TP Réaction de Hill - Université de Neuchâtel

Laboratoire de Physiologie végétaleUniversité de NeuchâtelTravaux pratiques de Physiologie végétaleLA REACTION DE HILLDans cette réaction lumineuse mise en évidence par Hill en 1937, les électronsexcités par la lumière sont transportés via le photosystème II et la chaîne detransporteurs d'électrons jusqu'à un accepteur d'électrons artificiel (A).lumière2 H 2 O + 2 A → 2 AH 2 + O 2thylacoïdesOn peut suivre cette réaction de deux manières par:1. Mesure de la formation d'oxygène2. Mise en évidence de la réduction de l'accepteur d'électron.Dans cette expérience, nous allons suivre la réduction de l'accepteur d'électronsDCPIP (2,6-dichloro-phenolindophenol) qui est bleu dans son état oxydé et incoloredans son état réduit.DCPIP oxydé, bleuDCPIP réduit, incoloreLe transport d'électrons peut être interrompu par des inhibiteurs. Ainsi le fluxd'électrons est interrompu à un endroit de la chaîne des transporteurs d'électrons.Comme exemple d'agent inhibiteur du flux d'électrons, nous utiliserons les herbicidesAtrazine et DCMU (dichlorophényldiméthylurée) qui bloquent le flux d'électrons auniveau du photosystème II. Ces inhibiteurs vont affecter la réduction des accepteursd'électrons exogènes placés en aval du photosystème II.

Matériel :Matériel végétal300g petit poisSolutionsMilieu A0.33 M sorbitol30 mM KCl5 mM NaCl25 mM HEPES-KOH pH 7.62 mM EDTA-Na 21 mM MgCl 21 mM MnCl 20.5 mM K 2 HPO 45 mM ascorbate4 mM cystéineMilieu B30 mM KCl5 mM NaCl25 mM HEPES-KOH pH 7.62 mM EDTA-Na 21 mM MgCl 21 mM MnCl 2Acétone 80%1 mM DCMU (dans 60% EtOH)1 mM Atrazine (dans EtOH)Appareils : Centrifugeuse à Eppendorfs, tubes à essai en verre, Eppendorfs,broyeur, source lumineuse, bécher de 500 ml, pipettes de 100 µl et 1000 µl, pipettesde 10 et 5 ml, spectrophotomètre, cuvettes de mesure, bac à glace, feuilled'aluminium, gaze.1. Préparation de thylacoïdes fonctionnelsImportant : La préparation des thylacoïdes doit se faire au froid (bac à glace,chambre froide).• Laver 300 g de feuilles de petit pois.• Rincer les limbes à l'eau désionisée; puis broyer 3 x 3 secondes dans 750 mlde milieu A (froid).• Filtrer le broyat à travers quatre couches de gaze et répartir la suspensiondans des pots à centrifuger de 250 ml.• Sédimenter les chloroplastes en centrifugeant à 3000 rpm (rotor SLA-1500)pendant 2 min.• Jeter le surnageant et resuspendre les culots contenant les chloroplastes dansun volume total de 100 ml de milieu B.• Incuber 4 min (glace) dans ce même tampon afin de permettre la lyse deschloroplastes.• Centrifuger à 3000 rpm pendant 5 min. Eliminer les surnageants commeprécédemment. Resuspendre les thylacoïdes dans environ 5 ml de milieu B.La suspension de thylacoïdes est conservée à l'obscurité et au froid (glace).• Aliquoter une partie des thylacoïdes par 12 mL/groupe tels que laconcentration finale en thylacoides soit de 1-2 mg/mL en chlorophylle.

3. Mesure de l'activité de HillBIEN LIRE L'ENSEMBLE DU PARAGRAPHE AVANT DE COMMENCER !Préparer dans des tubes à essai en verre les mélanges suivants (volumes en ml) :Calculer x (volume de DCMU et d'Atrazine 1 mM à ajouter) et y (volume d’eau àajouter).-Tubes 1 + 2 3 + 4 5 + 6 7 – 14 15 – 22 23 + 24LUMIERE OBSCURITE LUMIERECHALEURLUMIEREDCMULUMIEREATRAZINELUMIERETEMOINMilieu B 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.5Thylacoïde 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 -DCMU 1 mM - - - x - -Atrazine 1 mM - - - - x -DCPIP (0,6 mM) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2H 2 O 0.3 0.3 0.3 y y 0.3Volume total 4 4 4 4 4 41 + 2 Conditions optimales pour la réaction de Hill3 + 4 Entourer les tubes avec de l'aluminium (obscurité)5 + 6 Incuber milieu B et thylacoïdes à 60°C pendant 10 min. (chauffage), etrefroidir (puis ajouter DCPIP et eau)7 à 14 Concentration de DCMU : 5 x 10 -5 M (tubes 7&8), 5 x 10 -6 M (tubes9&10), 5 x 10 -7 M (tubes 11&12) et 5 x 10 -8 M (tubes 13&14)15 à 22 Concentration d'atrazine : 5 x 10 -5 M (tubes 15&16), 5 x 10 -6 M (tubes17&18), 5 x 10 -7 M (tubes 19&20) et 5 x 10 -8 M (tubes 21&22).23 à 24 Témoins• Bien mélanger les tubes.• Placer les tubes à 30 cm d'une lampe 250 W. Afin de ne pas exposer les tubes àune trop grande chaleur (lampe) on placera un filtre de chaleur (vitre) entre lestubes et la source de lumière.• Prélever 1 ml après 5 min (tubes avec numéro impair) et après 10 min (tubesavec numéro pair) et déposer les échantillons dans des Eppendorfs, centrifugerpendant 2 min, a vitesse max• Mesurer l'absorbance A 600 dans une cuvette pour spectrophotomètre.L'absorbance mesurée dans les cuvettes 23 et 24 correspond à 0% de réduction duDCPIP. Par contre, l'absorbance mesurée dans les cuvettes 1 et 2 représente le100% de réduction. Utiliser du milieu B pour régler le zéro du spectrophotomètre.

Calculer le % de réduction dans les autres cuvettes par rapport à la réductionmaximale.4. Détermination de la concentration en chlorophylle• Placer 10 µl de suspension thylacoïdale dans 1 ml d'acétone 80%.• culotter les protéines dénaturées par centrifugation pendant 1 min.• Mesurer l'absorbance à A 652 .OD 652 x 100 (facteur de dilution) / 36 = mg chlorophylle/ml.