Kitka Tamás - Semmelweis Egyetem Doktori Iskola
Kitka Tamás - Semmelweis Egyetem Doktori Iskola
Kitka Tamás - Semmelweis Egyetem Doktori Iskola
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
4.6 Immunhisztokémia<br />
Immunhisztokémiai vizsgálatot csak a REM-visszacsapás neurobiológiai hátterét<br />
vizsgáló kísérletben végeztünk. A HC, LP és SP csoportokat a fény felkapcsolásakor, az<br />
SPR és LPR állatokat három órával később, a felvétel elkészítését követően Na-<br />
pentobarbitallal (Nembutal, 35 mg/kg intraperitonealisan, CEVA-Phylaxia) altattuk,<br />
majd 4% paraformaldehid, 0,1 M foszfát-puffer (pH=7,4) oldattal transzkardiálisan<br />
perfundáltuk. Az agyakat eltávolítottuk, majd egy napos posztfixálást (ugyanilyen<br />
oldatban, 4 ˚C) és egy napos krioprotekciós inkubálást (20%-os szukróz-oldat 0,1 M<br />
foszfát-pufferban, 4 ˚C) követően a hypothalamusokból 4 párhuzamos sorozat 50 μm<br />
vastag metszetet készítettünk (Frigomobile, Reichert-Jung, Bécs, Ausztria).<br />
Az immunohisztokémia során az oldatokat foszfát-pufferben készítettük, az<br />
elsődleges antitestekkel 2 napos inkubációt végeztünk 4 ˚C-on, míg a másodlagos<br />
antitestekkel való inkubáció szobahőmérsékleten zajlott. Az inkubációs lépések között<br />
minden esetben 3 x 10 perces foszfát pufferes kimosást végeztünk.<br />
A kettős immunhisztokémiát megelőzően a metszeteket 0,5%-os Triton X-100-ban<br />
permeabillizáltuk egy órán keresztül, majd az endogén peroxidáz-aktivitást 3%-os<br />
hidrogén-peroxiddal (15 perc), végül a nem specifikus antigén-kötőhelyeket 10%<br />
normál kecske-szérummal blokkultuk (1 óra). Ezután a metszeteket nyúl anti-cFos<br />
antitestben inkubáltuk (1:30 000, Santa Cruz Biotechnology, Inc, Heidelberg,<br />
Németország). Ezt biotinilált kecske anti-nyúl IgG (1:1000), majd avidin-biotin<br />
peroxidáz-komplex (1:500) inkubáció követte (mindkettő 1 óra hosszan, Vector<br />
Laboratories, Burlingame, CA, USA). Ezt követően a jelölést nikkel-<br />
diaminobenzidinnel (NiDAB) vizualizáltuk. A második immunohisztokémia az elsőhöz<br />
hasonlóan zajlott, kivéve azt, hogy az elsődleges antitest nyúl anti-MCH (1:10 000), ill<br />
nyúl anti-orexin A (1:5000) volt (mindkettő 3% marha szérum albumin és 0,5% Triton<br />
X-100 oldatban, Phoenix Europe GMBH, Karlsruhe, Németország), ill. a<br />
vizualizációhoz diaminobenzidint (DAB) használtunk. Végül a metszeteket zselatinos<br />
tárgylemezre húztuk, dehidráltuk, és DPX Mountant-ban (Sigma-Aldrich, Budapest,<br />
Magyarország) fedtük.<br />
Az MCH/cFos/CART hármas immunohisztokémiához a metszeteket 3% hidrogén-<br />
peroxidos kezelést követően 5%, 10% és 20% dimetil-szulfoxid (DMSO, 10-10 perc)<br />
oldatban inkubáltuk (krioprotekció). Ez után 10-szer fagyasztottuk le és olvasztottuk fel<br />
49
Change language