Wira Y Rahman, Endang Sarmini, Herlina, Azmairit Aziz

PROSIDING SEMINAR
PENELITIAN DAN PENGELOLAAN PERANGKAT NUKLIR
Pusat Teknologi Akselerator dan Proses Bahan
Yogyakarta, 27 Juli 2011
PEMBUATAN NUKLEOTIDA BERTANDA [γ- 32 P]ATP
SEBAGAI PELACAK MUTASI GENETIK.
Wira Y Rahman, Endang Sarmini, Herlina, Azmairit Aziz,Triyanto, Hambali
Pusat Teknologi Nuklir Bahan Radiometri- BATAN
E-mail: wira@batan.go.id
ABSTRAK
PEMBUATAN NUKLEOTIDA BERTANDA [γ- 32 P]ATP SEBAGAI PELACAK MUTASI
GENETIK. Penyakit akibat infeksi atau ketidaknormalan genetik dapat didiagnosa
dengan mendeteksi deret asam nukleatnya yang spesifik untuk setiap penyakit,
diagnosa meliputi PCR (Polymerase Chain Reaction) dan hibridisasi dot blot
menggunakan pelacak berlabel radioaktif P-32 yaitu nukleotida bertanda [γ- 32 P]ATP.
Metode untuk mendeteksi gen tersebut menggunakan teknik Southern Blotting.
Pembuatan nukleotida bertanda ini dilakukan dengan reaksi enzimatis yang
merupakan bagian dari proses glikolisis, diawali dari fruktosa 1,6-diphosphat,
32
nukleotida ADP dan H3 PO4 dengan menggunakan enzim aldolase, gliseraldehid 3phosphat,
3-phosphogliseratkinase dan laktat dehidrogenase. Sementara
karakterisasinya menggunakan Thin Layer Chromatography (TLC) PEI Cellulose dan
32
Liquid Scintilation Counter (LSC). H3 PO4 yang digunakan mempunyai kemurnian
radiokimia 99,85% sedangkan ATP bertanda yang dihasilkan dengan penambahan air
pada temperatur 36⁰C berada pada Rf 0,2 dengan hasil penandaan 33,46%. Hasil
penelitian ini diharapkan sebagai acuan produksi nukleotida bertanda lainnya.
Kata kunci : nukleotida bertanda [γ- 32 P]ATP, reaksi enzimatis, proses glikolisis
ABSTRACT
PRODUCTION OF LABELED NUCLEOTIDE [γ- 32 P])ATP AS THE GENETIC
MUTATION TRACKER. Infectious disease or genetic abnormality can be diagnosed
by detecting the nucleic acid sequence that are specific to each disease, diagnostics
includes PCR and dot blot hybridization using P-32 labeled tracer that is
labeled nucleotide [γ-32P]ATP. The method to detect the gene using Southern Blotting
technique. The preparation of labeled nucleotides is done by enzimatic reactions that
are part of the glycolisis pathway, starting from fructose 1.6-diphosphate, ADP
nucleotide, and H332PO4, using the enzym aldolase, glyseraldehide 3-phosphate, 3phosphoglycerate
kinase, and lactate dehydrogenase. While its characterization using
Thin Layer Chromatography (TLC) PEI Cellulose and Liquid Scintilation Counter
(LSC). H332PO4 who used to have radiochemical purity of 99.85% while ATP labeled
which is produced by adding water at a temperature of 36⁰C marked at Rf 0.2 with
33.46% tagging results. Labeled nucleotide [γ32P]-ATP which is resulted as basis for
other labeled nucleotide synthesis.
Key word : [γ- 32 P]ATP labeled nucleotide, enzimatic reaction, glycolysis pathways
PENDAHULUAN
S
elama dekade terakhir ini aplikasi radioisotop
telah berkembang dengan cepat tidak hanya
digunakan dalam pencitraan untuk memperoleh
informasi fungsional suatu zat senyawa, juga untuk
mendalami berbagai macam proses fisiologi dan
patologi. Kendala utama dalam pengobatan
penyakit infeksi adalah ditemukannya organisme
yang tahan terhadap obat, antibiotika atau
insektisida yang disebabkan adanya mutasi
genetik. Diagnosis penyakit infeksi dengan biologi
molekul adalah mendeteksi asam nukleat
mikroorganisme penyebab dengan menggunakan
pelacak DNA. Untuk mendeteksi kelainan genetik
yang diakibatkan oleh virus, kuman atau bakteri
dapat dengan pelacak DNA/RNA menggunakan
teknik Southern Blotting [1,4,5,6] . Dimana prinsip
dari teknik tersebut adalah memisahkan sampel
DNA utas ganda menjadi utas tunggal dan
mentransfernya ke membran nilon. Saat diinkubasi
dengan membran dalam larutan, pelacak mengikat
Wira Y Rahman, dkk. ISSN 1410 – 8178 Buku II hal 25

PROSIDING SEMINAR
PENELITIAN DAN PENGELOLAAN PERANGKAT NUKLIR
Pusat Teknologi Akselerator dan Proses Bahan
Yogyakarta, 27 Juli 2011
bagian-bagian yang merupakan pasangannya
dalam DNA dan "melekat" pada membran. Setelah
itu, dilakukan kontak antara membran dengan
selembar film fotografis yang sensitif terhadap
emisi radioaktif. Hanya bagian-bagian dari sampel
tempat lokasi gen yang terlihat sebagai titik gelap
pada film, karena hanya bagian itulah yang terikat
pada pelacak radioaktif.
Salah satu radioisotop yang bisa
digunakan untuk pelacak DNA/RNA adalah P-32
dalam senyawa [γ- 32 P]ATP. Pemanfaatan
teknologi nuklir [γ- 32 P]ATP dalam bidang
kesehatan menggunakan teknik biologi molekul
dengan cara mendeteksi DNA virus, kuman atau
bakteri tersebut, melalui DNA virus bisa diketahui
apakah virus tersebut menjadi penyebab kanker
atau bukan, DNA kuman tersebut sudah resisten
atau tidak dengan antibiotika yang akan digunakan
[3,4,8] . Sehingga bisa diketahui lebih awal dan bisa
ditentukan pengobatan yang tepat dan jangka
waktu pengobatan sehingga pengobatan lebih
efektif dan efisien.
Proses pembuatan [γ- 32 P]ATP dapat
dilihat pada Gambar 1., dimana sintesis [γ-
32 P]ATP dilakukan dengan penandaan senyawa
nukleotida secara enzimatis, dengan
memanfaatkan proses glikolisis. Diawali dari
perubahan fruktosa -1, 6-difosfat yang memiliki 6
buah atom C menjadi 3-difosfogliseral-dehida
(dengan 3 buah atom C) dan dihidroksi-asetonfosfat
dengan bantuan enzim aldolase. Dihidroksi
aseton fosfat kemudian menjadi 3- fosfogliseral-
Buku II hal 26
dehida juga dengan pertolongan enzim glycerol -3-
phosphate dehydrogenase. Selanjutnya
fosfogliseraldehida bersenyawa dengan suatu asam
fosfat (H3 32 PO4) dan berubah menjadi 1,3 –
disfosfogliseraldehida. 1,3 – difosfogliseraldehida
berubah menjadi asam 1,3 –difosfogliserat dengan
bantuan enzim dehidrogenase serta ion – ion Mg ++ ,
membantu proses ini. Perubahan terakhir dalam
glikolisis adalah pelepasan satu fosfat dari asam 2fosfoenol
piruvat menjadi asam piruvat, sedang
ADP meningkat menjadi ATP. Pada proses
enzimatis ini ada faktor-faktor yang
mempengaruhi kerja enzim yaitu : temperatur,
kadar air, pH (derajat keasaman), konsentrasi
enzim dan substrat serta zat-zat penghambat
(inhibitor) [1,2,3] .
Pada penelitian ini dilakukan pembuatan
[γ- 32 P]ATP dari H3 32 PO4 dengan reaksi enzimatis.
H3 32 PO4 direaksikan dengan campuran enzim dan
diinkubasikan dengan memvariasikan waktu
inkubasi, kadar air dan temperatur, diharapkan dari
penelitian ini diperoleh senyawa nukleotida
bertanda [γ- 32 P]ATP dengan kemurnian yang
memenuhi persyaratan yang diizinkan. Sehingga
penelitian ini bisa memenuhi kebutuhan senyawa
nukleotida bertanda [γ- 32 P]ATP di Indonesia,
dalam rangka pemberantasan penyakit mutasi
genetik yang diakibatkan oleh virus, kuman atau
bakteri. Dan juga akan sangat mendukung
peningkatan kemampuan di bidang biologi
molekul dan dapat mengurangi ketergantungan
impor.
Gambar. 1. Bagian dari proses glikolisis dengan reaksi enzimatispembentukan ADP menjadi ATP
dengan penambahan fosfat radioaktif (H3 32 PO4)
ISSN 1410 – 8178 Wira Y Rahman, dkk

TATA KERJA
PROSIDING SEMINAR
PENELITIAN DAN PENGELOLAAN PERANGKAT NUKLIR
Pusat Teknologi Akselerator dan Proses Bahan
Yogyakarta, 27 Juli 2011
Bahan Yang Digunakan
Bahan-bahan yang digunakan adalah
H3 32 PO4 bebas pengemban dengan kemurnian
radiokimia diatas 97 % yang diperoleh dari
pemurnian H3 32 PO4 yang diproses di PTNBR
Bandung. Enzim aldolase 9 unit/mg, 10 mg/ml,
gliseraldehid-3-phosphat dehidrogenase 80
unit/mg, 10 mg/ml, phosphogliserat kinase 450
unit/mg, 10 mg/ml, fruktosa 1.6-bisphosphat,
sodium pyruvat, dithiothreitol, Tris-HCL, EDTA
dari Sigma Aldrich, laktat dehidrogenase 250
unit/mg, 5 mg/ml, ADP, β-NAD, magnesium
klorida dari E.Merck.
Bahan penunjang yang digunakan kolom
kromatografi DEAE Sephadex dengan pendingin,
TLC plastik PEI Cellulose dari E.Merck, kertas
indikator pH universal serta peralatan gelas dan
mikrotube.
Alat Yang Digunakan
Peralatan yang digunakan refrigerator
sentrifus, penangas air Memmert, Mini TLC
Scanner Bioscan AR-2000, dan LSC.
1. Preparasi pereaksi campuran yang digunakan
Pembuatan larutan campuran A : 100
μl campuran berikut ini dibuat dalam satu
mikrotube
500 mM Tris-HCl ⎫
120 mM Magnesium Klorida ⎬ (pH 8.0) 50 μl
1 mM EDTA ⎭
125 mM Natrium piruvat 20 μl
200 mM Dithiothreitol 15 μl
20 mM FDP 5 μl
5 mM ADP 5 μl
20 mM β-NAD 5 μl
2. Preparasi pereaksi campuran untuk pelarutan
pellet enzim
Pembuatan larutan campuran B : 50 μl
larutan berikut disiapkan dalam satu
miktotube
500 mM Tris-HCl ⎫
120 mM Magnesium Klorida ⎬ (pH 8,0) 5 μl
1 mM EDTA ⎭
200 mM Dithiothreitol 1,5 μl
air 43,5 μl
3. Preparasi campuran enzim
Pembuatan campuran enzim : 12 μl campuran
enzim berikut dibuat didalam satu mikrotube
Aldolase 6 μl (0,54 units)
Glyceraldehydes 3-phosphate 2 μl (1,6 units)
dehydrogenase
Lactate dehydrogenase 2 μl (2,5 units)
3-phosphoglycerate kinase 2 μl (0,9 units)
Campuran enzim tersebut disentrifuse
pada kecepatan 15000 rpm selama 20 menit
Setelah diambil cairan supernatantnya, endapannya
dilarutkan dengan 10 μl larutan campuran B.
4. Proses penandaan [γ- 32 P]ATP
Ke dalam mikrotube bervolume 1,5 ml
dimasukkan 40 μl H3 32 PO4 (aktivitas terukur)
diatur pH 7 – 9 dengan larutan NaOH 5 M.
Selanjutnya ke dalam larutan tersebut ditambahkan
berturut-turut 40 μl larutan campuran A dan 10 μl
campuran enzim. Inkubasi dilakukan selama (t)
menit dan dicuplik setiap waktu tertentu selama 1
jam. Reaksi dihentikan dengan memasukkan
mikrotub ke dalam penangas air pada temperatur
70⁰C selama 3 menit untuk menghentikan aktivitas
enzim.
5. Pengujian hasil penandaan [γ- 32 P]ATP
Hasil penandaan diuji dengan KLT PEI
Cellulose sebagai fasa diam dan KH2PO4 0,5 M
pH 3,5 sebagai fasa gerak. Kemudian ditentukan
Rf-nya dengan Bioscanner.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Radioisotop P-32, berupa larutan
H332PO4 (dalam bentuk orto-fosfat) ternyata tidak
stabil selama beberapa hari penyimpanan dan
mudah berubah menjadi senyawa polifosfat. Hasil
pemeriksaan H332PO4 dengan Bioscanner seperti
ditampilkan pada Gambar 2., terlihat bahwa
kemurnian H332PO4 86,48 % dan Rf-nya pada
0,7, dengan kemurnian di bawah 97% ini bisa
mengakibatkan terjadinya proses inhibisi yang
akan menghambat kerja enzim, sehingga proses
sintesis [γ-32P]ATP tidak bisa maksimal. Untuk
mengatasi hal tersebut H332PO4 yang akan
digunakan harus dimurnikan terlebih dahulu ke
dalam kolom penukar kation Dowex AG 50 (1 x 8)
yang telah dikondisikan dengan HCl 1M, sehingga
diperoleh larutan H332PO4 dengan kemurnian
radiokimia yang tinggi dan layak digunakan untuk
pembuatan nukleotida bertanda [γ-32P]ATP.
Gambar 2. Radiokromatogram dari larutan
H3 32 PO4 sebelum proses pemurnian
Wira Y Rahman, dkk. ISSN 1410 – 8178 Buku II hal 27

PROSIDING SEMINAR
PENELITIAN DAN PENGELOLAAN PERANGKAT NUKLIR
Pusat Teknologi Akselerator dan Proses Bahan
Yogyakarta, 27 Juli 2011
Pengujian kemurnian radiokimia
dilakukan dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
PEI cellulose, dengan melewatkan larutan H3 32 PO4
ke dalam kolom terjadi peningkatan kemurnian
larutan H3 32 PO4 dari 86,48 % menjadi 99,85 %
seperti terlihat pada Gambar 2 dan Gambar 3.
Gambar 3.Radiokromatogram dari larutan H3 32 PO4
setelah proses pemurnian
Larutan H3 32 PO4 setelah proses pemurnian
ini diinkubasikan dengan campuran enzim, selama
reaksi enzimatik berlangsung pada tiap (t) menit
inkubasi dicuplik untuk melihat pembentukan [γ-
32 P]ATP yang diuji dengan KLT PEI Cellulose.
Hasil pemeriksaan KLT PEI cellulose
menggunakan bioscanner dari reaksi inkubasi
tersebut dapat dilihat pada Gambar 4. Pada gambar
tersebut menunjukkan hasil penandaan [γ- 32 P]ATP
33,46 %, dengan nilai Rf 0,241. Selain itu dari
hasil penandaan tersebut masih terdapat H3 32 PO4
bebas dengan persentase 65,90% dengan Rf 0,608.
Rendahnya hasil penandaan [γ- 32 P]ATP tersebut
disebabkan oleh beberapa faktor yang dapat
mempengaruhi tidak maksimalnya daya kerja
campuran enzim, yaitu kadar air dan temperatur.
Buku II hal 28
Gambar 4. Radiokromatogram pembentukan [γ-
32 P]ATP setelah inkubasi (60) menit
Pada Gambar 5. terlihat penambahan
kadar air sebanyak 50 μl sangat berpengaruh
terhadap persentase rendemen penandaan [γ-
32 P]ATP yang dihasilkan, dibandingkan dengan
tanpa penambahan kadar air. Selain itu dari
Gambar 5. terlihat pola yang hampir sama antara
reaksi yang ditambahkan kadar air dan yang tidak
ditambahkan kadar air untuk waktu inkubasi (t) 50
menit dan (t) 60 menit, dimana ADP telah
terfosforilasi menjadi ATP sehingga pembentukan
[γ- 32 P]ATP sudah stabil.
Sedangkan pengaruh temperatur terhadap
hasil penandaan [γ- 32 P]ATP ditampilkan pada
Gambar 6., dari gambar tersebut menunjukan
bahwa pada suhu 36⁰C mempunyai rendemen
pembentukan lebih tinggi dibandingkan pada suhu
kamar (22⁰C). Adanya perbedaan tersebut
dikarenakan kerja enzim lebih maksimal dengan
adanya penambahan air pada temperatur 36⁰C
dengan persentase penandaan 33,46 %.
Gambar 5. Pengaruh penambahan kadar air (50 μl) pada hasil penandaan [γ- 32 P]ATP
ISSN 1410 – 8178 Wira Y Rahman, dkk

PROSIDING SEMINAR
PENELITIAN DAN PENGELOLAAN PERANGKAT NUKLIR
Pusat Teknologi Akselerator dan Proses Bahan
Yogyakarta, 27 Juli 2011
Gambar 6. Pengaruh temperatur pada hasil penandaan [γ-32P]ATP
KESIMPULAN
Larutan H3 32 PO4 yang digunakan untuk
pembuatan nukleotida bertanda [γ- 32 P]ATP dalam
penyimpanannya tidak stabil mudah berubah
menjadi senyawa polifosfat. Sebelum digunakan
terlebih dahulu dimurnikan untuk meningkatkan
kemurnian radiokimianya. Setelah dilakukan
proses pemurnian didapatkan hasil pemurnian
larutan H3 32 PO4 meningkat menjadi 99,85%.
Pembuatan nukleotida bertanda [γ- 32 P]ATP
menggunakan larutan H3 32 PO4 hasil pemurnian
dengan campuran enzim menghasilkan rendemen
pembentukan 33,46 % dengan Rf 0,241 setelah
ditambahkan air dan temperatur inkubasi 36⁰C.
Diharapkan rendemen hasil penandaan bisa
mencapai diatas 90%. Hasil penandaan ini
dipengaruhi oleh kadar air reaktan, temperatur dan
waktu inkubasi. Untuk meningkatkan hasil
penandaan perlu dilakukan penelitian lebih lanjut
dengan menaikkan aktivitas H3 32 PO4 yang
digunakan.
UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis mengucapkan terimakasih kepada
sejawat dari PTNBR – BATAN Bandung, atas
kerjasamanya yang baik dalam penyediaan P-32
(H3 32 PO4), Bapak Abdul Mutalib yang telah
memberikan kepercayaan untuk melakukan
penelitian ini, Ibu Santi Nurbaiti dari Kelompok
Keahlian Biokimia, Fakultas Matematika & Ilmu
Pengetahuan Alam, ITB dan Bapak Sunarhadiyoso
S. yang telah membantu dalam penulisan ini.
DAFTAR PUSTAKA
1. Lehninger, A.L,”Dasar-dasar Biokimia Jilid I”,
Erlangga, Jakarta, 1982
2. Roger A. Johnson, Timothy F.
Walseth,”Enzymatic Process For Preparing [γ-
32
P]-Labeled Nucleotides”, United State Patent,
1980
3. F. Sakamoto, M. Izumo, K. Hashimoto, Y.
Fuji,”Study of optimum condition for synthesis
of [y-32P]ATP with high specific
radioactivity”, Journal of Radioanalytycal and
Nuclear Chemistry, Vol. 239, No.2 (1999) 423-
427.
4. Mukh Syaifudin dan Devita Tetriana,
“ANALISIS MUTASI GEN inhA UNTUK UJI
RESISTENSI M. tuberculosis TERHADAP
ISONIAZID DENGAN METODE SSCP
RADIOAKTIF”, Pusat Teknologi Keselamatan
dan Metrologi Radiasi, BATAN Jakarta
5. Maria Lina R, “Deteksi Resistensi
Mycobacterium Tuberculosis Terhadap
Rifampisin Berdasarkan Mutasi Gen RPOO
(RNA Polymerase Sub Unit B) Dengan Metode
PCR (Polymerase Chain Reaction) - Hibridasi
DOT Blot dan PCR-Sekuensing, Jurnal Respir
Indo, Vol 7, no. 3 Juli 2007
6. Suharsono, ”Struktur dan Ekspresi gen”,
Jurusan Bilologi FMIPA Institut Pertanian
Bogor.
7. Maria Lina R, Budiman Bela, dan Andi
Yasmon, ”Deteksi Mutasi Gen KATG
(Mycobacterium Tuberculosis) dengan Metode
PCR (Polymerase Chain Reaction) –
Hibridisasi Dot Blot menggunakan Pelacak
Oligonukleotida Bertanda 32 P”, Jurnal Ilmiah
Wira Y Rahman, dkk. ISSN 1410 – 8178 Buku II hal 29

Buku II hal 30
PROSIDING SEMINAR
PENELITIAN DAN PENGELOLAAN PERANGKAT NUKLIR
Pusat Teknologi Akselerator dan Proses Bahan
Yogyakarta, 27 Juli 2011
Aplikasi Isotop dan Radiasi Vol. 5 No. 1 Juni
2009.
8. Budiawan, ”Pengembangan Teknik 32P-
Postlabelling untuk Mendeteksi Dini Resiko
Kanker”, Risalah Pertemuan Ilmiah Penelitian
dan Pengembangan Teknologi Isotop dan
Radiasi, 2000.
9. Wira Y Rahman, Endang Sarmini, Herlina,
dkk, ”Sintesa ATP Bertanda P-32 Sebagai
Perunut Biologi Molekul”, Pertemuan Ilmiah
Radioisotop, Radiofarmaka dan Siklotron,
2010.
10. IAEA-TECDOC-1340,”Manual for Reactor
Produced Radioisotop”, International Atomic
Energy Agency, IAEA, January 2003.
TANYA JAWAB
Budi Setiawan
Apa arti PCR ?
Hasil Randemen 33,46% apakah sesuai target?
Wira Y Rahman
Arti PCR adalah Polymerase Chain Reaction,
reaksi untuk melipatgandakan fragmenfragmen
DNA yang sudah berhasil diisolasi
Sebetulnya randemen pembentukan 33,46%
belum mencapai target yang diinginkan,
diharapkan rendemen pembentukannya
adalah diatas 90% banyak faktor yang
mempengaruhi randemen pembentukan
tersebut, yang terutama adalah enzim-enzim
yang digunakan, sama seperti radioisotop
enzimpun mempunyai waktu paruh
ISSN 1410 – 8178 Wira Y Rahman, dkk