 切 割 法 一 般 用 於 剛 建 立 之 胚 胎 幹 細 胞 上 ,所 需 處 理 的 細 胞 數 量 亦 不 多 , 由 於 可 以 將 已 分 化 之 部 分 切 掉 , 而 專 一 的 挑 選 較 為 健 康 的 部 分 ,成 功 率 可 以 提 高 , 另 一 項 優 勢 為 細 胞 保 持 正 常 染 色 體 核 型 (normal karyotype) 之 機 會 較 高 。另 一 種 方 法 為 使 用 collagenase IV 酵 素 處 理 位 於 飼 養 層 細 胞 (feeder cells) 上 的 胚 胎 幹 細胞 , 此 種 方 式 最 大 的 優 點 為 可 以 處 理 大 量 的 細 胞 和 培 養 盤 , 只 要 將 酵 素 溶 液 加 入 培 養 盤 ,2-3小 時 後 , 胚 胎 幹 細 胞 團 塊 會 自 動 脫 落 ( 圖 二 ), 而 飼 養 層 細 胞 則 仍 吸 附 在 原 培 養 盤 上 , 收 集 胚胎 幹 細 胞 團 塊 再 以 微 量 吸 管 (pipetteman) 上 下 吸 放 數 次 ( 約 五 次 ), 將 細 胞 團 塊 打 散 成 數 小塊 , 但 不 要 將 細 胞 團 塊 打 的 太 小 , 否 則 細 胞 不 易 存 活 , 即 使 存 活 細 胞 亦 容 易 分 化 或 需 要 超 過10 天 之 生 長 , 團 塊 方 長 成 可 以 分 割 繼 代 之 大 小 , 惟 此 種 方 式 無 法 將 已 分 化 之 胚 胎 幹 細 胞 作 有效 區 隔 和 去 除 , 在 連 續 數 次 繼 代 培 養 之 過 程 中 , 容 易 造 成 細 胞 分 化 比 率 愈 來 愈 高 , 所 得 的 實驗 結 果 不 一 致 , 目 前 亦 有 數 篇 報 告 顯 示 , 利 用 酵 素 處 理 繼 代 之 胚 胎 幹 細 胞 , 較 易 有 染 色 體 異常 之 情 形 發 生 , 尤 其 是 第 十 二 對 和 第 十 七 對 染 色 體 有 多 一 套 (trisomy) 之 情 形 ; 也 因 為 如 此有 些 學 者 堅 持 使 用 機 械 切 割 法 , 筆 者 個 人 之 建 議 則 是 剛 開 始 建 立 中 之 胚 胎 幹 細 胞 , 應 該 使 用機 械 切 割 法 , 待 胚 胎 幹 細 胞 株 建 立 確 定 完 成 , 且 已 保 存 足 夠 之 冷 凍 管 後 , 方 以 利 用 酵 素 法 進行 細 胞 之 處 理 。 無 論 何 種 方 式 , 最 後 將 細 胞 團 塊 置 於 冷 凍 培 養 基 中 , 再 分 裝 於 冷 凍 小 管 或 塑膠 麥 管 中 , 進 行 冷 凍 程 序 。4. 冷 凍 保 存 容 器 和 降 溫 程 序冷 凍 保 存 胚 胎 幹 細 胞 的 容 器 可 分 為 塑 膠 冷 凍 小 管 (1.2-2.0 ml vials) 和 塑 膠 麥 管 , 兩 者的 保 存 效 果 大 致 相 同 , 差 別 在 使 用 者 的 習 慣 和 訓 練 , 使 用 塑 膠 麥 管 者 大 多 利 用 玻 璃 化 法 , 將含 有 小 細 胞 團 塊 之 麥 管 , 直 接 浸 到 液 態 氮 中 即 刻 完 成 降 溫 程 序 , 而 使 用 塑 膠 冷 凍 小 管 者 則 必須 注 意 降 溫 程 序 ; 根 據 近 年 之 數 篇 研 究 報 告 顯 示 , 胚 胎 幹 細 胞 之 凍 後 存 活 率 在 10-60%, 早期 更 有 報 告 顯 示 低 於 10%, 主 要 原 因 為 研 究 人 員 對 於 冷 凍 細 胞 團 塊 之 經 驗 極 少 , 加 上 對 於 胚胎 幹 細 胞 之 操 作 經 驗 不 足 所 致 , 尤 其 是 剛 建 立 之 胚 胎 幹 細 胞 生 長 並 不 穩 定 , 必 須 特 別 注 意 冷凍 流 程 和 解 凍 後 之 培 養 操 作 。 一 般 而 言 , 熟 悉 顯 微 注 射 、 胚 胎 操 作 之 實 驗 室 或 部 分 使 用 機 械切 割 方 式 製 備 胚 胎 幹 細 胞 者 , 習 慣 使 用 塑 膠 麥 管 , 其 所 需 之 胚 胎 幹 細 胞 團 塊 不 需 很 多 , 每 支塑 膠 麥 管 中 僅 有 5-8 個 團 塊 , 這 種 玻 璃 化 降 溫 方 式 的 好 處 是 方 便 和 快 速 , 且 無 須 購 買 昂 貴 的可 程 式 降 溫 機 或 使 用 -80°C 冰 箱 , 但 必 須 有 液 態 氮 之 供 應 和 攜 帶 設 備 , 其 原 理 為 將 含 有 高 濃度 冷 凍 保 護 劑 之 冷 凍 培 養 基 和 細 胞 團 塊 吸 入 塑 膠 麥 管 後 直 接 浸 入 液 態 氮 中 , 使 細 胞 和 液 體 進行 瞬 間 玻 璃 化 , 雖 然 細 胞 內 水 分 無 法 排 出 , 但 由 於 沒 有 冰 晶 之 產 生 , 細 胞 不 會 因 為 水 分 結 冰體 積 膨 脹 而 破 裂 ; 惟 所 儲 存 或 運 送 時 的 溫 度 若 高 於 -130°C 時 , 其 內 容 物 就 會 產 生 冰 晶 , 而 破壞 胚 胎 幹 細 胞 團 塊 之 存 活 效 果 , 所 以 在 儲 存 和 運 送 方 面 要 非 常 的 小 心 ; 實 際 上 操 作 必 須 要 確保 全 時 浸 放 於 液 態 氮 內 , 且 因 為 麥 管 很 細 , 解 凍 的 很 快 , 在 保 存 和 運 送 時 需 要 特 別 注 意 一 定99

要 完 全 浸 在 液 氮 中 , 才 不 會 回 溫 , 而 破 壞 了 胚 胎 幹 細 胞 之 存 活 , 此 種 方 法 一 般 適 用 於 處 理 樣品 數 少 或 細 胞 量 低 時 較 為 適 合2 。 使 用 塑 膠 冷 凍 小 管 操 作 胚 胎 幹 細 胞 之 保 存 則 遵 守 一 般 細 胞冷 凍 操 作 和 程 序 , 並 沒 有 特 殊 之 處 , 簡 言 之 主 要 是 將 胚 胎 幹 細 胞 之 小 團 塊 置 於 含 有5-10%DMSO 的 冷 凍 培 養 基 後 , 利 用 程 式 降 溫 儀 (programmable freezer), 以 每 分 鐘 降 低1-3°C 的 方 式 , 等 速 的 將 冷 凍 管 降 至 -80°C 以 下 , 再 移 轉 至 液 態 氮 桶 中 儲 存 ; 依 我 們 實 驗 室的 經 驗 以 每 分 鐘 降 低 1.5°C 可 以 得 到 >80% 的 存 活 率 ; 若 沒 有 程 式 降 溫 儀 , 一 般 均 使 用 異 丙醇 (isopropanol) 的 壓 克 力 容 器 (Mr. Frosty, Nalgene product), 將 冷 凍 管 放 置 於 此 種 壓 克力 容 器 中 , 再 移 到 -80°C 的 冰 箱 , 經 過 隔 夜 後 再 轉 移 到 液 態 氮 桶 中 保 存 , 異 丙 醇 容 器 在 此 種環 境 下 可 以 提 供 每 分 鐘 約 降 低 0.4°C 的 條 件 。 然 而 , 冷 凍 過 程 中 , 最 主 要 之 關 鍵 在 於 含 有 細胞 之 溶 液 在 液 態 變 為 固 態 時 , 即 凝 固 點 溫 度 , 其 潛 熱 (latent heat) 之 釋 放 , 此 時 已 凝 固 的細 胞 液 會 因 為 潛 熱 之 釋 放 , 又 溶 解 成 為 液 體 , 造 成 細 胞 有 反 覆 結 凍 、 解 凍 之 現 象 , 細 胞 之 冷凍 傷 害 隨 之 發 生 , 含 有 5-10% 的 細 胞 液 其 潛 熱 釋 放 溫 度 為 -6 至 -8°C 之 間 , 即 當 細 胞 液 慢 慢降 溫 至 凝 固 點 時 , 因 為 潛 熱 大 量 釋 放 , 溫 度 反 而 會 短 暫 的 升 溫 約 2-3°C, 當 潛 熱 完 全 去 除 後 ,冷 凍 管 內 細 胞 液 之 溫 度 才 會 再 持 續 下 降3 。 如 果 使 用 程 式 降 溫 儀 則 可 以 使 用 儀 器 本 身 具 有 的所 謂 seeding 功 能 , 利 用 先 接 觸 液 態 氮 之 金 屬 鑷 子 觸 碰 冷 凍 管 壁 將 潛 熱 立 刻 移 除 並 迅 速 結冰 , 溫 度 即 可 繼 續 降 低 ; 或 撰 寫 一 急 速 降 溫 再 升 溫 的 小 程 式 , 將 潛 熱 完 全 移 除 , 如 此 即 可 獲得 一 穩 定 的 降 溫 結 果 , 細 胞 的 凍 後 存 活 率 也 相 對 提 高 很 多 。 當 冷 凍 小 管 之 溫 度 低 於 -80°C 後 ,即 可 直 接 將 冷 凍 小 管 轉 移 到 液 態 氮 桶 中 儲 存 。5. 冷 凍 細 胞 的 復 甦冷 凍 細 胞 最 主 要 的 目 的 , 為 當 需 要 細 胞 時 可 以 加 以 解 凍 , 解 凍 後 的 細 胞 必 須 保 持 冷 凍 前之 活 性 和 生 長 特 性 。 除 少 數 臨 床 工 作 者 必 須 將 解 凍 的 細 胞 直 接 注 射 到 病 人 身 上 外 , 大 部 分 的研 究 人 員 , 當 細 胞 解 凍 後 , 必 須 加 以 培 養 , 一 則 可 以 將 不 存 活 的 細 胞 去 除 , 二 則 細 胞 培 養 後 ,細 胞 數 目 可 以 持 續 再 增 加 。 解 凍 細 胞 之 操 作 只 有 一 項 原 則 , 即 快 速 讓 細 胞 回 復 到 生 長 之 最 適溫 度 。對 於 以 塑 膠 麥 管 冷 凍 之 胚 胎 幹 細 胞 , 由 於 細 胞 液 體 積 很 小 , 一 旦 塑 膠 麥 管 離 開 液 態 氮 後在 室 溫 下 很 快 就 溶 解 , 所 以 建 議 必 須 在 無 菌 操 作 臺 或 生 物 安 全 操 作 櫃 內 取 出 塑 膠 麥 管 , 並 將胚 胎 幹 細 胞 團 塊 儘 快 推 出 或 擠 出 到 清 洗 液 中 ( 可 以 胚 胎 幹 細 胞 培 養 基 為 之 ), 主 要 目 的 為 去 除高 濃 度 的 DMSO, 再 轉 移 至 正 式 之 培 養 環 境 中 , 例 如 含 有 飼 養 層 細 胞 的 環 境 下 培 養 或 特 殊 之細 胞 外 間 質 (extracellular matrix), 由 於 剛 解 凍 之 胚 胎 幹 細 胞 團 塊 貼 附 性 不 高 , 應 儘 量 避 免搖 動 , 即 使 需 要 在 顯 微 鏡 下 觀 察 , 也 必 須 小 心 移 動 不 要 劇 烈 晃 動 , 並 減 少 觀 察 頻 率 , 待 胚 胎幹 細 胞 貼 附 完 成 並 向 外 生 長 後 , 每 天 或 每 隔 天 更 換 培 養 基 , 直 到 可 以 進 行 所 需 之 試 驗 或 繼 代 。對 於 以 塑 膠 冷 凍 小 管 保 存 之 胚 胎 幹 細 胞 , 操 作 上 則 必 須 額 外 注 意 解 凍 過 程 , 由 液 態 氮 或乾 冰 ( 因 為 運 送 之 需 要 , 由 液 態 氮 移 轉 至 乾 冰 桶 內 ) 直 接 取 出 之 冷 凍 小 管 , 其 溫 度 相 對 極 低 ,100

將 冷 凍 小 管 直 接 放 到 37°C 水 浴 槽 解 凍 時 , 必 須 輕 微 搖 動 直 到 完 全 解 凍 , 其 主 要 之 目 的 為 加速 細 胞 之 解 凍 , 然 更 重 要 的 是 確 保 已 解 凍 之 細 胞 不 要 再 結 凍 回 去 。 由 於 解 凍 過 程 , 事 實 上 是一 個 動 態 的 進 程 , 所 謂 解 凍 乃 是 溶 解 速 度 大 於 凝 結 速 度 , 最 終 至 完 全 溶 解 , 我 們 可 以 想 像 一下 , 當 冷 凍 小 管 內 之 細 胞 液 解 凍 時 , 因 為 熱 傳 導 關 係 , 高 溫 由 外 管 壁 向 內 傳 熱 , 故 管 壁 邊 緣之 部 分 會 先 行 解 凍 , 此 時 冷 凍 管 內 中 心 之 溫 度 仍 在 凝 結 溫 度 以 下 , 其 低 溫 仍 足 夠 將 剛 剛 解 凍之 部 分 , 立 刻 結 凍 回 來 , 如 此 若 已 解 凍 之 細 胞 又 再 次 結 凍 , 將 造 成 反 覆 解 凍 、 結 凍 之 微 觀 變化 , 對 於 細 胞 之 傷 害 極 大 , 所 以 解 凍 速 度 要 快 , 讓 此 種 傷 害 降 到 最 低 , 對 細 胞 解 凍 後 之 生 長影 響 最 小 。 在 水 浴 槽 溶 解 過 程 中 , 不 可 讓 水 面 淹 過 冷 凍 小 管 之 蓋 子 下 緣 , 甚 至 觸 碰 到 蓋 子 ,因 為 容 易 造 成 微 生 物 污 染 。 完 全 解 凍 後 之 冷 凍 小 管 , 以 70% 酒 精 擦 拭 管 壁 , 儘 速 移 到 無 菌 操作 臺 內 , 依 據 無 菌 操 作 程 序 將 細 胞 團 塊 輕 輕 加 入 已 含 有 胚 胎 幹 細 胞 培 養 基 之 離 心 管 中 , 經 過適 當 離 心 步 驟 , 去 除 含 有 DMSO 的 溶 液 後 , 再 接 種 於 適 當 培 養 環 境 中 , 如 同 上 一 段 所 述 。特 別 注 意 的 是 , 由 液 態 氮 取 出 冷 凍 麥 管 或 冷 凍 小 管 時 , 必 須 注 意 操 作 者 之 安 全 , 液 態 氮溫 度 極 低 (-196°C) 揮 發 快 速 , 其 危 險 性 就 像 沸 騰 的 開 水 一 樣 , 操 作 者 必 須 使 用 標 準 防 護 工具 , 千 萬 不 可 逞 強 和 大 意 , 以 免 凍 傷 , 甚 至 發 生 意 外 傷 害 。AB圖 一 、 人 類 胚 胎 幹 細 胞 之 生 長 形 態 : (A) 未 分 化 之 胚 胎 幹 細 胞 群 落 , 周 圍 為 飼 養 層 細 胞(B) 中 間 顏 色 較 深 者 已 有 明 顯 分 化 , 旁 邊 一 圈 顏 色 較 淡 者 為 未 分 化 之 胚 胎 幹 細 胞 。圖 二 、 利 用 collagenase IV 處 理 , 人 類 胚 胎 幹 細 胞 脫 落 之 情 形 。101

三 、 參 考 文 獻1. Oh, S. K., Kim, H. S., Park, Y. B., Seol, H. W., Kim, Y. Y., Cho, M. S., Ku, S. Y., Vhoi, Y. M.,Kim, D. W. & Moon, S. Y.Methods for expansion of human embryonic stem cells. StemCells 23:605-09 (2005).2. Reubinoff, B. E., Pera, M. F., & Trounson, A. O. Effective cryopreservation of humanembryonic stem cells by the open pulled straw vitrification method. Human Reprod.16:2187-94 (2001).3. Ware, C. B., Nelson, A. M. & Blau, C. A. Controlled-rated freezing of human ES cells.BioTechniques 38:879-83 (2005).102

第 九 章幹 細 胞 在 臨 床 之 應 用Clinical Application of Stem Cells李 茂 盛中 山 醫 學 大 學 醫 學 研 究 所 教 授一 、 前 言早 在 西 元 1961 年 , 加 拿 大 多 倫 多 大 學 的 科 學 家 詹 姆 士 (James E. Till) 及 恩 尼 斯 特 (ErnestMcCullough) 分 析 老 鼠 骨 髓 成 分 , 發 現 可 以 分 化 成 血 球 細 胞 的 造 血 幹 細 胞1 。 當 時 骨 髓 之 造血 幹 細 胞 便 開 始 被 廣 泛 的 研 究 , 企 圖 用 於 治 療 各 種 血 液 疾 病 。 此 後 生 物 學 家 陸 續 開 始 尋 找 比造 血 幹 細 胞 更 原 始 的 幹 細 胞 , 於 是 老 鼠 、 兔 子 、 豬 及 猴 子 甚 至 人 類 的 胚 胎 幹 細 胞 陸 續 被 建 立出 來 , 人 體 幾 乎 所 有 組 織 都 存 在 成 體 幹 細 胞 , 目 前 已 知 的 成 體 幹 細 胞 包 括 骨 髓 、 週 邊 血 液 、大 腦 、 脊 椎 、 牙 髓 腔 、 血 管 、 骨 骼 肌 、 皮 膚 上 皮 、 消 化 器 官 的 表 皮 、 眼 角 膜 、 視 網 膜 、 肝 臟 、胰 臟 、 脾 臟 及 大 腿 骨 等 , 此 外 存 在 於 骨 髓 、 羊 水 、 臍 帶 及 胎 盤 等 組 織 之 間 葉 幹 細 胞(mesenchymal stem cell) 亦 因 其 具 有 體 外 增 殖 及 多 重 分 化 能 力 , 而 被 認 為 具 有 治 療 各 種 疾病 之 潛 力 。 民 國 九 十 五 年 臺 灣 十 大 死 因 中 前 四 位 , 亦 分 別 為 惡 性 腫 瘤 、 腦 血 管 疾 病 、 心 臟 疾病 及 糖 尿 病 , 根 據 Perry 2 於 2000 年 統 計 在 美 國 可 能 藉 由 應 用 具 分 化 潛 能 的 幹 細 胞 治 療 的 疾病 及 罹 病 人 數 的 統 計 心 臟 血 管 疾 病 約 五 千 八 百 萬 人 、 自 體 免 疫 疾 病 約 三 千 萬 人 、 糖 尿 病(Diabetes) 約 一 千 六 百 萬 人 、 骨 質 疏 鬆 症 約 一 千 萬 人 、 癌 症 約 八 百 二 十 萬 人 、Alzheimer氏 老 年 癡 呆 症 約 四 百 萬 人 、 帕 金 森 氏 症 (Parkinson's disease) 約 一 百 五 十 萬 人 以 及 嚴 重 燒燙 傷 、 脊 椎 損 傷 新 生 兒 缺 陷 等 , 共 上 億 的 病 患 等 待 幹 細 胞 治 療 為 他 們 帶 來 治 癒 的 希 望 , 本 章將 就 幹 細 胞 在 臨 床 之 應 用 作 一 介 紹 。二 、 幹 細 胞 應 用 於 之 臨 床 的 三 階 段目 前 已 知 許 多 疾 病 的 發 生 , 與 特 定 的 組 織 或 細 胞 功 能 的 喪 失 與 壞 死 有 關 , 例 如 糖 尿 病 、帕 金 森 氏 症 、 老 年 癡 呆 症 、 脊 椎 神 經 損 傷 、 燒 燙 傷 、 心 臟 衰 竭 、 肝 硬 化 等 等 。 目 前 的 醫 療 技術 雖 可 以 經 由 移 植 正 常 器 官 或 組 織 而 治 癒 , 但 正 常 可 移 植 的 器 官 來 源 卻 嚴 重 缺 乏 , 且 器 官 捐獻 並 未 形 成 風 氣 。 至 於 成 體 幹 細 胞 或 胚 胎 幹 細 胞 用 於 臨 床 治 療 的 方 式 , 主 要 可 分 成 三 個 階 段 :1. 將 來 自 某 單 一 組 織 之 成 體 幹 細 胞 以 直 接 移 植 的 方 式 輸 入 給 同 一 組 織 損 傷 的 患 者最 早 進 行 人 類 異 體 骨 髓 幹 細 胞 移 植 的 病 例 , 發 表 於 1968 年3,4 , 該 期 期 刊 先 後 報 導 了 以103

骨 髓 細 胞 移 植 治 療 一 個 五 個 月 大 , 罹 患 性 聯 遺 傳 之 淋 巴 球 細 胞 病 變 之 免 疫 不 全 症(sex-linked lymphopenic immunological deficiency) 及 歐 德 里 症 候 群 (Wiskott-AldrichSyndrome) 的 案 例 。 這 兩 例 報 導 皆 是 直 接 將 骨 髓 移 植 入 患 者 體 內 , 而 治 療 成 功 的 病 例 。血 液 系 統 的 疾 病 , 可 利 用 骨 髓 移 植 以 治 療 無 數 的 患 者 , 而 移 植 到 病 患 體 內 真 正 發 揮 治 療效 果 的 , 就 是 存 於 骨 髓 內 的 造 血 幹 細 胞 。 此 外 , 瑞 典 神 經 學 家 於 2000 年 將 流 產 胎 兒 的腦 中 分 離 出 之 神 經 幹 細 胞 , 移 植 入 罹 患 帕 金 森 氏 症 的 患 者 腦 來 治 療5 , 並 經 過 長 期 的 追蹤 發 現 移 植 的 神 經 元 仍 能 存 活 且 可 繼 續 分 泌 多 巴 胺 (Dopamine), 且 帕 金 森 氏 症 的 症 狀亦 有 所 改 善 , 成 體 幹 細 胞 是 已 經 具 有 組 織 特 異 性 的 幹 細 胞 , 故 可 以 用 來 修 復 其 相 對 應 的病 變 或 受 損 組 織 , 但 是 可 以 移 植 的 幹 細 胞 數 量 , 通 常 是 一 個 移 植 上 的 瓶 頸 。 至 目 前 為 止 ,這 類 的 研 究 已 經 進 行 超 過 十 年 , 許 多 病 患 的 症 狀 , 明 顯 地 獲 得 改 善 。 但 是 , 進 行 一 次 移植 , 平 均 需 要 摘 取 六 個 流 產 胎 兒 的 腦 組 織 , 這 些 腦 組 織 的 來 源 勢 必 相 當 有 限 , 在 以 臍 帶血 治 療 血 液 疾 病 上 , 也 一 樣 存 在 輸 入 細 胞 數 量 的 問 題 , 如 何 使 成 體 幹 細 胞 增 殖 至 足 以 治療 疾 病 的 數 量 , 還 是 醫 界 一 個 很 大 的 考 驗 。2. 將 幹 細 胞 分 化 成 特 定 種 類 的 細 胞將 幹 細 胞 導 向 特 定 的 分 化 方 向 , 使 幹 細 胞 在 體 外 定 向 分 化 為 醫 療 上 所 需 要 特 定 組 織的 源 祖 細 胞 (progenitor cells), 例 如 根 據 細 胞 分 化 的 訊 息 傳 遞 所 需 的 特 定 路 徑 或 特 殊的 生 長 因 子 , 使 幹 細 胞 被 誘 導 成 病 人 所 需 的 細 胞 , 而 針 對 某 些 基 因 發 生 變 異 的 遺 傳 疾 病則 透 過 基 因 修 飾 來 改 造 基 因 得 到 治 療 所 需 的 細 胞 , 來 完 成 細 胞 替 代 治 療 (cellreplacement therapy)。 將 帶 有 人 工 培 養 的 活 性 細 胞 或 組 織 等 移 植 到 體 內 , 使 受 過 損 傷的 人 體 臟 器 或 組 織 再 生 , 進 而 恢 復 健 康 的 醫 療 , 這 也 就 是 應 用 所 謂 的 再 生 醫 學 。3. 組 織 工 程 之 運 用當 器 官 嚴 重 功 能 損 傷 , 必 須 進 行 組 織 層 次 的 治 療 或 修 復 甚 至 器 官 移 植 時 , 須 應 用 組織 工 程 技 術 , 製 造 出 一 個 適 合 病 患 需 要 的 器 官 。 組 織 工 程 學 需 要 整 合 的 知 識 除 了 基 本 的細 胞 學 、 生 物 學 、 生 化 學 、 分 子 生 物 學 外 , 尚 須 包 括 材 料 學 、 工 程 學 、 外 科 學 及 臨 床 醫學 等 , 此 時 除 了 考 慮 器 官 的 型 態 功 能 , 其 中 的 血 管 系 統 , 神 經 分 布 及 可 能 遇 到 的 排 斥 問題 , 都 還 是 目 前 醫 療 界 需 要 努 力 克 服 的 。三 、 幹 細 胞 之 臨 床 應 用人 類 幹 細 胞 體 外 分 化 的 研 究 , 是 近 年 來 十 分 熱 門 的 主 題 , 除 了 造 血 幹 細 胞 是 臨 床 上應 用 較 成 功 的 部 分 , 其 他 可 以 應 用 在 臨 床 治 療 而 無 副 作 用 的 尚 屬 少 數 。 人 類 胚 胎 的 研究 , 約 比 小 鼠 動 物 的 治 療 模 式 慢 了 至 少 十 年 , 近 年 來 , 順 利 修 正 動 物 的 模 式 , 而 可 以 用於 治 療 疾 病 的 大 部 分 都 還 停 留 在 第 一 期 的 人 體 試 驗 階 段 。 但 是 我 們 堅 持 幹 細 胞 應 用 於 人體 的 治 療 , 其 方 法 必 須 是 安 全 而 嚴 謹 的 , 針 對 不 同 幹 細 胞 , 直 接 移 植 或 分 化 成 可 以 應 用於 不 同 種 類 疾 病 , 整 理 於 表 一5 , 本 章 節 將 目 前 已 有 研 究 報 告 的 病 例 , 依 不 同 種 類 幹 細胞 對 疾 病 治 療 的 效 果 作 一 整 理 , 使 讀 者 明 瞭 幹 細 胞 治 療 不 同 的 疾 病 臨 床 應 用 的 進 展104

表 一 、 幹 細 胞 或 源 祖 細 胞 對 於 多 種 疾 病 的 潛 在 治 療 應 用 性疾 病 分 類幹 細 胞 來 源[ 註 一 ]細 胞 來 源造 血 及 免 疫 疾 病 、 再 生胚 胎 幹 細 胞 、 造 血 幹 細 胞不 良 性 貧 血 、 自 體 免 疫( 胎 兒 、 臍 帶 及 成 人 )疾 病 、 癌 症血 管 系 統 疾 病 、 缺 血 性 胚 胎 幹 細 胞 、 羊 膜 間 葉 幹 細心 臟 病胞 、 脂 肪 幹 細 胞骨 質 疏 鬆 症 、 骨 頭 發 育 胚 胎 幹 細 胞 、 骨 髓 幹 細 胞 、不 全 、 骨 關 節 炎 、 軟 骨 脂 肪 間 葉 幹 細 胞 、 胎 兒 組 織疾 病間 葉 幹 細 胞 、 臍 帶 血 間 葉 幹細 胞 、 肌 肉 衍 生 的 幹 細 胞肌 肉 性 疾 病 、 骨 骼 肌 缺 胚 胎 幹 細 胞 、 胎 兒 組 織 間 葉乏 症幹 細 胞 、 臍 帶 血 間 葉 幹 細胞 、 骨 髓 間 葉 幹 細 胞 、 肌 肉衍 生 幹 細 胞 、 脂 肪 幹 細 胞心 臟 衰 竭胚 胎 幹 細 胞 、 臍 帶 血 間 葉 幹細 胞 、 骨 髓 間 葉 幹 細 胞 、 脂肪 幹 細 胞 、 肌 肉 衍 生 的 幹 細胞神 經 系 統 疾 病 、 巴 金 森 胚 胎 幹 細 胞 、 胎 兒 神 經 幹 細氏 症 、 髓 磷 脂 疾 病 胞 、 成 人 神 經 幹 細 胞 、 皮 膚( 上 皮 神 經 脊 幹 細 胞 )、 表皮 神 經 元 鞘 幹 細 胞 、 骨 髓 造血 及 間 葉 幹 細 胞 、 脂 肪 幹 細胞肺 部 疾 病胚 胎 幹 細 胞 、 成 人 支 氣 管 肺泡 幹 細 胞 、 骨 髓 幹 細 胞肝 臟 疾 病胚 胎 幹 細 胞 、 胎 兒 肝 臟 間 葉幹 細 胞 、 脂 肪 幹 細 胞第 一 型 和 第 二 型 糖 尿 胚 胎 幹 細 胞 、 來 自 胎 盤 的 多病能 幹 細 胞 、 成 人 胰 臟 幹 細胞 、 脂 肪 幹 細 胞 、 造 血 幹 細胞 、 間 葉 幹 細 胞視 網 膜 疾 病胚 胎 幹 細 胞 、 胎 兒 神 經 幹 細胞 、 角 膜 上 皮 - 視 網 膜 幹 細 胞角 膜 疾 病 邊 緣 角 膜 上 皮 幹 細 胞 、 骨 髓5源 祖 細 胞 來 源(progenitor cell)內 皮 源 祖 細 胞 ( 胎 兒 肝 組織 、 臍 帶 血 、 骨 髓 )羊 膜 上 皮 細 胞羊 膜 上 皮 細 胞 、羊 膜 上 皮 細 胞 、 肝 卵 圓 形細 胞羊 膜 上 皮 細 胞 、 臍 帶 血 細胞胎 兒 肺 細 胞臍 帶 血 細 胞 、 羊 膜 上 皮 細胞 、 肝 卵 圓 形 細 胞胎 兒 胰 腺 ( 類 胰 島 細 胞群 )、 臍 帶 血 細 胞 、 羊 膜上 皮 細 胞 、 肝 卵 圓 形 細 胞105

間 葉 幹 細 胞皮 膚 和 頭 髮 疾 病 胚 胎 幹 細 胞 、 成 人 角 質 幹 細胞 、 表 皮 神 經 元 鞘 幹 細 胞 、胎 兒 組 織 、 羊 膜 上 皮 細胞 、突 上 皮 幹 細 胞註 一 : 胚 胎 幹 細 胞 (embryonic stem cell)、 造 血 幹 細 胞 (hematopoietic stem cell)、 臍 帶血 細 胞 (UCB, umbilical cord blood)、 神 經 幹 細 胞 (neural stem cell)、 內 皮 源 祖 細 胞(endothelial progenitor cell)、 間 葉 幹 細 胞 (mesenchymal stem cell)、 骨 髓 幹 細 胞 (bonemarrow-derived stem cell)、 脂 肪 幹 細 胞 (adipose-derived stem cell)、 羊 膜 內 皮 細 胞 (amnioticepithelial cell)、 肌 肉 衍 生 的 幹 細 胞 (muscle-derived stem cell)、 肝 卵 圓 形 細 胞 (hepatic ovalcell)、 表 皮 神 經 脊 幹 細 胞 (epidermal neural crest stem cell)、 支 氣 管 肺 泡 幹 細 胞(bronchioalveolar stem cell)、 角 質 幹 細 胞 (keratinocyte stem cell)、 突 上 皮 幹 細 胞 (bESC,bulge epithelial stem cell)1. 成 體 幹 細 胞 之 臨 床 應 用(a). 造 血 幹 細 胞湯 馬 士 (Thomas) 於 1959 年 成 功 完 成 首 例 雙 胞 胎 骨 髓 移 植 後 7 , 移 植 技 術 不 斷 改進 , 而 移 植 用 的 造 血 幹 細 胞 來 源 已 不 侷 限 於 骨 髓 。 目 前 醫 學 界 對 於 具 有 形 成 各 種 血 液 細胞 能 力 的 造 血 幹 細 胞 的 研 究 , 已 有 超 過 50 年 的 經 驗 , 並 有 足 夠 的 知 識 和 經 驗 應 用 於 臨 床上 的 治 療 上 。 造 血 幹 細 胞 , 是 指 在 血 液 或 骨 髓 中 具 有 自 我 更 新 並 且 能 分 化 成 多 種 特 定 的血 球 細 胞 , 並 且 能 從 骨 髓 移 動 到 周 邊 循 環 血 液 中 , 以 及 回 歸 到 骨 髓 中 的 能 力 , 這 是 移 植造 血 幹 細 胞 的 重 要 基 礎 。 造 血 幹 細 胞 的 移 植 ( 早 期 叫 骨 髓 移 植 ), 包 括 : 傳 統 骨 髓 移 植 、周 邊 血 液 幹 細 胞 移 植 、 以 及 臍 帶 血 移 植 8,9 。全 世 界 第 一 例 臍 帶 血 移 植 治 療 成 功 的 病 例 報 告 是 1988 年 一 位 罹 患 范 可 尼 貧 血(Fanconi’s Anemia) 的 法 國 五 歲 男 童 , 經 接 受 他 妹 妹 的 臍 帶 血 後 病 情 獲 得 改 善 。 目 前為 止 , 全 世 界 手 足 間 臍 帶 血 移 植 數 已 超 出 數 百 例 , 在 非 惡 性 疾 病 臍 血 移 植 成 效 比 骨 髓 移植 成 效 好 , 而 非 親 屬 間 臍 帶 血 移 植 數 已 超 數 千 例 , 已 經 登 錄 於 國 際 臍 帶 血 網(Netcord), 共 50,000 到 60,000 單 位 臍 帶 血 完 成 HLA 檢 驗 可 等 待 配 對 , 其 中 已 配 成且 移 植 者 約 有 1,000 到 2,000 例 , 孩 童 約 佔 3/4, 成 人 約 佔 1/4。 臺 灣 臍 帶 血 移 植 於 1995年 , 在 臺 大 醫 院 完 成 首 例 , 接 著 陸 續 有 林 口 長 庚 醫 院 、 臺 北 榮 民 總 醫 院 、 花 蓮 慈 濟 醫 院及 中 國 醫 院 大 學 兒 科 部 等 都 有 臍 帶 血 移 植 成 功 的 案 例 。 臍 帶 血 採 集 方 法 較 簡 單 , 不 會 傷害 母 體 及 胎 兒 , 同 時 沒 有 骨 髓 移 植 麻 醉 的 危 險 及 疼 痛 、 住 院 等 不 便 , 故 已 漸 漸 取 代 傳 統骨 髓 移 植 , 二 者 治 療 上 的 差 異 見 表 二10 。藉 由 臍 帶 血 庫 的 品 質 和 管 理 , 對 臍 帶 血 移 植 是 否 成 功 , 固 然 是 相 當 重 要 的 一 環 , 但是 臍 帶 血 移 植 另 一 個 常 遇 到 的 困 難 , 是 一 單 位 臍 帶 血 所 含 的 幹 細 胞 總 數 目 不 足 , 對 一 位成 人 體 重 的 個 體 而 言 , 有 些 人 是 不 夠 用 的 , 目 前 利 用 二 單 位 或 二 單 位 以 上 的 臍 帶 血 , 同時 植 入 一 位 成 人 病 患 , 來 克 服 臍 帶 血 幹 細 胞 數 目 的 不 足 , 而 利 用 體 外 培 養 將 臍 帶 血 的 量「 增 大 」(expansion) 的 方 式 , 也 可 克 服 幹 細 胞 數 目 的 不 足 ; 此 外 , 亦 有 科 學 家 利 用 已培 育 成 功 的 人 類 胚 胎 細 胞 株 , 經 適 當 培 養 與 誘 導 , 可 使 人 類 胚 胎 細 胞 株 分 化 成 血 液 幹 細106

胞 , 並 進 一 步 分 化 成 各 種 血 液 細 胞 , 若 臨 床 證 實 利 用 此 種 方 式 形 成 之 血 液 幹 細 胞 , 可 在人 體 表 現 應 有 的 造 血 功 能 和 建 立 免 疫 系 統 , 則 血 庫 之 血 荒 問 題 不 但 可 以 解 決 , 所 提 供 之血 液 更 不 需 要 擔 心 有 病 毒 污 染 。10表 二 、 臍 帶 血 是 骨 髓 理 想 的 移 植 替 代 品比 較 項 目 臍 帶 血 移 植 骨 髓 移 植採 集 過 程捐 髓 者 必 須 全 身 麻 醉 從 大 腿 兩對 產 婦 及 嬰 兒 皆 無 痛 苦且 無 傷 害 性 [ 註 一 ]側 腸 骨 抽 取 骨 髓 , 還 要 忍 受 傷口 的 疼 痛 和 麻 醉 後 反 應 的 痛 苦造 血 幹 細 胞 濃 度高 於 骨 髓 10 倍 以 上 , 且其 增 生 能 力 較 高濃 度 較 低 且 增 生 能 力 較 弱人 類 白 血 球 抗 原 配 對非 親 屬 之 間 移 植 , 只 需4~5 個 人 類 白 血 球 抗 原 相符非 親 屬 之 間 移 植 , 必 需 6 個 人類 白 血 球 抗 原 皆 相 符 , 因 此 配對 成 功 率 較 低宿 主 排 斥發 生 機 會 較 少 , 且 嚴 重 程 發 生 率 較 高 , 通 常 是 骨 髓 移 植度 較 低失 敗 的 主 因病 毒 感 染 較 為 純 淨 不 易 受 到 感 染[ 註 二 ]較 容 易 遭 受 感 染來 源每 位 新 生 兒 經 父 母 同意 , 皆 可 採 集 , 世 界 多 國都 已 建 立 龐 大 的 臍 帶 血必 須 捐 贈 者 同 意銀 行時 效 需 要 可 隨 時 解 凍 使 用 需 要 花 費 長 時 間 尋 找 配 對 者[ 註 一 ] 除 了 妊 娠 不 足 32 週 、 胎 盤 剝 離 時 間 與 分 娩 時 間 相 差 12 小 時 以 上 、 分 娩 時 發 燒 高 於38℃、 羊 水 中 有 胎 糞 、 產 婦 有 嚴 重 貧 血 、 胎 兒 呼 吸 窘 迫 、 紅 血 球 致 敏 、 產 婦 有 HBV、HCV、HIV、 或 梅 毒 感 染 等 情 況 者 不 予 採 集 外 , 正 常 分 娩 的 胎 盤 與 臍 帶 都 是 良 好 的 來 源 。[ 註 二 ] 巨 細 胞 病 毒 (Cytomegalovirus; CMV) 感 染 , 是 造 成 異 基 因 造 血 幹 細 胞 移 植 病 人 死 亡的 主 要 原 因 之 一 , 人 類 巨 細 胞 病 毒 感 染 在 人 群 中 廣 泛 存 在 , 在 發 達 國 家 為 40-60%, 發 展 中國 家 為 0-100%。 因 為 胎 盤 具 有 極 佳 的 過 濾 能 力 , 使 得 臍 帶 血 幹 細 胞 的 相 對 純 淨 , 所 以 臍 帶血 幹 細 胞 移 植 和 骨 髓 或 周 邊 血 幹 細 胞 移 植 相 比 , 受 感 染 可 能 性 極 低 。以 造 血 幹 細 胞 治 療 糖 尿 病糖 尿 病 在 國 人 十 大 死 因 從 民 國 91 年 到 95 年 連 續 五 年 排 名 第 四 位 , 第 一 型 糖 尿 病在 所 有 疾 病 中 所 佔 的 比 例 約 是 百 分 之 五 到 十 , 會 引 發 如 眼 盲 、 腎 衰 竭 、 心 臟 病 和 中 風 等嚴 重 的 併 發 症 。 這 種 病 起 因 於 患 者 自 身 的 免 疫 系 統 , 攻 擊 並 破 壞 胰 腺 裡 製 造 胰 島 素 的beta 細 胞 , 形 成 荷 爾 蒙 不 足 現 象 , 影 響 到 血 糖 值 。 大 部 分 的 病 患 在 接 受 臨 床 診 斷 時 , 體內 百 分 之 六 十 到 八 十 的 beta 細 胞 已 經 被 破 壞 殆 盡 。人 類 糖 尿 病 細 胞 治 療 的 成 功 案 例 , 來 自 加 拿 大 的 醫 療 團 隊 自 死 者 的 胰 臟 中 分 離 出 胰107

島 細 胞 並 將 其 移 植 入 糖 尿 病 病 人 的 肝 臟 中 , 使 其 生 產 胰 島 素11 。 其 結 果 顯 示 , 部 分 病 人可 不 再 使 用 胰 島 素 而 過 著 健 康 的 生 活 。 此 研 究 證 明 , 胰 島 細 胞 移 植 是 治 療 糖 尿 病 的 有 效方 式 。 但 是 , 這 個 治 療 方 式 仍 然 受 限 於 胰 島 細 胞 的 取 得 不 易 , 兩 位 器 官 捐 贈 者 身 上 所 取得 的 胰 島 細 胞 , 僅 足 夠 給 予 一 位 糖 尿 病 病 人 。 若 能 利 用 人 類 幹 細 胞 , 誘 導 其 成 為 胰 島 細胞 , 並 進 行 大 量 培 養 , 再 結 合 這 項 移 植 技 術 , 對 糖 尿 病 的 治 療 將 會 是 一 大 突 破 。根 據 2007 年 四 月 「 美 國 醫 學 會 」 期 刊 的 報 導 ,Voltarelli 醫 師 所 率 領 的 醫 療 群 , 進行 了 一 項 小 型 的 幹 細 胞 人 體 治 療 計 畫12 , 這 項 成 果 讓 第 一 型 糖 尿 病 患 者 在 幾 個 月 內 都 不需 要 接 受 任 何 治 療 , 這 是 第 一 次 發 現 , 可 以 不 必 補 充 胰 島 素 治 療 第 一 型 糖 尿 病 的 方 法 ,也 是 許 多 試 圖 利 用 細 胞 治 療 法 阻 斷 , 第 一 期 糖 尿 病 病 情 惡 化 的 第 一 項 成 果 。這 份 報 告 中 指 出 , 一 共 有 十 五 位 被 診 斷 為 第 一 型 糖 尿 病 的 患 者 , 這 些 接 受 治 療 的 患者 , 年 齡 從 14 歲 到 31 歲 , 這 些 病 患 先 注 射 cyclophosphamide 及 顆 粒 球 細 胞 生 長 刺 激素 (granulocyte colony-stimulating factor), 刺 激 病 人 的 骨 髓 製 造 幹 細 胞 , 並 釋 放 到 周邊 血 液 中 , 再 由 醫 護 人 員 收 集 週 邊 血 處 理 後 注 入 患 者 體 內 。 經 7 到 36 個 月 的 療 程 後 ,檢 測 血 中 醣 化 血 色 素 (hemoglobin A 1C ) 及 peptide C 等 生 化 值 , 確 定 有 十 三 人 可 以 不必 再 注 射 胰 島 素 並 且 可 維 持 正 常 生 活 。 其 中 一 名 患 者 甚 至 長 達 三 年 , 沒 有 使 用 任 何 控 制血 糖 的 綜 合 胰 島 素 。 它 初 期 顯 現 的 結 果 令 人 振 奮 , 除 了 前 述 的 益 處 外 , 副 作 用 也 很 低 ,只 有 一 例 引 起 肺 炎 , 另 兩 例 出 現 內 分 泌 失 調12 , 我 們 也 期 望 , 大 規 模 的 人 體 試 驗 可 以 儘速 展 開 , 確 認 此 治 療 的 安 全 性 , 使 得 第 一 型 糖 尿 病 患 者 , 可 因 接 受 這 一 項 治 療 , 不 必 再長 期 忍 受 治 療 或 併 發 症 之 苦 。以 造 血 幹 細 胞 進 行 基 因 療 法 治 療 嚴 重 複 合 性 免 疫 缺 陷 症造 血 幹 細 胞 為 懸 浮 性 細 胞 , 可 經 血 流 傳 輸 , 因 此 可 以 利 用 造 血 幹 細 胞 進 行 前 述 的細 胞 療 法 修 補 受 損 細 胞 及 組 織 。 目 前 另 一 個 重 要 的 醫 療 議 題 是 使 用 造 血 幹 細 胞 進 行 基 因治 療 (gene therapy)。 因 為 利 用 造 血 幹 細 胞 做 為 基 因 治 療 的 靶 細 胞 (target cell), 有著 勝 過 以 其 他 細 胞 做 為 靶 細 胞 的 優 點 , 例 如 造 血 幹 細 胞 具 有 自 我 更 新 與 分 化 的 能 力 , 能解 決 外 源 基 因 無 法 長 期 表 現 的 問 題 ; 且 當 造 血 幹 細 胞 分 化 為 血 液 細 胞 後 , 其 細 胞 是 屬 於全 身 性 的 分 布 與 循 環 能 夠 達 到 最 大 範 圍 的 基 因 修 正 , 因 此 當 前 許 多 基 因 治 療 的 計 畫 都 是以 造 血 幹 細 胞 為 主 要 的 研 究 對 象 。世 界 上 第 一 個 基 因 治 療 的 臨 床 試 驗 是 在 1990 年 於 美 國 進 行 , 由 安 德 生 (FrenchAnderson ) 主 持 , 對 象 為 一 患 了 嚴 重 複 合 性 免 疫 缺 陷 症 (severe combinedimmunodeficiency disease, SCID) 的 女 孩 13 , 患 者 因 腺 苷 酸 脫 胺 酶 (adenosinedeaminase deficiency, ADA) 的 缺 乏 , 而 造 成 免 疫 功 能 喪 失 。1990 年 9 月 美 國 安 德 生 等人 , 將 這 位 病 童 本 身 的 血 液 中 T 細 胞 取 出 , 利 用 病 毒 將 正 常 的 ADA 基 因 導 入 細 胞 , 並 將帶 有 修 復 基 因 的 自 體 細 胞 送 回 體 內 , 經 四 年 治 療 後 確 實 能 維 持 病 人 生 命 , 治 療 後 患 者 的T 細 胞 數 目 上 升 , 細 胞 和 體 液 免 疫 功 能 及 臨 床 症 狀 有 明 顯 改 善 , 且 隨 後 五 年 仍 能 測 得 轉入 載 體 的 序 列 , 其 他 免 疫 指 標 檢 測 也 證 實 基 因 治 療 長 期 的 效 果 。在 幹 細 胞 基 因 治 療 最 受 注 目 的 病 例 , 是 法 國 醫 師 Alain Fischer 對 俗 稱 泡 泡 兒 的 疾 病做 的 治 療 , 泡 泡 兒 也 是 一 種 肇 因 於 X 性 聯 遺 傳 缺 陷 的 「 嚴 重 型 合 併 性 免 疫 不 足 症 」108

(SCID-X1), 這 種 病 症 係 因 為 X 染 色 體 的 伽 瑪 c 鏈 (γ- c chain) 基 因 有 缺 陷 , 造 成 免 疫系 統 的 T 與 B 細 胞 死 亡 而 免 疫 力 喪 失 , 即 使 是 輕 微 的 細 菌 感 染 就 可 能 讓 病 嬰 喪 命 。 胎 兒 出生 三 個 月 後 即 可 能 發 病 , 會 有 反 覆 的 黴 菌 、 細 菌 感 染 , 肺 部 也 因 原 蟲 感 染 而 氣 喘 , 通 常都 活 不 過 一 歲 。 傳 統 上 治 療 SCID-X1 係 採 用 骨 髓 移 植 , 可 是 療 程 長 而 且 未 必 都 能 成 功 。Fischer 率 領 的 醫 療 團 隊 治 療 的 流 程 是 先 抽 出 病 童 的 骨 髓 , 篩 出 病 童 自 體 的 表 現 CD34+的 造 血 幹 細 胞 , 然 後 讓 幹 細 胞 浸 泡 在 含 多 種 蛋 白 質 溶 液 中 , 使 之 容 易 接 受 基 因 轉 殖 。 他利 用 反 轉 錄 病 毒 gamma-retroviral vector 作 為 載 體 , 把 泡 泡 兒 所 缺 乏 的 正 常 伽 瑪 c 鏈 基 因置 入 該 無 害 的 病 毒 中 , 並 在 培 養 皿 中 讓 病 兒 的 幹 細 胞 感 染 攜 帶 基 因 的 病 毒 , 再 把 幹 細 胞植 回 病 童 體 內 。 藉 這 種 修 正 基 因 缺 陷 的 方 式 , 達 到 治 療 目 的 。Fischer 的 研 究 團 隊 , 在 2000 14-16 年 起 陸 續 發 表 了 利 用 上 述 方 法 作 基 因 治 療 而 植 入骨 髓 幹 細 胞 的 成 功 案 例 , 這 些 臨 床 治 療 的 病 例 中 有 十 名 接 受 基 因 療 法 的 病 童 , 其 中 九 名在 臨 床 症 狀 上 有 明 顯 的 改 善 , 已 能 過 正 常 生 活 , 是 至 今 唯 一 用 基 因 療 法 克 服 的 絕 症 。 但後 續 的 觀 察 又 發 現 , 一 名 在 嬰 兒 期 治 癒 的 病 童 , 約 三 歲 時 出 現 白 血 病 症 狀 , 不 久 之 後 又出 現 第 二 起 案 例 , 此 種 利 用 造 血 幹 細 胞 進 行 的 基 因 療 法 , 因 兩 名 法 國 嬰 兒 出 現 白 血 病 而遭 到 質 疑 , 這 兩 起 變 成 白 血 病 的 案 例 , 皆 因 轉 入 的 病 毒 本 來 攜 帶 有 正 常 的 伽 瑪 c 的 基 因 ,但 是 正 常 的 基 因 插 入 到 靠 近 骨 髓 細 胞 的 LMO2 源 致 癌 症 基 因 (proto-oncogene) 的 啟 動子 區 域 中 , 科 學 家 推 論 這 兩 個 基 因 產 生 協 同 作 用 導 致 T 細 胞 不 正 常 增 生 。 而 在 英 國 倫 敦Trasherg 率 領 的 的 醫 療 團 隊 對 SCID-X1 進 行 人 體 治 療 的 四 個 病 例 17 , 目 前 尚 未 傳 出 失 敗的 消 息 , 但 是 由 於 曾 有 前 車 之 鑑 , 這 些 病 例 需 要 更 長 時 間 的 觀 察 , 等 這 些 泡 泡 兒 年 紀 更大 而 且 SCID 未 復 發 , 才 能 斷 言 病 已 治 癒 。目 前 , 全 世 界 正 在 熱 烈 討 論 這 些 外 在 基 因 應 用 在 基 因 治 療 , 是 否 會 在 人 體 其 他 部 位造 成 突 變 或 導 致 其 他 疾 病 產 生 ? 然 而 , 應 用 基 因 治 療 這 種 最 尖 端 的 醫 學 生 物 技 術 治 癒 遺傳 病 的 夢 想 , 似 乎 已 經 在 初 步 的 成 功 經 驗 , 點 亮 了 一 盞 明 燈 , 但 後 續 可 能 的 副 作 用 仍 待更 充 足 的 前 臨 床 科 學 試 驗 , 證 明 創 新 療 法 的 有 效 性 及 安 全 性 。聖 路 易 華 盛 頓 大 學 醫 學 院 , 在 2003 年 五 月 的 的 血 液 (Blood) 期 刊 裡 正 式 發 表 的 研究 報 告 指 出 , 骨 髓 或 臍 帶 血 裡 發 現 的 幹 細 胞 將 可 利 用 於 治 療 人 類 因 肝 硬 化 、 病 毒 感 染 、腫 瘤 、 化 學 治 療 或 放 射 治 療 所 引 起 的 肝 臟 肝 細 胞 缺 損 。 雖 然 整 個 實 驗 在 免 疫 缺 乏 的 實 驗鼠 身 上 進 行 , 但 實 驗 的 結 果 顯 示 人 類 的 幹 細 胞 可 以 正 常 的 產 生 血 球 細 胞 也 能 再 受 損 的 肝臟 裡 產 生 類 似 肝 臟 細 胞 的 細 胞 體 18 。現 今 全 球 每 年 約 進 行 3 萬 例 造 血 幹 細 胞 移 植 , 其 中 白 血 病 患 者 佔 1/3、 淋 巴 癌 佔 1/3強 、 原 位 癌 約 20%、 嚴 重 再 生 不 良 貧 血 約 2%, 其 餘 各 類 先 天 性 孩 童 疾 病 佔 3%。 故 骨髓 幹 細 胞 移 植 可 治 療 非 惡 性 疾 病 , 普 遍 施 行 於 嚴 重 性 再 生 不 良 性 貧 血 及 地 中 海 性 貧 血 ,亦 可 救 治 惡 性 疾 病 如 白 血 病 等 , 其 他 可 以 應 用 造 血 幹 細 胞 的 移 植 治 療 的 疾 病 還 包 括 : 嚴重 複 合 免 疫 缺 陷 症 、 慢 性 肉 芽 腫 、 紅 斑 性 狼 瘡 、 風 濕 性 關 節 炎 及 多 發 性 硬 化 症 等 。造 血 幹 細 胞 除 了 具 有 恢 復 造 血 的 功 能 外 , 還 有 能 夠 攻 擊 腫 瘤 細 胞 的 特 性 , 在 臨 床 上針 對 患 有 轉 移 性 腎 癌 的 病 患 進 行 異 體 造 血 幹 細 胞 的 移 植 時 發 現 約 有 一 半 患 者 的 腫 瘤 體積 會 縮 小 。 目 前 推 測 其 可 能 原 因 , 在 於 雖 然 病 患 體 內 的 腫 瘤 能 夠 躲 過 自 體 免 疫 系 統 的 攻擊 而 長 大 , 然 而 新 移 植 的 異 體 造 血 幹 細 胞 能 夠 在 病 患 體 內 建 立 新 的 免 疫 系 統 , 並 具 有 對109

癌 細 胞 進 行 毒 殺 的 能 力 , 也 就 是 進 而 抑 制 腫 瘤 的 生 長 甚 至 消 滅 腫 瘤 。 目 前 這 類 的 研 究 已經 擴 展 到 其 他 原 位 腫 瘤 的 治 療 包 括 肺 癌 、 前 列 腺 癌 、 卵 巢 癌 、 結 腸 癌 、 食 道 癌 、 肝 癌 與胰 腺 癌 等 。 在 人 類 心 臟 病 治 療 上 , 美 國 、 德 國 及 巴 西 等 地 也 陸 續 傳 出 成 功 利 用 病 患 之 自身 骨 髓 幹 細 胞 , 直 接 打 入 病 患 動 脈 , 成 功 的 將 病 患 骨 髓 幹 細 胞 轉 換 成 心 臟 肌 肉 細 胞 , 進而 恢 復 病 患 心 臟 機 能 。(b). 間 葉 幹 細 胞 之 臨 床 應 用間 葉 幹 細 胞 主 要 存 在 於 人 體 骨 髓 中 , 除 了 骨 髓 之 外 , 間 葉 幹 細 胞 尚 可 取 自 許 多 其他 的 組 織 , 包 括 髓 質 骨 、 週 邊 血 液 、 脂 肪 、 皮 膚 、 胎 兒 血 液 、 胎 兒 肝 臟 、 胎 兒 骨 組 織 、肺 臟 、 臍 帶 血 等19-26 。 間 葉 幹 細 胞 能 夠 分 化 成 中 胚 層 的 各 種 組 織 細 胞 , 包 括 硬 骨 細 胞 、軟 骨 細 胞 、 脂 肪 細 胞 、 肌 肉 細 胞 , 甚 至 可 分 化 成 源 自 於 內 胚 層 的 肝 臟 細 胞 等 。 最 近 ,有 些 科 學 家 更 進 一 步 指 出 , 間 葉 幹 細 胞 極 可 能 存 在 於 人 類 所 有 組 織 當 中 , 而 它 們 的 存在 與 維 持 各 組 織 及 器 官 的 恆 定 有 關27 。間 葉 幹 細 胞 在 器 官 移 植 的 案 例 中 , 最 容 易 出 現 的 免 疫 相 關 併 發 症 , 是 移 植 捐 贈 者的 組 織 對 宿 主 的 產 生 排 斥 , 這 是 因 為 移 植 組 織 中 的 T 淋 巴 球 攻 擊 接 受 者 的 組 織 , 導 致 宿主 全 身 器 官 系 統 發 生 病 變 , 稱 為 移 植 物 對 抗 宿 主 疾 病 (Graft Versus Host Disease,GVHD), 最 終 可 使 宿 主 死 亡 , 臨 床 上 的 治 療 相 當 困 難 26 。 近 年 來 間 葉 幹 細 胞 具 有 特 殊的 免 疫 調 節 的 功 能 , 間 葉 幹 細 胞 的 第 一 型 組 織 相 容 性 複 合 體 (major histocompatibilitycomplex, MHC I) 表 現 量 低 而 第 二 型 組 織 相 容 性 複 合 體 不 表 現 , 並 且 可 抑 制 T 細 胞 及 B細 胞 的 增 生 28 29,2004 年 瑞 典 Le Blanc 醫 師 利 用 移 植 病 患 母 親 的 間 葉 幹 細 胞 , 成 功 地治 療 接 受 異 體 骨 髓 移 植 , 醫 治 血 癌 而 產 生 的 急 性 GVHD 的 男 童 。2006 年 Le Blanc 醫 師更 進 一 步 應 用 異 體 間 葉 幹 細 胞 移 植 以 治 療 急 性 嚴 重 GVHD 病 患 , 其 中 接 受 治 療 的 8 位 病患 有 6 位 治 療 成 功 , 類 似 成 功 的 案 例 在 中 國 醫 療 界 也 有 報 導 30-32 。間 葉 幹 細 胞 在 組 織 損 傷 的 修 復 治 療 上 也 不 斷 有 成 功 案 例 的 報 導 , 臨 床 上 第 一 次 成功 應 用 , 是 以 來 自 骨 髓 的 間 葉 幹 細 胞 , 治 療 俗 稱 玻 璃 娃 娃 的 成 骨 不 全 症 (osteogenesisimperfecta)。 成 骨 不 全 症 是 一 種 遺 傳 疾 病 , 無 法 正 常 地 製 造 第 一 型 膠 原 蛋 白 , 造 成 骨質 極 端 脆 弱 且 易 斷 裂 , 患 此 種 病 的 孩 童 會 出 現 畸 形 及 身 材 矮 小 的 症 狀 。1999 年 由 美 國Horwitz 等 醫 師 為 3 位 成 骨 不 全 孩 童 進 行 骨 髓 的 間 葉 幹 細 胞 移 植 治 療 , 經 三 個 月 後 於患 者 骨 小 梁 中 可 偵 測 到 輸 入 的 成 骨 細 胞 , 骨 中 礦 物 質 增 加 21-29 公 克 , 對 此 病 的 症 狀有 了 初 步 的 治 療 成 果33 。 日 本 、 美 國 等 醫 療 團 隊 分 別 應 用 骨 髓 中 間 葉 幹 細 胞 治 療 骨 性關 節 炎34,35 , 骨 髓 中 間 葉 幹 細 胞 的 移 植 也 用 於 治 療 心 肌 梗 塞 的 治 療 , 德 國 的 Wollerket醫 師 治 療 團 隊 將 60 位 心 肌 梗 塞 的 病 人 分 成 2 組 , 其 中 30 人 以 藥 物 治 療 的 控 制 , 其 餘30 人 則 採 用 自 體 骨 髓 細 胞 作 治 療 , 注 入 骨 髓 細 胞 的 病 患 心 肌 梗 塞 區 域 的 心 臟 細 胞 收 縮功 能 有 提 高 , 且 治 療 過 程 沒 有 副 作 用 發 生 的 作 用36 。 中 國 的 陳 醫 師 也 應 用 病 患 自 體 骨髓 純 化 的 間 葉 幹 細 胞 , 對 69 名 心 肌 梗 塞 的 患 者 作 治 療 , 也 有 效 的 改 善 病 患 的 心 臟 功能37 。間 葉 幹 細 胞 應 用 在 脊 髓 損 傷 的 病 例 , 也 同 時 是 異 體 間 葉 幹 細 胞 移 植 的 世 界 首 例 由南 韓 醫 師 Kang 於 2005 發 表 於 Cytotherapy 期 刊 。 這 個 醫 療 團 隊 為 一 位 37 歲 因 為 車110

禍 導 致 第 十 胸 椎 骨 折 合 併 脊 髓 損 傷 , 而 導 致 下 肢 癱 瘓 的 女 性 , 進 行 配 對 異 體 臍 帶 血 間葉 幹 細 胞 移 植 。 手 術 後 病 患 確 實 在 癱 瘓 19 年 之 後 能 夠 站 起 來 走 了 幾 步 , 這 項 初 步 的研 究 結 果 也 受 到 世 界 媒 體 的 重 視 及 廣 泛 報 導 。 然 而 , 這 位 病 患 在 幹 細 胞 移 植 術 後 幾 個月 並 無 法 再 行 走 , 且 伴 隨 有 無 法 忍 受 的 疼 痛 , 這 種 移 植 失 敗 的 原 因 至 今 尚 不 清 楚38,39 。相 較 於 大 部 分 成 體 幹 細 胞 , 間 葉 幹 細 胞 具 有 極 佳 的 自 我 更 新 以 及 增 生 的 能 力 , 除了 能 做 為 疾 病 治 療 用 的 細 胞 源 頭 之 外 , 間 葉 幹 細 胞 亦 已 開 始 被 應 用 於 基 因 治 療 的 研 究中 , 科 學 家 可 以 將 經 過 修 飾 的 基 因 細 胞 與 間 葉 幹 細 胞 融 合 , 或 是 將 目 標 基 因 直 接 轉 殖到 間 葉 幹 細 胞 中 , 再 植 入 自 體 的 組 織 中 進 行 修 復 及 治 療 的 工 作 。 嘗 試 用 間 葉 幹 細 胞 治療 的 疾 病 還 包 括 脊 髓 神 經 損 傷 、 腦 血 管 疾 病 , 帕 金 森 氏 症 及 阿 茲 海 默 氏 症 等 神 經 疾 患 ,間 葉 幹 細 胞 同 時 也 發 展 於 治 療 心 肺 疾 病 的 應 用 , 如 心 肌 梗 塞 , 心 血 管 疾 病 或 因 石 綿 或多 囊 性 纖 維 化 引 致 的 肺 纖 維 化 疾 病 ; 間 葉 幹 細 胞 也 被 應 用 來 做 骨 骼 、 肌 肉 或 軟 骨 缺 損的 治 療 , 目 前 間 葉 幹 細 胞 的 基 礎 研 究 在 很 多 疾 病 的 治 療 上 , 已 經 建 立 很 好 的 動 物 研 究模 式 , 相 信 臨 床 的 應 用 也 將 會 也 陸 續 看 到 成 效 。2. 胚 胎 幹 細 胞 之 臨 床 應 用胚 胎 幹 細 胞 具 有 較 成 人 幹 細 胞 強 的 分 裂 能 力 , 而 且 可 在 培 養 皿 中 長 期 培 養 。 但 是 並不 表 示 將 其 大 量 培 養 , 再 分 送 給 其 他 實 驗 室 培 養 , 即 可 無 限 制 的 增 殖 或 順 利 分 化 。 因 為分 離 胚 胎 幹 細 胞 的 程 序 若 有 所 不 同 , 其 將 來 分 化 成 各 種 細 胞 型 的 潛 力 會 不 同 。 此 外 胚 胎幹 細 胞 經 體 外 長 期 培 養 後 , 會 累 積 一 些 無 法 回 復 的 變 化 , 而 且 培 養 的 條 件 不 同 , 這 種 變化 的 累 積 速 度 也 會 不 同 。 胚 胎 幹 細 胞 可 能 會 因 為 這 些 原 因 , 而 失 去 分 化 成 某 些 細 胞 的 能力40 。 因 此 , 長 期 在 體 外 培 養 的 胚 胎 幹 細 胞 株 應 用 於 臨 床 治 療 時 , 細 胞 株 本 身 的 特 性 必須 相 當 穩 定 , 而 且 在 繼 代 培 養 的 過 程 也 必 須 經 常 的 檢 測 這 些 細 胞 株 的 特 性 或 染 色 體 等 是否 有 因 體 外 培 養 刺 激 所 造 成 的 變 異 , 而 且 不 同 的 胚 胎 幹 細 胞 株 本 身 的 生 長 速 率 及 特 性 也不 完 全 相 同 , 筆 者 與 工 研 院 合 作 建 立 的 7 株 人 類 胚 胎 幹 細 胞 即 有 觀 察 到 此 現 象 。胚 胎 幹 細 胞 的 第 一 型 人 類 白 血 球 抗 原 (HLA calss I) 表 現 量 低 且 第 二 型 人 類 白 血 球抗 原 (HLA calss II) 不 會 表 現 , 雖 然 這 種 表 現 較 低 的 白 血 球 抗 原 的 特 性 可 能 與 腫 瘤 的生 成 時 的 免 疫 逃 脫 有 關41 , 不 過 也 有 學 者 提 出 已 分 化 的 胚 胎 幹 細 胞 仍 具 有 免 疫 的 特 性42 。 以 全 世 界 目 前 已 經 建 立 的 約 150 株 的 胚 胎 幹 細 胞 , 似 乎 很 難 對 全 世 界 上 龐 大 需 要 幹細 胞 移 植 治 療 的 患 者 達 到 配 對 成 功 的 目 的 , 因 此 解 決 之 道 可 以 利 用 操 作 基 因 的 方 式 剔 除MHC class I 及 MHC II 基 因 , 或 者 建 立 更 多 胚 胎 幹 細 胞 株 以 增 加 具 MHC 相 容 的 胚 胎幹 細 胞 株 的 機 會 , 更 多 的 學 者 建 議 使 用 「 體 細 胞 核 轉 植 術 」(Somatic Cell NuclearTransfer,SCNT), 這 種 技 術 是 指 從 病 人 體 身 上 取 出 體 細 胞 核 , 顯 微 注 射 進 入 一 個 去 核的 人 類 卵 子 中 , 再 以 電 流 刺 激 使 其 融 合 為 一 體 , 經 由 發 育 之 後 便 可 得 到 人 造 的 人 類 胚胎 , 不 需 經 由 精 卵 結 合 便 可 獲 得 胚 胎 , 故 為 無 性 生 殖 , 所 得 到 的 胚 胎 稱 之 為 「 體 細 胞 核轉 植 術 之 胚 胎 」( 圖 一 )。 在 體 外 培 育 成 囊 胚 後 進 行 病 人 胚 胎 幹 細 胞 的 建 立 , 然 後 以 這 個胚 胎 製 造 病 患 專 屬 的 胚 胎 幹 細 胞 株 , 再 進 行 進 一 步 體 外 誘 導 分 化 成 所 須 的 組 織 細 胞 以 供治 療 用 。 但 是 以 這 種 無 性 生 殖 方 法 產 生 的 胚 胎 幹 細 胞 , 在 臨 床 的 接 受 性 仍 有 技 術 瓶 頸 及應 用 的 爭 議 , 尤 其 是 成 熟 女 性 卵 子 的 來 源 在 倫 理 學 上 也 仍 有 相 當 大 的 討 論 空 間 。 對 於 分111

化 後 的 胚 胎 幹 細 胞 若 純 化 不 完 全 在 輸 入 體 內 治 療 時 , 未 分 化 的 細 胞 極 有 可 能 在 體 內 分 化成 無 法 控 制 的 畸 胎 瘤 , 這 種 狀 況 的 處 理 已 有 學 者 建 議 引 介 自 殺 基 因 至 胚 胎 幹 細 胞 , 以 消滅 未 分 化 的 多 功 能 細 胞 避 免 產 生 腫 瘤 的 危 機43 。現 有 的 體 外 研 究 或 動 物 實 驗 陸 續 證 實 胚 胎 幹 細 胞 可 以 應 用 在 遺 傳 、 損 傷 及 退 化 性 疾病 , 例 如 : 心 血 管 疾 病 、 肌 肉 萎 縮 及 神 經 損 傷 等 疾 病 , 但 是 現 今 尚 未 有 人 類 胚 胎 幹 細 胞應 用 於 臨 床 之 病 例 。 由 於 早 期 所 建 立 的 胚 胎 幹 細 胞 株 , 皆 是 以 小 鼠 胚 胎 纖 維 母 細 胞 為 滋養 層 細 胞 , 胚 胎 幹 細 胞 如 要 應 用 於 臨 床 , 該 胚 胎 幹 細 胞 株 必 須 完 全 建 立 於 無 異 種 動 物 來源 的 滋 養 層 細 胞 , 如 人 類 皮 膚 纖 維 母 細 胞 , 應 用 前 亦 須 確 認 無 動 物 病 毒 或 反 轉 錄 病 毒 的污 染 , 此 外 , 用 於 分 化 的 試 劑 或 培 養 液 也 必 須 符 合 臨 床 用 藥 的 品 質 , 才 能 用 於 臨 床 治 療44 45。 建 立 第 一 株 人 類 胚 胎 幹 細 胞 株 的 Thomson 領 導 的 團 隊 已 於 2006 46 年 發 表 , 在 無動 物 污 染 源 的 培 養 條 件 下 , 成 功 建 立 可 能 可 以 應 用 在 臨 床 等 級 人 類 胚 胎 幹 細 胞 株 , 筆 者也 積 極 的 朝 這 個 方 向 邁 進 , 相 信 不 久 的 將 來 胚 胎 幹 細 胞 在 臨 床 的 應 用 上 應 可 提 供 極 佳 的治 療 利 器 。圖 一 、 體 細 胞 核 轉 植 術 ( 資 料 來 源 : 李 茂 盛 婦 產 科 鄭 恩 惠 )(A). 將 自 願 者 捐 贈 卵 子 第 一 極 體 及 細 胞 核 以 顯 微 操 作 管 吸 出(B). 將 取 自 病 人 的 體 細 胞 核 , 以 顯 微 操 作 管 注 入 已 取 出 核 的 卵 子 中(C). 以 適 當 的 電 流 激 活 卵 子 與 病 人 體 細 胞 核 產 生 電 融 合(D). 以 體 外 培 養 方 式 繼 續 培 養 胚 胎 至 囊 胚 期 , 以 提 供 建 立 幹 細 胞四 、 幹 細 胞 之 臨 床 應 用 之 展 望在 基 礎 研 究 及 臨 床 治 療 上 , 幹 細 胞 具 有 極 大 的 潛 力 , 其 對 人 類 的 健 康 , 勢 必 能 夠 提 供 劃時 代 的 貢 獻 。 根 據 大 多 數 科 學 家 的 經 驗 , 老 鼠 與 人 類 的 差 異 並 不 小 , 因 此 這 部 分 的 突 破 仍 是幹 細 胞 的 研 究 重 心 。 近 年 來 科 學 家 在 成 體 幹 細 胞 的 研 究 與 應 用 上 , 有 令 人 驚 訝 的 發 展 , 如 成體 幹 細 胞 多 向 可 塑 性 的 發 現 , 雖 然 紓 解 了 應 用 治 療 性 複 製 的 迫 切 性 , 但 是 從 病 患 骨 髓 培 育 出此 類 似 多 能 幹 細 胞 的 成 功 率 仍 然 偏 低 , 距 離 實 質 的 治 療 仍 有 不 少 地 方 等 待 突 破 。 在 某 些 遺 傳112

性 缺 陷 疾 病 中 , 遺 傳 錯 誤 同 樣 出 現 於 病 人 的 幹 細 胞 中 , 這 樣 的 幹 細 胞 不 適 合 進 行 自 體 移 植 ,除 非 移 植 異 體 幹 細 胞 , 但 是 異 體 幹 細 胞 的 免 疫 排 斥 反 應 還 沒 有 完 全 得 到 解 決 。 另 一 方 面 , 在胚 胎 幹 細 胞 的 臨 床 應 用 上 也 有 許 多 需 一 一 克 服 的 困 難 , 首 先 是 胚 胎 幹 細 胞 的 取 得 , 各 國 政 府由 於 擔 心 此 技 術 被 使 用 於 複 製 人 , 因 此 於 對 新 胚 胎 幹 細 胞 建 立 的 採 用 圍 堵 的 政 策 , 但 是 站 在醫 療 的 角 度 上 , 我 們 應 該 主 動 地 為 正 在 遭 受 疾 病 痛 苦 煎 熬 的 病 患 , 謀 求 最 大 的 福 祉 。幹 細 胞 的 應 用 開 發 仍 在 當 前 全 球 最 尖 端 的 醫 學 中 心 進 行 中 , 臺 灣 的 醫 學 界 及 各 研 究 單 位的 醫 師 及 科 學 家 們 也 期 望 在 幹 細 胞 的 臨 床 應 用 上 有 更 多 的 突 破 , 儘 管 不 斷 改 進 幹 細 胞 人 工 誘導 的 定 向 分 化 技 術 、 組 織 工 程 技 術 , 以 及 各 種 動 物 實 驗 的 結 果 令 人 滿 意 , 我 們 仍 需 要 更 多 、更 嚴 謹 的 臨 床 研 究 , 期 能 使 幹 細 胞 成 為 一 完 整 安 全 的 新 醫 療 方 案 , 造 福 全 球 許 多 在 痛 苦 中 的生 活 病 患 。五 、 參 考 資 料1. Till J. E. & McCulloch, E. A. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mousebone marrow cells. Radiat Res. 14:213-22 (1969).2. Perry, D. Patient’ voices: The powerful sound in the stem cell debate. Science 287:1423 (2000).3. Gatti, R., Meuwissen, H., Allen, H., Hong, R. & Good, R. Immunological reconstitution ofsex-linked lymphopenic immunological deficiency. The Lancet 292:1366-1369 (1968).4 Bach, F., Albertini, R., Joo, P., Anderson,J. & Bortin, M. Bone-marrow transplantation in a patientwith the wiskott-aldrich syndrome. The Lancet 292:1364-1366 (1968).5. Barinaga, M. Fetal neuron grafts pave the way for stem cell therapies. Science 287:1421-1422(2000).6. Mimeault, M., Hauke, R. & Batra, S. K. Stem Cells: A Revolution in Therapeutics - Recentadvances in stem cell biology and their therapeutic applications in regenerative medicine andCancer Therapies. Clin Pharmacol Ther. 82:252-264 (2007).7. Thomas, E. & Clift, R. Hematopoietic Cell Transplantation. Thomas, E. D., Blume, K. G., Forman,S. J. (eds.), Blackwell Science, Malden, MA, 1999, pp. 807-816.8. Prentice, D. A. & Tarne, G. Treating disease with adult stem cell. Science 315: 328 (2007).9. Armitage, J. O. Bone marrow transplantation. N Engl J Med. 330:827-838 (1994).10. 巫 康 熙 . 臍 帶 血 移 植 . 婦 幼 關 懷 雜 誌 13:11-13 (2006).11. Smaglik, P. Diabetes therapy boosts stem-cell campaign. Nature 406:224 (2000).12. Voltarelli, J. C., Couri, C. B. E., Stracieri, A. B. P. L., Oliveira, M. C., Moraes, D. A., Pieroni, F.,Coutinho, M., Malmegrim, K.C.R., Foss-Freitas, M.C., Simões, B. P., Foss, M. C., Squiers, E. &Burt, R.K. Autologous Nonmyeloablative Hematopoietic Stem Cell Transplantation in NewlyDiagnosed Type 1 Diabetes Mellitus. J Ameri. Med. Assoc. 297:1568-1576 (2007).13. Blaese, R. M., Culver, K. W., Miller, A. D., Carter, C. S., Fleisher, T., Clerici, M., Shearer, G.,Chang, L., Chiang, Y., Tolstoshev, P., Greenblatt, J. J., Rosenberg, S. A., Klien, H., Berger, M.,Muller, C. A. , Ramsey, J. W., Muul, L., Morgan, R. A. & Anderson, W. F. Tlymphocyte-directedgene therapy for ADA deficiency SCID: Initial trial results after 4 years. Science 270:475-480113

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第 十 章幹 細 胞 治 療 研 究 與 臨 床 試 驗Clinical Trials and Advance Research for Stem Cell Therapies陳 婉 昕1陳 甫 州21工 業 技 術 研 究 院 生 技 醫 藥 所2台 中 榮 民 總 醫 院 醫 學 研 究 部 幹 細 胞 中 心一 、 前 言幹 細 胞 具 有 自 我 更 新 與 分 化 的 能 力 , 可 將 培 養 保 有 分 化 潛 能 的 幹 細 胞 分 化 為 成 熟 之 先 趨細 胞 及 組 織 細 胞 , 或 將 體 內 的 幹 細 胞 分 離 後 , 直 接 作 為 進 行 自 體 移 植 治 療 , 於 體 外 培 養 增 殖後 誘 導 其 分 化 , 都 具 有 臨 床 應 用 極 大 的 潛 力 。 由 於 目 前 全 球 幹 細 胞 治 療 的 積 極 研 發 , 許 多 醫藥 或 是 醫 療 技 術 尚 無 法 完 全 治 療 的 重 症 , 如 心 臟 衰 竭 、 巴 金 森 氏 症 、 脊 髓 損 傷 或 腦 中 風 等 患者 , 都 對 未 來 幹 細 胞 的 醫 療 應 用 寄 予 厚 望 , 希 望 幹 細 胞 能 為 這 些 疾 病 帶 來 一 線 曙 光1,2 。 幹 細胞 因 為 取 得 來 源 、 分 化 潛 力 之 不 同 , 具 有 不 同 之 特 性 , 故 在 臨 床 應 用 上 與 發 展 時 程 也 各 不 相同 , 成 體 幹 細 胞 雖 然 分 化 能 力 較 有 限 , 較 不 易 於 體 外 長 期 培 養 增 生 , 但 是 因 其 可 能 自 體 取 得 ,或 是 異 體 移 植 時 已 累 積 數 十 年 的 臨 床 配 對 與 治 療 經 驗 , 直 接 可 因 應 血 液 疾 病 治 療 上 的 需 求 ,所 以 , 現 階 段 幹 細 胞 移 植 醫 療 應 用 , 以 成 體 幹 細 胞 移 植 手 術 或 臨 床 試 驗 為 主 , 這 些 移 植 幹 細胞 的 主 要 來 源 包 括 取 自 骨 髓 、 周 邊 血 液 及 臍 帶 血 中 之 血 液 幹 細 胞 與 間 葉 幹 細 胞 ,1999 年 以 前血 液 幹 細 胞 移 植 手 術 還 是 以 骨 髓 移 植 手 術 為 主 , 但 是 , 骨 髓 移 植 手 術 數 量 已 開 始 遞 減 , 取 而代 之 的 是 周 邊 血 液 移 植 手 術 則 有 漸 增 的 數 量 , 目 前 周 邊 血 液 移 植 手 術 與 骨 髓 移 植 手 術 數 量 大約 是 6:4, 同 時 也 開 始 有 臍 帶 血 移 植 手 術 , 最 近 五 年 來 臍 帶 血 移 植 手 術 則 是 有 漸 增 的 趨 勢 。至 於 間 葉 幹 細 胞 的 臨 床 試 驗 則 有 日 趨 重 要 , 目 前 正 在 執 行 或 已 完 成 的 間 葉 幹 細 胞 臨 床 試 驗 已有 16 個 , 其 中 包 括 以 治 療 移 植 物 抗 宿 主 病 (GVHD) 六 個 和 急 性 心 肌 梗 塞 四 個 臨 床 試 驗 為 主 。人 胚 幹 細 胞 於 1998 年 底 才 成 功 被 分 離 培 養3 , 具 有 廣 大 之 分 化 潛 能 , 可 分 化 為 成 體 二 百 六 十餘 種 成 熟 細 胞 , 胚 幹 細 胞 在 體 外 易 於 培 養 增 殖 , 但 未 分 化 狀 態 之 細 胞 , 可 能 有 在 體 內 形 成 畸胎 瘤 或 癌 化 之 風 險 , 所 以 其 臨 床 應 用 需 先 經 過 誘 導 分 化 之 步 驟 , 以 降 低 上 述 之 缺 點 , 除 此 之外 , 在 進 行 異 體 移 殖 時 還 可 能 產 生 免 疫 排 斥 等 問 題 尚 待 解 決 , 是 研 發 中 的 主 要 課 題 , 雖 然 成體 幹 細 胞 要 進 行 異 體 移 殖 亦 需 解 決 免 疫 排 斥 之 問 題 , 但 是 在 臨 床 應 用 上 已 經 有 相 當 多 的 經 驗能 克 服 這 些 問 題 , 近 年 來 , 間 葉 幹 細 胞 之 研 究 也 有 助 於 解 決 免 疫 排 斥 之 問 題 , 人 胚 幹 細 胞 研究 因 為 起 步 晚 , 所 以 臨 床 應 用 之 發 展 時 程 將 會 較 慢 些 , 但 是 人 胚 幹 細 胞 具 備 絕 佳 之 發 展 潛 能 ,包 括 糖 尿 病 、 心 臟 血 管 疾 病 、 血 液 疾 病 、 肝 臟 疾 病 、 神 經 退 化 性 疾 病 或 對 目 前 常 規 方 法 難 以見 效 的 其 他 疾 病 , 都 可 能 囊 括 在 其 研 究 之 領 域 , 幹 細 胞 臨 床 試 驗 與 研 究 範 圍 廣 闊 , 研 究 內 涵117

與 許 多 最 新 進 展 也 日 新 月 異 無 法 一 一 介 紹 , 本 章 將 就 幹 細 胞 在 重 要 的 臨 床 應 用 領 域 與 研 究 現況 做 一 簡 單 之 概 述 。二 、 幹 細 胞 臨 床 醫 療 應 用 之 關 鍵 因 素要 進 行 幹 細 胞 臨 床 治 療 , 必 須 先 考 慮 幾 個 關 鍵 因 素4 , 包 括 : 所 使 用 的 幹 細 胞 種 類 、 足 夠 的細 胞 數 以 及 純 度 、 細 胞 植 入 體 內 的 方 式 和 免 疫 排 斥 問 題 。1. 所 使 用 的 幹 細 胞 種 類 :不 同 的 幹 細 胞 具 有 不 同 特 性 , 治 療 時 施 行 方 式 與 考 量 也 有 不 同 , 所 以 將 來 要 應 用 於 細 胞移 植 醫 療 時 , 所 要 開 發 的 技 術 重 點 也 不 盡 相 同 。 成 體 幹 細 胞 研 究 與 應 用 歷 史 最 久 , 包 括 取 自骨 髓 、 周 邊 血 液 、 骨 骼 肌 與 胎 兒 組 織 的 幹 細 胞 , 因 可 取 自 病 患 直 接 進 行 移 植 醫 療 , 沒 有 免 疫排 斥 或 移 植 細 胞 傳 染 病 原 之 問 題 , 成 為 最 早 使 用 於 臨 床 再 生 醫 學 之 用 途 , 但 是 , 也 因 其 不 易於 體 外 長 期 培 養 增 殖 , 且 分 化 能 力 較 為 有 限 , 故 不 能 適 用 於 所 有 壞 損 組 織 之 修 復 。 目 前 已 有臨 床 應 用 者 如 取 自 骨 髓 或 臍 帶 血 之 血 液 幹 細 胞 (Hematopoietic Stem Cells, HSCs) 治 療 血液 疾 病 , 除 了 血 液 幹 細 胞 以 外 , 目 前 比 較 有 潛 能 之 成 體 細 胞 為 間 葉 幹 細 胞 (MesenchymalStem Cell, MSC), 此 類 幹 細 胞 存 在 於 骨 髓 、 臍 帶 血 、 臍 帶 、 脂 肪 組 織 、 羊 水 胎 盤 等 , 目 前多 為 取 自 骨 髓 , 間 葉 幹 細 胞 可 被 誘 導 分 化 成 為 軟 骨 、 硬 骨 、 脂 肪 、 肌 肉 及 神 經 等 組 織 細 胞 ,目 前 已 有 臨 床 試 驗 進 行 修 復 軟 硬 骨 、 心 肌 等 。 此 外 , 因 其 具 有 免 疫 調 節 功 能 , 亦 有 應 用 於 治療 移 植 之 免 疫 細 胞 對 宿 主 之 排 斥 (GVHD), 或 應 用 於 異 體 移 植 修 復 心 肌 梗 塞 造 成 之 心 肌 壞 死者5,11 。人 胚 幹 細 胞 (human embryonic stem cells) 為 一 種 取 自 發 育 4 至 5 天 囊 胚 期(blastocysts) 之 內 細 胞 團 塊 (inner cell mass) 所 建 立 而 成 的 細 胞 株 , 具 有 全 能 分 化 潛 力之 幹 細 胞 (pluriopotent stem cells), 在 胚 胎 發 育 時 期 能 發 育 成 三 胚 層 , 包 括 外 胚 層 細 胞 、 中胚 層 細 胞 及 內 胚 層 細 胞 以 及 生 殖 細 胞 , 並 能 進 一 步 發 育 組 成 成 體 所 有 二 百 六 十 餘 種 細 胞 , 而且 它 可 在 體 外 複 製 、 增 生 , 仍 保 有 可 分 化 成 人 體 各 種 器 官 與 組 織 細 胞 的 能 力 , 故 具 有 醫 療 應用 之 潛 力 。 但 是 由 於 目 前 取 得 來 源 為 體 外 受 精 之 卵 子 , 必 需 克 服 社 會 倫 理 道 德 之 疑 慮 , 在 實際 操 作 上 也 遇 到 相 當 大 的 困 難 , 是 必 需 面 對 的 問 題 。 因 為 於 1998 年 才 成 功 被 分 離 培 養 , 人胚 幹 細 胞 之 研 發 使 用 時 程 較 短 , 各 國 均 投 入 大 量 資 源 投 入 其 研 發 , 法 規 也 漸 漸 鬆 綁 。 其 特 性雖 可 於 體 外 長 期 培 養 增 生 而 仍 保 有 分 化 潛 能 , 但 未 分 化 狀 態 之 細 胞 , 可 能 會 在 體 內 形 成 畸 胎瘤 , 在 各 國 科 學 家 積 極 研 發 之 下 , 已 瞭 解 一 旦 胚 幹 細 胞 分 化 , 可 能 就 失 去 形 成 畸 胎 瘤 的 能 力 ,所 以 其 臨 床 應 用 可 先 經 過 誘 導 分 化 之 步 驟 , 在 安 全 性 上 就 比 較 能 被 接 受 。 目 前 研 發 時 程 上 ,已 有 許 多 體 外 誘 導 分 化 之 報 導 , 如 圖 一 所 示 , 人 胚 幹 細 胞 可 於 體 外 誘 導 分 化 為 早 期 之 神 經 細胞 , 近 一 、 二 年 並 進 展 至 臨 床 前 動 物 試 驗 , 部 分 研 究 已 證 實 分 化 之 細 胞 移 植 於 動 物 體 內 , 可修 復 壞 損 之 組 織 功 能 , 例 如 由 人 胚 幹 細 胞 分 化 為 寡 突 細 胞 (oligodendrocytes) 純 度 超 過98%, 移 植 大 鼠 受 損 之 脊 髓 , 可 幫 助 急 性 脊 髓 損 傷 神 經 再 生 與 運 動 功 能 之 恢 復6 。 除 此 之 外 ,針 對 免 疫 排 斥 之 問 題 、 各 種 細 胞 之 臨 床 研 發 與 應 用 實 例 , 將 於 之 後 再 詳 述 。118

A. C.Pax6Neural rosettesB. D.Map2 NF-H DAPI圖 一 、 人 胚 幹 細 胞 株 TW1( 工 業 技 術 研 究 院 與 李 茂 盛 婦 產 科 合 作 建 立 ) 以 及 其 於 體 外被 誘 導 分 化 成 早 期 神 經 細 胞 ( 工 業 技 術 研 究 院 )。A.B. 未 分 化 狀 態 之 人 胚 幹 細 胞 TW1 於倒 立 式 光 學 顯 微 鏡 下 之 型 態 。 刻 度 單 位 為 200 um。C.D. 於 體 外 誘 導 TW1 分 化 為 神 經 譜系 之 細 胞 後 , 以 免 疫 螢 光 法 偵 測 分 化 細 胞 表 現 早 期 神 經 細 胞 標 記 , 包 括 PAX6 綠 色 螢 光(C.), MAP2(D.) 以 及 紅 色 螢 光 NF-H 的 表 現 情 形 ,D 圖 並 用 DAPI 將 細 胞 核 染 色 。型 態 上 可 見 neural rosettes(C.) 與 神 經 突 觸 (D.)( 圖 片 由 工 業 技 術 研 究 院 計 畫 執 行 單位 生 醫 所 提 供 )2. 足 夠 的 細 胞 數 以 及 純 度依 照 要 修 復 的 組 織 與 功 能 , 所 需 之 細 胞 數 不 盡 相 同 , 例 如 脊 髓 損 傷 與 心 肌 修 復 所 需 之 細胞 數 目 , 差 距 很 大 , 所 以 必 須 仔 細 考 量 , 於 臨 床 前 動 物 試 驗 中 找 出 適 當 範 圍 , 才 可 能 進 行 臨床 試 驗 , 另 外 如 前 所 述 , 不 同 細 胞 特 性 不 同 , 胚 幹 細 胞 之 應 用 必 須 經 過 分 化 誘 導 , 如 何 誘 導分 化 , 要 誘 導 為 何 種 細 胞 , 誘 導 的 比 率 與 純 度 為 何 , 那 個 分 化 階 段 的 細 胞 , 才 能 達 到 移 植 醫療 之 效 果 , 都 是 很 重 要 的 議 題 , 必 須 仔 細 研 究 , 而 成 體 幹 細 胞 也 有 可 能 需 要 經 過 適 當 的 純 化步 驟 , 如 何 取 得 足 夠 所 需 之 特 性 的 幹 細 胞 , 是 幹 細 胞 臨 床 醫 療 應 用 重 要 的 課 題 。3. 細 胞 植 入 體 內 的 方 式依 受 損 部 位 之 不 同 , 需 考 慮 植 入 細 胞 之 方 式 , 血 液 疾 病 之 治 療 可 經 由 靜 脈 注 射 幹 細 胞 ,其 他 組 織 疾 病 者 , 則 可 以 直 接 將 細 胞 注 射 於 受 損 部 位 , 例 如 可 用 心 導 管 將 幹 細 胞 定 位 移 植 到心 肌 壞 死 之 心 臟 部 位 、 或 直 接 定 位 移 植 導 入 中 風 或 脊 髓 損 傷 部 位 、 或 利 用 生 物 可 降 解 薄 膜 之119

包 埋 技 術 , 然 而 在 這 些 特 殊 部 位 幹 細 胞 的 存 活 率 仍 待 探 討 , 如 何 有 效 施 打 或 移 植 細 胞 到 所 要部 位 , 而 不 致 有 太 多 幹 細 胞 隨 液 體 流 失 , 這 也 是 細 胞 治 療 中 重 要 的 一 個 需 進 行 研 發 之 技 術 。4. 免 疫 排 斥 問 題若 進 行 異 體 移 植 , 則 需 考 慮 免 疫 排 斥 問 題 , 人 胚 幹 細 胞 之 抗 原 會 隨 著 細 胞 分 化 而 顯 現 ,如 前 所 述 , 針 對 人 胚 幹 細 胞 免 疫 排 斥 之 問 題 , 有 短 、 中 或 長 程 可 以 解 決 的 方 法 , 例 如 使 用 免疫 抑 制 藥 物 、 建 立 人 胚 胎 幹 細 胞 庫 搭 配 抗 原 配 對 與 藥 物 篩 選 、 與 胚 幹 細 胞 分 化 之 免 疫 細 胞 共同 移 植 、 以 基 因 工 程 法 剔 除 免 疫 抗 原 MHC、 核 轉 殖 製 造 個 人 化 之 細 胞 。 另 外 , 成 體 幹 細 胞用 於 異 體 移 植 時 , 亦 需 經 免 疫 抗 原 配 對 尋 找 捐 贈 者 , 而 目 前 許 多 研 究 也 顯 示 , 間 葉 幹 細 胞 具備 有 免 疫 調 節 功 能 , 將 來 應 用 於 治 療 時 可 以 減 少 移 植 之 免 疫 細 胞 對 宿 主 之 排 斥 (GVHD), 目前 應 用 朝 向 可 用 於 異 體 移 植 之 臨 床 研 究 。三 、 幹 細 胞 臨 床 醫 療 應 用 之 開 發 歷 程幹 細 胞 之 臨 床 移 植 醫 療 , 是 一 項 新 的 醫 療 技 術 , 其 開 發 歷 程 與 新 藥 開 發 一 樣 , 有 嚴 格 之法 規 規 範 、 嚴 謹 之 臨 床 前 研 究 與 臨 床 試 驗 , 以 確 保 各 項 幹 細 胞 移 植 醫 療 的 安 全 與 有 效 性 , 以謀 求 病 人 最 大 的 福 祉 。除 了 前 述 之 考 量 (1) 所 要 使 用 的 幹 細 胞 種 類 ,(2) 如 何 取 得 足 夠 的 細 胞 數 以 及 純 度 ,(3)有 效 的 細 胞 植 入 體 內 之 方 式 以 及 (4) 免 疫 排 斥 等 問 題 。 針 對 所 要 治 療 的 疾 病 或 受 損 組 織 ,研 究 分 析 細 胞 特 性 、 功 能 並 考 量 所 要 使 用 之 幹 細 胞 , 而 後 研 究 如 何 取 得 足 夠 量 的 適 用 的 幹 細胞 , 包 括 分 離 、 純 化 或 是 誘 導 分 化 的 方 法 , 於 體 外 分 析 研 究 中 , 除 了 確 定 取 得 細 胞 具 備 所 需之 特 性 、 功 能 , 而 後 選 定 動 物 疾 病 或 組 織 受 損 模 式 , 進 行 幹 細 胞 移 植 動 物 體 內 之 試 驗 , 包 括安 全 與 有 效 性 , 以 及 移 植 修 復 之 機 制 探 討 , 同 時 需 瞭 解 適 當 的 細 胞 數 目 。 若 是 能 取 得 動 物 試驗 證 明 細 胞 移 植 之 安 全 性 與 有 效 性 , 接 者 便 可 申 請 人 體 臨 床 試 驗 , 遵 循 細 胞 治 療 人 體 試 驗 申請 之 相 關 規 範 , 在 台 灣 為 衛 生 署 92 年 公 告 之 「 體 細 胞 治 療 人 體 試 驗 申 請 與 操 作 規 範 」, 以 及「 人 體 細 胞 組 織 優 良 操 作 規 範 」, 臨 床 試 驗 一 般 分 成 三 期 , 第 一 期 是 安 全 性 測 試 , 通 常 是 以 正常 人 測 試 移 植 細 胞 之 安 全 性 , 在 第 二 期 則 為 有 效 性 之 測 試 , 通 常 在 少 於 10 個 左 右 病 人 身 上做 測 試 , 同 時 看 安 全 與 有 效 性 , 最 後 , 在 第 三 期 是 大 樣 本 有 效 性 測 試 , 通 常 需 要 上 百 至 千 人的 測 試 , 結 果 以 統 計 分 析 確 定 其 有 效 性 。 幹 細 胞 移 植 醫 療 之 人 體 試 驗 , 通 常 第 一 期 與 第 二 期試 驗 會 同 時 進 行 , 亦 即 在 病 人 身 上 同 時 測 試 安 全 與 有 效 性 , 三 期 臨 床 試 驗 都 成 功 驗 證 安 全 與有 效 性 後 , 便 可 申 請 產 品 上 市 。 做 為 一 個 細 胞 移 植 醫 療 之 產 品 , 製 程 必 需 符 合 臨 床 優 良 製 造操 作 規 範 GMP, 確 保 移 植 細 胞 之 品 質 與 安 全 。雖 然 廿 年 前 科 學 家 已 經 從 小 鼠 胚 中 培 養 出 來 的 胚 幹 細 胞 , 也 能 在 試 管 中 分 化 成 其 他 種 類的 細 胞 , 再 加 上 1997 年 英 國 的 科 學 家 衛 爾 傌 (Wilmut) 等 人 , 以 成 年 羊 的 乳 腺 細 胞 核 融 入去 掉 細 胞 核 的 卵 子 , 複 製 了 桃 莉 羊 , 當 1998 美 國 威 斯 康 辛 大 學 湯 姆 生 (Thomson) 成 功 的在 實 驗 室 裡 培 養 出 人 類 胚 幹 細 胞 , 確 實 具 有 多 種 分 化 潛 力 (pluripotent) 的 幹 細 胞 時 , 科 學120

家 都 相 信 在 理 論 上 合 併 這 兩 項 研 究 發 現 , 可 以 應 用 在 治 療 複 製 (therapeutic cloning) 或 複 製人 類 , 所 以 在 近 年 來 生 命 科 學 研 究 的 領 域 裡 , 大 概 很 能 再 找 到 一 個 比 “ 人 胚 幹 細 胞 ” 還 要 炙 手可 熱 的 話 題17 。 生 物 學 家 對 胚 幹 細 胞 愛 不 釋 手 , 因 為 到 目 前 為 止 , 沒 有 任 何 一 種 成 體 幹 細 胞能 比 胚 幹 細 胞 更 具 全 能 性 的 分 化 , 台 灣 也 有 許 多 實 驗 室 也 已 經 培 養 出 人 胚 幹 細 胞 。 近 年 來 新聞 報 導 複 製 人 類 胚 胎 與 幹 細 胞 治 療 的 臨 床 研 究 的 消 息 , 引 起 了 各 界 的 關 切 , 美 國 前 總 統 布 希及 議 員 們 紛 紛 也 重 申 禁 止 利 用 胚 胎 複 製 人 的 相 關 研 究 , 卻 有 限 度 的 開 放 胚 幹 細 胞 的 研 究 。 相較 之 下 , 成 體 幹 細 胞 卻 是 目 前 在 臨 床 上 最 有 潛 能 應 用 在 人 類 疾 病 的 細 胞 種 類 , 目 前 血 液 科 醫生 應 用 累 積 40 年 來 的 移 植 經 驗 , 已 在 血 液 疾 病 上 的 應 用 積 極 地 收 集 、 純 化 、 培 育 各 種 成 體幹 細 胞 , 朝 向 更 有 效 的 治 療 各 種 血 液 疾 病 進 展 。近 年 來 有 許 多 幹 細 胞 的 突 破 , 由 人 胚 胎 的 幹 細 胞 (hESC) 分 化 成 的 心 臟 細 胞 , 移 植 到受 傷 的 老 鼠 心 臟 後 , 還 能 產 生 正 常 的 心 肌 功 能 ; 將 胚 幹 細 胞 誘 導 分 化 後 移 植 到 腦 或 脊 髓 , 也能 分 化 成 神 經 細 胞 並 恢 復 傳 導 作 用 ; 在 未 來 的 糖 尿 病 以 及 腎 臟 疾 病 的 研 究 , 更 能 協 助 醫 生 在各 式 各 樣 的 疾 病 治 療 策 略 上 , 有 全 面 性 的 影 響 。 所 以 , 將 來 人 類 幹 細 胞 具 有 潛 力 能 誘 發 成 不同 種 類 的 細 胞 並 進 而 應 用 在 疾 病 治 療 上 , 目 前 國 際 上 已 有 些 幹 細 胞 醫 療 之 產 品 與 人 體 試 驗 之進 行 , 文 獻 上 更 有 許 多 有 關 幹 細 胞 移 植 醫 療 之 動 物 實 驗 報 導 , 以 下 僅 就 相 關 研 究 與 應 用 實 例依 不 同 醫 療 之 應 用 領 域 介 紹 之8 。四 、 神 經 幹 細 胞 臨 床 試 驗 研 究1. 神 經 幹 細 胞 的 重 要 性現 代 醫 學 科 技 雖 然 發 達 , 但 是 對 於 神 經 損 傷 所 造 成 的 神 經 系 統 疾 病 , 包 括 車 禍 和 運 動 傷害 導 致 脊 髓 損 傷 及 神 經 退 化 性 疾 病 ( 包 括 腦 中 風 、 帕 金 森 氏 症 等 ), 偏 重 於 症 狀 減 輕 的 治 標方 法 , 仍 然 沒 有 徹 底 治 本 的 療 法 , 或 多 或 少 皆 會 造 成 部 份 神 經 元 永 久 性 的 缺 損 或 死 亡 , 神 經系 統 無 法 再 生 足 夠 的 新 神 經 元 以 維 持 神 經 網 路 之 正 常 聯 繫 時 , 導 致 身 體 的 神 經 系 統 或 運 動 功能 難 以 完 全 恢 複 。 直 至 上 世 紀 , 具 有 多 向 分 化 潛 能 的 神 經 幹 細 胞 被 培 養 出 來 , 是 神 經 生 物 學領 域 上 重 要 的 進 展 , 近 年 來 , 並 發 現 腦 組 織 內 還 存 在 具 有 多 向 分 化 潛 能 的 神 經 幹 細 胞 , 這 些重 大 的 發 現 終 於 打 破 傳 統 認 知 中 「 神 經 系 統 損 傷 後 不 可 再 生 」 的 觀 念16 。過 去 一 般 的 觀 念 認 為 , 動 物 的 中 樞 神 經 系 統 的 神 經 細 胞 在 出 生 前 或 出 生 後 不 久 就 不 能 再生 , 這 種 觀 念 意 味 著 成 體 動 物 的 腦 和 脊 髓 內 的 神 經 細 胞 只 會 逐 漸 凋 亡 減 少 , 無 法 再 生 或 更 新 ,對 於 後 天 發 生 中 樞 神 經 系 統 的 損 傷 , 不 可 能 進 行 神 經 修 復 , 神 經 功 能 的 恢 復 只 能 依 靠 鄰 近 或其 他 中 樞 部 位 進 行 結 構 上 的 代 償 。1980 年 代 中 期 , 美 國 洛 克 菲 勒 大 學 兩 位 學 者 在 研 究 金 絲雀 的 發 聲 學 習 行 為 中 , 發 現 成 年 鳴 禽 金 絲 雀 腦 中 確 實 有 新 的 神 經 細 胞 產 生 , 並 且 這 些 新 的 神經 細 胞 能 夠 在 前 腦 參 與 協 調 控 制 發 聲 學 習 的 神 經 中 樞 , 對 於 如 何 產 生 這 些 新 生 神 經 細 胞 的 機轉 則 是 未 知 , 直 至 1992 年 科 學 家 才 發 現 , 在 胚 胎 及 成 體 中 樞 神 經 系 統 的 腦 室 下 區(subventricular zone, SVZ), 存 在 著 一 群 能 自 我 更 新 、 分 裂 增 殖 及 能 分 化 成 為 大 部 分 類 型神 經 細 胞 的 前 驅 細 胞 群 , 經 離 體 實 驗 證 實 , 此 細 胞 群 能 聚 集 成 大 小 不 一 的 神 經 球121

(neurospheres), 繼 代 培 養 若 干 次 後 , 可 分 離 得 到 神 經 幹 細 胞 (neural stem cells, NSCs),此 為 首 次 提 出 神 經 幹 細 胞 的 概 念 。 在 1996 年 的 美 國 《 科 學 》 雜 誌 刊 載 一 篇 革 命 性 的 實 驗 報告 , 這 篇 由 台 北 榮 總 鄭 宏 志 醫 師 在 瑞 典 的 研 究 成 果 , 約 兩 千 字 的 報 告 紀 錄 兩 隻 脊 椎 被 截 斷 的大 白 鼠 , 透 過 兩 種 不 同 手 術 的 成 效 , 以 傳 統 接 合 手 術 治 療 的 大 白 鼠 , 康 復 效 果 並 不 理 想 ; 但另 一 隻 大 白 鼠 , 利 用 最 新 的 醫 學 技 術 ─ 肋 間 神 經 結 合 神 經 膠 修 復 , 六 個 月 後 , 後 腳 明 顯 恢 復行 動 , 這 是 全 球 第 一 宗 在 哺 乳 動 物 上 成 功 的 脊 椎 修 復 手 術 , 推 翻 了 幾 百 年 來 神 經 無 法 再 生 的理 論 。所 以 長 期 以 來 科 學 家 一 直 認 為 , 成 體 動 物 腦 內 神 經 細 胞 並 不 具 備 更 新 能 力 , 一 旦 受 損 乃至 死 亡 , 不 可 能 再 生 , 這 種 觀 點 使 科 學 家 對 帕 金 森 氏 症 、 阿 茲 海 默 症 及 腦 脊 髓 損 傷 的 治 療 受到 了 很 大 的 限 制 , 雖 然 傳 統 藥 物 及 外 科 手 術 治 療 可 以 有 相 當 的 進 展 , 但 是 仍 不 能 達 到 滿 意 且持 久 的 療 效 , 隨 著 神 經 幹 細 胞 研 究 與 最 新 的 進 展 , 對 於 治 療 上 述 的 中 樞 神 經 退 化 疾 病 將 可 開創 出 劃 時 代 的 重 大 意 義 。2. 神 經 幹 細 胞 的 治 療 應 用神 經 再 生 的 契 機 , 使 得 神 經 幹 細 胞 研 究 成 為 當 今 生 命 科 學 矚 目 的 焦 點 之 一 。 神 經 幹 細 胞在 醫 學 的 應 用 與 展 望 , 主 要 應 用 在 治 療 神 經 退 化 疾 病 或 是 神 經 再 生 與 修 復 等 , 例 如 脊 髓 受 傷 、腦 中 風 、 阿 茲 海 默 症 、 帕 金 森 氏 症 、 腦 部 創 傷 等 病 患 將 是 最 有 可 能 的 受 惠 者 , 現 在 的 研 究 發展 中 , 也 有 將 神 經 幹 細 胞 移 植 技 術 與 基 因 治 療 合 併 , 利 用 具 有 特 定 基 因 工 程 載 體 的 神 經 幹 細胞 為 治 療 工 具 , 提 供 新 的 移 植 技 術 , 以 提 昇 神 經 幹 細 胞 在 再 生 醫 學 上 的 應 用7,18 。神 經 幹 細 胞 研 究 在 神 經 發 育 學 和 修 復 受 損 神 經 組 織 中 扮 演 著 重 要 的 角 色 , 目 前 在 神 經 幹細 胞 的 兩 大 研 究 主 題 中 , 一 是 人 胚 胎 神 經 幹 細 胞 , 可 以 由 多 功 能 性 的 胚 幹 細 胞 分 化 而 來 , 胚幹 細 胞 的 發 展 歷 史 與 特 性 已 在 前 面 簡 述 過 , 單 就 學 術 研 究 層 面 而 言 , 利 用 人 胚 幹 細 胞 來 研 究神 經 幹 細 胞 可 能 是 最 佳 的 選 擇 ; 二 是 利 用 自 體 或 異 體 之 成 體 或 墮 胎 組 織 幹 細 胞 。 在 治 療 腦 中風 方 面 , 台 灣 在 近 年 來 也 有 幾 個 新 的 臨 床 試 驗 , 中 國 醫 藥 大 學 由 林 欣 榮 教 授 領 軍 的 研 究 團 隊 ,以 自 體 幹 細 胞 直 接 注 射 損 傷 的 腦 神 經 , 成 功 改 善 了 許 多 腦 中 風 患 者 病 情 , 有 些 病 患 從 原 本 手不 能 動 , 治 療 後 不 但 手 可 以 握 杯 子 、 還 可 以 擠 牙 膏 , 走 路 的 步 伐 也 變 快 了 , 臨 床 試 驗 還 在 進行 中 , 根 據 目 前 的 治 療 成 果 可 以 說 是 相 當 顯 著 。在 北 京 首 都 大 學 附 屬 朝 陽 醫 院 黃 紅 雲 醫 師 在 病 人 受 傷 椎 骨 上 下 處 鑽 兩 個 小 孔 , 然 後 注 射入 從 墮 胎 組 織 所 培 養 的 鼻 鞘 神 經 細 胞 , 鼻 鞘 神 經 細 胞 移 殖 被 認 為 是 治 療 脊 髓 損 傷 最 有 前 景 的方 法 之 一 。 鼻 鞘 神 經 細 胞 起 源 於 嗅 基 底 膜 , 分 布 在 嗅 球 、 嗅 神 經 並 可 伴 隨 嗅 束 遷 徙 入 腦 。 鼻鞘 神 經 細 胞 雖 不 同 於 星 形 細 胞 和 許 旺 氏 細 胞 , 但 是 , 同 時 具 有 這 兩 種 細 胞 的 特 性 , 它 存 在 並遷 徙 於 周 圍 神 經 和 中 樞 神 經 之 間 , 在 嗅 球 內 , 它 是 惟 一 接 觸 和 包 被 嗅 神 經 軸 突 的 膠 質 細 胞 ,在 整 個 中 樞 神 經 系 統 通 路 中 , 它 包 被 嗅 神 經 軸 突 , 以 防 止 它 們 與 其 他 中 樞 神 經 系 統 細 胞 接 觸 ,鼻 鞘 神 經 細 胞 的 膜 上 可 以 分 泌 許 多 與 細 胞 黏 合 和 軸 突 生 長 和 促 進 神 經 生 長 的 分 子 , 也 能 分 泌大 量 不 同 種 類 的 神 經 滋 養 和 支 持 因 子 。 毫 無 疑 問 地 , 嗅 鞘 細 胞 的 這 些 特 性 為 損 傷 神 經 修 復 和122

再 生 以 及 功 能 恢 復 建 立 了 很 好 的 內 在 環 境 。 鼻 鞘 神 經 細 胞 會 分 泌 這 些 滋 養 物 質 , 以 刺 激 殘 存的 軸 突 再 生 , 並 以 髓 鞘 包 裹 在 再 生 軸 突 的 外 層 , 同 時 隨 著 再 生 軸 突 遷 移 形 成 造 橋 的 作 用 。 然而 鼻 鞘 神 經 細 胞 移 殖 病 患 在 術 後 一 至 二 個 星 期 通 常 會 發 生 劇 烈 疼 痛 , 根 據 朝 陽 醫 院 的 報 導 ,在 術 後 一 至 一 年 半 內 病 患 均 有 程 度 不 等 的 功 能 改 善 , 當 然 , 這 些 改 善 的 機 轉 並 不 清 楚 , 值 得進 一 步 去 研 究 並 釐 清 。3. 神 經 幹 細 胞 基 因 治 療 理 念另 外 有 一 個 新 的 研 究 發 展 理 念 : 以 神 經 幹 細 胞 的 移 植 合 併 基 因 治 療 。 此 研 究 將 神 經 幹 細胞 作 為 神 經 系 統 疾 病 基 因 治 療 的 載 體 , 具 有 其 他 細 胞 移 植 所 不 能 比 擬 的 優 勢 , 首 先 , 帶 有 特定 基 因 的 神 經 幹 細 胞 植 入 宿 主 體 內 後 , 可 直 接 進 入 並 整 合 神 經 網 絡 , 使 治 療 基 因 表 達 與 微 環境 調 控 連 結 , 且 其 分 化 所 產 生 的 神 經 細 胞 將 逐 漸 取 代 有 缺 陷 或 死 亡 的 神 經 細 胞 。 再 者 , 治 療基 因 種 類 、 表 達 時 機 與 效 能 及 這 些 神 經 細 胞 的 分 佈 , 不 會 侷 限 於 解 剖 學 上 神 經 幹 細 胞 的 周 圍 ,還 可 以 根 據 整 體 的 需 求 , 更 廣 泛 地 遷 移 分 佈 或 支 持 局 部 的 受 創 神 經 組 織 。神 經 幹 細 胞 作 為 移 植 細 胞 或 基 因 載 體 , 還 具 備 許 多 移 植 治 療 上 的 優 點 : 神 經 幹 細 胞 可 以分 化 成 神 經 元 或 神 經 膠 原 細 胞 , 結 構 上 易 與 宿 主 固 有 組 織 融 合 而 有 較 低 免 疫 反 應 ; 能 在 腦 內做 遠 距 離 遷 移 活 動 ; 對 宿 主 中 樞 神 經 系 統 損 害 較 低 ; 比 較 不 干 擾 其 他 正 常 的 腦 細 胞 功 能 ; 載體 基 因 表 達 比 較 穩 定 , 維 持 時 間 比 較 長 ; 易 於 生 存 在 中 樞 神 經 系 統 中 , 所 以 , 它 不 受 限 於 腦血 管 障 壁 的 屏 障 , 能 直 接 在 中 樞 神 經 系 統 中 運 送 基 因 產 物 或 替 補 失 去 這 些 功 能 之 神 經 細 胞 。移 植 治 療 研 究 過 程 中 有 兩 項 因 素 需 要 特 別 注 意 , 細 胞 數 量 的 多 寡 及 神 經 元 分 化 的 比 率 是一 項 重 要 的 考 量 , 神 經 幹 細 胞 在 體 外 培 養 可 以 分 化 為 神 經 細 胞 , 但 是 分 化 為 特 定 神 經 細 胞 的比 例 並 不 高 , 而 且 每 次 誘 導 分 化 時 會 有 程 度 上 的 差 異 。 以 目 前 的 研 究 技 術 , 仍 無 法 做 到 產 出完 全 均 一 的 神 經 細 胞 分 化 比 率 , 同 時 也 尚 未 建 立 一 套 標 準 化 的 操 作 流 程 , 若 貿 然 將 誘 導 之 神經 幹 細 胞 或 伴 隨 其 所 產 出 的 具 有 隨 機 性 分 化 的 細 胞 , 直 接 移 植 到 病 患 身 上 , 其 所 產 生 的 臨 床風 險 將 難 以 評 估 及 承 擔 。儘 管 神 經 幹 細 胞 廣 泛 存 在 神 經 系 統 , 但 是 在 移 植 治 療 時 選 定 移 植 標 的 區 時 , 還 要 考 量 到不 同 腦 區 所 需 之 神 經 細 胞 與 膠 原 細 胞 的 分 化 時 機 與 比 率 , 微 環 境 訊 息 等 生 物 學 特 徵 的 調 適 ,才 能 精 確 地 選 擇 移 植 的 神 經 幹 細 胞 , 同 時 提 昇 移 植 後 細 胞 的 存 活 率 、 細 胞 間 突 觸 的 建 立 以 及減 低 免 疫 排 斥 反 應 。 利 用 基 因 修 飾 的 神 經 幹 細 胞 治 療 疾 病 在 臨 床 上 將 會 有 廣 大 的 應 用 前 景 ,但 應 用 成 功 與 否 仍 仰 賴 對 神 經 幹 細 胞 的 分 化 影 響 因 子 及 機 轉 的 深 入 研 究 了 解 ; 同 時 , 如 何 發展 出 一 套 簡 便 又 有 效 的 神 經 幹 細 胞 體 外 增 殖 與 特 定 神 經 元 的 大 量 誘 導 分 化 , 也 都 是 將 來 解 決問 題 的 致 勝 關 鍵 點 。五 、 心 血 管 疾 病 幹 細 胞 臨 床 應 用儘 管 心 血 管 疾 病 在 臨 床 上 已 經 有 諸 多 重 大 的 突 破 , 如 成 功 完 成 心 臟 移 植 手 術 等 , 但 要 恢123

復 一 個 受 損 之 心 臟 , 仍 是 一 項 令 人 敬 畏 的 浩 大 工 程 。 近 來 研 究 發 現 , 利 用 幹 細 胞 來 治 療 修 補受 損 的 心 臟 細 胞 , 除 了 能 產 生 新 的 心 肌 細 胞 外 , 亦 能 形 成 新 的 血 管 來 彌 補 原 先 的 血 液 供 應 ,研 究 中 也 發 現 血 管 內 皮 幹 細 胞 確 實 功 不 可 沒 。 另 外 有 些 研 究 則 發 現 , 血 管 內 皮 幹 細 胞 能 改 善糖 尿 病 小 鼠 的 血 管 形 成 , 由 於 糖 尿 病 患 者 的 血 管 形 成 能 力 很 差 , 如 果 預 先 從 體 內 取 出 把 血 管內 皮 幹 細 胞 分 離 , 在 體 外 進 行 大 量 培 養 , 之 後 再 將 其 植 回 體 內 , 藉 此 改 善 糖 尿 病 患 者 的 血 管形 成 能 力 , 也 能 對 糖 尿 病 或 心 臟 衰 竭 之 治 療 有 相 當 程 度 之 貢 獻 。目 前 治 療 心 臟 血 管 疾 病 已 經 有 許 多 有 效 的 治 療 方 法 , 如 外 科 手 術 、 藥 物 治 療 或 是 器 官 移植 等 , 但 是 對 於 移 植 心 臟 來 源 始 終 是 不 足 , 此 外 這 些 病 患 無 法 維 持 長 久 之 存 活 時 間 , 也 是 還有 相 當 的 困 擾 , 近 來 , 科 學 家 利 用 特 定 的 培 養 環 境 將 幹 細 胞 分 化 成 心 肌 細 胞 與 血 管 內 皮 細 胞 ,藉 以 替 代 受 損 的 心 臟 細 胞 , 使 心 臟 恢 復 原 有 的 功 能 性14 , 這 種 修 補 方 法 比 傳 統 的 異 體 心 臟 移植 簡 單 、 方 便 且 來 源 豐 富 , 並 且 毋 須 漫 長 等 待 一 顆 可 移 植 的 心 臟 , 這 些 幹 細 胞 可 從 自 體 取 得並 分 離 , 因 此 病 人 本 身 所 冒 移 植 後 的 排 斥 風 險 也 遠 比 移 植 異 體 心 臟 小 很 多 。美 國 研 究 人 員 查 克 · 默 裏 等 人 在 2007 年 9 月 號 《 自 然 · 生 物 技 術 》 雜 誌 上 撰 文 說 , 他 們 成功 利 用 人 胚 幹 細 胞 修 復 了 實 驗 鼠 受 損 的 心 肌 , 這 一 進 展 為 用 幹 細 胞 技 術 治 療 人 類 心 臟 病 帶 來了 希 望9 。 美 國 華 盛 頓 大 學 和 傑 龍 生 物 醫 藥 公 司 的 研 究 人 員 首 先 誘 導 實 驗 鼠 發 生 心 臟 病 , 然後 在 其 體 內 植 入 由 人 胚 幹 細 胞 分 化 成 的 心 肌 細 胞 , 實 驗 結 果 發 現 , 一 段 時 間 後 , 實 驗 鼠 受 損的 心 肌 開 始 重 新 生 長 , 整 個 心 臟 的 功 能 也 有 所 改 善 。 華 盛 頓 大 學 的 查 克 · 默 裏 說 , 他 們 的 實 驗結 果 “ 特 別 重 要 ”, 因 為 心 臟 病 患 者 發 病 後 的 主 要 問 題 之 一 , 就 是 心 臟 受 損 不 能 復 原 , 新 實 驗結 果 表 明 , 幹 細 胞 療 法 有 可 能 使 受 損 心 臟 恢 復 正 常 , 由 此 可 知 在 治 療 心 血 管 疾 病 上 血 管 內 皮幹 細 胞 是 相 當 具 有 遠 景 。胚 幹 細 胞 理 論 上 能 分 化 成 各 種 類 型 的 細 胞 , 但 在 實 際 操 作 時 , 通 常 僅 有 不 到 1% 的 胚 幹細 胞 能 分 化 為 心 肌 細 胞 , 而 且 移 植 後 這 些 心 肌 細 胞 大 多 死 亡9 , 用 幹 細 胞 治 療 心 臟 血 管 疾 病的 研 究 在 此 之 前 一 直 受 阻 於 這 難 題 , 查 克 · 默 裏 等 人 的 新 實 驗 在 解 決 上 述 問 題 取 得 了 突 破 。 首先 , 研 究 人 員 在 幹 細 胞 培 養 過 程 中 加 入 了 兩 種 生 長 因 子 , 使 得 胚 幹 細 胞 分 化 為 心 肌 細 胞 的 成功 率 達 到 90%; 其 次 , 他 們 在 心 肌 細 胞 移 植 時 混 入 多 種 細 胞 滋 養 因 子 、 生 長 因 子 和 抑 制 細 胞死 亡 的 成 分 , 使 移 植 成 功 率 從 過 去 的 18% 上 升 至 100%, 研 究 人 員 表 示 , 他 們 計 劃 下 一 步 對豬 和 羊 等 大 型 動 物 進 行 類 似 實 驗 , 預 計 兩 年 內 開 展 人 體 早 期 臨 床 研 究 , 無 疑 地 , 幹 細 胞 將 為心 臟 血 管 疾 病 患 者 帶 來 莫 大 的 福 音 。六 、 造 血 幹 細 胞 臨 床 應 用臨 床 上 針 對 惡 性 血 液 疾 病 的 治 療 方 式 , 不 外 乎 為 放 射 性 療 法 與 化 學 性 療 法 兩 種 , 藉 此 來抑 制 殺 死 惡 性 腫 瘤 細 胞 , 到 了 80 年 代 , 骨 髓 移 植 成 為 治 療 惡 性 血 液 疾 病 之 造 血 支 持 治 療 的主 要 措 施 , 藉 此 重 建 修 復 被 破 壞 的 造 血 與 免 疫 系 統 , 由 於 臍 帶 血 中 含 有 豐 富 的 造 血 幹 細 胞 ,1988 年 醫 學 界 成 功 地 利 用 人 類 臍 帶 血 移 植 治 療 貧 血 症 , 從 此 開 創 了 臍 帶 血 移 植 的 先 例 。一 般 認 為 造 血 幹 細 胞 除 了 造 血 功 能 外 , 多 項 研 究 發 現 造 血 幹 細 胞 有 著 令 人 興 奮 的 跨 胚 層分 化 能 力 , 其 能 夠 分 化 成 為 非 血 液 系 統 的 細 胞 , 如 神 經 細 胞 、 血 管 內 皮 細 胞 或 心 肌 細 胞 等124

10,15 。 另 外 , 它 還 有 一 項 令 人 驚 訝 的 特 性 , 就 是 能 夠 攻 擊 腫 瘤 細 胞 。 推 測 原 因 在 於 新 移 植 的異 體 造 血 幹 細 胞 , 能 夠 在 患 者 體 內 建 立 一 套 新 的 免 疫 系 統 , 進 而 對 癌 細 胞 產 生 毒 殺 作 用 , 即所 謂 的 Graft-Versus-Tumor, 因 而 消 滅 或 抑 制 腫 瘤 生 長 。當 造 血 幹 細 胞 分 化 為 血 液 細 胞 後 , 是 屬 於 全 身 性 的 分 佈 與 循 環 , 因 此 利 用 造 血 幹 細 胞 做為 基 因 治 療 的 標 的 細 胞 , 也 勝 於 其 他 種 類 的 幹 細 胞 之 優 點 , 因 此 當 前 許 多 基 因 治 療 的 計 畫 ,都 是 以 造 血 幹 細 胞 為 主 要 的 研 究 對 象12 。 經 過 五 十 多 年 來 的 造 血 幹 細 胞 研 究 與 臨 床 試 驗 , 目前 , 造 血 幹 細 胞 已 成 為 最 被 人 們 所 了 解 的 幹 細 胞 , 並 且 也 是 應 用 最 廣 的 幹 細 胞 。七 、 未 來 的 挑 戰 與 展 望相 對 於 生 物 學 家 對 人 類 胚 幹 細 胞 的 厚 愛 , 許 多 團 體 卻 對 人 胚 幹 細 胞 的 研 究 有 道 德 的 質疑 , 例 如 在 建 立 人 胚 胎 幹 細 胞 株 時 , 必 須 使 用 體 外 人 工 受 精 胚 囊 , 然 後 再 從 內 質 團 (inner cellmass) 裡 分 離 出 人 胚 幹 細 胞 培 養 , 這 種 培 育 過 程 具 有 一 定 程 度 的 道 德 爭 議 。 因 此 , 除 了 人 胚幹 細 胞 與 成 體 幹 細 胞 的 多 能 性 幹 細 胞 外 , 日 本 山 中 伸 彌 的 研 究 小 組 發 表 ” 誘 導 式 多 能 性 幹 細胞 ” (induced pluripotent stem cells, iPS cells) 的 建 立 , 能 將 小 鼠 纖 維 母 細 胞 誘 導 成 類 胚 幹細 胞 , 此 種 類 胚 胎 幹 細 胞 還 能 形 成 嵌 合 體 (chimera)。 為 了 能 精 確 地 將 纖 維 母 細 胞 轉 變 成胚 幹 細 胞 , 他 們 使 用 四 個 轉 錄 因 子 , 並 利 用 另 一 個 表 現 在 胚 幹 細 胞 裡 的 分 子 Nanog 作 為 鑑 定誘 導 式 多 能 性 幹 細 胞 的 標 記 , 今 年 他 與 英 國 的 古 爾 登 (John Gurdon) 同 樣 在 幹 細 胞 研 究 領域 開 創 性 的 成 就 , 他 們 「 發 現 成 體 細 胞 經 重 新 編 程 , 可 成 為 誘 導 式 多 能 性 幹 細 胞 (iPS 細 胞 ),具 備 胚 胎 幹 細 胞 功 能 , 可 分 化 形 成 其 他 型 態 的 細 胞 , 革 新 了 人 類 對 細 胞 和 生 物 如 何 發 展 的 認識 」, 同 獲 2012 年 諾 貝 爾 「 生 理 學 或 醫 學 獎 」 的 殊 榮 。近 幾 年 來 , 對 幹 細 胞 的 基 礎 研 究 和 臨 床 前 應 用 研 究 均 取 得 了 可 喜 的 進 展 , 幹 細 胞 之 所 以吸 引 人 , 其 魅 力 莫 過 於 能 「 再 生 新 的 細 胞 」; 但 相 對 來 說 , 精 確 誘 導 分 化 的 調 控 機 制 也 就 成為 目 前 幹 細 胞 研 究 的 重 大 難 題 。 隨 著 不 斷 的 研 究 , 仍 有 許 多 問 題 未 能 明 確 , 如 .. 人 體 如 何 能獲 得 足 夠 移 植 的 幹 細 胞 ? 移 植 進 入 人 體 的 幹 細 胞 與 體 內 原 有 的 細 胞 相 互 作 用 與 影 響 ? 移 植 幹細 胞 能 否 在 體 內 順 利 增 殖 分 化 ? 其 關 鍵 因 子 是 什 麼 ? 幹 細 胞 移 植 到 動 物 體 內 後 是 否 有 潛 在 的致 瘤 性 ? 這 些 都 有 待 深 入 研 究 和 解 決 。神 經 幹 細 胞 的 研 究 和 臨 床 應 用 方 面 的 價 值 日 益 成 為 中 樞 神 經 系 統 退 化 疾 病 、 腦 脊 隨 損 傷與 再 生 醫 學 研 究 的 焦 點 , 神 經 幹 細 胞 移 植 無 疑 將 成 為 各 種 疾 病 的 治 療 帶 來 希 望 的 曙 光 。 然 而腦 內 神 經 元 種 類 繁 多 且 功 能 極 為 複 雜 , 不 同 功 能 的 神 經 元 分 佈 在 腦 內 不 同 部 位 , 透 過 合 成 及釋 放 神 經 傳 遞 物 質 以 發 揮 各 自 獨 特 的 功 能 , 又 相 互 整 合 神 經 網 絡 的 訊 息 。 因 此 , 即 使 誘 導 神經 幹 細 胞 分 化 成 我 們 想 要 的 神 經 細 胞 , 細 胞 本 身 是 否 具 有 生 理 功 能 性 , 能 否 與 周 圍 的 神 經 形成 適 當 的 網 絡 , 整 合 執 行 該 有 的 生 理 功 能 , 這 些 都 是 當 前 迫 需 解 決 的 問 題 。總 之 , 幹 細 胞 移 植 對 於 治 療 糖 尿 病 、 心 臟 血 管 疾 病 、 肝 臟 疾 病 、 神 經 退 化 性 疾 病 或 對 目前 常 規 方 法 難 以 見 效 的 其 他 疾 病 , 除 了 提 供 另 一 選 項 以 外 , 也 提 供 研 究 學 者 更 廣 闊 的 思 路 和125

誘 人 的 前 景 , 但 是 , 要 將 幹 細 胞 治 療 大 量 用 於 臨 床 治 療 之 前 , 科 學 家 還 有 一 些 關 鍵 問 題 需 要解 決 , 或 許 將 來 幹 細 胞 的 研 究 與 應 用 能 提 供 再 生 醫 學 一 個 較 佳 的 解 決 方 案 。綜 合 前 面 所 述 , 目 前 幹 細 胞 的 來 源 、 分 離 、 培 養 及 鑑 定 還 有 許 多 研 究 工 作 待 突 破 , 幹 細胞 之 誘 導 、 分 化 及 遷 移 機 轉 也 有 待 進 一 步 研 究13,19 。 雖 然 臨 床 幹 細 胞 應 用 中 還 存 在 許 多 未 解決 的 問 題 , 但 由 於 其 廣 泛 的 應 用 前 景 , 仍 成 為 目 前 科 學 界 研 究 最 重 要 的 焦 點 之 一 。 若 以 病 患的 細 胞 訂 製 胚 幹 細 胞 , 並 能 誘 導 分 化 成 特 定 的 細 胞 , 就 可 以 自 體 修 補 損 傷 或 退 化 的 細 胞 , 而不 用 擔 憂 免 疫 排 斥 問 題 , 因 此 , 未 來 在 培 養 的 人 胚 幹 細 胞 加 入 某 些 特 定 生 長 因 子 , 就 可 能 培養 出 心 臟 細 胞 、 神 經 細 胞 、 胰 臟 細 胞 等 等 , 來 治 療 這 些 受 傷 的 器 官 及 組 織 。 目 前 , 幹 細 胞 移植 到 臨 床 前 動 物 身 上 , 已 經 有 相 當 好 的 成 果 , 但 是 應 用 在 人 身 上 是 否 也 會 有 同 樣 的 功 效 , 還有 等 待 未 來 的 發 展 證 實 。 生 物 學 家 目 前 已 能 利 用 各 種 適 當 的 細 胞 訊 息 傳 遞 分 子 , 在 培 養 皿 裡忠 實 地 將 人 胚 幹 細 胞 引 導 成 為 各 種 不 同 的 體 細 胞 ( 例 如 運 動 神 經 元 , 多 巴 胺 分 泌 神 經 元 , 肝臟 細 胞 等 )。 這 也 是 為 何 大 家 對 於 人 胚 幹 細 胞 寄 予 厚 望 , 希 望 有 朝 一 日 胚 幹 細 胞 能 完 成 治 癒人 類 各 種 難 纏 的 糖 尿 病 、 心 臟 血 管 疾 病 與 神 經 退 化 性 疾 病 的 夢 想 。八 、 參 考 文 獻1. Lovell-Badge, R. The future for stem cell research. Nature 414:88-91 (2001).2. Ki rschstein, R. & Skirboll, L. R. Stem Cells: Scientific Progress and future directionshttp://stemcells.nih.gov/stemcell/scireport.asp.ES-1-ES-7 p1-5 (2001).3. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz M. A., Swiergiel J. J., Marshall V. S.& Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282:1145-7 (1998).4. Preti, R. A. Bringing safe and effective cell therapies to the bedside. Nature biotechnology23:801-804 (2005).5. Howard, W. K., Scott, C. T. & Herrera, S. Chasing a cellular fountain of youth NatureBiotechnology 23:807 - 815 (2005).6. Keirstead, H. S., Nistor, G., Bernal, G., Totoiu M., Cloutier, F., Sharp, K. & Steward, O. Humanembryonic stem-cell derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate andrestore locomotion after spinal cord injury. The Journal of Neuroscience 25:4694-4705 (2005).7. Chang, Y. C., Shyu, W. C., Lin, S. Z. & Li, H. Regenerative therapy for stroke. Cell Transplant16:171-81 (2007).8. Kassem, M. Mesenchymal stem cells: biological characteristics and potential clinicalapplications. Cloning Stem Cells 6:369-74 (2004).9. Laflamme, M. A., Chen, K. Y., Naumova, A. V., Muskheli, V., Fugate, J. A., Dupras, S. K.,Reinecke, H., Xu, C., Hassanipour, M., Police, S., O'Sullivan, C., Collins, L., Chen, Y., Minami,E., Gill, E. A., Ueno, S., Yuan, C., Gold, J. & Murry, C. E. Cardiomyocytes derived from humanembryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. NatBiotechnol. 25:1015-24 (2007).126

10. Nishiyama, N., Miyoshi, S., Hida, N., Uyama, T., Okamoto, K., Ikegami, Y., Miyado, K.,Segawa, K., Terai, M., Sakamoto, M., Ogawa, S. & Umezawa, A. The significantcardiomyogenic potential of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells invitro. Stem Cells 25:2017-24 (2007).11. Orlic, D., Kajstura, J., Chimenti, S., Bodine, D. M., Leri, A. & Anversa, P. Transplanted adultbone marrow cells repair myocardial infarcts in mice. Ann N Y Acad Sci. 938:221-9 (2001).12. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H. & Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoieticreconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science 273:242-5(1996).13. Pearse, D. D. & Bunge, M. B. Designing cell- and gene-based regeneration strategies to repairthe injured spinal cord. J Neurotrauma. 23:438-52 (2006).14. Pittenger, M. F. & Martin, B. J. Mesenchymal stem cells and their potential as cardiactherapeutics. Circ Res. 95:9-20 (2004).15. Prat-Vidal, C., Roura, S., Farre, J., Galvez, C., Llach, A., Molina, C. E., Hove-Madsen, L.,Garcia, J., Cinca, J. & Bayes-Genis, A. Umbilical cord blood-derived stem cells spontaneouslyexpress cardiomyogenic traits. Transplant Proc. 39:2434-7 (2007).16. Rietze, R. L. & Reynolds, B. A. Neural stem cell isolation and characterization. MethodsEnzymol. 419:3-23 (2006).17. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V.S. & Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science282:1145-7 (1998).18. Watson, D. J., Walton, R. M., Magnitsky, S. G., Bulte, J. W., Poptani, H. & Wolfe, J. H.Structure-specific patterns of neural stem cell engraftment after transplantation in the adultmouse brain. Hum Gene Ther. 17:693-704 (2006).19. Zeng, Z., Yuan, X., Liu, G., Zeng, X., Zeng, X., Ng, H., Chen, H., Jiang, T., Akasaki, Y., Kessey,K., Black, K. L. & Yu, J. S. Manipulation of proliferation and differentiation of human bonemarrow-derived neural stem cells in vitro and in vivo. J Neurosci Res. 85:310-20 (2007).127

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第 十 一 章幹 細 胞 之 生 技 產 業 運 用Commercialization of stem cell technology陳 婉 昕工 業 技 術 研 究 院 生 技 與 醫 藥 研 究 所一 、 前 言幹 細 胞 (stem cells) 因 具 有 自 我 更 新 (self-renewal) 與 分 化 為 成 熟 組 織 細 胞 的 能 力 ,又 可 取 自 人 體 , 於 體 外 培 養 誘 導 分 化 後 , 呈 現 人 類 組 織 細 胞 之 特 性 與 功 能 , 故 具 有 基 礎 醫 學如 胚 胎 發 育 與 疾 病 細 胞 機 制 探 討 , 以 及 臨 床 醫 療 如 藥 物 篩 選 與 移 植 醫 療 應 用 之 潛 力1-2 。 其 展現 的 應 用 潛 力 , 不 僅 引 起 研 發 的 熱 潮 , 各 國 政 府 均 投 入 大 量 研 發 經 費 , 更 帶 動 私 人 資 金 之 投入 , 一 些 與 幹 細 胞 有 關 之 產 業 , 包 括 研 發 市 場 與 與 大 家 寄 予 厚 望 之 醫 療 應 用 , 開 始 形 成 。 而幹 細 胞 因 為 來 源 、 分 化 潛 力 、 分 離 、 培 養 技 術 難 易 度 不 同 , 現 皆 段 之 臨 床 醫 療 應 用 時 程 不 盡相 同 , 故 各 個 公 司 之 標 的 與 經 營 模 式 亦 有 所 不 同 , 本 章 將 就 目 前 幹 細 胞 相 關 產 業 之 現 況 及 政策 法 規 等 做 一 簡 單 之 概 述 。二 、 幹 細 胞 的 來 源 、 特 性 與 應 用1. 幹 細 胞 的 分 類幹 細 胞 依 在 體 內 發 育 的 階 段 與 分 化 潛 力 的 不 同 , 可 分 為 萬 能 分 化 潛 能 (totipotent), 複能 分 化 潛 能 (pluripotent) 與 多 分 化 潛 能 (multipotent) 細 胞(1) 萬 能 分 化 潛 能 的 細 胞 擁 有 最 廣 的 分 化 潛 力 , 可 發 育 為 一 個 新 的 個 體 以 及 發 育 為個 體 所 需 的 母 體 組 織 如 胎 盤 之 中 來 自 胚 胎 之 部 分 , 此 類 細 胞 如 受 精 卵 (zygote);(2) 複 能 分 化 潛 能 的 細 胞 可 發 育 為 組 成 成 體 的 所 有 二 百 六 十 餘 種 細 胞 , 包 括 內 、 中 、外 三 胚 層 與 生 殖 細 胞 , 此 類 細 胞 如 胚 胎 幹 細 胞 (embryonic stem cells) 以 及 胚胎 生 殖 細 胞 (embryonic germ cells)(3) 多 分 化 潛 能 細 胞 分 化 能 力 有 限 , 僅 可 分 分 化 為 數 種 成 熟 之 組 織 細 胞 , 如 成 體 幹細 胞 。3 。129

2. 幹 細 胞 的 來 源幹 細 胞 依 其 取 得 的 組 織 來 源 , 可 分 為 :(1) 胚 胎 組 織 : 此 類 細 胞 均 為 複 能 分 化 潛 能 的 細 胞 , 如(a) 胚 胎 幹 細 胞 : 在 人 類 , 為 取 自 發 育 四 至 五 天 囊 胚 期 (blastocyst) 內 細 胞 團 塊 (innercell mass) 的 細 胞 , 每 顆 內 細 胞 團 塊 分 離 培 養 出 的 細 胞 都 是 胚 胎 幹 細 胞 。(b) 胚 胎 生 殖 細 胞 : 在 人 類 , 為 取 自 5-10 週 胚 胎 組 織 中 , 將 發 育 成 生 殖 腺 的 細 胞 。(2) 成 體 與 胎 兒 組 織 : 幹 細 胞 只 佔 其 中 約 0.001%( 成 體 組 織 ) 至 1%( 胎 兒 組 織 ) 的比 例 , 為 多 分 化 潛 能 細 胞 , 依 所 取 得 之 部 位 分 可 分 為 :(a) 骨 髓 (bone marrow): 含 有 造 血 幹 細 胞 (hematopietic stem cells), 可 分 化 為血 液 中 各 種 細 胞 ,1990 年 代 開 始 , 進 行 骨 髓 移 植 治 療 血 癌 , 即 是 利 用 骨 髓 內 含有 此 類 幹 細 胞 之 特 性 ; 1999 年 後 , 發 現 骨 髓 內 並 含 有 間 質 幹 細 胞(mesenchymal stem cells), 可 分 化 為 軟 骨 、 硬 骨 、 肌 肉 與 脂 肪 細 胞 等 。(b) 臍 帶 (umbilical cord): 包 括 臍 帶 血 (umbilical cord blood), 其 中 亦 含 有 造 血幹 細 胞 與 間 質 幹 細 胞 , 近 年 來 並 發 現 臍 帶 部 分 含 有 豐 富 之 間 質 幹 細 胞 , 可 分 離應 用 。(c) 成 體 幹 細 胞 (adult stem cells): 其 他 存 在 於 成 體 組 織 中 之 幹 細 胞 , 如 脂 肪 組 織 、神 經 、 心 臟 、 皮 膚 與 肝 臟 組 織 。(d) 胎 兒 幹 細 胞 : 存 在 於 胎 兒 組 織 中 的 幹 細 胞 。另 外 有 一 類 幹 細 胞 此 章 之 中 不 會 討 論 , 那 就 是 腫 瘤 幹 細 胞 (cancer stem cells),這 是 很 新 、 很 重 要 的 一 個 領 域 , 將 來 的 研 發 將 會 帶 出 癌 症 機 轉 之 新 觀 念 並 衝 擊 到 抗 癌藥 物 之 開 發 。 但 因 其 無 法 應 用 於 細 胞 移 植 醫 療 , 故 此 章 中 不 予 討 論 。3. 幹 細 胞 之 特 性 與 應 用如 上 所 述 , 幹 細 胞 依 其 來 源 與 分 化 潛 能 不 同 , 特 性 不 盡 相 同 , 目 前 研 發 與 應 用 方 向 也 不盡 相 同 。 一 般 而 言 , 取 自 胚 胎 之 幹 細 胞 分 化 潛 力 廣 , 體 外 長 期 培 養 、 量 產 相 對 容 易 , 細 胞 生命 週 期 相 對 年 輕 , 但 有 道 德 倫 理 議 題 , 細 胞 需 經 誘 導 分 化 後 才 可 進 行 移 植 醫 療 , 否 則 會 形 成畸 胎 瘤 (teratoma), 並 有 免 疫 排 斥 問 題 待 解 決 , 但 其 寬 廣 的 分 化 潛 能 , 是 成 體 幹 細 胞 所 不 能及 的 , 所 以 吸 引 許 多 人 的 研 究 , 也 有 一 些 公 司 投 入 其 臨 床 應 用 包 括 藥 物 篩 選 與 細 胞 移 植 醫 療之 研 發 。成 體 組 織 的 細 胞 分 化 潛 力 較 有 限 , 體 外 不 易 長 期 培 養 與 量 產 , 生 命 週 期 較 老 , 但 因 其 較 無道 德 倫 理 議 題 , 又 可 取 自 自 體 , 直 接 進 行 細 胞 移 植 醫 療 , 沒 有 免 疫 排 斥 問 題 , 所 以 目 前 已 經進 行 臨 床 試 驗 或 甚 至 有 產 品 上 市 的 幹 細 胞 醫 療 公 司 , 多 是 以 此 為 標 的 , 尤 其 是 取 自 骨 髓 之 幹細 胞 , 目 前 醫 療 應 用 最 多 , 但 是 自 體 移 植 這 類 個 人 化 的 產 品 模 式 , 因 為 成 本 昂 貴 , 會 限 制 將來 的 市 場 發 展 , 所 以 異 體 移 植 是 成 體 幹 細 胞 目 前 研 發 方 向 之 一 。 而 骨 髓 間 質 幹 細 胞 因 具 有 免130

疫 調 節 之 功 能 , 故 為 極 具 潛 力 的 應 用 標 的 , 亦 有 些 公 司 利 用 其 特 性 , 進 行 臨 床 試 驗 。三 、 幹 細 胞 於 基 礎 醫 學 研 發 與 臨 床 應 用 之 技 術 發 展如 圖 一 所 示 , 幹 細 胞 具 有 基 礎 醫 學 如 胚 胎 發 育 與 疾 病 細 胞 機 制 探 討 , 以 及 臨 床 醫 療 如 藥物 篩 選 與 移 植 醫 療 應 用 之 潛 力 , 針 對 這 些 應 用 目 前 正 發 展 相 關 技 術 , 包 括 細 胞 分 離 、 培 養 、大 量 培 養 、 分 化 誘 導 、 轉 譯 研 發 (translational study) 試 驗 、 臨 床 前 動 物 試 驗 與 臨 床 試 驗 。要 進 行 臨 床 試 驗 或 藥 物 研 發 商 品 化 前 , 這 些 技 術 的 開 發 每 個 環 節 都 十 分 重 要 , 不 同 細 胞 並 有不 同 執 行 方 法 , 比 如 成 體 幹 細 胞 要 進 行 細 胞 醫 療 , 可 抽 取 後 直 接 打 回 病 人 體 內 , 不 需 經 過 培養 分 化 , 但 是 人 胚 幹 細 胞 則 必 須 經 過 誘 導 分 化 , 使 其 失 去 因 自 發 性 分 化 形 成 畸 胎 瘤 的 能 力 後 ,才 可 進 行 移 植 醫 療 。 而 不 同 的 應 用 所 需 細 胞 不 同 , 量 產 上 也 是 需 要 考 慮 的 。 而 人 胚 胎 幹 細 胞因 體 外 長 期 培 養 、 量 產 相 對 容 易 , 所 以 進 行 藥 物 研 發 與 毒 性 篩 選 應 用 者 , 多 是 使 用 人 胚 胎 幹細 胞 。 所 以 一 個 產 品 之 開 發 , 需 對 不 同 幹 細 胞 特 性 、 科 學 上 研 發 進 展 、 產 品 最 終 標 的 , 有 非常 清 楚 之 瞭 解 , 這 張 圖 簡 單 介 紹 各 種 應 用 可 能 需 要 的 相 關 技 術 , 也 是 學 術 界 與 產 業 界 正 積 極進 行 之 研 發 方 向 。細 胞 分 離 、 純 化成 體 幹 細 胞 : 轉 譯 研 發臨 床 前 動 物 試 驗 、 臨 床 試 驗幹 細 胞臨 床 醫 療 應 用細 胞 培 養 、( 量 產 )、 誘 導 分 化藥 物 開 發 與毒 性 測 試特 定 組 織 之 細 胞胚 幹 細 胞 等 : 轉 譯 研 發臨 床 前 動 物 試 驗 、 臨 床 試 驗臨 床 醫 療 應 用研 究 發 育與 分 化 之基 因 調 控人 類 疾 病細 胞 模 式圖 一 、 幹 細 胞 於 基 礎 醫 學 研 發 與 臨 床 應 用 之 技 術 發 展131

四 、 各 國 幹 細 胞 研 發 應 用 相 關 法 規所 有 產 品 要 商 業 化 的 第 一 步 就 是 要 符 合 相 關 法 規 , 幹 細 胞 產 品 除 要 符 合 相 關 醫 療 法 規 ,確 保 使 用 安 全 、 有 效 性 外 , 針 對 胚 胎 幹 細 胞 , 並 因 國 情 不 同 , 有 不 同 之 研 究 應 用 相 關 規 範 ,故 而 進 行 產 品 技 術 研 發 前 , 必 須 瞭 解 當 地 的 相 關 規 範 。 以 下 就 此 議 題 簡 單 介 紹 。1. 世 界 各 國 對 胚 胎 與 胚 胎 幹 細 胞 研 究 之 政 策全 世 界 對 胚 胎 與 胚 胎 幹 細 胞 研 究 之 政 策 規 範 , 依 各 國 宗 教 、 歷 史 背 景 , 可 進 行 不 同程 度 之 研 究 , 大 家 的 共 識 是 不 能 進 行 複 製 人 之 研 究 , 其 他 根 據 陳 英 鈐 教 授 所 譯 之 LeRoyWATERS 資 料 , 將 之 分 為 六 類 , 以 下 就 此 六 類 討 論 之 :• 第 一 類 禁 止 所 有 人 類 胚 胎 研 究 : 如 愛 爾 蘭 、 奧 地 利 、 波 蘭 、 挪 威 、 哥 斯 大 黎加 、 梵 諦 岡 。• 第 二 類 只 允 許 研 究 現 有 的 胚 胎 幹 細 胞 株 , 不 得 進 行 人 類 胚 胎 研 究 與 製 造 新 的胚 胎 幹 細 胞 株 , 如 德 國• 第 三 類 允 許 使 用 流 產 或 人 工 生 殖 的 剩 餘 胚 胎 , 製 造 新 的 胚 胎 幹 細 胞 株 , 如 加拿 大 、 以 色 列 、 日 本 、 澳 洲 、 印 度 、 瑞 士 、 巴 西 。• 第 四 類 允 許 使 用 剩 餘 胚 胎 , 以 及 特 別 為 研 究 目 的 , 以 體 外 受 精 方 式 (IVF) 製造 胚 胎 進 行 研 究 , 如 英 國 、 比 利 時 、 新 加 坡 ( 需 逐 案 審 查 )。• 第 五 類 允 許 使 用 剩 餘 胚 胎 , 以 及 特 別 為 研 究 目 的 , 以 體 細 胞 核 轉 移 至 人 類 卵細 胞 或 受 精 卵 方 式 製 造 胚 胎 進 行 研 究 : 英 國 、 比 利 時 、 瑞 典 、 韓 國 ( 總 統 批 准 )、 以 色列 ( 逐 案 審 查 )、 印 度 ( 逐 案 審 查 )、 新 加 坡 ( 逐 案 審 查 )、 臺 灣 ( 逐 案 審 查 )、 中 國 。• 第 六 類 允 許 使 用 剩 餘 胚 胎 , 以 及 特 別 為 研 究 目 的 , 將 人 類 體 細 胞 核 轉 殖 至 非人 類 卵 細 胞 裂 造 胚 胎 進 行 研 究 : 中 國至 於 美 國 , 其 聯 邦 政 府 經 費 補 助 之 研 究 限 於 第 二 類 。 但 私 人 經 費 以 及 有 些 州 政 府 經費 , 如 加 州 州 政 府 則 不 受 限 於 第 二 類 研 究 , 可 進 行 新 的 胚 胎 幹 細 胞 株 建 立 與 體 細 胞核 轉 移 研 究 。臺 灣 行 政 院 衛 生 署 於 2002 年 2 月 19 日 公 告 「 胚 胎 幹 細 胞 研 究 的 倫 理 規 範 」 使 胚 胎132

幹 細 胞 研 發 有 倫 理 規 範 可 尋 , 之 後 經 各 界 廣 泛 、 長 時 間 討 論 後 , 於 2007 年 8 月 9 日 修 訂 並公 告 「 人 類 胚 胎 與 胚 胎 幹 細 胞 研 究 倫 理 政 策 指 引 」, 全 文 如 圖 二 所 示 , 草 案 並 送 立 法 院 審 議 中 。一 、 人 類 胚 胎 及 胚 胎 幹 細 胞 研 究 ( 以 下 簡 稱 胚 胎 及 其 幹 細 胞 研 究 ), 應 本 尊 重 及 保 障 人 性 尊嚴 、 生 命 權 之 原 則 及 維 護 公 共 秩 序 善 良 風 俗 為 之 。二 、 胚 胎 及 其 幹 細 胞 研 究 應 遵 守 政 府 有 關 法 令 之 規 定 。三 、 胚 胎 及 其 幹 細 胞 研 究 不 以 下 列 方 式 為 之 :( 一 ) 使 用 體 細 胞 核 轉 植 技 術 製 造 胚 胎 並 植 入 子 宮 。( 二 ) 以 人 工 受 精 方 式 , 製 造 研 究 用 胚 胎 。( 三 ) 製 造 雜 交 體 。( 四 ) 體 外 培 養 已 出 現 原 條 之 胚 胎 。( 五 ) 繁 衍 研 究 用 胚 胎 或 將 研 究 用 胚 胎 植 入 人 體 或 其 他 物 種 之 子 宮 。( 六 ) 繁 衍 具 有 人 類 生 殖 細 胞 之 嵌 合 物 種 。( 七 ) 以 其 他 物 種 細 胞 核 植 入 去 核 之 人 類 卵 細 胞 。四 、 胚 胎 及 其 幹 細 胞 來 源 , 應 為 無 償 提 供 之 自 然 流 產 、 符 合 優 生 保 健 法 規 定 之 人 工 流 產 、 人工 生 殖 剩 餘 胚 胎 , 或 以 體 細 胞 核 轉 植 製 造 且 尚 未 出 現 原 條 之 胚 胎 或 胚 胎 組 織 。五 、 胚 胎 及 其 幹 細 胞 來 源 之 取 得 , 應 於 事 先 明 確 告 知 同 意 事 項 , 經 提 供 者 完 全 理 解 後 , 依 自由 意 願 簽 署 書 面 同 意 書 後 為 之 。六 、 以 人 類 卵 細 胞 進 行 體 細 胞 核 轉 植 研 究 , 應 為 依 法 施 行 人 工 生 殖 之 剩 餘 卵 細 胞 , 且 經 受 術夫 妻 或 捐 贈 人 書 面 同 意 ; 或 經 告 知 成 年 婦 女 並 取 得 其 書 面 同 意 捐 贈 之 卵 細 胞 。前 項 卵 細 胞 之 提 供 者 , 應 具 行 為 能 力 , 且 不 得 與 計 畫 主 持 人 有 職 務 上 之 關 係 。七 、 胚 胎 及 其 幹 細 胞 研 究 計 畫 應 經 研 究 機 構 倫 理 委 員 會 或 委 託 其 他 機 構 之 研 究 倫 理 委 員 會 審查 通 過 後 為 之 。前 項 審 查 , 應 注 意 下 列 事 項 :( 一 ) 研 究 計 畫 須 符 合 促 進 醫 療 與 科 學 發 展 、 增 進 人 類 健 康 福 祉 及 治 療 疾 病 之 目 的 。( 二 ) 難 以 使 用 其 他 研 究 方 法 獲 得 成 果 。( 三 ) 計 畫 內 容 具 備 科 學 品 質 並 符 合 倫 理 要 求 。圖 二 、「 人 類 胚 胎 與 胚 胎 幹 細 胞 研 究 倫 理 政 策 指 引 」, 衛 署 醫 字 第 0960223086 號 公 告http://dohlaw.doh.gov.tw/Chi/FLAW/FLAWDAT0202.asp133

2. 幹 細 胞 臨 床 醫 療 應 用 相 關 法 規隨 著 幹 細 胞 研 發 進 展 , 有 些 科 學 證 據 , 大 多 是 來 自 體 外 與 動 物 試 驗 , 顯 示 其 於 臨 床 移 植醫 療 之 效 果 , 故 各 國 紛 紛 進 行 針 對 幹 細 胞 臨 床 醫 療 應 用 制 訂 相 關 法 規 , 以 準 備 其 於 人 體 醫 療之 驗 證 與 實 施 , 法 規 之 宗 旨 均 在 於 確 保 此 細 胞 醫 療 技 術 於 人 體 使 用 之 安 全 與 有 效 性 。 美 國 藥物 與 食 品 檢 驗 局 (U.S. Department of Health and Human Services Food and DrugAdministration (FDA)) 之 中 Center for Biologics Evaluation and Research(CBER) 為 負 責規 範 與 查 驗 之 單 位 , 相 關 規 範 可 由 網 站 http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm 參 考「Guidance for Reviewers Instructions and Template for Chemistry, Manufacturing, andControl (CMC) Reviewers of Human Somatic Cell Therapy Investigational New DrugApplications (INDs)」, 而 臺 灣 衛 生 署 則 於 2002 公 告 人 體 細 胞 組 織 優 良 操 作 規 範 (91.12.13衛 署 醫 字 第 ○ 九 一 ○○ 七 八 六 七 七 號 公 告 ), 並 於 2003 年 公 告 「 體 細 胞 治 療 人 體 試 驗 申 請 與操 作 規 範 」( 衛 署 醫 字 第 ○ 九 二 ○ 二 ○ 二 四 七 七 號 公 告 , 全 文 詳 網 址http://dohlaw.doh.gov.tw/Chi/FLAW/FLAWDAT01.asp?lsid=FL027594) 以 確 保 細 胞 治 療 產品 之 安 全 與 有 效 性 。 另 外 針 對 「 細 胞 與 材 料 / 藥 物 」 或 者 是 「 細 胞 與 醫 療 器 材 」 之 複 合 產 品 ,則 除 細 胞 本 身 受 此 規 範 , 與 其 並 用 之 產 品 亦 需 合 乎 其 於 人 體 使 用 之 規 範 。五 、 幹 細 胞 產 業 現 況自 從 1998 年 美 國 科 學 家 James Thomson 第 一 次 成 功 於 體 外 分 離 培 養 人 胚 幹 細 胞 後因 其 展 現 的 生 長 與 分 化 潛 力 , 對 於 許 多 目 前 沒 有 藥 物 或 醫 療 方 式 的 重 症 疾 病 , 開 啟 了 無 限 的醫 療 新 希 望 , 故 而 在 全 世 界 引 起 一 股 對 幹 細 胞 研 發 之 熱 潮 , 各 國 政 府 紛 紛 投 入 大 量 研 究 資 源 ,而 民 間 資 金 亦 隨 之 投 入 , 私 人 公 司 開 始 成 立 , 一 股 新 興 的 產 業 悄 悄 萌 芽 。政 府 經 費 的 投 入 方 面 , 美 國 聯 邦 經 費 中 ,NIH 於 2006 年 於 幹 細 胞 相 關 研 發 經 費 共 美 金 6.43億 元 ( 約 臺 幣 212 億 ), 而 加 州 政 府 於 2005 年 底 通 過 公 投 , 同 意 舉 債 , 每 年 2.95 億 美 元 ( 約97 億 臺 幣 ) 共 十 年 , 支 助 幹 細 胞 研 發 經 費 , 包 括 人 胚 幹 細 胞 與 成 體 細 胞 , 此 舉 不 僅 吸 引 許 多科 學 家 , 也 促 成 一 些 幹 細 胞 相 關 公 司 於 加 州 的 成 立 與 研 發 。 英 國 、 以 色 列 、 瑞 典 、 新 加 坡 、加 拿 大 、 韓 國 與 中 國 在 這 方 面 也 很 積 極 。根 據 Frost & Sullivan 2004 的 市 場 報 告 , 全 球 共 有 超 過 200 個 公 司 與 學 術 機 構 從 事 幹 細胞 相 關 研 發 工 作 , 並 快 速 成 長 。 而 據 統 計 全 球 直 接 從 事 幹 細 胞 研 究 與 產 品 開 發 的 , 較 有 規 模 的公 司 在 2004 年 大 於 50 餘 家 , 雖 然 有 些 公 司 因 資 金 耗 盡 而 倒 閉 , 但 又 有 更 多 成 立 , 故 至 2006年 已 超 過 100 家 , 這 些 公 司 , 尚 不 包 括 提 供 幹 細 胞 研 發 試 劑 、 工 具 的 公 司 。 而 公 司 標 的 包 括人 胚 幹 細 胞 與 成 體 幹 細 胞 , 應 用 領 域 涵 蓋 細 胞 儲 存 (cell banking), 細 胞 放 大 , 藥 物 研 發 ,藥 物 毒 性 測 試 與 細 胞 醫 療 。 這 些 公 司 最 終 目 標 大 多 是 進 行 細 胞 醫 療 , 但 在 這 長 期 研 發 時 程 之中 , 因 為 公 司 資 金 籌 募 之 故 , 為 維 持 公 司 持 續 之 經 營 , 有 許 多 營 運 模 式 , 其 中 一 種 是 混 合 商業 模 式 , 即 利 用 既 有 正 在 開 發 之 技 術 , 順 便 提 供 服 務 以 賺 取 收 益 , 例 如 Cambrex Bioscience以 其 分 離 間 質 幹 細 胞 之 技 術 提 供 販 售 人 骨 髓 間 質 幹 細 胞 , 以 及 培 養 液 , 並 提 供 cGMP 設 備供 人 類 細 胞 之 生 產 。 又 如 Cellartis AB 販 售 開 發 之 人 胚 幹 細 胞 株 與 繼 代 培 養 切 割 工 具 。 另 外1 ,134

這 一 、 二 年 有 些 具 潛 力 的 小 公 司 , 被 大 公 司 收 購 。茲 依 公 司 產 品 應 用 領 域 , 將 幹 細 胞 相 關 產 業 與 公 司 分 成 三 類 介 紹 之 :1. 開 發 幹 細 胞 研 發 所 需 之 試 劑 與 工 具 的 公 司 :幹 細 胞 許 多 領 域 都 還 在 研 發 階 段 , 所 以 如 培 養 液 、 培 養 基 質 、 抗 體 、 細 胞 來 源 、 細胞 生 長 與 分 化 所 需 之 生 長 因 子 與 試 劑 等 , 目 前 需 求 量 極 大 , 如 前 所 述 , 各 國 政 府 與 民 間甚 至 公 司 挹 注 龐 大 經 費 於 幹 細 胞 之 研 發 , 且 金 額 正 急 速 增 加 中 , 其 中 有 大 半 經 費 將 會 用於 採 購 研 發 耗 材 , 包 括 試 劑 與 工 具 等 , 所 以 幹 細 胞 的 研 發 市 場 是 目 前 極 大 的 一 個 產 業 契機 , 原 本 經 營 細 胞 研 發 試 劑 的 公 司 , 紛 紛 投 下 大 量 資 金 , 採 取 不 同 策 略 , 希 望 可 以 搶 攻幹 細 胞 之 研 發 市 場 。 以 培 養 液 為 例 說 明 之 , 見 表 三 與 表 四 ,表 一 、 細 胞 培 養 液 等 相 關 試 劑 2005 年 營 業 額 與 市 占 率 前 幾 名 的 公 司2005 年 營 業 額 市 場 佔 有 率公 司 單 位 : 億 美 元 百 分 比Invitrogen 4.62 36%Sigma-Aldrich 2.62 20%Fisher Scientific 1.90 14%Cambrex 1.50 11%Serologicals 1.36 10%Others 1.00 9%Total 13 100%4表 一 顯 示 2005 年 細 胞 培 養 液 等 相 關 試 劑 年 營 業 額 與 市 占 率 前 幾 名 的 公 司 , 分 別 是名 列 第 一 的 Invitrogen, 市 占 率 36%,,2005 年 營 業 額 4.62 億 美 金 ( 約 臺 幣 153 億 元 ),Sigma-Aldrich 第 二 , 市 占 率 20%,2005 年 營 業 額 2.62 億 美 金 ( 約 臺 幣 87 億 元 ), 而Serologicals 則 以 市 占 率 10%, 年 營 業 額 1.36 億 美 金 ( 約 臺 幣 45 億 元 ) 居 於 第 五 , 由表 二 可 知 , 此 公 司 2005 年 併 購 Specialty Media, 並 與 專 營 幹 細 胞 研 發 試 劑 的 Chemicon公 司 合 併 , 而 後 於 2006 年 被 Millipore 併 購 ,Millipore 這 二 、 三 年 積 極 切 入 幹 細 胞 研 發市 場 , 藉 由 併 購 專 營 幹 細 胞 研 發 試 劑 、 工 具 , 如 培 養 液 、 培 養 基 質 、 生 長 因 子 LIF(leukemiainhibitory factor) 與 幹 細 胞 特 有 抗 體 等 的 公 司 Serologicals Corporation_Chemicon, 使其 能 快 速 跨 入 此 領 域 , 並 率 先 於 2007 年 上 旬 推 出 第 一 個 無 異 種 成 分 (Xeno-free) 的 人胚 幹 細 胞 培 養 液 。 而 Invitrogen 則 於 2006 年 6 月 宣 布 , 已 向 全 球 最 大 的 人 胚 幹 細 胞 研發 公 司 Geron Corporation 取 得 授 權 , 可 開 發 、 製 造 與 銷 售 人 胚 幹 細 胞 培 養 相 關 試 劑 ,135

於 2007 年 下 半 年 推 出 人 胚 幹 細 胞 無 滋 養 層 培 養 液 與 基 質 。 另 外 Sigma-Adrich 於 2006年 10 月 宣 布 已 開 發 一 種 神 經 幹 細 胞 增 生 之 培 養 液4 。4表 二 、 幹 細 胞 研 發 市 場 主 要 公 司公 司與 幹 細 胞 相 關 訊 息Invitrogen1. 2005 年 併 購 以 研 發 市 場 所 需 之 檢 驗 試劑 與 抗 體 ( 含 幹 細 胞 特 有 抗 體 ) 為 主 要業 務 的 公 司 BioSource International2. 2006 年 並 取 得 向 全 球 最 大 的 人 胚 幹 細胞 研 發 公 司 Geron Corporation 取 得 授權 , 可 開 發 、 製 造 與 銷 售 人 胚 幹 細 胞 培養 相 關 試 劑3. 2007 年 推 出 人 胚 幹 細 胞 無 滋 養 層 培 養液 與 基 質Sigma-Aldrich_ JRH1. 2005 年 併 購 以 細 胞 培 養 液 、 試 劑 與 培 養Biosciences技 術 開 發 為 主 要 業 務 的 公 司 JRHBiosciences2. 2006 年 開 發 一 種 神 經 幹 細 胞 增 生 之 培養 液 。Millipore Corporation_1. 2005 年 併 購 以 幹 細 胞 細 胞 培 養 液 、 試 劑Serologicals Corporation_生 長 因 子 與 抗 體 為 主 要 業 務 的 公 司ChemiconSerologicals2. 2007 年 推 出 全 球 第 一 個 無 異 種 成 分 的人 胚 幹 細 胞 培 養 液2. 開 發 幹 細 胞 技 術 產 品 應 用 於 藥 物 毒 性 測 試 與 藥 物 研 發利 用 人 幹 細 胞 可 分 化 為 成 熟 有 功 能 性 的 組 織 細 胞 之 特 性 , 使 其 成 為 人 的 組 織 細 胞 , 可 提 供體 外 測 試 平 臺 , 進 行 藥 物 有 效 性 與 安 全 性 測 試 。 例 如 Cellular Dynamics International . Inc(http://www.cellular-dynamics.com/), 這 個 2005 年 由 Dr. James Thomson( 全 世 界 第 一 個成 功 於 體 外 分 離 培 養 人 胚 幹 細 胞 的 科 學 家1 ), Dr. Crig January 與 Dr. Tim Kamp 等 科 學 家 與Tactics II 創 投 成 立 的 公 司 , 利 用 Thomson 與 Kamp 開 發 的 技 術 , 將 人 胚 幹 細 胞 誘 導 分 化 為人 心 肌 細 胞 (cardiomyocytes), 希 望 能 應 用 於 藥 物 安 全 與 有 效 性 的 篩 選 , 包 括 對 心 臟 之 毒 性測 試 , 提 升 藥 物 臨 床 試 驗 的 成 功 率 。 另 外 如 VistaGen Inc.(http://www.vistagen.com/htm_pages/homepage.htm) 也 利 用 人 胚 幹 細 胞 技 術 提 供 藥 物 篩選 與 研 發 平 臺 , 初 期 鎖 定 治 療 糖 尿 病 與 中 樞 神 經 系 統 之 藥 物 。 而 瑞 典 公 司 Cellartis AB136

(http://www.cellartis.com/) 亦 致 力 開 發 人 胚 幹 細 胞 技 術 應 用 於 藥 物 研 發 與 毒 性 測 試 以 及 再生 醫 學 , 第 一 階 段 為 誘 導 分 化 為 肝 臟 細 胞 與 心 肌 細 胞 進 行 藥 物 研 發 與 毒 性 測 試 。3. 開 發 幹 細 胞 技 術 與 產 品 應 用 於 細 胞 治 療細 胞 治 療 是 所 有 幹 細 胞 公 司 的 最 終 目 標 , 根 據 2006 cell therapy commercializationD&MD 市 場 調 查 報 告 , 目 前 細 胞 治 療 市 場 美 國 約 為 2 億 美 金 , 歐 洲 為 3 億 美 金 , 並 快 速 成長 當 中 , 預 估 至 2011 年 美 國 約 為 2.8 億 美 元 , 歐 洲 為 4.6 億 美 元 , 其 中 人 胚 幹 細 胞 占 約 20%成 體 幹 細 胞 約 45%, 細 胞 移 植 相 關 器 材 用 品 占 20%。 而 根 據 stem cell analysis and marketforecast 2006-2016 報 告 , 全 球 幹 細 胞 相 關 產 品 市 場 在 2011 年 為 13 億 美 元 ,2016 年 將 會達 80.5 億 美 元 , 而 治 療 標 的 以 整 形 外 科 (orthopedic indications) 占 最 大 比 例 約 為 30-40%,其 次 是 糖 尿 病 , 抗 發 炎 , 神 經 修 復 , 心 血 管 疾 病 , 牙 科 治 療 與 其 他 疾 病 。 並 預 估 2016 年 至少 會 有 16 個 幹 細 胞 產 品 通 過 FDA 審 核 , 用 於 疾 病 醫 療 上 , 屆 時 將 會 有 上 千 個 醫 生 使 用 於治 療 上 百 萬 個 病 人5 。 表 五 列 出 幾 個 已 有 細 胞 治 療 產 品 上 市 之 公 司 , 表 六 則 是 細 胞 治 療 產 品已 進 入 臨 床 試 驗 之 公 司 , 表 七 為 以 人 胚 幹 細 胞 相 關 技 術 為 產 品 並 積 極 進 行 細 胞 治 療 技 術 產品 開 發 的 公 司 , 主 要 是 幹 細 胞 治 療 的 公 司 , 由 這 些 資 料 可 看 出 目 前 已 有 產 品 或 以 進 入 臨 床試 驗 者 多 是 利 用 成 體 幹 細 胞 , 其 中 又 以 間 質 幹 細 胞 為 主 , 治 療 標 的 主 要 是 心 臟 ( 尤 其 是 心肌 梗 塞 )、 中 樞 神 經 、 軟 硬 骨 之 修 復 。 而 美 國 Osiris Therapeutics 更 利 用 骨 髓 間 質 幹 細 胞 有免 疫 調 節 功 能 的 特 性 , 開 發 應 用 於 醫 療 移 植 排 斥 引 起 的 嚴 重 反 應 (graft-versus-hostdisease), 且 已 進 入 臨 床 試 驗 第 三 期 , 表 示 已 通 過 第 一 期 (phaseI) 安 全 性 測 試 , 第 二 期(phase II) 小 樣 本 有 效 性 測 試 , 所 以 可 進 入 第 三 期 (phase III) 大 樣 本 有 效 性 測 試 , 目 前結 果 良 好 , 一 般 來 說 , 第 三 期 試 驗 結 果 證 實 有 效 、 安 全 後 , 技 術 產 品 即 可 上 市 。137

表 三 、 有 細 胞 治 療 產 品 上 市 的 公 司公 司 / 所 在 地 細 胞 種 類 治 療 標 地 產 品 狀 況 / 商 品 名Genzyme軟 骨 細 胞修 復 軟 骨 損 傷 上 市 (Carticel)Cambridge, 美 國 (Chondrocytes) (cartilagedefects)CellTranSheffield, 英 國角 質 細 胞(Keratinocytes) 角 膜細 胞 ( corneal cells) 與黑 色 素 細 胞(melanocytes)燒 燙 傷 , 糖 尿 病引 起 之 創 傷上 市 (Myskin)a polymercombined withautologouskeratinocytesOrganogenesis 角 質 細 胞慢 性 創 傷 上 市 (Apligraf)Canton, 美 國(Keratinocytes) 與 纖維 母 細 胞 (fibroblasts)TheraVitaeBangkok, Thailand and周 邊 血 裏 的 血 管 生 成 前軀 細 胞 (Angiogenic心 臟 疾 病 上 市 (VesCell, 泰國 )Ness Ziona, 以 色 列http://www.theravitae.comprecursor cells fromperipheral blood)ViaCellCambridge, 美 國臍 帶 血 幹 細 胞 (Cordblood stem cells)血 液 疾 病 、 心 臟疾 病 、 糖 尿 病 、中 風上 市 (Viacord,pediatrictransplantationproduct)Vet-StemPoway, 美 國馬 匹 的 脂 肪 組 織 幹 細 胞(Horseadipose-derived stemcells)修 復 馬 匹 的 韌帶 、 肌 腱 損 傷上 市 (Vet-StemStat stem cellcollection andtransplant servicefor horses)6表 三 所 列 有 細 胞 治 療 產 品 上 市 的 公 司 中 , 可 看 出 全 世 界 第 一 個 經 FDA 審 核 通 過 上 市 之 細胞 治 療 產 品 是 Genzyme 的 Carticel, 這 是 一 個 利 用 軟 骨 細 胞 修 復 關 節 受 損 之 商 品 。 而TheraVitae 在 泰 國 上 市 的 產 品 VesCell, 則 是 利 用 周 邊 血 裏 的 血 管 生 成 前 軀 細 胞 (Angiogenicprecursor) 修 復 心 肌 梗 塞 之 病 人 。ViaCell 是 美 國 那 斯 達 克 (Nasdaq) 股 票 上 市 公 司 , 美 國最 大 的 臍 帶 血 收 集 公 司 , 除 了 開 發 利 用 臍 帶 血 幹 細 胞 治 療 血 液 疾 病 、 心 臟 疾 病 、 糖 尿 病 外 ,也 利 用 其 冷 凍 、 儲 存 細 胞 技 術 , 發 展 冷 凍 保 存 卵 子 的 技 術 產 品 (Viacyte) 正 在 跟 FDA 申 請510K 審 核 後 預 計 上 市 。 而 Vet-Stem 則 是 鎖 定 馬 匹 ( 尤 其 是 賽 馬 ) 為 治 療 對 象 , 抽 取 馬 匹 的脂 肪 組 織 幹 細 胞 修 復 韌 帶 、 肌 腱 ,138

表 四 、 產 品 已 經 在 進 行 臨 床 試 驗 的 公 司公 司 / 所 在 地 細 胞 來 源 治 療 標 的 臨 床 試 驗 狀 況TiGenix軟 骨 細 胞 與 間 質 幹 骨 關 節 炎 , 軟 骨 、 心 肌 損 Phase IIILeuven, 比 利 時細 胞 ( Chondrocytesand MSCs)傷 、 肌 肉 萎 縮Aastrom BiosciencesAnn Arbor, 美 國http://www.aastrom.com/骨 髓 幹 細 胞 (Bonemarrow-derivedstem cells)骨 頭 移 植 、 血 管 組 織 、軟 骨 組 織 修 復PhaseI&III (US,Spain), (Germany)Phase I/IIPhase I/IIOsiris TherapeuticsBaltimore, 美 國http://www.osiristx.com/a骨 髓 間 質 幹 細 胞MSCs from bonemarrow移 植 排 斥 引 起 的 嚴 重 反應 (Graft-versus-hostdisease)、 心 肌 受 損 、Phase III (US)(US)Phase I/II (US)bout.php新 月 形 膝 關 節 受 損BioHeartSunrise, 美 國骨 骼 肌 (Skeletalmuscle cells)心 肌 梗 塞 引 起 心 臟 衰 竭 PhaseI/II (US,Europe)6GenVecGaithersburg, 美 國骨 骼 肌 之 肌 肉 母 細胞 (Myoblasts from心 臟 衰 竭PhaseIskeletal muscle)Stem CellsPalo Alto, 美 國由 腦 、 肝 臟 與 胰 臟 取得 之 神 經 幹 細 胞中 樞 神 經 併 發 症 引 起 的代 謝 異 常IND(Neural stem cellsfrom brain, liver,and pancreas)Vesta TherapeuticsDurham, 美 國肝 細 胞 與 肝 臟 前 軀細 胞 (Hepatocytes肝 臟 疾 病Phase I (US)and hepatocyteprogenitor cells)表 四 中 可 看 出 產 品 已 經 在 進 行 臨 床 試 驗 的 公 司 , 治 療 標 的 多 是 軟 、 硬 骨 與 心 臟 方 面 的 疾病 , 所 使 用 的 細 胞 多 是 成 體 幹 細 胞 , 包 括 Astron Biosciences 利 用 骨 髓 間 質 幹 細 胞 進 行 骨 組織 修 復 已 進 行 到 臨 床 試 驗 第 三 期 ,Osiris Therapeutics 也 利 用 骨 髓 間 質 幹 細 胞 除 了 進 行 前 段介 紹 的 用 於 醫 療 移 植 排 斥 引 起 的 嚴 重 反 應 , 另 外 於 2006 年 開 始 進 行 異 體 移 植 治 療 心 肌 梗 塞臨 床 試 驗 第 一 期 。Stem cells Inc. 則 是 利 用 神 經 幹 細 胞 來 治 療 中 樞 神 經 、 肝 臟 與 胰 臟 的 疾 病 ,它 也 是 個 美 國 那 斯 達 克 股 票 上 市 公 司 。139

表 五 、 以 人 胚 幹 細 胞 相 關 技 術 為 產 品 的 公 司公 司GeronMenlo Park, California andEdinburgh, 美 國http://www.geron.com/Nasdaq:GERNES Cell InternationalSingapore, 新 加 坡http://www.escellinternational.com/Cellartis ABGoteborg, Swedenhttp://www.cellartis.com/經 營 方 向1. 以 人 胚 幹 細 胞 相 關 技 術 進 行 細 胞治 療 脊 髓 損 傷 、 心 衰 竭 、 糖 尿 病 、關 節 炎 等2. 藉 由 調 控 染 色 體 終 端 酵 素 進 行 包括 癌 症 之 醫 療 (telomeraseregulation therapeutics)1. 以 人 胚 幹 細 胞 相 關 技 術 進 行 細 胞治 療 糖 尿 病 、 心 衰 竭 、 退 化 性 神經 病 變2. 提 供 人 胚 幹 細 胞 株1. 開 發 人 胚 幹 細 胞 技 術 應 用 於 藥 物研 發 與 毒 性 測 試2. 人 胚 幹 細 胞 量 產 與 品 質 提 升3. 提 供 人 胚 幹 細 胞 株表 五 則 是 列 出 以 人 胚 幹 細 胞 相 關 技 術 進 行 細 胞 治 療 為 產 品 的 公 司 , 其 中 最 大 的 是 美 國美 國 那 斯 達 克 股 票 上 市 公 司 Geron, 它 開 發 利 用 人 胚 幹 細 胞 衍 生 細 胞 進 行 移 植 醫 療 的 技 術與 產 品 之 腳 步 , 居 於 世 界 之 冠 , 公 司 經 營 策 略 是 與 學 術 、 研 發 機 構 密 切 合 作 , 其 豐 富 優 異的 期 刊 論 文 , 包 括 數 篇 在 Nature Biotechnology 7 ,The Journal of Neuroscience 8 ,Stemcells 等 知 名 國 際 期 刊 發 表 者 , 以 及 佈 局 完 整 、 品 質 優 良 的 專 利 , 涵 蓋 了 人 胚 幹 細 胞 培 養 、分 化 、 移 植 排 斥 、 醫 療 應 用 等 範 圍 , 醫 療 應 用 中 含 括 了 神 經 、 心 臟 、 軟 硬 骨 、 肝 臟 、 糖 尿病 等 疾 病 , 使 得 公 司 發 展 有 極 為 優 厚 、 獨 特 的 利 基 , 這 也 是 為 何 Invitrogen 要 於 2006 年 向其 取 得 授 權 , 開 發 、 製 造 與 銷 售 人 胚 幹 細 胞 培 養 相 關 試 劑 。Geron 並 率 先 在 2004-2005 年著 手 建 立 符 合 臨 床 使 用 優 良 操 作 規 範 GTP 等 級 的 細 胞 , 並 與 University of California atIrvine 的 Hans S. Keirstead 合 作 , 將 人 胚 幹 細 胞 分 化 為 寡 突 前 軀 細 胞 (oligodendrocyteprogenitor cell) 9 , 而 後 將 人 胚 幹 細 胞 衍 生 的 寡 突 前 軀 細 胞 (human embryonic stemcell-derived oligodendrocyte progenitor cell) 植 入 脊 髓 損 傷 的 大 鼠 體 內 , 發 覺 可 以 幫 助 修復 受 損 神 經 並 恢 復 運 動 功 能 (locomotion) 8 , 所 以 2007 年 即 向 美 國 FDA 提 出 臨 床 試 驗 申請 , 計 畫 利 用 人 胚 幹 細 胞 衍 生 的 寡 突 前 軀 細 胞 , 移 植 醫 療 急 性 脊 髓 損 傷 的 病 人 , 若 此 人 體臨 床 試 驗 通 過 , 將 會 是 第 一 個 人 胚 幹 細 胞 技 術 應 用 於 細 胞 移 植 醫 療 之 產 品 ,Geron 在 這 方面 , 確 實 是 開 路 先 鋒 。ES Cell International 則 是 利 用 澳 洲 莫 爾 本 大 學 的 人 胚 幹 細 胞 技 術 ,在 新 加 坡 成 立 的 公 司 , 新 加 坡 政 府 投 入 相 當 多 經 費 , 也 是 最 大 股 東 , 除 了 建 立 的 人 胚 幹 細胞 株 , 於 2006 年 宣 布 建 立 了 無 異 種 源 污 染 的 、GTP 等 級 的 細 胞 株 , 可 供 臨 床 應 用 , 公 司也 致 力 於 利 用 人 胚 幹 細 胞 技 術 治 療 糖 尿 病 。Cellartis AB 除 了 之 前 所 述 開 發 人 胚 幹 細 胞 技術 應 用 於 藥 物 研 發 與 毒 性 測 試 , 也 擁 有 30 多 個 人 胚 幹 細 胞 細 胞 株 , 其 中 2 個 是 可 於 美 國 聯140

邦 政 府 經 費 支 助 下 使 用 的 , 並 有 全 世 界 第 一 個 無 異 種 源 污 染 的 人 胚 幹 細 胞 細 胞 株 , 公 司 並致 力 於 人 胚 幹 細 胞 量 產 與 品 質 提 升 , 包 括 發 展 自 動 化 培 養 系 統 。 公 司 的 經 營 策 略 是 與 學 術界 或 產 業 界 其 他 公 司 合 作 開 發 。總 結 以 上 幹 細 胞 相 關 產 業 狀 況 , 可 看 到 這 個 新 興 領 域 , 在 研 發 市 場 、 藥 物 研 發 、 毒 性 測試 以 及 細 胞 治 療 均 有 些 產 業 與 公 司 開 始 發 展 , 研 發 市 場 目 前 多 是 些 大 公 司 投 入 , 但 藥 物 研 發 、毒 性 測 試 以 及 細 胞 治 療 多 是 新 成 立 的 公 司 , 而 在 幹 細 胞 移 植 醫 療 方 面 , 成 體 幹 細 胞 已 有 些 產品 , 也 有 許 多 正 在 有 明 確 法 規 的 國 家 如 美 國 , 進 行 人 體 臨 床 試 驗 , 甚 至 已 經 到 第 三 期 ; 人 胚幹 細 胞 則 正 在 起 步 階 段 , 全 世 界 第 一 個 案 例 正 在 美 國 由 Geron 向 FDA 提 出 人 體 臨 床 試 驗 申請 。 綜 觀 目 前 學 術 界 於 幹 細 胞 科 學 研 發 與 公 司 之 技 術 發 展 , 可 見 的 未 來 , 幹 細 胞 必 定 會 成 為一 個 有 潛 力 的 新 產 業 。六 、 參 考 文 獻1. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J.,Marshall, V. S. & Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.Science 282:1145-7(1998).2. Lovell-Badge, R. The future for stem cell research. Nature 414:88-91 (2001).3. Ki rschstein, R. & Skirboll, L. R. Stem Cells: Scientific Progress and future directionshttp://stemcells.nih.gov/stemcell/scireport.asp.ES-1-ES-7 p1-5 (2001).4. Anscomb, A. Cell Culture: The World Markeet for Media, Sera, and Reagents AkloramaInformation. P57-75 (2007).5. Young, R. R. CFA. Stem Cell Analysis and Market Forecast 2006-2016, RRY publications.P1-35 (2007).6. Howard, W. K., Scott, C. T. & Herrera, S. Chasing a cellular fountain of youth. NatureBiotechnology 23:807--815 (2005).7. Xu, C., Inokuma, M. S., Denham, J., Golds, K., Kundu, P., Gold J. D. & Carpenter, M. K.Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. NatureBiotechnology 19:971-974 (2001).8. Keirstead, H. S., Nistor, G., Bernal, G., Totoiu M., Cloutier, F., Sharp, K. & Steward, O.Human embryonic stem-cell derived oligodendrocyte progenitor cell transplantsremyelinate and restore locomotion after spinal cord injury. The Journal of Neuroscience25:4694-4705 (2005).9. Nistor, G. I., Totov, M. O., Haque, N., Carpenter, M. K. & Keirstead, H. S. Humanembryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes in high purity andmyclinate after spinal cord transplantation. Glia. 49:385-396 (2005).141

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作 者 簡 歷陳 信 孚現 任 :臺 大 醫 院 婦 產 部 主 治 醫 師臺 大 醫 學 院 基 因 體 暨 蛋 白 體 醫 學 研 究 所 副 教授 兼 所 長臺 灣 生 殖 醫 學 會 理 事 長臺 灣 幹 細 胞 醫 學 會 監 事臺 灣 婦 產 科 醫 學 會 副 秘 書 長最 高 學 歷 :臺 灣 大 學 醫 學 系 醫 學 士經 歷 :臺 大 醫 院 婦 產 部 生 殖 內 分 泌 科 研 究 員加 拿 大 英 屬 哥 倫 比 亞 大 學 婦 產 科 博 士 後 研 究員巴 黎 大 學 附 設 醫 院 婦 產 部 生 殖 內 分 泌 科 研 究員中 華 民 國 不 孕 症 暨 生 殖 內 分 泌 醫 學 會 秘 書 長E-mail:hfchen@ntu.edu.tw何 弘 能現 任 :臺 大 醫 院 婦 產 部 主 治 醫 師臺 大 醫 學 院 免 疫 學 研 究 所 教 授 ( 合 聘 )臺 大 醫 學 院 副 院 長最 高 學 歷 :國 立 臺 灣 大 學 醫 學 院 醫 學 士經 歷 :美 國 加 州 大 學 洛 杉 磯 分 校 研 究 員美 國 匹 玆 堡 大 學 研 究 員臺 大 醫 院 醫 研 部 主 任臺 大 醫 院 副 院 長臺 灣 生 殖 醫 學 會 理 事 長E-mail:hnho@ntu.edu.tw郭 紘 志現 任 :中 央 研 究 院 細 胞 曁 個 體 生 物 學 研 究 所 助 研究 技 師台 北 醫 學 大 學 臨 床 醫 學 研 究 所 兼 任 助 理 教 授最 高 學 歷 :英 國 倫 敦 大 學 英 皇 學 院 博 士經 歷 :美 國 奧 立 岡 國 家 靈 長 類 研 究 中 心 博 士 後 研 究員美 國 奧 立 岡 國 家 靈 長 類 研 究 中 心 研 究 科 學 家E-mail:kuohuch@gate.sinica.edu.tw陳 淑 華現 任 :中 央 研 究 院 資 訊 科 學 研 究 所 博 士 後 研 究 員最 高 學 歷 :國 立 臺 灣 大 學 動 物 學 研 究 所 博 士經 歷 :中 央 研 究 院 細 胞 曁 個 體 生 物 學 研 究 所 博 士 後研 究 員E-mail:sophia@iis.sinica.edu.tw張 為 芳現 任 :中 央 研 究 院 基 因 體 研 究 中 心 研 究 助 理最 高 學 歷 :國 立 中 興 大 學 動 物 科 學 研 究 所 碩 士莊 靜 玉現 任 :中 央 研 究 院 細 胞 曁 個 體 生 物 學 研 究 所 博 士 後研 究 員研 究 生最 高 學 歷 :143

英 國 倫 敦 大 學 帝 國 學 院 碩 士臺 灣 大 學 生 物 科 技 研 究 所 博 士經 歷 :英 國 倫 敦 大 學 MRC 神 經 發 育 研 究 中 心 研 究助 理中 央 研 究 院 基 因 體 研 究 中 心 研 究 助 理沈 家 寧現 任 :中 央 研 究 院 基 因 體 研 究 中 心 副 研 究 員國 立 陽 明 大 學 醫 學 生 物 技 術 研 究 所 兼 任 助 理教 授最 高 學 歷 :英 國 巴 斯 大 學 發 育 生 物 學 博 士經 歷 :臺 灣 幹 細 胞 學 會 秘 書 長英 國 巴 斯 大 學 再 生 醫 學 中 心 博 士 後 研 究 員美 國 德 州 大 學 醫 學 部 病 理 及 微 免 系 訪 問 學 者E-mail:cnshen@gate.sinica.edu.tw林 宇 星現 任 :國 防 醫 學 院 生 命 科 學 研 究 所 博 士 班 研 究 生最 高 學 歷 :國 立 中 興 大 學 生 物 化 學 研 究 所 碩 士經 歷 :中 研 院 生 醫 所 國 防 研 究 役E-mail:omstares@hotmail.com張 曉 旻現 任 :國 立 陽 明 大 學 微 生 物 及 免 疫 學 研 究 所 博 士 班最 高 學 歷 :長 庚 大 學 醫 學 生 物 技 術 研 究 所 碩 士經 歷 :林 口 長 庚 醫 院 研 究 助 理E-mail:snowdreams2002@yahoo.com.tw陳 志 龍現 任 :國 防 醫 學 院 生 命 科 學 研 究 所 博 士 班最 高 學 歷 :國 立 中 興 大 學 生 物 化 學 研 究 所 碩 士經 歷 :中 研 院 分 生 所 國 防 研 究 役E-mail:Jyhlong.chen@gmail.com簡 皎 芸現 任 :國 立 臺 灣 大 學 生 物 科 技 研 究 所 博 士 班最 高 學 歷 :國 立 成 功 大 學 藥 理 研 究 所 碩 士經 歷 :中 研 院 基 因 體 研 究 中 心 研 究 助 理E-mail:happyepi@gate.sinica.edu.tw李 光 申現 任 :國 立 陽 明 大 學 臨 床 醫 學 研 究 所 教 授臺 北 榮 民 總 醫 院 骨 科 部 主 治 醫 師最 高 學 歷 :陽 明 大 學 醫 學 系英 國 倫 敦 大 學 骨 科 醫 學 所 碩 士英 國 倫 敦 大 學 醫 學 工 程 研 究 所 博 士政 治 大 學 科 技 管 理 研 究 所 碩 士經 歷 :陽 明 大 學 幹 細 胞 研 究 中 心 主 任陽 明 大 學 大 學 國 際 事 務 處 副 國 際 長臺 北 榮 民 總 醫 院 骨 科 住 院 醫 師 / 總 醫 師英 國 倫 敦 皇 家 骨 科 醫 院 臨 床 進 修 醫 師英 國 倫 敦 大 學 醫 學 工 程 中 心 研 究 員臺 東 榮 民 醫 院 骨 科 主 任144

許 素 菁現 任 :國 家 衛 生 研 究 院 感 染 症 與 疫 苗 研 究 所 助 研 究員最 高 學 歷 :國 立 臺 灣 大 學 微 生 物 學 研 究 所 博 士經 歷 :美 國 杜 蘭 大 學 (Tulane University) 博 士 後研 究 員E-mail:mschsu@nhri.org.tw何 慧 君現 任 :萬 芳 醫 院 眼 科 主 治 醫 師臺 北 醫 學 大 學 臨 床 醫 學 研 究 所 副 教 授最 高 學 歷 :國 立 陽 明 大 學 生 物 藥 學 研 究 所 博 士經 歷 :佛 教 慈 濟 綜 合 醫 院 臺 北 分 院 眼 科 主 治 醫 師臺 北 榮 民 總 醫 院 眼 科 部 住 院 醫 師臺 北 榮 民 總 醫 院 眼 科 部 住 院 總 醫 師臺 東 榮 民 醫 院 眼 科 主 治 醫 師國 立 陽 明 大 學 醫 學 院 PBL 小 組 課 程 教 師何 嘉 倫現 任 :國 立 成 功 大 學 臨 床 醫 學 研 究 所 專 任 助 理最 高 學 歷 :加 拿 大 多 倫 多 大 學經 歷 :國 立 成 功 大 學 臨 床 醫 學 研 究 所生 達 製 藥 股 份 有 限 公 司扶 陞 國 際 貿 易 有 限 公 司E-mail:Kate88h@gmail.com王 僅 文現 任 :成 功 大 學 醫 學 工 程 研 究 所 博 士 生最 高 學 歷 :中 山 醫 學 大 學 口 腔 材 料 科 學 研 究 所 碩 士經 歷 :高 雄 長 庚 醫 院 基 因 治 療 實 驗 室 研 究 助 理成 功 大 學 生 物 科 技 中 心 研 究 組 助 理E-mail:p8892109@mail.ncku.edu.tw邱 智 東現 任 :成 功 大 學 臨 床 醫 學 所 博 士 後 研 究 員最 高 學 歷 :陽 明 大 學 醫 學 工 程 所 博 士E-mail:tung2chi@gmail.com謝 清 河現 任 :成 功 大 學 附 設 醫 院 心 臟 血 管 外 科 主 治 醫 師成 功 大 學 臨 床 醫 學 研 究 中 心 / 醫 工 所 副 教 授最 高 學 歷 :高 雄 醫 學 大 學 醫 學 系美 國 華 盛 頓 大 學 醫 學 工 程 研 究 所 博 士經 歷 :Brigham and Women's Hospital 研 究 員哈 佛 醫 學 院 研 究 員臺 大 醫 院 住 院 醫 師 及 總 醫 師E-mail:phsieh@mail.ncku.edu.tw吳 信 志現 任 :臺 灣 大 學 動 物 科 學 技 術 學 系 副 教 授最 高 學 歷 :國 立 臺 灣 大 學 畜 產 系 博 士經 歷 :臺 灣 動 物 科 技 研 究 所 副 研 究 員仁 德 醫 護 管 理 專 科 學 校 兼 任 助 理 教 授美 國 康 乃 迪 克 大 學 訪 問 學 者臺 灣 養 豬 科 學 研 究 所 副 研 究 員145

美 國 農 業 部 訪 問 學 者E-mail:scw01@ntu.edu.tw鄭 登 貴現 任 :臺 灣 大 學 動 物 科 技 學 系 終 身 特 聘 教 授最 高 學 歷 :英 國 劍 橋 動 物 生 理 學 研 究 所 哲 學 博 士經 歷 :臺 灣 大 學 生 物 科 技 研 究 所 所 長臺 灣 大 學 畜 產 學 系 系 主 任臺 灣 大 學 畜 產 學 系 教 授臺 灣 大 學 畜 產 學 系 生 物 技 術 中 心 主 任臺 灣 畜 產 試 驗 所 生 理 系 系 主 任臺 灣 畜 產 試 驗 所 生 理 系 研 究 員E-mail:wtkcheng@ntu.edu.tw徐 善 慧現 任 :臺 灣 大 學 高 分 子 科 學 與 工 程 學 研 究 所 教 授最 高 學 歷 :美 國 凱 斯 西 儲 大 學 生 物 醫 學 工 程 學 博 士經 歷 :中 興 大 學 化 工 系 特 聘 教 授 / 組 織 工 程 與 幹 細胞 研 究 中 心 主 任美 國 哈 佛 大 學 訪 問 研 究日 本 京 都 大 學 訪 問 研 究E-mail:shhsu@dragon.nchu.edu.tw黃 效 民現 任 :食 品 工 業 發 展 研 究 所 生 物 資 源 保 存 及 研 究 中心 副 主 任台 灣 幹 細 胞 庫 計 畫 主 持 人最 高 學 歷 :美 國 羅 格 斯 大 學 微 生 物 和 分 子 遺 傳 學 博 士美 國 牙 醫 暨 醫 學 大 學 生 物 醫 學 博 士經 歷 :食 品 工 業 發 展 研 究 所 生 物 資 源 保 存 及 研 究 中心 資 深 研 究 員E-mail:hsm@firdi.org.tw李 茂 盛現 任 :中 山 醫 學 大 學 醫 學 研 究 所 教 授李 茂 盛 婦 產 科 院 長最 高 學 歷 :中 山 醫 學 大 學 醫 學 系日 本 東 邦 大 學 醫 學 博 士經 歷 :中 山 醫 學 大 學 附 設 醫 院 婦 產 部 兼 產 科 主 任中 山 醫 學 大 學 附 設 醫 院 不 孕 症 研 究 室 主 任中 山 醫 學 大 學 護 理 系 系 主 任中 山 醫 學 大 學 研 究 所 教 授中 臺 醫 事 技 術 學 院 兼 任 教 授中 國 醫 藥 大 學 醫 學 系 教 授E-mail:msleephd@giga.net.tw陳 甫 州現 任 :國 立 中 興 大 學 醫 學 科 技 研 究 所 兼 任 教 授臺 中 榮 民 總 醫 院 教 學 研 究 部 研 究 員 兼 任 幹細 胞 中 心 主 任最 高 學 歷 :美 國 奧 克 拉 荷 馬 大 學 化 學 暨 生 化 系 博 士經 歷 :中 國 化 學 會 中 區 分 會 理 事 長臺 灣 神 經 創 傷 學 會 常 務 理 事臺 灣 幹 細 胞 學 會 理 事E-mail:fucheng@vghtc.gov.tw146

陳 婉 昕現 任 :工 業 技 術 研 究 院生 技 與 醫 藥 研 究 所 幹 細 胞 技 術 部 經 理最 高 學 歷 :中 研 院 與 國 防 醫 學 院 合 辦 生 命 科 學 研 究 所 博士經 歷 :工 研 院 生 醫 中 心 幹 細 胞 應 用 技 術 開 發 計 畫( 人 胚 幹 細 胞 與 骨 髓 間 葉 幹 細 胞 相 關 計 畫 )副 理 / 研 究 員工 研 院 生 醫 中 心 肝 組 織 工 程 技 術 發 展 計 畫( 人 胚 幹 細 胞 相 關 計 畫 ) 研 究 員E-mail:WhsinChen@itri.org.tw147

148

索 引A.adenosine deaminase deficiency (ADA) 108腺 苷 酸 脫 胺 酶aggregate(s) 聚 合 體 21,76aggregate morphology 集 結 狀 態 65albumin 白 蛋 白 39alginate 褐 藻 酸 鹽 87alkaline phosphatase 鹼 性 磷 酸 酶 19,31alpha fetal protein (AFP) 胎 兒 蛋 白 39,Alzheimer’s disease 老 年 失 智 症 53animal cloning 動 物 複 製 75anti-human serum 抗 人 類 血 清 3,4,14aplastic anemia 再 生 不 良 貧 血 症 48apolipoprotein E (ApoE) 載 脂 蛋 白 E 39astrocyte 星 狀 細 胞 34,55atherosclerosis 動 脈 硬 化 68autograft 自 體 細 胞 移 植 75autologous transplant 自 體 移 植 58axon 軸 突 32B.β-galactosidase β- 半 乳 糖 苷 酶 基 因 39basic fibroblast growth factor (bFGF)鹼 性 纖 維 母 細 胞 生 長 因 子 5,6,8,13,29,31,32bioavailability 生 體 可 用 率 69biocompatibility 生 物 相 容 性 63biodegradable 生 物 可 降 解 性 67,75bioreactor(s) 生 物 反 應 器 86dynamic compression 壓 縮 式 生 物 反 應 器 92perfusion 灌 流 式 生 物 反 應 器 91spinner flask 攪 拌 式 生 物 反 應 器 91biorecognition molecules 生 物 辨 識 分 子 64biosensor 生 物 感 測 器 64bio-targeting 生 物 標 記 64blastocyst(s) 囊 胚 2,21,22,27,118,130blastomere 胚 葉 細 胞 13,76bone marrow 骨 髓 130bone morphogenesis protein (BMP)骨 形 態 發 生 蛋 白 29,30,31,32,36,37C.cardiomyocytes 心 肌 細 胞 21,136cardiovascular disease 心 臟 血 管 疾 病 80cell(s) 細 胞brain neuronal 腦 神 經 細 胞 77cumulus 卵 丘 細 胞 77embryonal carcinoma 胚 胎 瘤 細 胞 76embryonic germ 胚 胎 生 殖 細 胞 129endoderm 內 胚 層 細 胞 21epiblast 上 胚 板 細 胞 28epithelial 上 皮 細 胞 32feeder 飼 養 層 細 胞 9,99germ 生 殖 細 胞 1hematopoietic 造 血 細 胞 34mast 肥 大 細 胞 35muscle 肌 肉 細 胞 34neural 神 經 細 胞 21oligodendrocyte progenitor寡 突 前 軀 細 胞 140primordial germ始 基 生 殖 細 胞 76progenitor 源 祖 細 胞 51,104,105Sertoli 賽 托 力 氏 細 胞 77stromal 基 質 細 胞 31target 靶 細 胞 108transit amplify 暫 時 性 增 殖 細 胞 51vascular endothelial 血 管 內 皮 細 胞 34cell banking 細 胞 儲 存 134149

cell boundary 細 胞 邊 界 17cell fusion 細 胞 融 合 56cell morphology 細 胞 型 態 17cell replacement therapy 細 胞 替 代 治 療 104cell scaffold 細 胞 支 架 67cell tracking 細 胞 追 蹤 68channeling effect 隧 道 效 應 91chimera 嵌 合 體 125chimeric conceptus 嵌 合 胚 體 76chitosan 幾 丁 聚 醣 87cholangiocyte 膽 管 細 胞 38cleavage 卵 裂 27clone 複 製 76comparative genome hybridization (CGH)基 因 體 雜 交 比 較 法 22collagen 膠 原 蛋 白 30,87collagenase 膠 原 蛋 白 脢 6,30,99,101colony 細 胞 群 落 5colorimetric contrasts 色 度 顯 影 劑 65compact colonies 細 胞 聚 落 17complement 補 體 4compression 壓 縮 86conceptus 複 製 胚 體 81contrast agents 顯 影 劑 64cytogenetic analysis 細 胞 遺 傳 分 析 22cytotoxicity 細 胞 毒 性 63D.dendrimers 樹 狀 聚 合 物 64,66dendrite 樹 突 32deoxyribonucleic acid (DNA)去 氧 核 糖 核 酸13,64,67,69,76,81diabetes 糖 尿 病 103dielectric properties 介 電 性 質 65differentiation 分 化 27,47dimethyl sulfoxide (DMSO)二 甲 基 亞 碸 10,98,100,101dopamine 多 巴 胺 104E.ectoderm 外 胚 層 28eight cell stage 八 細 胞 時 期 27Electrospinning 電 紡 絲 法 67embryo splitting 早 期 胚 分 切 法 76embryoid bodies 類 胚 體 21emission spectrum 發 射 光 譜 64endoderm 內 胚 層 28enzyme digestion 酵 素 處 理 法 98epithelia 表 皮 細 胞 21extracellular matrix (ECM)細 胞 外 基 質 13,31,33,100F.Fanconi’s Anemia 范 可 尼 貧 血 106feeder cells 餵 養 細 胞 9,99ferrite 鐵 磁 體 65fiber-bonding 纖 維 鍵 結 89fibroblast 纖 維 母 細 胞 137embryonic 胚 胎 纖 維 母 細 胞 28fibroblast growth factor (FGF)纖 維 母 細 胞 生 長 因 子 34,38,39filter 過 濾 膜 2flatten 扁 平 化 18flow cytometry 流 式 細 胞 定 量 20fluid-flow 流 場 86fluorescence resonance energy65transfer (FRET) 螢 光 共 振 能 量 轉 移focal ischemic lesions 局 部 腦 缺 血 68four cell stage 四 細 胞 時 期 27freeze-drying 冷 凍 乾 燥 法 89G.gastrulation 腔 腸 化 27gelatin 動 物 明 膠 10,11,87gene knock out 基 因 剔 除 28,79gene targeting 基 因 定 位 轉 殖 79gene therapy 基 因 治 療 75,108150

genetic compatibility 遺 傳 相 容 性 80genetic selection 遺 傳 性 篩 擇 36genome modification 基 因 組 改 造 80germ line transmission 性 腺 傳 承 率 77glial precursor 神 經 膠 質 前 驅 細 胞 31glucagon 昇 糖 素 38glycerol 甘 油 98gold nanoparticles 金 奈 米 顆 粒 65Graft Versus Host Disease (GVHD) 53,移 植 物 對 抗 宿 主 疾 病 110,117,118,120,137,138granulocyte colony- stimulating factor顆 粒 球 細 胞 生 長 刺 激 素 108green fluorescence protein (GFP)綠 色 螢 光 蛋 白 39H.haemocytometer 血 球 計 數 器 10haptoglobin 結 合 素 39hemangioblast 血 液 血 管 母 細 胞 36hemoglobin 血 紅 蛋 白 39hepatoblast 肝 原 母 細 胞 38hepatocyte 肝 細 胞 31hepatocyte growth factor (HGF)肝 生 長 因 子 38,39heterogeneous cell population異 質 細 胞 族 群 68human foreskin fibroblast (HFF)人 類 包 皮 纖 維 母 細 胞 9,12hyaluronic acid 透 明 質 酸 87hydrogel 水 膠 69Hypermethylation 過 度 基 因 甲 基 化 作 用 81I.immunocompatibility 免 疫 相 容 性 69Immunocytochemistry 免 疫 細 胞 化 學 染 色 20immunosurgery 免 疫 手 術 法 3inner cell mass (ICM) 內 細 胞 團 2,28,118,125,130insulin 胰 島 素 37in utero transplantation 子 宮 內 移 植 53irradiation 輻 射 線 照 射 48iron oxide nanoparticles 氧 化 鐵 奈 米 顆 粒 64isopropanol 異 丙 醇 100K.keratinocyte lineage 表 皮 角 質 細 胞 系 31kidney capture 腎 臟 20L.latent heat 潛 熱 100Leukemia inhibitory factor (LIF)白 血 病 抑 制 因 子 21,29,30,31,135ligand 配 體 65liposomes 微 脂 粒 64,66liver bud 肝 芽 38locomotion 運 動 功 能 140M.macrophage 巨 噬 細 胞 35maghemite 磁 赤 鐵 礦 65magnetite 磁 鐵 礦 65Magnetic Resonance Imaging (MRI)磁 核 共 振 影 像 系 統 64,65,67,68mechanical dissection 機 械 式 切 割 法 98mesenchymal tissue 間 葉 組 織 32mesoderm 中 胚 層 28microenvironment 微 環 境 58,66micromanipulator 顯 微 操 作 器 21micrometer 微 米 63microemulsions 微 乳 劑 63mitomycin C 絲 裂 黴 素 -C 10,11,30molecule diagnosis 分 子 診 斷 64molecule image 分 子 影 像 64mouse embryonic fibroblasts (MEF)小 鼠 胚 胎 纖 維 母 細 胞 2,9,11,12,13,21multilineage hematopoietic clonies多 原 性 血 球 細 胞 株 54151

multiple sclerosis 多 發 性 硬 化 68multipotent 多 分 化 潛 能 129myoblast 肌 母 細 胞 35N.nano-biomaterials 奈 米 生 醫 材 料 63nanofibers 奈 米 纖 維 66nanometer 奈 米 63nanoparticles 奈 米 微 粒 66nanotechnology 奈 米 科 技 63nanowires 奈 米 線 材 66Netcord 國 際 臍 帶 血 網 106neuron 神 經 元 34cholinergic 膽 鹼 性 神 經 元 34dopaminergic 多 巴 胺 神 經 元 31serotonergic 血 清 素 神 經 元 34niche 利 基 58nonreproductive cloning 非 生 殖 性 複 製 80nucleoli 核 仁 17,18O.oligodendrocyte(s) 寡 突 細 胞 34,55,118oncostatin M (OSM) 抑 瘤 素 38,39ontogeny 發 生 學 50organic dyes 有 機 染 劑 64organogenesis 誘 導 器 官 發 育 33osteoarthritis 骨 關 節 炎 68osteocyte 成 骨 細 胞 34osteogenesis imperfecta 成 骨 不 全 症 53,110P.pancreatic bud 早 期 胰 芽 37Parkinson’s disease 帕 金 森 氏 症 80particulate leaching 微 粒 造 孔 89PBS 磷 酸 緩 衝 液 2,5,6,9,10peripheral myelin protein 周 邊 髓 質 蛋 白 55photo decomposition 光 解 效 應 65photonic crystal fiber 光 子 晶 體 纖 維 67pipetteman 微 量 吸 管 99pile-up 堆 疊 18Platelet Derived Growth Factor69,70(PDGF) 血 小 板 衍 生 生 長 因 子pluripotency 多 潛 能 分 化 特 性 17,28pluripotent 複 能 分 化 潛 能 1,121,129polycaprolactone 聚 己 內 酯 87polyglycolide 聚 甘 醇 酸 87polylactide 聚 乳 酸 87polymers 高 分 子 聚 合 物 66Positron Emission Tomography67(PET) 正 子 放 射 型 斷 層 掃 描 術postimplantation 著 床 27primitive erythocyte 原 始 紅 血 球 細 胞 35programmable freezer 程 式 降 溫 儀 100progenitor 前 驅 細 胞 31,36proliferation 無 限 制 增 殖 17,29protease 蛋 白 酶 2,70proto-oncogene 源 致 癌 症 基 因 109pulsatile flow reacto93r 悸 動 式 生 物 反 應 器Q.quantum dots (QD) 量 子 點 64quantum size effects 量 子 尺 寸 效 應 64R.rapid prototype 快 速 成 型 法 89regenerative medicine 再 生 醫 學 75,85reporter gene 報 導 基 因 75reprogramming 再 程 序 化 80retinoic acid 維 甲 酸 34rotating-wall vessels 旋 轉 式 生 物 反 應 器 92RT-PCR 反 轉 錄 聚 合 酶 連 鎖 反 應 19,20,21S.scaffold 支 架 69,86Science Magazine 科 學 雜 誌 49,50152

self-renewal 自 我 更 新severe combined immunodeficiency disease(SCID) 嚴 重 複 合 性 免 疫 缺 陷 症 17,28,129sex-linked lymphopenic immunological deficiency性 聯 遺 傳 之 淋 巴 球 細 胞 病 變 之 免 疫 不 全 症20,21,108,109shear-stress 剪 切 力 86signal transdufction 訊 號 傳 導 29solute effect 溶 質 效 應 97solvent 溶 劑 65somatic cell. nuclear transfer (SCNT)體 細 胞 核 轉 植 術 75,111somatostatin 體 抑 素 38spectral karyotyping (SKY)螢 光 染 色 光 譜 之 染 色 體 分 析 法 22spinal cord injury 脊 髓 損 傷 53,80spontaneous differentiation 自 發 性 分 化 17stages-specific embryonic antigen 18,19,20,31(SSEA) 階 段 特 異 性 胚 胎 抗 原stem cell(s) 幹 細 胞 75,85,97,103,117adult 成 體 幹 細 胞 27,47,75,97,130bone marrow-derived 骨 髓 幹 細 胞 48,106cancer 腫 瘤 幹 細 胞 68,130embryonic 胚 胎 幹 細 胞 47,75,97,106,129hematopoietic 造 血 幹 細 胞 36,47,106,118mesenchymal間 葉 系 幹 細 胞 47,49,103,106,130multipotent 複 能 性 幹 細 胞 76neural (NSCs) 神 經 幹 細 胞 47,55,106,122nuclear-transfer embryonic79(ntESCs) 核 移 植 胚 胎 幹 細 胞pluripotent (PSCs) 多 潛 能 幹 細 胞 27,76somatic 體 源 性 幹 細 胞 27,76totipotent (TSCs) 全 能 性 幹 細 胞 76unipotent 單 能 性 幹 細 胞 76stem cell biology 幹 細 胞 生 物 學 63stroke 中 風 53,80substrate 基 質 64subventricle zone (SVZ) 室 管 膜 下 區 121superparamagnetic 超 順 磁 64superparamagnetic iron oxide (SPIO)超 順 磁 性 氧 化 鐵 奈 米 粒 子 65,68Surface Plasmon Resonance (SPR)表 面 電 漿 共 振 65suspension culture 懸 浮 培 養 21synapse 胞 突 接 合 32synovial tissues 清 液 組 織 51T.targeted therapy 標 靶 治 療 68tension 拉 力 86teratoma 畸 胎 瘤 20,21,28,81,130testis 睪 丸 20therapeutic cloning 治 療 用 複 製 技 術 75,121three-dimensional printing 三 度 空 間 列 印 89tibialis anterior muscle 前 脛 肌 56tissue engineering 組 織 工 程 67,85totipotent 萬 能 分 化 潛 能 1,129toxicity 組 織 毒 性 65trabecular bone 髓 質 骨 51transcription factor 轉 錄 因 子 19,28transgenesis 基 因 轉 殖 75transversum mesenchyme 橫 膈 間 葉 38trophectoderm 胚 胎 滋 養 層 28trophoblast 滋 養 層 細 胞 3trypsin 胰 蛋 白 脢 30tumor growth factor β 乙 型 腫 瘤 生 長 因 子 29turbulent flow 紊 流 zygote 91two cell stage 二 細 胞 時 期 27U.umbilical cord 臍 帶 130umbilical cord blood 臍 帶 血 55,106,130V.vascular endothelial growth factor (VEGF)153

血 管 內 皮 生 長 因 子 40,69vitrification 玻 璃 化 7W.water-solubility 水 溶 性 63Wiskott-Aldrich Syndrome 歐 德 里 症 候 群 104Z.zygote 受 精 卵 27,129154

155