Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) dalam Kultur ... - Kalbe

TINJAUAN PUSTAKA
Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)
dalam Kultur Embryonic Stem Cell
Riris L. Puspitasari, Caroline T. Sardjono, Ferry Sandra
Stem Cell and Cancer Institute, Kalbe Pharmaceutical Company, Jakarta, Indonesia
ABSTRAK
Penelitian embryonic stem cell (ESC) dalam upaya penemuan cara pengobatan penyakit degeneratif saat ini tengah menjadi sorotan
dalam dunia kedokteran. Kesulitan mengontrol diferensiasi ESC sering menjadi fokus utama dalam metode kultur yang ada saat ini.
Salah satu jenis sel hasil diferensiasi ESC yang banyak menarik perhatian para peneliti adalah neuron (sel saraf). ESC yang dikultur dalam
medium yang sesuai dapat diarahkan perkembangannya menjadi neuron, tetapi sering kali sel yang terdiferensiasi masih merupakan
populasi heterogen; karena itu, diperlukan metode tambahan untuk memilih tipe sel yang akan diisolasi. Melalui metode Fluorescence
Activated Cell Sorting (FACS), peneliti dapat melakukan purifikasi populasi sel berdasarkan molekul penanda yang spesifik terhadap
neuron. Di samping itu, FACS juga dapat mendeteksi tipe-tipe sel yang ada, seperti ESC imatur, progenitor neuron, maupun sel yang
telah terdiferensiasi menjadi neuron. Dengan demikian, akan didapatkan populasi sel homogen, yang dapat digunakan dalam penelitian
mengenai terapi penyakit neurodegeneratif.
Kata Kunci: Fluorescence activated cell sorting, Stem cell, Neuron
Pendahuluan
Mekanisme regenerasi sistem saraf pusat,
seperti penemuan sel punca di otak yang dapat
tumbuh menjadi neuron baru, telah mendorong
para peneliti untuk mengembangkan
metode perbaikan pada sistem tersebut.
Aplikasi sel punca sebagai terapi alternatif untuk
penyakit degeneratif, antara lain Parkinson,
amyotrophic lateral sclerosis (ALS), stroke,
dan spinal cord injury, didasarkan pada fakta
bahwa neurogenesis tetap berlangsung pada
individu dewasa dan dipengaruhi oleh banyak
faktor. 1
Pada kultur embryonic stem cell, propagasi
dipengaruhi oleh beberapa faktor yang diregulasi
oleh sinyal tertentu. Propagasi ESC
mencit dapat dilakukan melalui co-culture
dengan fibroblas embrio sebagai feeder layer
atau dengan penambahan leukemia inhibitory
factor (LIF). 2,3 Secara in vitro, pertumbuhan
ESC dapat diarahkan agar berdiferensiasi
menjadi beberapa tipe sel melalui kombinasi
mediator pertumbuhan (growth factor) yang
digunakan. 4
Permasalahan yang mungkin muncul saat mengkultur
ESC untuk diarahkan menjadi neuron,
antara lain, adalah penurunan kemampuan
diferensiasi sel dan rendahnya respons sel
terhadap metode kultur untuk pengarahan
menjadi sel neurogenik. Penurunan kemampuan
dan respons sel untuk berdiferensisasi
dalam suatu kondisi kultur dapat menghambat
perkembangan sel yang dikehendaki. Mengingat
permasalahan tersebut, beberapa peneliti
menggunakan medium bebas serum
untuk mengarahkan ESC menjadi neuron; penambahan
growth factor ke dalam medium
diharapkan dapat mengarahkan pertumbuhan
sel yang baik. Dengan demikian, didapatkan
pertumbuhan sel neurogenik yang lebih
tinggi. 5
Setelah didapatkan pertumbuhan sel neurogenik,
peneliti membutuhkan pembuktian
bahwa sel yang tumbuh benar-benar memiliki
karakteristik sel yang diinginkan. Selain itu,
pada kultur pengarahan ESC menjadi neuron,
ternyata didapat koloni sel yang heterogen;
tumbuh juga sel-sel prekursor neuron, sel-sel
yang tidak berdiferensiasi, dan sel mati.
Heterogenitas tersebut sangat menyulitkan
transplantasi neuron pada hewan coba
karena terdapat risiko terjadi pertumbuhan
tumor pada transplantasi sel dengan populasi
heterogen; oleh sebab itu, sangat diupayakan
digunakan satu tipe sel saja pada transplantasi. 6
Upaya mendapatkan sel-sel homogen dapat
dilakukan apabila karakteristik neuron yang
diinginkan dapat ditentukan. Berdasarkan
molekul penanda spesifik, dapat ditentukan
populasi sel tertentu saja yang akan ditransplantasikan.
Informasi penting hasil akhir sel
yang telah dikultur dan mengalami diferensiasi
meliputi persentase tiap jenis sel berdasarkan
molekul penanda tertentu, ukuran sel, dan
granulositas sel. Salah satu metode untuk
mengetahui karakteristik sel hasil kultur adalah
dengan menggunakan FACS (Fluorescence
Activated Cell Sorting). Aplikasi FACS dalam
proses kultur dan diferensiasi ESC menjadi
neuron, antara lain untuk dapat melakukan
karakterisasi neuron yang tumbuh. Lebih lanjut,
dengan menggunakan perangkat FACS yang
dilengkapi fungsi cell sorting, dapat pula dilakukan
isolasi populasi sel yang diinginkan
sehingga dapat dihasilkan populasi sel yang
murni. 6
Kultur Pengarahan ESC menjadi Neuron
Embryonic stem cell (ESC) berasal dari inner
cell mass yang diisolasi dari embrio pada
stadium blastokista. ESC memiliki sifat pluripoten,
yaitu mampu melakukan pembelahan
untuk proliferasi, mampu berdiferensiasi menjadi
tipe sel lain, baik pada fetus maupun
individu dewasa, dan (bersama-sama dengan
embrio) membentuk jaringan fungsional.
Kajian molekuler sel pluripoten sangat penting
untuk menjelaskan karakter dan mekanisme
propagasi ESC. 7,8
In vitro, pertumbuhan ESC mencit dapat diarahkan
agar berdiferensiasi menjadi beberapa
tipe sel. Metode kultur yang sesuai diharapkan
dapat menghasilkan tipe-tipe sel yang diinginkan.
Medium bebas serum diharapkan
sebagai medium yang mampu mendukung
pertumbuhan sel prekursor neuron. 9 Selain
itu, pengarahan ESC menjadi sel neurogenik
CDK 186/Vol.38 no.5/Juli-Agustus 2011
337

TINJAUAN PUSTAKA
juga dapat dilakukan dengan penambahan
zat penginduksi, seperti FGF2 (fibroblast growth
factor)10,12, FGF11, BMP2, RA (retinoic acid),
Shh (sonic hedgehog), Wnt3a11, BMP410,
CNTF (ciliary neurotrophic factor), dan neurotrofin
3 13 . Zat penginduksi tersebut ditambahkan
ke dalam medium bersuplemen, baik
secara tunggal maupun kombinasi.
Penggunaan RA, Shh, BMP2, dan Wnt3a
dapat mengarahkan ESC menjadi neuron
yang memiliki molekul penanda tertentu,
termasuk mengekspresikan protein sinapsis,
dan mensekresikan neurotransmitter. Lebih
lanjut, diketahui bahwa maturasi neurit (outgrowth
dan percabangannya) ditentukan oleh
sinyal dari BMP2 dan Shh. 11
Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)
FACS merupakan suatu sistem yang dikembangkan
di tahun 1950-an, yaitu alat penghitung
sel Coulter Counters. Coulter counters
menghitung sel dengan menggunakan aliran
sel secara automatis yang dilewatkan pada
suatu detektor. Pada awalnya, Mack Fulwyler
menggabungkan teknologi ink jet printer
dengan Coulter Counters; bagian kepala printer
dapat menggetarkan lubang sehingga terbentuk
droplet. Pada dasarnya, prinsip FACS
hampir sama dengan Coulter Counters, dengan
beberapa modifikasi. Pada FACS, suspensi sel
dilewatkan dalam suatu kolom vibrasi sehingga
akan terbentuk droplet bermuatan
yang mengandung sel tunggal. Aliran droplet
akan ditembak dengan sinar laser dan sinar
yang diteruskan akan ditangkap oleh detektor.
Detektor tersebut disambungkan dengan
software untuk menganalisis sinyal yang diperoleh
sehingga sel dapat dianalisis, dipisahkan,
dan dikoleksi. 14,15
Tabel 1. Daftar fluorokrom yang umum digunakan dalam analisis FACS
Fluorokrom
4,6-Diamidino 2-Phenylinidole (DAPI)
Alexa Fluor 350
R-Phycoerythrin (PE)
Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP)
Fluorescein Isothiocyanate (FITC)
Propidium Iodide (PI)
Texas Red
tertentu. Fluorokrom dapat menyerap sinar
dengan panjang gelombang tertentu dan
meneruskan sinar tersebut, dinamakan emisi.
Beberapa macam fluorokrom dapat dipilih,
tergantung panjang gelombang eksitasi yang
akan dipakai. Emisi akan melewati suatu filter
dan ditangkap oleh detektor; sinyal yang ditangkap
akan dianalisis oleh komputer menggunakan
software tertentu sehingga data
dapat divisualisasikan dalam bentuk histogram
maupun dot plot. Berikut beberapa fluorokrom
yang umum digunakan dalam analisis menggunakan
FACS (Tabel 1).
Visualisasi Hasil Analisis
Pada metode FACS untuk deteksi maupun
purifikasi sel, data yang telah dianalisis dapat
tervisualisasi berupa dot plot atau histogram.
Eksitasi
(nm)
345
346
480
489
495
536
589
Emisi
(nm)
455
445
578
508
519
617
615
Sinar emisi dari senyawa fluorokrom akan
ditangkap oleh detektor, lalu akan dianalisis
menggunakan software tertentu. Sinyal tersebut
akan diterjemahkan sebagai scatter
dan intensitas fluoresens. 14
Sinar laser ditembakkan langsung ke aliran suspensi
sel. Sejumlah detektor digunakan untuk
menangkap sinyal panjang gelombang. Satu
detektor diletakkan berhadapan dengan sumber
sinar (Forward Scatter/FSC), beberapa diletakkan
dengan membentuk sudut (Side Scatter/
SSC), dan detektor fluoresens (Gambar 1). FSC
berkorelasi dengan volume atau ukuran sel,
sedangkan SSC berhubungan dengan kompleksitas
bagian dalam partikel, seperti ukuran
nukleus, tipe granula sitoplasma, dan kekasaran
membran plasma. 14
Lebih lanjut, visualisasi data terhadap molekul
penanda spesifik memerlukan pengikatan
antibodi-antigen sel yang spesifik dan penambahan
penanda (fluorokrom). Ikatan antibodi
terhadap antigen yang dituju harus bersifat
spesifik sehingga pelabelan akan memberikan
hasil akurat. Dengan memberikan label
pada antibodi yang digunakan, ekspresi antigen
(protein) dapat diketahui. 16
Fluorokrom
Fluorokrom merupakan suatu senyawa fluoresein
yang dapat berpendar saat mengalami
eksitasi oleh sinar dengan panjang gelombang
Gambar 1. Mekanisme deteksi ukuran, kompleksitas sel, dan fluoresens pada FACS. 15
338 CDK 186/Vol.38 no.5/Juli-Agustus 2011

TINJAUAN PUSTAKA
Pemisahan Sel (Cell Sorting)
Pada perangkat FACS yang dilengkapi dengan
modul cell sorting, dapat dilakukan pemisahan
populasi sel yang heterogen menjadi beberapa
subpopulasi. Pemisahan tersebut dilakukan
atas dasar seleksi molekul penanda
khusus yang telah terkonjugasi dengan fluorokrom.
Pada pemisahan secara mekanis,
sejumlah sel dipisahkan setiap detik sehingga
menghasilkan persentase kepadatan sel tertentu.
Pada pemisahan secara elektrostatik,
pemisahan didasarkan pada jenis muatan sel.
Untuk pemisahan tersebut, mesin FACS dilengkapi
dengan elektroda bermuatan positif
dan negatif. Pemberian muatan listrik pada
droplet sel dilakukan sebelum sel tunggal
melewati elektroda tersebut. Sel bermuatan
positif akan mengalir ke chamber negatif,
sedangkan sel bermuatan negatif akan mengalir
ke chamber positif (Gambar 2). Dengan
demikian, akan dihasilkan tiga subpopulasi
sel, yaitu sel bermuatan positif, negatif, dan
tidak bermuatan. Sel yang tidak bermuatan
dapat diasumsikan tidak memiliki karakter
yang diinginkan. 14,15
Penggunaan FACS dalam Kultur Pengarahan
ESC Menjadi Neuron
FACS dapat digunakan untuk menganalisis
karakteristik populasi neuron maupun untuk
memisahkannya. Protein yang diekspresikan
oleh neuron dapat diketahui berdasarkan
molekul penanda yang dapat dideteksi oleh
antibodi yang spesifik. 17 Berikut merupakan
molekul penanda yang digunakan untuk
mendeteksi tipe neuron. 18
Tipe sel neural
Neuron
Astrosit
Oligodendrosit
Neural stem cell
GABA-ergic neuron
Dopaminergic neuron
Gambar 2. Skema pemisahan sel dengan FACS (15)
Antibodi primer
Neuronal class III beta tubulin
Microtubule Associated Protein-2 (MAP2)
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)
Oligodendrocite marker 4
Myelin Basic Protein (MBP)
Nestin
Gamma Amino Butyric Acid (GABA)
Tyrosine Hydroxylase (TH2)
Penggunaan FACS untuk melihat karakter sel
dan pemisahannya telah banyak dilaporkan.
Bouhon dkk. menggunakan chemically defined
medium (CDM) untuk mengkultur neurogenic
embryoid bodies (NEB). NEB merupakan
sekelompok sel yang pertumbuhannya akan
mengarah kepada sel-sel neuron. Pada medium
CDM, penambahan FGF2 menyebabkan
diameter neurosphere bertambah, yang
mengindikasikan peningkatan pertumbuhan
sel-sel neural. Ekspresi gen-gen dalam NEB
tergolong heterogen, dan hasil analisis FACS
menunjukkan adanya populasi sel yang berbeda
dari NEB. Populasi tersebut berbeda dalam
ekspresi nestin mulai dari hari ke-2 hingga
hari ke-8 kultur. Sementara itu, dengan melihat
granulositas sel (berdasarkan profil SSC
dari FACS), dapat diketahui adanya populasi
CDK 186/Vol.38 no.5/Juli-Agustus 2011
339

TINJAUAN PUSTAKA
sel dengan granulositas yang lebih tinggi dibanding
populasi sel lain seiring waktu pengkulturan.
9 Pruszak dkk. menggunakan FACS
untuk memisahkan populasi sel berdasarkan
ekspresi molekul protein pada beberapa tipe
sel yang dideteksi, antara lain molekul SSEA-3
(stage specific mouse embryonic antigen)
sebagai penanda ESC imatur, molekul CD133
sebagai sel prekursor neuron, dan molekul
CD24 sebagai penanda sel yang telah berdiferensiasi
menjadi neuron. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa populasi sel hasil pemisahan
melalui FACS mampu tumbuh menjadi
neuron-neuron yang homogen setelah
dikultur selama 11 hari. 19
Simpulan
FACS merupakan salah satu sarana pendukung
dalam bidang penelitian sel punca. FACS
dapat membantu menganalisis karakter dan
memisahkan sel-sel yang telah berdiferensiasi
menjadi suatu populasi yang homogen.
DAFTAR PUSTAKA
1. Gage FH. Mammalian neural stem cells. Science 2000; 287:1433-8.
2. Gregg C, Weiss S. CNTF/LIF/gp130 receptor complex signaling maintains a VZ precursor differentiation gradient in the
developing ventral forebrain. Development 2005; 132:565-78.
3. Montcouquiol M, Crenshaw EB, Kelley MW. Noncanonical Wnt signaling and neural polarity. Annu Rev Neurosci 2006;
29:363-86.
4. Priosoeryanto BP. Penggunaan teknik biakan sel dalam berbagai pengujian di bidang biomedis. Dalam: Pelatihan
pemanfaatan teknik kultur jaringan dan histokimia. FKH IPB, 2003.
5. Fukuda H, Takahashi J, Watanabe K. Fluorescence activated cell sorting-based purification of embryonic stem cells-derived
neural precursors averts tumor formation after transplantation. Stem Cells 2006; 24:763-71.
6. Dihné M, Bernreuther C, Hagel C, Wesche KO. Embryonic stem cell-derived neuronally committed precursor cells with
reduced teratoma formation after transplantation into the lesioned adult mouse brain. Stem Cells 2006; 24:1458-66.
7. Djuwita I. Biologi kultur jaringan. Dalam Pelatihan pemanfaatan teknik kultur jaringan dan histokimia. FKH IPB, 2003.
8. Matahine T, Boediono A. Peluang dan tantangan penggunaan stem cells untuk terapi regeneratif. Med Vet Indones
2006; 10:31-8.
9. Bouhon IA, Kato H, Chandran S, Allen ND. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in chemically defined
medium. Brain Res Bull 2005; 68:62-75.
10. Rathjen J, Halnes BP, Hudson KM, Nesci A, Dunn S, Rathjen PD. Directed differentiation of pluripotent cells to neural
lineage: Homogeneous formation and differentiation of neuroectoderm population. Development 2002; 129:2649-61.
11. Murashov AK, Pak ES, Hendricks WA, Owensby JP, Sierpinski PL, Tatko LM, Fletcher PL. Directed differentiation of
embryonic stem cells into dorsal interneuron. FASEB J 2005; 19:252-64.
12. Zhang P, Chebath J, Lonal P, Renel M. Enhancement of oligodendrocyte differentiation from murine embryonic stem
cells by an activator of gp 130 signalling. Stem Cells 2004; 22:344-54.
13. Liu S, Qu Y, Stewart TJ. Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal
cord transplantation. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97:6126-31.
14. http://openwetware.org/wiki/BE.109:DNA_engineering/FACS_analysis (16 Juli 2007)
15. http://www.bio.davidson.edu/COURSES/GENOMICS/method/FACS.html (16 Juli 2007)
16. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. 2nd ed. Pergamon, 1990.
17. Male D. Immunology: An illustrated outline. 3rd ed. Mosby, 1998.
18. http://www.stemcell.com (23 Maret 2006)
19. Pruszak J, Sonntag KC, Aung MH. Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell derived neural
cell populations. Stem Cells 2007; DOI: 10.1634/stemcells.2006-0744
340 CDK 186/Vol.38 no.5/Juli-Agustus 2011