ITC - Szerves Kémiai Tanszék

Isothermal titration calorimetry
Izotermális titrációs kalorimetria
(ITC)
Állandó hőmérséklet
∆T=0
Reakcióhő,
mértékegység
mérés
Folyamatok hőeffektuson
alapuló követése
Ismert koncentrációjú
oldat fokozatos
adagolása,
1 - 2 ul-enként

Termodinamika és molekuláris alapjai
Biofizika (Damjanovich) : 52-61, 249-275
Fizika II. (Litz) 48-245 (ajánlott)
Biofizika silabusz: http://szerves.science.unideb.hu/
letöltések

(Gibbs-potenciál)
definíció
10

Kalorimetria
Fizikai és kémiai folyamatokat kísérő energiaváltozás hő
formájában nyilvánul meg: hő szabadul fel (exoterm), hő nyelődik
el (endoterm)
Hőmennyiség SI mértékegysége a Joule (J) [Nm],
alternatív mértékegység a kalória (cal) 1 cal = 4.18 J
A molekuláris interakció során keletkezik / elnyelődik hő →
hidrogén kötések, hidrofób kölcsönhatások, Van der Waals kh,
oldószer átrendeződés, konformáció változás

Endoterm és exoterm folyamatok
●
●
Endoterm: ∆H pozitív érték (bárium­hidroxid és
ammónium tiocianát: 30 °C → ­20 °C)
Exoterm: ∆H negatív érték (tömény savat vízhez
adunk)

Kaloriméter
●
Olyan eszköz, mely méri a reakció során
keletkezett / elnyelt hőt

Hőkapacitás (C p
)
●
●
●
●
●
Egy rendszer hőkapacitása megadja, hogy mennyi hőt kell
közölni a rendszerrel, hogy hőmérséklete 1K­el emelkedjék
(állandó nyomáson vett hőkapacitást (Cp) használjuk)
Mértékegység: J/K
C = ∆Q / ∆T
Fajlagos hőkapacitás: 1g anyag 1K­el való felmelegítéséhez
szükséges energia (J K ­1 g ­1 )
Moláris hőkapacitás: 1 mol anyag 1K­el való
felmelegítéséhez szükséges energia (J K ­1 mol ­1 )

Belső energia (∆U)
●
●
●
●
●
Egy termodinamikai rendszer összes energiája, extenzív
mennyiség
SI mértékegysége: Joule (J)
2 fő komponense: kinetikus energia és a helyzeti energia
(potentital energy)
Kinetikus energia: a rendszer részecskéinek mozgásából adódik
: rotáció, vibráció
Helyzeti energia pedig az anyag statikus alkotóival van
kapcsolatban: a molekulák, kristályok atomjainak energiája és
kémiai kötések energiája

Termodinamika I. főtétele
●
●
●
●
A belső energia megváltoztatható, ha a melegítjük a
rendszert (∆Q), vagy munkát végzünk rajta (∆W) →
→ ∆U = ∆Q ­ ∆W (Zárt rendszer)
∆Q – rendszerrel közölt hő
∆W – a rendszer által a környezeten végzett munka
A környezeten végzett munka vagy nyomás vagy térfogat
változás eredménye: ∆W = ­p∆V
p ­ nyomás, V ­ térfogat

Entalpiaváltozás: ∆H
● Közel egyensúlyi folyamatokban állandó nyomáson a ∆H
egyenlő a rendszer belső energia változásával (∆U) és a
munkával amit a rendszer a környezetén végez (∆W).
● Ez azt jelenti, hogy az entalpia változás ilyen körülmények
között egy kémiai reakció által kibocsátott (vagy elnyelt)
”hővel” egyenlő. Azzal az energiával ami hő formájában ki tud
bocsátódni vagy el tud nyelődni.
● ∆H = kJ/mol (előjel!!)
● kJ → Q = m c ∆T (J)
● Mol

Entalpiaváltozás: ∆H
∆H = kJ/mol
kJ → Q = mc∆T (J)
Példa:
Mol
● 0,67g Mg­ot beleteszek 100ml (100,0 g) HCl­ba és
mérem a hőmérséklet változást
● 19,1 °C → 48,7 °C ∆T = 29,6 °C
● Q = (100g)(4,18 J/g°C)(29,6 °C) = 12373J = 12,4kJ
● 1 mol Mg → 24,3 g; nekünk 0,67g van, ez 0,0276 mol
● ∆H= 12,4kJ/0,0276 mol = 449kJ/mol
exoterm reakció tehát: ­ 449kJ/mol

Entrópiaváltozás (∆S)
●
●
●
●
Az anyagi rendszerek molekuláris rendezettségét
jellemzi
Következtethetünk belőle a maguktól végbemenő
folyamatok irányára
Extenzív mennyiség
Két molekula kapcsolódása során az entrópia
csökken (a rendezetlenség csökken)

ITC: szerkezet –
mechanizmus - funkció
Sok szerkezeti adat
Biokémiai interakciók felderítéséhez nem elegendő
csak a szerkezet ismerete (pl. enzimek)
Reakciók termodinamikai jellemzése, interakciós
partnerek felderítése
Komplexek
szerkezeti
sajátságai
(interakciós
felszínek,
funkciós
csoportok
orientációja)
+
Reakció
termodinamikai
paraméterei
MECHANIZMUS,
FUNKCIÓ

MicroCal ITC 200
Legérzékenyebb a típusok között
Minimális kísérlet tervezés
Könnyű kivitelezés
Egy kísérlet: ~2 óra
Univerzális detektor (nem optikai)
Nem szükséges a minta jelölése,
immobilizációja
Mérés oldatban
Hőmérséklettartomány: +2 °C ... +80 °C
Széles moltömeg tartomány
Sok publikáció és referencia
TÁMOP és OTKA pályázat

MicroCal ITC 200
Összes kötődési paraméter egyidejű
meghatározása egyetlen kísérletben
Közvetlenül mérhetőek mM­nM
nagyságrendű disszociációs állandók
(K d
) (K eq
: 10 2 to 10 9 M ­1 )
Kompetitív technika használatával nM ­
pM kötődési állandók (10 9 to 10 12 M ­1 )
Kis mintatérfogat: 200 µl + 40 µl (akár
10 µg fehérje is elegendő)
- VP-ITC cella: 1,4 ml
- ITC200 cella: 200µl
- Kémiailag ellenálló
Hastelloy® cellák

ITC kísérlet elve
Egy molekula oldatát titráljuk a reakciópartner oldatával
A kibocsátott / elnyelt hőmennyiség folyamatos mérése: nyers adat
(exoterm, endoterm reakciók)
A csúcs alatti területek integrálásával meghatározható a molekuláris
kölcsönhatás teljes termodinamikai profilja
Hőeffektus az alábbiakból tevődik össze: kevertetés, a ligand hígulása,
a makromolekula hígulása, az interakcióból származó hő

ITC kísérlet elve
Minden kötődési (interakció) paraméter meghatározása egy kísérletben:
N (reakció sztöchiometriája),
K B
(kötődési konstans) = 1/K d
,
∆H (entalpia): moláris entalpia változás (kcal/mól)
endoterm reakció: ∆H>0 exoterm reakció: ∆H

The energetics
∆G = -RT ln K A
∆G = ∆H –T∆S

Az affinitás csak egy része a teljes képnek
Entalpia termodinamikai és funkciós / szerkezeti
összefüggések
Kötések energetikája: pl. hidrogén hidak
kialakulása/felbomlása, Van der Waals kölcsönhatások
Hidrofób interakciók, konformációs változások
Elektrosztatikai interakciók
Ezeknek jellegezetes termodinamikai profilja van:

ITC technikai működése
DP: mért energia különbség,
amely szükséges a
referencia cella és a minta
cella közötti ∆T~0
hőmérséklet különbség
biztosításához
Referencia cella
Minta cella
Fecskendő (keverő
berendezés is egyben)
Adiabatikus köpeny
Gyors hőmérséklet
kiegyenlítés: félvezető
Peltier szenzor a két
cella között

Interakció erőssége
Gyenge, közepes és erős interakció
1 < c= n x K a
x [M] T
< 1000
Paraméterek optimalizálása (több kísérlet)

ITC experiment design - C value
What is the C value?
– N x [protein in cell]/K D or N x [protein in cell] x K A
Why does it matter?
– Data quality-successful experiments

Kontroll kísérlet:
EDTA - CaCl 2
5 mM CaCl 2
0,4 mM EDTA (Etiléndiamin­tetraecetsav)
Puffer: 10mM MES (2­(Nmorpholino)ethanesulfo
nic acid), pH 5,6
25 °C

PAF - Ca 2+
NMR adat:
K eq
= 463 ± 23 M ­1
ITC adat:
K eq
= 400 ± 8,6 M ­1

Jellegzetes alkalmazási
területek
Széleskörű alkalmazás
Molekuláris interakciók jellemzése – natív molekulák
oldatban való vizsgálata:
kis molekulák, fehérjék, antitestek, DNS,
szénhidrátok, lipidek, célmolekula­gyógyszer
molekula, fém ionok között
Enzimaktivitás vizsgálata, enzim – szubsztrát, enziminhibítor,
enzim­szubsztrát­inhibítor, enzimkinetika
Molekulán található több különböző interakciós hely
affinitásának meghatározása

Többszörös kötőhely
Endonukleáz, két értékű fém ion
kofaktor szükséges a
reakcióhoz
MnCl 2
oldat (8.8 mM) ­ enzim
(382 μM)
ITC mérés: az I.­es kötőhely 30­
szor erősebb mint a II.­es
Feng, et al, Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 450-456 (2004)

DNS-fehérje interakció
Megismerésük a biokémia és molekuláris biológia egyik fő
célja ( a génszabályozás hibája pl. rákos megbetegedéshez
vezethet)
DNS­ben kódolt információ kifejezése enzimreakciók
segítségével történik, a génszabályozásban a DNS szállal
való kölcsönhatás kulcsfontosságú
Ez a kölcsönhatás közvetlenül mérhető ITC módszerrel
pl. restrikciós endonukleázok: az enzimek ezen csoportjának
nagyfokú specifitása van egyes DNS szekvenciákra

DNS-fehérje interakció
MunI restrikciós endonukleáz –
duplaszálú DNS
d(GCCAATTGGC) 2
19,5 °C, 200 mM NaCl, pH 6,5
K b
: 1x10 6 M ­1
∆H: ­80 kJ mol ­1
DNS­puffer titrálás és DNSfehérje
titrálás
Ladbury, J. E. and Doyle, M. L. (eds) (2005) Front Matter, in Biocalorimetry 2:
Applications of Calorimetry in the Biological Sciences, John Wiley & Sons, Ltd,
Chichester, UK.

Enzim-szubsztrát-inhibítor
Assay
Enzim katalizált reakciók termodinamikájának és kinetikájának
vizsgálata
Rekombináns technikával előállított enzimek (orvosi, biotechnológiai
alkalmazás)
Kémiai szintézissel előállított szubsztrátok, szubsztrát analógok,
inhibítorok
Enzim katalizált reakció tanulmányozása: spektrofotometriásan vagy
radioaktív jelöléssel; a szubsztráton lévő csoportok gyakran nem
kívánt hatással vannak az enzim aktivitására
Ilyen csoportok ITC vizsgálathoz nem szükségesek
Enzim kinetikai paraméterek meghatározása:
Egyszeres injektálás: ∆H
Többszörös injektálás: K m
, K cat

B-D-Glükozidáz – cellobióz
1 mg/ml enzim
10 mM cellobióz
20 mM MOPS puffer, pH 7,2
hidrolízise
25 °C, 290 rpm
Egyszeres injektálás: ∆H= -627,8 ± 5,25 cal/mol

B-D-Glükozidáz - cellobióz
Többszörös injektálás:
- 1.0 µg/ml enzim
- 200 nmol cellobióz/titrálás
K m
= 0,22 ± 0,02 mM
k cat
= 16,3 ± 0,16 s -1
Jeoh, T., Baker, J.O., Ali, M.K., Himmel, M.E. & Adney, W.S. β-d-Glucosidase reaction kinetics from
isothermal titration microcalorimetry. Analytical Biochemistry 347, 244-253 (2005).