熊本大学学術リポジトリ Kumamoto University Repository System

6-3)血液サンプルおよび癌組織の採取
1994年から2004年の期間に、熊本大学医学部皮膚科にて治療を受けたメラノー
マ患者および巨大先天性母斑患者からインフォームドコンセントを得た後に、末梢
血サンプルを採取し、遠心分離によって、患者血清あるいは血漿を単離した。癌組
織および母斑組織の手術摘出検体を検討できた患者に対しては、腫瘍組織における
SPARCの発現を検討した｡用いた抗体は以下の通りである。ウエスタンプロット法:
抗ヒトSPARCモノクローナル抗体:AON-5031(HacmatologicalTcchnologics社)、
EUSA法:抗ヒトSPARCモノクローナル抗体:ON1-1(ZymcdLab社)、ピオチン
化ヤギ杭ヒトSPARCボリクローナル抗体:EYRO1(R&Dsystem社)。
全ての患者サンプルは、符号をつけて匿名化し、実験時まで-80℃で保管し、そ
の後に使用した。サンプル提供患者に関しては、診療記録より、年齢、性別、腫瘍
の臨床病期(UICC国際分類;AJCC分類)の臨床データを診療録より収集し、血清
もしくは血漿中のSPARC値との関係について検討した。
6-4)QuuantitativeReverseTranscription-PCR
(定量によるRT-PCID
TRIZOLrcagcntを用いて、様々な組織と細胞株からtotalRNAを抽出した。い
くつかの正常組織のtotalRNAはBiochain社から購入した。各lUgのtotalRNA
からランダムヘキサマープライマーを用いて、Superscriptrcvcrsctranscriptasc
(インビトロジェン社)により各cDNAを合成した。RT‐PCRのSPARC特異的
プライマーを作成し、ロッシユ社のライトサイクラーを用いて、定量的RT-PCR
を行った。用いたSPARCPCRプライマー配列は、センス:5I-CGAAGAGGAGG
TGGTGGCGGAAAA-31,アンチセンス:5'一GGTTGTTGTCCTCATCCCTCTCATAC
-31である。
PCR反応は95℃1秒間、68°C1秒間、72°C10秒間で45サイクル行い、培養メラ
ノサイト細胞株であるHEMnの10倍希釈標準曲線を用いて、HEMnの発現を1と
して定量化した。また、ヒトの正常組織の半定量的RT-PCRは、95°C1分間、60°C
1分間、72°C分秒間で30サイクル行い、PCR産物を1%アガロースゲルで分離して
エチジウムブロマイドで染色して特異的バンドを検出した。比較対照として、6アク
チン特異的なプライマーも同時に用いた。用いたβアクチンプライマー配列は、セン
ス:51-CCTCGCCTTTGCCGATCC-3i,アンチセンス:SLGGATCTTCATGAGG
TAGTCAGTC-3’である。
6-5)Westernblot法
11種類の培養メラノーマ細胞株、1種類の培養メラノサイト細胞株、色素性母斑
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