L'hybridation génomique comparative en microréseau d'ADN (HGCM)

L’hybridation génomiquecomparative en microréseaud’ADN (HGCM) à très hauterésolution en génétiquehumaineApplication au syndromed'AicardiDr Christophe NEMOSMaitre de Conférences en BiologiecellulaireFaculté de Médecine de Nancycnemos@uhp-nancy.frM2R 2008-2009

INTRODUCTIONLe génome diploïde humain (46 chromosomes, 3200 Mb) est sujet de part sa nature(ADN) à des réarrangements et des polymorphismes constitutionnels entrainant un trèslarge spectre de phénotypes allant de l’individu viable et adapté à l’individu non-viable.SKY

Existence et importance insoupçonnée de la variabilité de l'ADN en tant que séquencespolynucléotidiques à sub-microscopique (≥ 1 kb) dénommées séquences variantes ennombre de copies (CNVs) et régions comportant plusieurs CNVs (CNVRs).- N = 270 individus normaux- Identification de 1.500 régions variables en nombre de copies- 360 Mb englobant plus d’un millier de gènes connus

DEPUIS 2006…

2000 génomes - 20000 CNVs 600 Mb – 20% euchromatine

Hybridation Génomique Comparative en Microréseau d’ADN (HGCM)RESOLUTION DES « ARRAYS »

Hybridation Génomique Comparative en Microréseau d’ADN (HGCM)Puces à BAC80-200 kbRecouvrement Bruit de fond RésolutionPuces àfosmides/cosmides40 kbPuces àADNc50-250 mersPuces àOligonucléotides50-65 mers

Hybridation Génomique Comparative en Microréseau d’ADN (HGCM)Contrôles pools d’échantillons d’ADN NA15510 et NA10851 du NIGMS (US National Institute of General Medical Sciences) L'hybridation de l’ADN contrôle contre lui-même (efficacité d’analyse X10)Recommandations surestimation des CNV (contrôle unique) diminution de la détection des CNV dans les CNP critiquer les données obtenues-dosages différentiels dus aux hétérochromosomes-réarrangements somatiques des immunoglobulines-des altérations géniques engendrées par la culture cellulaire (trisomies en mosaïque)-instabilité génomique due aux transformations virales

GESTION DU SIGNAL EN HGCMFiltre bruit de fondFiltre dye-swapTRAITEMENT DU SIGNAL BRUTCONFRONTATIONAUXBASES DE DONNEESFiltre sonde consécutive (>3)Filtre récurrenceRéplicas d’expériencesIncidence de la variationCNP?, duplication?, délétion?Pertinence de la variationCodante?, régulation?, inconnue?Antécédents cliniquesComparaison avec l’observation faiteQ-PCRVALIDATIONDES RESULTATSCaryotype/FISHséquençage

HGCM: APPLICATION AU SYNDROME D’AICARDIEncéphalopathie rare liée au sexeIncidence 1/100 000 naissancesPrévalence: 4 000 cas dans le monde

27 ADNs (Aicardi) + ADN référent – 244KOligos variantsX31 206 sondes déviantes823/lame en moyenneFILTRESDye swapping FP 244K (IGR, témoin self/self) Algorithme5 459 variations: 17,5% du signal287/lame en moyenneRégions variantes(>3 sondes consécutives)Oligos variants(>3 patientes)FILTRES: DGV et DECIPHERCOTATION: 1-4 (régions) et 1-3 (oligos)

27 ADNs (Aicardi) + ADN référent – 244KOligos variants31206 sondesFILTRESDye swapping FP 244K (IGR, témoin self/self) Algorithme5459 variations166 FP identifiés par hybridation pool témoin self/self7 050 FP déterminés par l’IGRÉlimination de 441 oligos déviantsRégions variantes(>3 sondes consécutives)Oligos variants(>3 patientes)FILTRES: DGV et DECIPHERCOTATION: 1-4 (régions) et 1-3 (oligos)

27 ADNs (Aicardi) + ADN référent – 244KOligos variants31 206 sondesFILTRESDye swapping FP 244K (IGR, témoin self/self) Algorithme5 459 variations441 FPRégions variantes(>3 sondes consécutives)214 régions : 19,3%11/lame en moyenneFILTRES: DGV et DECIPHEROligos variants(>3 patientes)288 variations récurrentes5,3% du signalCOTATION: 1-4 (régions) et 1-3 (oligos)

Un grand réarrangement:monosomie 1p36LTR11,727 MbSINELTRAGTRAP11,728 Mb• Taille de la délétion– Estimée entre 11,713 et 11,738 Mb• Point de cassure dans le gène AGTRAP, intron 1– Région comportant 2 LTR et 1 SINE

Confirmation en FISH• Sur 10 mitoses et 50 Noyaux• À l’aide de sondes Cytocell 1ptel et 1qtel

Précision du point de cassure• Taille de la délétion– 11 727 590 +/- 523 bpDélétion 1p36 de novo

Analyse desrégions19 p. 244 KAnalyse en régions(> 3 s consécutives)Signal en dye-swaprécurrence1 108 régions214 régionsouinonDGV32 régionsDGV182 régionsrapportéesrapportéesoui nonoui non32 régions 156 régions26 régionsDECIPHERSTOPSTOPouinon14 régionsouiOMIMnon17 régions 9 régionspertinenceAnomalies multiplesAnomalie unique8 régions 4 régionsSTOPoui2 régionsR14, 26pertinenceVérification prioritairenonoui3 régionsR12, 19, 20Vérification prioritairenon

R19R12- Contient gène ADAMTSL3Exprimé dans tissu cérébral et moelle épinière, tissu fœtalR14– Contient gène CNTNAP3• Code pour protéine impliquée dans adhésion et communication intercellulaire• Exprimé dans cerveau, moelle épinière chez adulte et foetus• Interagit avec MINT1 et de CASK– Contient miR-1299• séquence cible potentielle le gène NUFIP2 (17q11.2)– NUFIP2» Code pour une protéine particulièrement conservée entre les espèces» Exprimé dans le cerveau, Interagit avec FMRPR26Phénotype DECIPHER: ♀ épilepsie, retard mental, hypoplasie du corps calleuxR20Phénotype DECIPHER: retard mental– Contient gène CHD8• Rôle dans adhésion intercellulaire calcium-dép, dans dvpt et maintien des tissus• Modèle animal– Blocage de protéine dans cellules hippocampiques chez rat» Altération morphologique des cellules dendritiques

Variationsrécurrentes27 p. 244 K31 206 oligosSignal en dye-swap5 459 oligosAnalyse des récurrences(>3 patientes)288 oligosDGVrapportéesoui244 oligosnon44 oligosTest SpearmanRégion non annotéeRégion annotéeSTOPDECIPHEROMIMpertinenceouinon2 gènesSORCS1, TNMDVérification prioritaire

qPCRAu total,Niveaux d’amplification-1,97 +/- 0,31 chez lespatientes-2,14 +/- 0,25 chez lestémoins et parentsDifférence significative(p=0,012)test statistique de Mann-Whitney

– Séquence concernée par la délétioncerveaurétine• Séquence consensus potentielle de fixation à des FT– Familles HOX et BRN– BRAC et HOM– Dans tissus cérébraux, rétine, tissus embryonnairesneurectodermiques

• SORCS1– Locus 10q23.3– Code pour un récepteur à la sortilin• Impliqué dans le tri des « carboxy-peptidase Y » de l’appareil deGolgi à la vacuole– Homologue chez la levure et la souris, très conservé– Niveau d’expression élevé dans le cerveau• Également exprimé dans le cœur, le foie, le rein– Chez la souris• Impliqué dans le développement embryonnaire cérébral et oculaire– Télencéphale, mésencéphale– Rétine– Rôle dans la régionalisation cérébrale et la différenciation– Rôle dans la migration des astrocytes– Rôle dans la mise en place des réseaux vasculaires

Conclusion• Découverte d’une phénocopie du syndrome de délétion1p36• Pas d’autre réarrangement de grande taille• 26 régions, 48 variations récurrentes identifiées– Régions 12, 14, 26, 19 et 30– gènes SORCS1, TNMD• Nombreux résultats– Reflet de la variabilité du génome ?– Difficultés d’interprétation• Etiologie du syndrome d’Aicardi– Hétérogénéité génétique ?– Multigénique ?– Autre ?

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