熊本大学学術リポジトリ Kumamoto University Repository System

学位論文
Doctor,sThesis
新規ヒト癌関連抗原SecretedpmteinacidicandⅡichincysteine
(SEARC)の癌の診断と治療における有用性
(Secretedproteinacidicandrichincysteine,anidealcancer-associatedantigen
usefUlfOrserumdiagnosisandimmunotherapyofcancers,
identifiedusingcDNAmicroarrayanalysis)
生田義明
YOshiakilkuta
指導教授
西村泰治
熊本大学大学院医学教育部博士課程生体医科学専攻免疫識別学
馬場秀夫
熊本大学大学院医学教育部博士課程臨床医科学専攻消化器外科学
川筋道雄
熊本大学大学院医学教育部博士課程臨床医科学専攻心臓血管外科学
2007年3月

目次
目次……….……………….………………………………………..…….………………………….…………………….…………………….……….1
1要旨…………….………….……………..…..….…………….…………………………..…….…………………………………………….……3
2発表論文リスト.………………………..……………………………………………….……………………….…………………………….5
3謝辞……………………..………….………………..………………………………………………………………………………….……………6
4略語一°覧………….………….….………….…….………………………..………………………………………….………...……………….7
5研究の背景と目的.………….……..…….…………………………………………………….………………………………..……………8
5-1)HLA分子によるT細胞への抗原提示…………………………….….………………………………………………………8
図1MHCクラスI分子による抗原ペプチドのCD汀細胞傷害性T細胞(CIL)への提示……………10
図2MHCクラス分子による抗原ペブチドのCD4+T細胞への提示…………………………………….…11
5-2)抗腫蝋免疫のあらまし……………..……………………………….……………………………….……….……………………12
図3樹状細胞などの抗原提示細胞による抗腫瘍免疫応答の誘導.………………………………..……………13
5-3)従来の腫瘍拒絶抗原の同定法…………………………………………………….………………………….…………………14
5-4)cDNAマイクロアレイ解析による腫癌拒絶抗原の同定法………………………………………………………15
図4cDNAマイクロアレイ解析による腫瘍特異抗原の同定法の概要.……….……………………………16
5-5)新規癌関連抗原SEARC(Secr己tedProteinAcidicandRichmCysteine)について….………………..……17
5-6)メラノーマの臨床と腫瘍マーカー……………………………………………………………….……….………………….17
5-7)本研究の目的………………………………………………………………….…………………………….………….……………….18
6実験方法……………………………….…………………………………………………………………….………………….………….……19
6-1)cDNAマイクロアレイ解析によるスキルス胃癌に高発現する腫蕩抗原遺伝子の解析..…………19
6-2)使用した細胞….……………….……………………………………………………….…………………….…………………………19
6-3)血液サンプルおよび癌組織の採取……………….…………………………….……………………….……………………20
6-4)QuantitativeRcverscTranscription-PCR(定量によるRILPCR)..……………………………..……………………20
6-5)Westemblot法……………….………………………….……………….…….……….……………….……………………..………20
6-6)SPARCの免疫組織化学的解析..…………….………………………………………………………….……….………….…21
6-7)ELISA法による、メラノーマ細胞培養上漬、メラノーマ患者血清および血漿中の
可溶性SEARC蛋白質の検出…………………….……………….…………………………………………………………21
6-8)メラノーマ患者血清中のs-S-CD(HPLC法)およびGPC3(ELISA法)の測定_…………………22
6-9)HLA-A24およびH2-K.拘束性SPARC特異的CTLエピトープのモチーフ検索
(データベースでの検索)……………………………………………………………………………………………….………22
表lヒトとマウスで共通のアミノ酸配列をもちHLA-A24およびH2-K.分子に結合すると
推定されるSPARCペプチド….………………………………………………………….…………………….…………23
6-10)SEARC特異的CTLエピトープの同定.…………………………………….……………….…………………………24
6-11)BALB/Cマウスを用いた自己免疫反応の検討..………………..:……………….…………………………………24
6-12)細胞傷害活性の検討….………………………………………………………….………………………………………………25
6-13)Invivo腫瘍増殖抑制実験……………………………………………………………….………….…………………………25
6-14)統計学的解析…………………….………………….……….……………..………………………………………………………25
7実験結果.….………….……………………………………………….….………………………………………….……………….…………26
7-1)cDNAアイクロアレイ解析を用いた腫癌拒絶抗原候補遺伝子の選定……………….….…………………26
図5スキルス胃癌のcDNAマイクロアレイ解析データの解析…………….…………….….………………….26
図6正常組織でのSPARC遺伝子の発現解析(cDNAマイクロアレイ解析による)……………….27
1

7-2)ヒト正常組織におけるSEARCmRNAの発現解析(RIZPCR)…………………….……………………………28
図7ヒト正常組織におけるSPARCmRNAの発現…………….……………………….………………………………28
7-3)ヒト正常組織におけるSPARC蛋白質の発現(免疫組織化学的解析).……………………………….……29
図8ヒト正常組織におけるSFARC蛋白質の発現.………………………….…………………………………………29
7-4)ヒトメラノーマ細胞株におけるSPARCmRNAおよび蛋白質の発現………………….………………….30
図9メラノーマ細胞株におけるSPARCmRNAおよび蛋白質の発現.……………………………….………30
7-5)ヒトメラノーマ組織および巨大先天性母斑組織におけるSPARC蛋白質の発現
(Westemblot法).……..…………………..……………………………..………….………………….…………….……………31
図10色素性母斑、メラノーマ組織におけるSEARCmRNAおよび蛋白質の発現……..…………….31
7-6)ヒトメラノーマ組織および巨大先天性母斑組織におけるSPARC蛋白質の発現
(免疫組織化学法)…………………………….…….………………………………………….……………………………….…32
図11色素性母斑、メラノーマ組織におけるSPARC蛋白質の発現.…….…….………..……………………32
7-7)ELISA法を用いたメラノーマ細胞株培養上漬中の可溶'性SEARC蛋白質の検出….…………..……33
図l2ELISA法によるメラノーマ細胞株培養上漬中の可溶性SPARC蛋白質の検出…………………33
7-8)ELISA法によるメラノーマ患者、健常人および先天性色素性母斑患者血清中の可溶性
SEARC蛋白質の検出…………………………………………………………………….……………….………………………34
図l3ELISA法を用いたメラノーマ患者血清中のSFARC蛋白質の検出….……………………….………35
表2メラノーマ患者113例のプロフィールと、血清SPARC、GPC3および5-S-CD値
の比較………………………………………………………………..……………….………….………..……………………….36
7-9)メラノーマ患者におけるSPARC蛋白質の発現と血清中の可溶性SPARC蛋白質との
相関……………………..……….……………………………..……………………….………………………………………………39
図14ELISA法を用いたメラノーマ患者血漿中のSPARC蛋白質の検出.…………….……………………40
7-10)ステージ別にみたメラノーマ患者血清中のSEARC、GPC3およびS-S-CD濃度の比較……….41
表3ステージ別にみたメラノーマ患者血清中のSEARQGPC3および5-S-CD濃度の比較.……41
7-11)肉眼分類別メラノーマ患者における血清SEARC値の比較..…』.……………………..………………………42
表4肉眼分類別メラノーマ患者における血清SPARC値の比較….…………………….……………..………42
7-12)外科的切除前後のメラノーマ患者における血清SPARC値の推移.…………………………………….…43
表5術前の血清SPARC高値症例における術後の血清SPARC、GPC3
および5-S-CD値の推移.………………………………………………………………………………………….………44
7-13)BALB/cマウスを用いたSPARC特異的CTLエピトープの決定………………………………………..…45
7-14)BALB/cマウスを用いたSPARC特異的CⅡ株の樹立と、細胞傷害活性の検討…….……………45
図I5BALB/Cマウスを用いたSPARC由来のH2-K.拘束性CTLエピトープの同定………..……….46
図16SPARCペプチドを用いたSPARC特異的なCTLの誘導….………….……………..…………………….47
7-15)SPARCペプチド負荷BM-DCを免疫したマウスにおける腫瘍増殖の抑制…..…………….…………48
図l7SPARCペプチド負荷BM-DCワクチンによる腫癌増殖抑制効果と、生存期間延長
効果の検討…………………………………………………………………..……………………………….…………………49
7-16)ペプチド負荷BM-DCワクチンの投与を受けたBALB/cマウスの病理組織学的解析…………50
図18ペプチド負荷BM-DCワクチンの投与を受けたマウスの病理組織学的解析……………………50
8考察……….………….………….……………………….………………………………………………….……….….…………….….………51
9結語..………….…………………………….………………………..……………………………………………………………………….……55
10参考文献………………………………………………………………………………….……………………………….……………………56
2

1要旨
【目的】本研究は新規の腫瘍関連抗原を同定し、その癌の診断および抗腫瘍免疫
応答を誘導するワクチンとしての、臨床医学への応用の可能性を探ることを目的と
する。
【方法】(1)20人のスキルス胃癌患者の癌組織と正常組織におけるcDNAマイ
クロアレイ解析により、スキルス胃癌に特異的に高発現する遺伝子を同定した。
(2)同定した、Sccrctcdprotcinacidicandrichincysteine(SPARC)が、メ
ラノーマに高発現する分泌蛋白質である事に着目し、血清SPARCのメラノーマ診断
における有用性について検討した。原発性メラノーマ患者(109例)、巨大先天性母
斑(5例)、健常人(61例)を対象とし、ELISA法を用いて血清中のSEARC蛋白質
を定量し、その陽性率を既知の腫瘍マーカーであるGlypican3(GPC3)およびs-S
cysteinyldopa(5-S-CD)と比較検討した。(3)次に、SPARCを標的とした免疫療法の
開発を目的として、マウスを用いた動物実験を行った。ヒトとマウスのSPARCでア
ミノ酸配列が共通しているペプチドで、HLA-A24およびH2-Kdに共通したモチーフ
を持つものを4種類合成し、これらを負荷した骨髄由来樹状細胞(BMDC)を､BALB/c
マウスの腹腔内に2回免疫した後に脾細胞を回収し、ペプチド特異的細胞傷害性T
細胞(CTL)の誘導を検討した。さらに、当該ペプチドを負荷したBM-DCワクチン
のinvivoにおける腫瘍増殖抑制効果について検討した。
【結果】(1)cDNAマイクロアレイ解析により、正常では脂肪組織、乳腺、卵巣、
脊髄、精巣、子宮、胎盤などに軽度発現しているが、スキルス胃癌において発現が
著明に増加する遺伝子として、SPARCを同定した。ヒト第5染色体上の遺伝子によ
りコードされるSPARCは303個のアミノ酸により構成される分泌蛋白質であり、細
胞外基質蛋白質と細胞との相互作用を調節することにより、組織の修復、再構築や
細胞増殖に関与すると考えられており、SPARCはメラノーマや骨肉腫などの腫瘍細
胞および膵癌、胃癌などの腫瘍の問質細胞に高発現することが報告されていた。
(2)メラノーマ患者の血清SPARC値は健常人と比べて有意に増加しており、健常
人の平均値+2SDをカツトオフ値とすると、SPARCの陽性率は33%であり、健常人
では3例(5%)の疑陽性を認めた。術後経過を追う事が出来たSPARC陽性の13症例
中10例が、術後にカットオフ値以下となった。S-S-CDの陽性例は、ほとんどがStagc
IVであったが、SEARCおよびGPC3は早期のメラノーマでも陽性を示し、両者を併
用するとstagcO~nのメラノーマの66%を検出でき、早期メラノーマの診断への有
用性が証明された。(3)BALB/cマウスにおいて、自己免疫現象を伴うことなく、
KQ拘束性にSPARC陽性細胞株を傷害するSPARCペプチド特異的CTLを誘導できた。
さらに、同様のペプチド負荷BMDCを投与した後に、SPARCを高発現する細胞株を
移植し、抗腫瘍効果を検討したところ、腫瘍の増殖が80%のマウスにおいて抑制さ
れ、生存期間の延長を誘導することができた。
【結論】cDNAマイクロアレイ解析を用いて同定された新規癌抗原SPARCが、
メラノーマの腫瘍マーカーとして有用であることを示した。さらにマウスを用いた
動物実験により、SPARCを標的とした抗腫瘍免疫療法の有効性が示された。
3

SummaIy
Purpose:Tbestablishcffcctivcdiagnosticmcthodandanti-tumorimmunotherapyfOrseveral
canccrs,wctricdtoidcntifyanoveltumor色associatcdantigcn.
Experimentaldesign:WCanalyzcddataobtaincdfromcDNAmicroarrayanalysisofdiffUsc
gastriccanccrtissueand29normaltissucstofindanovcltumor迄associatcdantigen,secretcd
protcinacidicandrichinCystcinc(SPARC).Becausemclanomaccllswcrcreportedto
cxpressalargcamountofSPARC,andbccauseSPARCisasccrctcdprotein,atfi応t,sccrcted
SPARCproteinwasquantificdusingELISAinthcscrafromlO9mclanomapaticnts,s
paticntswithlargccongenitalmclanocyticnevus,61age-matchcdhealthydonorsandl3
discasc-frccpatientsaftcrundcrgoingasurgicalrcmovaLWCalsoquantificdtwoothcrknown
tumormarkcrsfOrmclanoma,GPC3and5-S-cystcinyldopa(5-S-CD),inthcsamcscrum
samplcs,andcomparcdthcscmarkcrsfOrthcirdiagnosticvaluc・Bccauscofthcsimilariticsin
thcbindingpeptidcmotifSsharcdbetwccnH2-KdandHLA-AZ4(A*2ｲ02),4pcptidcshaving
thcsemotifSwcrcsynthesizedThcn,wcinvestigatedwhcthcrthcH2-Kd-restrictedSEARC
pcptidcscouldinduccSPARCrcactivecytotoxicT1ymphocytcs(CTLs)ornot・Inaddition,
wcinvcstigatcdtheeffCctofthcprc-immunizationofBM-DCpulsedwiththcSEARCcpitopc
pcptidcsonagrowthofSPARC-cxprcssingtumorccllsimplantcdinBALB/Cmousc.
ResuuIts:In20diffUscgastriccanccrtissucs,anavcragcofrclativcratioofthccxprcssionof
thcSPARCmRNAincancercellsversusadjaccntnormalgastricmucosaswasl33,359.RIz
PCR,wcstcmblottingandimmunohistochemicalanalysisrcvcalcdthat,SPARCis
overcxpresscdinmelanoma・ThcscrumSPARCconccntrationsinmelanomapatientswcrc
grcatcrthanthoscinhcalthydonors(P=0.001)Whcnwcfixedacutoffvalucatthcmcan
conccntrationplus2SDofthehcalthydonors,thcscmmSRARCwasfOundtobcincreasedin
thcseraof36(33%)ofthelO9melanomapaticnts,whcrcasthcrewcrc3(49%)falscpositivccasesoutof61hcalthydonors・Sumrisingly,19of36paticntsshowingincrcascd
SPARClcvclswercinstagcsO-ILThcscrumSPARC1cvcldccreasedunderthccutofflcvclin
lOofl3paticntsaftcrsurgicalrcmovaLUsingSPARCandGPC3incombinationcnabledus
todctcct47of75(66.2%)mclanomapaticntsatancarlystage(0-11).SPARCprotcincontains
ZcpitopcsrccogmzcdbymouscH2-Kd-rcstrictcdCTLsThcscCTLs,gcncratedinBALB/C
mousc,hadcytotoxicactivityagainstcancercelllincspositivcfOrSPARC・Furthcnnorc,prc‐
immunizationofBALB/CmicewithBM-DCpulscdwiththcSPARCepitopcpcptidcs
prcvcntedthcgrowthofthcmouscfibrosalcomacclllinc(McthA)engraftcdinBALB/c
mouscandcontributcdtoclongationofsurvivaltimcwithoutcausingautoimmuncdiscascs.
Conclmsions:SEARCmayprovctobcanidealtumor上associatcdantigcnuscfUlfOrdiagnosis
andimmunotherapyofcancersincludingmclanoma・cDNAmicroarrayanalysisisausefill
mcthodtoidcntifytumoﾄassociatedantigensuscfUlfOrcanccrdiagnosisandimmunothcrapy.
4

1.
2.
3.
4.
Z発表論文リスト
処_X､,Nakatsula,T､,Kageshita,Ⅲ,Fukushima,S,Ito,S,Wakamatsu,K､,
Baba,H､,andNishimura,YmghlySensitiveDetectionofMelanomaatanEarly
StageBasedontheSemmSecretedProteinAcidicandRichinCysteineand
Glypican-31evels.αガルα"cc｢R“11:8079-8088,2005.
Komori,H,Nakatsura,T,Senju,S,Ybshitake,Y,Motomura,Y,lkuta・Yo
Fukuma,D,,Ybkomine,K､,Harao,M,Beppu,T､,Matsui,M,Tbrigoe,T､,Sato,
N､,Baba,H､,andNishimura,Y:IdentificationofHLA-A2-orHLA-A24-
RestrictedCTLEpitopesPossiblyUsefillfbrGlypican-3-Specific
ImmunotherapyofHepatocellularCaminoma・Cl『処Ou"ce7Resbl2:2689-2697,
2006,
YOshitake,Y,Nakatsura,T､,Monji,M,Senju,SMatsuyoshi,H,Imkamoto,
H,,Hosaka,S,Komori,H,Fukuma,、,Ikl』止竺_エ,Katagiri,T､,Furukawa,Y,
Ito,H､,Shinohara,M,Nakamura,Y,andNishimura,YProlifbrationPotential-
ReIatedProtein,anldealEsophagealCancerAntigenfbrlmmnotherapy,
IdentiHedUsingComplementaryDNAMicroarTayAnalysis､CTiDo.α"Ce｢雌58
10:6437-6448,2004
Nakatsura,I,Kageshita,正,Ito,S､,Wakamatsu,KMonji,M,l旦』旦_LSenju,
S・’0,0,ⅢandNishimura,YIdentificationofGlypican-3asaNovelTUmor
MarkerfbrMelanoma・CTK'6.oz"ceMResblO:6612-6621,2004
5

3謝辞
本研究を行なうにあたり、御指導を下さいました熊本大学大学院医学薬学研究部、
感染・免疫学講座、免疫識別学分野の西村泰治教授、心臓血管外科分野の川筋道雄
教授ならびに消化器外科分野の馬場秀夫教授に深く感謝いたします。また、研究方
法に関して直接御指導を頂いた千住覚助教授及び中面哲也前助手(現国立癌センタ
ー東病院・臨床開発センター・癌治療開発部・機能再生室・室長)、ならびに組織の
免疫染色に御協力いただきました分子病理学分野の山本哲郎教授、久保多律子さん
に深く感謝いたします。さらに、スキルス胃癌のcDNAマイクロアレイ解析のデー
タを御供与頂いた東京大学医科学研究所ヒトゲノム解析センターの中村祐輔教授、
古川洋一教授、片桐豊雅助教授に深く感謝いたします。また、メラノーマ患者の血
清S-S-CD値の測定に協力して下さった藤田保険衛生大学衛生学部の伊藤祥輔教授
および若松一雅教授、ならびにメラノーマ患者検体を御供与頂いた熊本大学大学院
医学薬学研究部皮膚科分野の福島聡先生、影下登志郎前助教授および小野友道前教
授に深く感謝いたします。
6

AJCC;Americanjointcommittceoncanccr
ALMacrallcntiginousmelanoma
BM-DC;boncmarrow-deriveddcndriticccll
cDNA;complemcntaryDNA
CrL;cytotoxicT1ymphocytc
DNA;dcoxyribonuclcicacid
ELISA;cnzymc-linkcdimmunosorbcntassay
ELISPOT:enzymc-1inkedimmunospot
5-S-CD;s-S-cysteinyldopa
4略語一覧
GM-CSF;granulocytc-macrophagccolonystimulatingfactor
GPC3;glypican-3
HEMn,humancpidermalmclanocytes,nconatal
HLA;humanhistocompatibilitylcukocyteantigens
lFN;intcrferon
lL;intcrlcukin
LMM;lentigomalignamclanoma
MHC;majorhistocompatibilitycomplcx
MIA;mclanomainhibitoryactivity
NK;naturalkiller
NM;nodularmclanoma
PBS;phosphate-buffercdsalinc
RIPCR;revcrsctranscription-polymerascchainrcaction
SD;standarddcviation
SEREX;scrologicalanalysisofrccombinantcDNAcxprcssi(
SEREX;scrologicalanalysisofrccombinantcDNAcxprcssionlibrarics
SPARC;sccretedproteinacidicandrichincysteinc
SSM;supcrficialspreadingmclanoma
TAP;transportcrassociatcdwithantigenprocessing
TCR;Tcellrcceptcr
TNF;tumornecrosisfacter
TNM:Tilmor-Node-Mctastasis
UICC;uniointcmationalcontracancrum
7

5研究の背景と目的
5-1)HLA分子によるT細胞への抗原提示
主要組織適合遺伝子複合体(majorhistocompatibilitycomplcx:MHC)によりコ
ードされるMHC分子は、細胞内で抗原が分解されてできたベプチドを分子の先端
に結合して細胞表面に発現する。T細胞は抗原を直接認識することはできず、細胞
表面に発現する抗原ペプチドとMHC分子を複合体として認識する。MHC分子には
クラスIとクラスⅢの2種類があり、それぞれ細胞内での局在が異なる抗原に由
来するペプチドを機能の異なるT細胞に提示して活性化を促す(1)。ヒトのMHCは
白血球の血液型として発見されたために、ヒト組織適合性白血球抗原(human
histocompatibilitylcukocytcantigcmHLA)系と呼ばれる。
q6型T細胞レセプター(TCR)を発現するT細胞のうち､細胞傷害性T細胞(CTL)
は、HLAクラスI分子に結合する性質を持つCD8分子を発現する。HLAクラスI
分子は主に核や細胞質の蛋白質に由来するペブチドを結合して、すべての有核細胞
と血小板の表面に発現する。CTLはTCRを介して自己のHLAクラスI分子に結
合した、ウイルスあるいは細菌などの非自己蛋白質に由来するペプチドを認識して
感染細胞を破壊する。さらに、腫瘍細胞の表面に発現するHLAクラスI分子に結
合した自己あるいは非自己ペプチドを認識したCTLは腫瘍細胞を破壊する(2)。また
HLAクラスI分子は、特定のウイルスあるいは細菌に感染した細胞、あるいは腫
瘍細胞を破壊する性質をもつナチュラルキラー(NK)細胞のレセプター(kiUer-ccll
inhibitoryrcccptor;KIR)に結合し、NK細胞の細胞傷害活'性を抑制する(図1C)(3)。
HLAクラスI分子に結合するペプチドは、細胞質蛋白質にユピキチンが複数結
合した後に、プロテアソーム(protcasomc)あるいはLMP(largcmultifunctional
protcase)と呼ばれる蛋白分解酵素の複合体によりエネルギー(ATP)依存性に分
解されてできたものである(4,5)。最近、細胞質内でmRNAが翻訳されてできたば
かりの蛋白質のうち30%にも及ぶものが直ちにこの経路に入ることが示されている。
さらにペプチドは、HSP70などのシヤペロンにより小胞体に運搬され、TAP
(transportcrassociatcdwithantigcnproccssing)分子により、エネルギー(ATP)
依存性に小胞体の内腔へと導かれ、そこでHLAクラスI分子のペプチド収容溝に
結合する(図1)(6)。このペプチド収容溝には、A~Fポケットと呼ばれる6個の
ポケットが存在する。MHCクラスI結合ベプチドは9個のアミノ酸(N末端側より
position-1(P1)~(P9)と呼ばれる。)により構成されていることが多く、ペプチドは
溝の両端からはみ出すことなく納まっている(図1A,B)(7-9)。MHCクラスI分
子で多型を示すアミノ酸残基の多くは、分子の先端にあるペプチドを収容する溝を
構成するα1およびα2ドメインに集中している。このような多型によりペプチド
収容溝の形状が変化するため、MHCクラスI分子に結合可能なペプチドの構造も
8

MHCクラスI分子ごとに異なっている。つまり結合するMHCクラスI分子ごと
に、ペプチドのNあるいはC末端寄りのアミノ酸には一定の傾向(MHCクラスI
結合モチーフ)が認められる('0)。これらのアミノ酸の側鎖はペプチド収容溝の左
端あるいは右端に位置する、それぞれA(P1)、B(P2)あるいはF(P,)ポケットに収容
される(図1B)(6,11)。これらのポケットとカッコ内に示した抗原ペプチド上の特
定の位置に存在するアンカーアミノ酸の側鎖の大きさ、極性(親水性あるいは疎水
|性)および荷電などの性質が適合した場合に、ペプチドはMHCクラスIに結合す
る。MHCクラスI結合性ペプチドは中央部で折れ曲がりペプチド収容溝からせり
上がっており、この部分のアミノ酸の側鎖がTCRにより認識される。この状況は特
にアミノ酸の数が1o個以上のペプチドで顕著である。
一方､HLAクラスⅢ分子に結合する性質を持つCD4分子を発現するT細胞は、
主に樹状細胞、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、単球、B細胞などのプロフ
ェッショナル抗原提示細胞(antigcnprcscntingcell;APC)に限定して発現する
HLAクラスⅢ分子に結合した非自己抗原ペプチドを認識して種々のサイトカイン
を分泌する。サイトカインはB細胞に増殖と形質細胞への分化を誘導して抗体産生
を促進したり、T細胞の分化と増殖および抗原提示細胞の活性化を促すなどの作用
を示し、細胞内の微生物の排除を促進する。抗原提示細胞はHLAクラスI結合性
ペプチドの提示のみならず、HLAクラスⅡ分子により提示される抗原のプロセッ
シングと提示という重要な機能を担っている。
図2Cに示すように、抗原提示細胞は細胞外から抗原を取り込み、これをエンド
ソーム内の種々の酵素により還元および分解してベプチドを作る。さらにペプチド
はMIIC(MHCclassIIcompartmcnts)やCIIV(classllvcsiclcs)と呼ばれる別
の細胞内コンパートメントで、HLAクラスⅢ分子に結合して細胞表面に発現する。
MHCクラスⅡ分子のペプチド収容溝には、MHCクラスI結合ベプチドと比較し
て長い10~30数個(多くは15個前後)のアミノ酸からなるペプチドが、伸張され
た形で結合している(12,13)。MHCクラスIではペプチドを収容する溝の両端が閉
じているのに対して、MHCクラス11では開放されているために、ベプチドの両端
のアミノ酸残基は溝の両端からはみ出している。ペプチド収容溝に収まるペプチド
部分は、MHCクラスIと同様に約9個のアミノ酸からなり、1アミノ酸残基進むご
とに側鎖の方向が回転するため、ベプチド上でMHCクラスⅢに向かう複数の(通
常4~5個)アミノ酸残基の側鎖がアンカーとなる。これらがMHCクラスⅢ上の
ペプチド収容溝に存在する4~5個のポケットに、うまく収容される形をしたアミ
ノ酸の組み合わせ(MHCクラスⅢ結合モチーフ)になっている場合に、ベプチド
はMHCクラス11に結合する(13)。ペプチド上の最もN末端側のアンカー残基の位
置をpositionl(P1)としてC末端方向に各アミノ酸残基に番号を付けると、通常
(P1),(P4),(P6),(P7)および(P9)の各アミノ酸残基の側鎖がMHCクラスⅢ分子の
溝に向かいアンカー残基となっていることが多い(図2A,B)。さらに、これらのア
ンカー残基の間に介在している残基の側鎖がTCRにより認識される。
9

HLA分子は、たとえ非自己抗原が存在しても、その大多数は正常な自己蛋白質に
由来するペプチドを結合して細胞表面に発現しており、これを認識するT細胞は胸
腺におけるT細胞の分化過程で消滅(クローン欠失)しているか、末梢で不活性化され
アナジーの状態になるなどして免疫寛容(トレランス)の状態にあり、応答を示す
ことはない。しかし、細胞表面に数千~数万個発現しているHLAクラスI分子のう
ちの数個~数十個が非自己抗原ペブチドを結合していると、CTLはこれを認識して
細胞傷害活性を発現する。いつぼう抗原提示細胞表面のHLAクラスⅢ分子のうち
数十~数百個が非自己抗原ペプチドを結合すると、CD4陽性ヘルパーT細胞がこれ
を認識して免疫応答を開始する。
図1
H末
A
P5
;(｣jji1菱1M参も≦《
C標的細胞に対する
細胞傷害性の発現細胞傷害活性の抑閣
蕊
閣性
■多型を示すアミノ酸残基(自己ﾀﾝﾊﾟｸ頁およびO伽ス
あるいは■■に特異的な
非自己ﾀﾝﾊﾟｸRを含む。)
図1.MHCクラスIによる抗原ペプチドのCD8+細胞傷害性T細胞
(CTL)への提示
AMHCクラスI(ヒトのHLA-A2分子)に結合性を示す、ウイルス由来の5種類のペプチドを重
ねて横から見た図。ペプチドはP1~P9で示した9個のアミノ酸からなり、両端(NおよびC末端)の
アミノ酸はすべて一致しており、この部分のアミノ酸の側鎖がMIICクラスIのペプチド収容溝にあ
る3つのポケットに収容される。ペプチドの中央部分のアミノ酸残基(P3~P7)の側鎖は、ペプチド収
容溝からせり上がりTCRにより認識される。BMIICクラスI(HLA-A2分子)のペプチド収容溝を、
TCR側より見た図。溝は相対する2つのαヘリックス(右巻きラセン)構造に囲まれている。丸はA,B
およびFポケットの位置を示し、()内の数字に対応するペプチド上のアンカーアミノ酸残基の側鎖
がここに収容される。黒塗りの部分はMHCクラスI(ヒトのHLAクラスI)で多型を示すアミノ酸残
基を示す。CHOは糖鎖を示す。CMHCクラスIにより提示された抗原ペプチドの認識によるCTL
の活性化およびNK細胞の細胞傷害活I性の抑制。α1,α2,α3および2inは、それぞれMHCクラ
スIの細胞外ドメインおよびβZミクログロブリンを表し、KIRは細胞傷害抑制性レセプター(killer-
cellinhibitoryreceptor)を表す。
10

図2
ﾛロ2
円T
盈威蓋三砦笥‘
抗原提示細胞
図二.MHCクラスⅡ分子を介した抗原ペプチドのCD4+ヘルパー
T細胞への提示
A・MHCクラスII分子cIIA-DR1)により抗原提示を受けるインフルエンザヘマグルチニンペプチド
CIA306-318)の構造を示す。MHCクラスⅡ分子との結合に重要なアンカーアミノ酸残基で、最もN末
端側のTyrの位置をpositionl(P1)としてC末端方向に番号を付けた場合の、各残基の番号およびアミ
ノ酸を表示した。またアミノ酸の側鎖が、MHCクラスⅡ分子のペプチド収容溝の5個のポケットに
収容されるアミノ酸残基を四角で囲んで示した。ペプチド結合で結ばれたペプチドの主鎖を黒の実線
で示す。各アミノ酸上の黒く塗りつぶした原子はMHCクラス11分子に接している原子を、白い原子
はMHCクラスⅢ分子とは接触していない原子を示す。B・HA306-318を結合したMHCクラス11分
子を真上(TCR側)より見た立体構造を示す。円は、HA306-318ペプチド上でMHCクラス11分子と
の結合に重要な5個のアンカーアミノ酸残基(P1,P4,P6,P7およびP9)の側鎖を収容すべ

5-2)抗腫瘍免疫のあらまし
「悪性腫瘍に対して免疫系の応答は有効か」という疑問に対する、現時点での答
えは、以下のとおりであろう。腫瘍浸潤リンパ球(tumorinfiltratinglymphocytc;
TIL)中に腫瘍に反応性のT細胞が多いこと、癌患者の末梢血に腫瘍抗原に対する免
疫応答が検出されることなどから、免疫系は腫瘍と戦ってはいるが、腫瘍を排除す
るには至ってない。
従来の免疫強化療法は、非特異的に活性化された免疫応答のなかに抗腫瘍効果を
期待したものであった。これに対し近年は、腫瘍に特異的な免疫応答をいかに増強
するかが研究の焦点となっている。この分野では1)HLAにより提示される腫瘍拒
絶抗原ならびにペプチドの同定、および2)これを認識するT細胞の活性化方法の
開発、が重要な問題となっている。近年の基礎免疫学の進歩により多くの腫瘍拒絶
抗原が発見され、T細胞活性化のメカニズムも次第に明らかとなり、腫瘍免疫学は
新しい局面を迎えつつある。
前述したように腫瘍拒絶抗原が細胞内でペプチドヘと分解されHLAクラスI分子
により腫瘍細胞の表面に発現されると、主にOTLがこれを認識し腫瘍細胞を傷害す
る。ただし多くの腫瘍細胞は抗原を一度も認識したことのないナイーブT細胞の活
性化に不可欠なCD80(B7-1)/CD86(B7-2)などの共刺激分子を発現しておらず、直接
CTLを活性化することは出来ない。図3に示したようにCD80/86分子を発現する最
もすぐれた抗原提示細胞である樹状細胞は腫瘍抗原を貧食し、腫瘍拒絶抗原ペプチ
ドをHLA分子に結合して、ナイーブCD4陽性ヘルパーT細胞およびCD8陽性CIL
に提示できる。ナイーブT細胞が活性化されてエフェクターT細胞になると、腫瘍
細胞のように共刺激分子を発現していなくてもT細胞レセプター(TCR)が認識可
能なHLA・ペプチド複合体を発現していれば、T細胞はこれを認識して免疫応答を
示す(14)。この際にCILは腫瘍細胞を認識してこれを破壊し、CD4陽性ヘルパーT
細胞は'し2,IFN‐γ,TNFおよびGM-CSFなどのサイトカインを産生し、T細胞、B
細胞、あるいは抗原提示細胞を活性化することにより抗腫瘍免疫応答を増強する(図
3)。活性化されたB細胞は腫瘍抗原に特異的な抗体を産生する。
12

図3
T飼飽ﾚｾﾌﾞ ﾀー
HLAク
抗原提示9翻包による
..B細胞...
匝疽抗原969K的ナイーヴ
T細胞の活性化
亡=>

5-3)腫瘍拒絶抗原の同定
科学的基盤に立った癌の免疫療法を確立するための第一のステップは、ターゲッ
トとなる腫瘍抗原を同定することである。このために、20世紀初めよりヒトや実験
動物に発生した種々の癌を用いて多大な努力がなされてきた。しかし、腫瘍抗原の
存在をヒトの癌で実証することはむずかしく、長いあいだその存在すら疑われてい
た。地道な研究が実を結び、ヒトの腫瘍抗原が分子レベルで明らかにされたのは、
1991年であった。Ludwig癌研究所(BrusselsBranch)のBoonらのグループ(15)
は、メラノーマ患者の細胞傷害性T細胞が認識する腫瘍抗原、MAGEの遺伝子クロ
ーニングに成功した。彼らの論文が、ヒトの腫瘍抗原に科学的根拠を与え、また腫
瘍抗原の同定方法も確立させた最初の報告であった。インターロイキン(IL)-2使用
によるCTLのクローン化と長期培養と遺伝子の発現クローニング法という二つのよ
く確立された技術を組み合わせたことと、T細胞による抗原認識の分子機構の解明
という学問的進展がこれを可能ならしめた。CTLは抗原丸ごとを認識するのではな
く、抗原蛋白質由来の8~12個のアミノ酸から成るペプチドと、主要組織適合遺伝
子複合体(MHC)の遺伝子産物であるMHCクラスI分子とが結合した複合体を認識
する(2)。MHC分子の役割は、ペプチド(抗原)をT細胞に提示することである。
したがって、抗原蛋白そのものが細胞表面に存在する必要はなく、核や細胞質に存
在する分子も適切にペプチドに分解されMHC分子に結合すれば、細胞表面に移動
してT細胞に認識される。この画期的な発見は、それまで主に抗体を用いて検出す
ることにより細胞表面分子に限定して考えられていた腫瘍抗原の概念を大きく変え、
腫瘍抗原となりうる分子の種類と数を飛躍的に拡大させた。
Boonらの発表後、癌患者由来のCTLが認識するメラノーマやほかの癌の腫瘍抗
原が、分子生物学的方法、もしくは生化学的方法を用いて同定されている(16-20)。
最近、抗腫瘍免疫におけるCD4+ヘルパーT細胞の重要性が指摘され、これが認識す
る腫瘍抗原も分子生物学的方法や生化学的方法を用いて同定されるようになってき
た(21,22)。同定された抗原をターゲットにした癌の免疫療法の臨床試験が、欧米で
もわが国でもすでに開始されている(23-26)。しかし、T細胞の活性化を指標にし
た癌抗原の遺伝子発現クローニングによる同定には技術的な制約が多く、これまで
同定された腫瘍抗原はメラノーマに関連するものが主であり、他の種々の癌におけ
る腫瘍抗原の同定にまでは普及しなかった。
抗体を用いた腫瘍抗原同定の試みは、CTLによる試みより長い歴史をもつ。特に
腫瘍特異的モノクローナル抗体は大きな期待をもって迎えられた。作製された抗体
の多くは分化抗原に対するもので､,,癌特異的”な抗原は同定されず、しかも癌免疫
療法での抗体の有用性は特定の抗原を発現する癌に限定されたものとなっている。
しかし、抗Hcr2抗体(Transtuzumab)や抗CD20抗体(Rituximab)などは、
正常組織に抗原が発現しているにも関わらず、それぞれ乳癌あるいはBリンパ腫の
治療において優れた効果を示している。さらに、1995年にドイツ・Saarland大学
14

のPfrcundschuhら(27)により、癌患者が自己の癌に反応して産生する抗体が認識
する腫瘍抗原を、遺伝子の発現クローニングの手法を取り入れて同定する方法、
SEREX(scrologicalidentificationofantigcnsbyrccombinantcxprcssion
cloning)が確立された。SEREX法は、腫瘍抗原の同定を加速的に進展させており、
すでにSEREX法により同定された多数の腫瘍抗原(28-30)がデータベース化されて
いる。(http://www2.licrorg/CanccrlmmunomeDB)。
また、われわれが世界に先駆けて行ったcDNAmicroarrayanalysisを用いて腫
瘍特異抗原の探索を行う方法も有用であることが判明してきた。さらに、これらの
方法で同定された抗原の一部をターゲットにした抗腫瘍免疫療法の臨床試験も開始
されてきている。
5-4)cDNAマイクロアレイ解析による
腫瘍拒絶抗原の同定
免疫療法への応用を考える場合には、多くの患者に使えるという共通性(発現頻
度)、腫瘍特異性、免疫原生、腫瘍拒絶能、抗原消失性、自己免疫などの副作用、な
どによって各抗原の特徴をとらえる必要がある。すなわち、理想的な癌拒絶抗原が
備えているべき性質として以下の3つが考えられる。1)癌患者の体内において免
疫応答を誘導する抗原;癌細胞の拒絶までは至らないとしても、癌患者の血液中に
抗原特異的な抗体やT細胞の存在が検出できるもの。2)発現の組織特異性が優れ
た抗原;癌細胞での発現は強いが、正常組織にはほとんど発現しておらず、腫瘍抗
原に対する免疫応答が重篤な自己免疫疾患を誘導しないもの。たとえば、胎児期組
織および癌組織のみに発現する癌胎児'性抗原や、癌細胞と免疫系から隔離された組
織のみに発現する癌精巣抗原(CT抗原)など。3)免疫系からの逃避が起こりにく
い抗原;癌細胞の悪性形質転換、組織浸潤や転移に重要な役割を担っている分子で、
癌細胞がその発現を欠落すると、癌の悪性形質を失うもの。
また、現在までに同定されているヒト癌抗原を分類すると、canccr-tcstis抗原、
組織特異抗原、変異ペプチド抗原、癌遺伝子、癌抑制遺伝子産物、癌胎児性抗原、
癌細胞で発現が増強している抗原などがあげられるが、T細胞によって認識される
ヒト腫瘍抗原の同定法として以下の4つがあげられる。1)癌化と関連した腫瘍抗
原の候補に対するT細胞応答の解析;細胞の癌化に関連した癌遺伝子や癌抑制遺伝
子産物の突然変異部分、融合蛋白質の境界部分、あるいはウイルス抗原に由来する
ペプチドを特異的に認識するT細胞の証明(変異Ras、変異p53、BCR/ABL、
TEL/AMUほか)。2)癌細胞に特異的に反応するT細胞株(クローン)を利用し
た、癌細胞由来のcDNAライブラリーのスクリーニング(MAGE-1/3,チロシナー
ゼ、gplOO、Mclan-A/MART-LSART-1ほか多数)。3)癌患者血清中の抗腫瘍
抗原IgGを利用した、癌細胞由来のcDNAライブラリーのスクリーニング(SEREX
法)(NY-ESO-1ほか多数)。4)cDNAmicroarrayanalysisによる、遺伝子発現
15

の組織特異性から抗腫瘍免疫の誘導に適した腫瘍抗原の同定と、その抗原性の解析
(PP-RP(31)、GIypican-3(32,33)ほか)。
このうちで最新にして最も有効なcDNAマイクロアレイ解析による腫瘍特異抗原
同定の概略を図4に示した。腫瘍抗原候補の同定にcDNAマイクロアレイ解析を用
いることの最大の利点は、一度に数千~数万種類の遺伝子の発現をスクリーニング
することができるところである。そこでまず理想的な癌拒絶抗原が備えているべき
性質のうちの2)の条件を満たす遺伝子を選出することができる。場合によっては
3)の条件を満たす遺伝子を選出することもできる。さらにcDNAマイクロアレイ
解析は、患者毎に遺伝子発現を解析することができるため、各遺伝子の癌における
発現頻度も知ることができる。
図4
RNAの抽出
:露雰ﾝグ
鱗十三十
屈部の粗伍I
繋十
プロープ
DNA
■■■■■■■■l■■■■■■■ 讓辨一三誓一》
-ﾉｰ↓-舌一
鑿欝欝
一…¯
轡|鯵iiGi
-一1+’
図4.cDNAマイクロアレイ解析による腫瘍特異抗原の同定法の概要
比較する2つの状態の細胞や組織からRNAを抽出する(今回の場合、スキルス胃癌の癌部と非癌部
組織をLasercaptuIemicrodissectionにて回収し、それぞれの組織からRNAを抽出した)。逆転写反応
によりcDNAを合成する際に、2種類の蛍光色素をそれぞれ取込ませ標識する(今回の場合、癌部DNA
をCy5で、非癌部DNAをCy3で標識した)。標識されたcDNAを混合し、ターゲットDNAとする。
プロープDNAをアレイしたスライドガラス上でハイプリダイゼーションを行ったのち、非特異的な
結合を洗浄し取り除き､CCDカメラあるいは蛍光スキャナーを用いてハイブリダイゼーシヨン後の蛍
光画像を取込み、疑似カラー(Cy5:赤、Cy3:緑)をつけて表示するとともに、それぞれの蛍光強度の比
(R/G)を計算し、遺伝子発現プロファイルとして示す。
16
DBCWS
■8CWS
沮合

5-5)新規癌関連抗原SPARC
(Secretedproteimacidicandrichincysteine)について
SPARC(別名ostconcctinまたはBM-40)は骨の構成蛋白質として、1981に初
めて報告され、また基底膜から発生した腫瘍に発現していることが1987年にMann
らによって報告された(34,35)。SPARCは様々な機能をもつ細胞-細胞間質糖蛋白
質であり、コラーゲンやビトロネクチンなどの細胞外基質蛋白を結合することによ
り、細胞間質と細胞との相互作用を調節している。また、その他の機能としては、
細胞の接着阻止、G1アレスト誘導による細胞の増殖抑制、様々な増殖因子・増殖抑
制因子の調節などがあるが、正確なメカニズムは未だ解明されていない(36,37)。
SPARCは、成人の骨、血小板あるいは創傷部位などの組織が改築をくり返してい
る部位で高発現している。また、様々な腫瘍においても、腫瘍内部の間質細胞を中
心に高発現しており、SPARCと腫瘍の関係については、様々な癌腫において多くの
報告が行われている。癌細胞が分泌するSPARCが好中球の抗腫瘍作用を抑制し、
エスケープ機構様の働きをするとの報告もある(38)。
Lcddaらは、免疫組織学的検査にて、ヒトメラノーマ細胞にSPARCが高発現す
ることを発見し､その発現が､腫瘍の進行に相関することを報告した(39)｡またLedda
らは､SPARCのアンチセンス発現ベクターを用いてヒトのメラノーマ細胞のSPARC
の発現を抑えると、invitroで接着性や浸潤性が失われ、invivoでの発癌性がな
くなったことを報告した(40)｡また､マウスの乳癌の間質細胞から分泌されるSPARC
が、腫瘍間質を増生させ、腫瘍の増殖を促進させるとの報告も行われている(41)。
以上より、メラノーマを含むいくつかの癌腫では、SPARCは、癌の進行を促す分
子ではないかと考えられている。
5-6)メラノーマの臨床と腫瘍マーカー
メラノーマ(悪性黒色腫)は、色素細胞(メラノサイト)が癌化したものである。
メラノーマは、皮膚癌のなかで最も悪性度が高く、非常に恐れられている。
日本におけるメラノーマの発生頻度は人口10万人あたり1.5~2人くらいと言われ、
年間1500人~2000人くらいが発症していると推測されている。欧米では人口10万
人あたり10数人以上の発生と言われ、オーストラリアでは人口10万人あたり20数
人以上の発生で世界一発生率が高いと言われている。それだけに欧米やオーストラ
リアの人々はメラノーマに関心を持ち、メラノーマの発生に注意をしている。また、
外国でも日本でもメラノーマの発生は、年々増加傾向が認められている。最近の調
査では、日本における年間死亡者数は450人前後である。メラノーマは、特に40歳
以上になると発生率が高くなり、患者数は60歳~70歳台で最も多くなっている。小
児の発生は非常に少ないが、最近20~30歳台の若年者の発生が増加している傾向が
17

ある。発症における、男女差は見られない。日本人でメラノーマが発生しやすい部
位は、足底が最も多く、約3割を占める。そのほか、欧米人と同様に体幹、四肢、
顔面、頭部など、いずれの部位にも発生する。メラノーマの治療法としては、外科
的切除、化学療法および放射線療法が実施されているが、遠隔転移を来したような
進行期の患者に対する治療法として免疫療法が注目され、実際に一部の患者では奏
功している。
血清腫瘍マーカーの測定は、メラノーマの診断のみならず、術後症例における再
発の早期発見と、進行期例の治療効果の判定に重要である。メラノーマの腫瘍マー
カーとしては、これまでに血清LDHや5-S-cysteinyldopa(s-S-CD)の有用性が知られ
ていたが、さらに近年、S-100β蛋白質およびmclanomainhibitoryactivity(MIA)がよ
り鋭敏なマーカーとして報告されている。本邦では、S-S-CDが広く用いられている。
しかしながら、これらの腫瘍マーカーは主として進行期で検出されるものが多い。
そのため、診断よりも転移巣の検出や経過観察のモニターとして用いられる。メラ
ノーマは再発、転移を生じやすいので、メラノーマを早期検出できる腫瘍マーカー
の意義は大きく、新たな腫瘍マーカーの発見が望まれる。
すでに当教室の中面らは、GPIアンカー膜蛋白であるGlypican-3(GPC3)が、メラ
ノーマ及び肝細胞癌に高発現し、さらにEUSA法を用いてメラノーマ患者および肝
細胞癌の共に約40%において、患者の血清中に検出され、これが、肝細胞癌および
メラノーマの新しい腫瘍マーカーとして有用であることを報告した(42)(43)。
5-7)本研究の目的
本研究はスキルス胃癌のcDNAマイクロアレイ解析により新たな腫瘍関連抗原を
同定し、その癌の診断および抗腫瘍免疫療法への応用の可能性を探ることを目的と
する。
18

6実験方法
6-1)cDNAマイクロアレイ解析による
スキルス胃癌に高発現する腫瘍抗原遺伝子の解析
東京大学医科学研究所ヒトゲノムセンターの中村祐輔博士との共同研究により、
cDNAマイクロアレイ解析を用いて、び漫性浸潤'性胃癌に特異的に高発現する遺伝
子の解析を行った。
スキルス胃癌患者20人の癌部と非癌部の組織から抽出したRNAを逆転写反応に
よりcDNAを合成する際に、それぞれCy3とCy5にて標識し、ターゲットDNA
とした。それらを、ヒトで発現している23,040種類のプローブDNAとハイブリダ
イズさせることにより、遺伝子の発現プロフィールを解析した。その解析結果を基
に、以下の手順で、多くの症例で、正常胃粘膜組織(非癌部)では発現が低いが、
スキルス胃癌で発現が著明に増加する遺伝子を選出した。
1)スキルス胃癌患者20例の癌部と非癌部における23,040種類の遺伝子の発現を比
較検討することにより、多くの症例で癌部/非癌部の発現の比が5以上の遺伝子を選
ぶ。2)次にそれらの各遺伝子について、29臓器(胎生期の4臓器を含む)の正常
組織における23,040種類の遺伝子の発現プロファイルを解析して、正常組織には発
現の弱い遺伝子を選ぶ。
6-2)使用した細胞
メラノーマ細胞株である、CRL1579、G36LHMV-1およびSK-MEL-28は、
東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センターから御供与頂いた。888mClおよ
びs26mclは、慶応大学先端医化学研究所細胞'情報研究部門教授の河上裕教授から
ご供与頂いた。164、HM3KqMeWo、SK-MEL-19、Colo38は、熊本大学皮膚
科の影下登志郎前助教授より御供与頂いた。これらのメラノーマ細胞株は、10%FCS
を添加したDMEMあるいはRPMI1640培養液中で培養し、SPARCの発現解析に
使用した。さらに、正常ヒト表皮メラニン細胞Humanepidermalmclanocytcs,nconatal
(HEMn)は、クラボウ(倉敷紡績株式会社)より購入した。
マウス腫瘍細胞株であるB16、EL4、BALB/3T3、Colon26,A20、RLmalel、McthA
は東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターから御供与頂いた。エピトープペ
プチド特異的なCTLの誘導の確認には、久留米大学の伊東恭吾教授(免疫学講座)か
ら頂いた、T2-Kd(TAP遺伝子の発現を欠損するT2細胞に、H2-K.遺伝子を強制
発現させた細胞株)を用いた。
19

6-3)血液サンプルおよび癌組織の採取
1994年から2004年の期間に、熊本大学医学部皮膚科にて治療を受けたメラノー
マ患者および巨大先天性母斑患者からインフォームドコンセントを得た後に、末梢
血サンプルを採取し、遠心分離によって、患者血清あるいは血漿を単離した。癌組
織および母斑組織の手術摘出検体を検討できた患者に対しては、腫瘍組織における
SPARCの発現を検討した｡用いた抗体は以下の通りである。ウエスタンプロット法:
抗ヒトSPARCモノクローナル抗体:AON-5031(HacmatologicalTcchnologics社)、
EUSA法:抗ヒトSPARCモノクローナル抗体:ON1-1(ZymcdLab社)、ピオチン
化ヤギ杭ヒトSPARCボリクローナル抗体:EYRO1(R&Dsystem社)。
全ての患者サンプルは、符号をつけて匿名化し、実験時まで-80℃で保管し、そ
の後に使用した。サンプル提供患者に関しては、診療記録より、年齢、性別、腫瘍
の臨床病期(UICC国際分類;AJCC分類)の臨床データを診療録より収集し、血清
もしくは血漿中のSPARC値との関係について検討した。
6-4)QuuantitativeReverseTranscription-PCR
(定量によるRT-PCID
TRIZOLrcagcntを用いて、様々な組織と細胞株からtotalRNAを抽出した。い
くつかの正常組織のtotalRNAはBiochain社から購入した。各lUgのtotalRNA
からランダムヘキサマープライマーを用いて、Superscriptrcvcrsctranscriptasc
(インビトロジェン社)により各cDNAを合成した。RT‐PCRのSPARC特異的
プライマーを作成し、ロッシユ社のライトサイクラーを用いて、定量的RT-PCR
を行った。用いたSPARCPCRプライマー配列は、センス:5I-CGAAGAGGAGG
TGGTGGCGGAAAA-31,アンチセンス:5'一GGTTGTTGTCCTCATCCCTCTCATAC
-31である。
PCR反応は95℃1秒間、68°C1秒間、72°C10秒間で45サイクル行い、培養メラ
ノサイト細胞株であるHEMnの10倍希釈標準曲線を用いて、HEMnの発現を1と
して定量化した。また、ヒトの正常組織の半定量的RT-PCRは、95°C1分間、60°C
1分間、72°C分秒間で30サイクル行い、PCR産物を1%アガロースゲルで分離して
エチジウムブロマイドで染色して特異的バンドを検出した。比較対照として、6アク
チン特異的なプライマーも同時に用いた。用いたβアクチンプライマー配列は、セン
ス:51-CCTCGCCTTTGCCGATCC-3i,アンチセンス:SLGGATCTTCATGAGG
TAGTCAGTC-3’である。
6-5)Westernblot法
11種類の培養メラノーマ細胞株、1種類の培養メラノサイト細胞株、色素性母斑
20

患者の摘出組織およびメラノーマ患者の摘出組織における、SPARC蛋白質の発現を
Wcsternblot法を使用して検討した。各サンプルを、ホモジナイザーを用いてホモ
ジナイズし、溶解バッファー(150mMNaCL50mMTris,pH7.4,1%NonidctP‐
40,1mMsodiumorthovanadate(和光社),1,MEDTA,plusaprotcascinhibitor
tablct(AmcrshamBioscience社))を用いて溶解した。
その上漬サンプルを、10%アクリルアミドゲルを用いてSDS-PAGEを行い、ニト
ロセルロースメンプレン(BIO-Rad社)に転写した。5%スキムミルクを加えた0.2%
Tween20-TBS溶液を用いて、4.Cで16時間ブロッキングした。0.2Mg/mLの濃度のマ
ウス抗ヒトSPARCモノクローナル抗体AON-5031(HacmatologicalTbchnologics社)
を1次抗体として1時間室温でインキュベーシヨンし、洗浄の後に、HRP標識抗マ
ウスIgG抗体(AmcrshamBioscicncc社)を用いて洗浄した後に、ECLWestcmB1ottiong
dctectionRcagcnts(AmershamBiosciencc社)にて検出した。
6-6)SPARCの免疫組織化学的解析
EnVision+システムキット(DAKO社)を用い、アピジンーピオチン複合体免疫
ぺルオキシダーゼ法により、免疫組織学化学的解析を行った。一次抗体は、マウス
抗ヒトSPARCモノクローナル抗体AON-5031を2000倍希釈したものを用いた。
ホルマリン固定パラフィン包埋切片よりパラフィンを除去して、正常ヤギ血清にて
室温で60分間ブロックした後に、-次抗体を4°Cで14時間反応させ、phosphatcbuffcrcdsaunc(PBS)で洗浄した。さらにビオチン標識抗マウスIgG抗体と室温
で1時間反応させた後にPBSで洗浄し、ストレプトアピジンーピオチン標識ぺルオ
キシダーゼと室温で1時間反応させてPBSで洗い、diaminobenzidineで発色させ
た。対比染色としてヘマトキシリン染色を行った。
6-7)ELISA法による、メラノーマ細胞培養上清、メラノーマ患
者血清および血漿中の可溶性SPARC蛋白質の検出
メラノーマ細胞株の培養上清、メラノーマ患者血清および血漿中のSPARCの測
定は、抗ヒトSEARC抗体及びビオチン化抗ヒトSPARCボリクローナル抗体を用い
て酵素結合免疫吸着検査法(EUSA)によって検出した。
96ウエルのELISAプレート(Nunc社)に、PBS(pH7.4)に溶解した0.05匹g
/ウェルの抗ヒトSPARCモノクローナル抗体ON1-1(Zymcdlaboratorics社)
を加え、室温で一晩インキュベー卜した。次いで、溶液を除いた後に、100%ブロツ
クエース(大日本製薬株式会社)を用い、室温で1時間、プレートの表面をブロッ
クした。
血清を含まない細胞培養上清サンプルを得るために、各細胞株を、細胞培養用デ
ィッシュにほぼコンフルエンス状態になった後に、PBSを用いて2回洗浄し、血清
21

を含まない培養液で24時間培養した。その培養液を遠心分離し、細胞を除いたも
のをELISAに使用した。
陽性対照の標準サンプル、10%プロックエースで4倍希釈したメラノーマ細胞株
培養上清および10%ブロツクエースで200倍希釈した患者血清、血漿サンプルを、
ピオチン化抗ヒトSPARCボリクローナル抗体EYRO1(R&Dsystem社)と共に添
加し、室温で2時間インキユベートした。PBSで3回洗浄した後に、各ウエルに
HRPを結合させたストレプトアピジン(ENDOGEN社)を添加した。30分のイ
ンキユベーシヨンの後、プレートをPBSで3回洗浄し、TMB基質溶液(ENDOGEN
社)を添加した。発色反応を定量するためにELISAリーダー(モデル550、Bio-Rad
社)で450,mの吸光度を測定した。
6-8)メラノーマ患者血清中のs-S-CD(HPLC法)
およびGPC3(ELISA法)の測定
SPARCを測定した同じメラノーマ患者血清について、従来の腫瘍マーカーである
5-S-CDと、新規腫瘍マーカーとして当教室の中面らが先に報告したGPC3を測定
した。
血清中s-S-CDおよびGPC3は、それぞれ高速液化クロマトグラフィー法
(HPLC)(44)およびELISA法を用いて測定した(43)。
6-9)HLA-AMおよびH2-Kd拘束性SPARC特異的
CTLエピトープのモチーフ検索(データベースでの検索)
次に、新規癌関連抗原SPARCが、理想的な腫瘍拒絶抗原になり得るかどうかを検
討した。日本人の約60%が陽性であるHLA-A24と、BALB/cマウス(H-2d)のク
ラスI分子のKdに結合するペプチドの構造モチーフは、非常に類似していることがわ
かっている。さらに、ヒトとマウスのSPARCでは、アミノ酸配列が95%以上のホモ
ロジーを認めることから、ヒトとマウスのSPARCでアミノ酸配列が完全に一致し、
HLA-A24Kdのいずれにも結合しうるSPARC由来のペプチドをモチーフ探索デー
タベース(
)を用いて検索し、4種類を選択して合成
した(表1)。HLA-A24(A*2402)結合モチーフの概略は、9個あるいは10個のア
ミノ酸により構成されるペプチドの第2番目のアミノ酸残基(P2)にチロシン、フエ
ニルアラニン、第9あるいは10番目のアミノ酸残基(P9またはP10)にロイシン、イ
ソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファンが存在することである。これら4種
類のペプチドをBALB/cマウスに免疫して解析し、Kd拘束性のCTLエピトープペプ
チドの同定を試みた。
22

表且
ヒトとマウスで共通のアミノ酸配列をもちHLA-A24およびH2-K.分子に
結合すると推定されるSPARCベプチド
Peptide Sequence Start
SPARC-Kd-1
SPARC-Kd-2
SPARC-Kd-3
SPARC-Kd-4
DYlGPCKY1
HFFATKCTL
EFPLRMRDWL
MY1FPVHWQF
position
143
123
161
225
Bindingscore*
A24Kd
5000
723創
400
1382
960
120
*HLA-A24およびH2-K.分子へのbindmgscorcは、BIMASソフトウエアを用いて算出した。
23

6-10)SPARC特異的CTLエピトープの同定
BALB/cマウスの骨髄細胞から従来どおりの誘導法で、骨髄由来樹状細胞(BM-
DC)を誘導した。(32)すなわちBALB/cマウスの骨髄細胞2×106個にマウス
GM-CSFを5,9,1の濃度で加え、10cm培養プレート内で1週間培養してBM‐
DCを誘導した。このようにして得られたBM-DCを上記で決定したペプチド4種
類の混合物(各1MM)と2時間インキユベー卜した。それらを洗浄、遠心した後に、
BALB/cマウス一匹あたり5×105個ずつ腹腔内に投与(免疫)した。1週間の間隔を
おいて2回免疫した後、最終投与の1週間後にマウスの脾細胞を回収してCTLの誘
導に用いた。CD4+T細胞による非特異的反応の影響を除外するために、脾細胞は採
取時磁気ビーズ(MACS,MiltenyiBiotec社)を用いてCD4+T細胞を除去したもの
を用いた(図13A)。
回収した免疫マウスの脾細胞を、試験管内でペプチドを添加したBM-DCにより
再刺激した。培養6日目に再び、ペプチドを添加したBM-DCおよびベプチドを添
加していないBM-DCを標的細胞とし、ペプチド特異的に免疫応答を示したCTLが
産生するIFN‐γをEnzymc-1inkcdimmunospot(ELISPOT)法にて検出した｡IFN‐
γ産生CTLの数に相関するスポット数の検出は、検出キット(BDBioscicnccs
ELISPOTSct)のプロトコールに準じて行った。前日から抗IFN‐γ抗体をコーティ
ングしたELISPOTプレートを培養液にて洗浄後、1×105個のエフェクター細胞
(1001LL/well)と1×104個の標的細胞(1001LL/well)とを混合し、37°Cで22時間培
養した。その後、プレートを滅菌水で洗浄し、ピオチン化抗IFN‐γ抗体と2時間、
さらにHRP標識ストレプトアビジンと1時間反応させ、基質溶液にてIFN-γ陽性
のスポットを検出した(45)。スポットのカウントは、MINERVATECH社の自動解
析装置にて行った。
6-11)MLB/cマウスを用いた自己免疫反応の検討
前項に示したSPARCベプチド負荷BM-DCを免疫したBALB/cマウスの重要臓
器(脳、心臓、肺、肝臓、腎臓)に対する自己免疫現象の有無を、2回目の免疫1週間
後に各臓器におけるCD8+およびCD4+T細胞の浸潤の有無により検討した。免疫し
たBALB/cマウスの各臓器を採取し、直ちにTissuc-TckOCTcompound(Miles
社)に包埋し、5Mmの切片を切り出した。20倍希釈の抗CD8抗体Ly-2(BD
PharMingcn社)および50倍希釈の抗CD4抗体L3T4(BDPharMingen社)を用い
て、37°Cで1時間反応させ、PBSで洗浄した。さらにマウスMAXPO(nichirci社)と
室温で30分間反応させた後にPBSで洗浄し、ストレプトアビジンービオチン標識ベ
ルオキシダーゼと室温で1時間反応させてPBSで洗い、diaminobcnzidincで発色させ
た。
24

6-12)細胞傷害活性の検討
ペプチド特異的CTLの誘導の確認は、T2-K.細胞を標的細胞にしたs1Cr放出法に
よる細胞傷害試験により行った。s1Cr放出法による細胞傷害の定量は、標的細胞を
ペプチドをパルスした群としなかった群に分け、s1Cr(Na2s1CrO4)で1時間ラベル
した後、96穴U底プレートに1ウエルあたり1×104個まいた。それぞれの標的細
胞をエピトープペプチドで誘導したCTLと共培養し、培養上清中にCTLによって
傷害された細胞より放出されたs1Crを測定して2群間で比較することにより行った。
腫瘍細胞反応性CTLの誘導の確認は、H2-K.陽性でSPARCを発現していない細
胞株RLmalcl、およびH2-K.陽性でSPARCを発現している繊維肉腫細胞株Mcth
Aを標的細胞として用いて細胞傷害活性を測定した。細胞をmCrで1時間ラベルし
た後に、96穴平底プレートに1ウエルあたり、1×104個まいた。次に、ターゲット
細胞に対して、10,20,40倍の数のCTL細胞株を加え、6時間後に培養上清を採
取して死細胞より放出されたs1Crを測定した。
6-13)imvivo腫瘍増殖抑制実験
7週齢のメスのBALB/cマウスをSLC社より購入し､熊本大学のCcntcrforAnimal
RcsourccsandDevelopment(CARD)にてSPF環境下に飼育した。1週間培養して
誘導したBM-DCを、SPARCペプチド4種類の混合物(各1MM)と2時間インキユ
ベートした後に、-匹あたり5×1o5個ずつ腹腔内に投与(免疫)した。1週間の間隔を
おいて2回免疫し、さらにその1週間後に1×106個のMcthA細胞株をBALB/cマ
ウスの背部皮下に移植し、腫瘍の大きさ(長径×短径)を3日毎に測定した。また、
マウスの生存期間も観察した。
6-14)統計学的解析
血清SPARC値､血漿SPARC値、マウスの腫瘍に対する細胞傷害活性およびinvivo
腫瘍増殖の各群間の有意差検定については、Two-tailcdStudcntWtcstを用いて
行った6P〈0.05の場合に、有意差ありと判定した。統計解析はStatVicw5D
(AbacusConccpt社製)を用いて行った。
25

7実験結果
7-1)cDNAマイクロアレイ解析を用いた
腫瘍拒絶抗原候補遺伝子の選定
共同研究者である東京大学医科学研究所ヒトゲノムセンターの中村祐輔博士らが、
スキルス胃癌患者20例の癌部と非癌部のRNAをそれぞれ抽出し、24,030種類の
遺伝子についてcDNAマイクロアレイ解析を行った。そのデータの供与を受けて解
析し、20例中10例以上の患者で非癌部より癌部で5倍以上発現が増加している遺
伝子を12種類選び出した(図5)。選んだ12種類の遺伝子の正常組織での発現を確
認後、Secretcdprotcinacidicandrichincystci、(SPARC)を腫瘍特異抗原の候
補として選んだ(図6)。
その結果、SPARC遺伝子は20例(発現情報があった症例は13例)中11例にお
いて、非癌部に比べて癌部で5倍以上の発現がみられる遺伝子であった。また、正
常および胎生期の組織では、脂肪組織、乳腺、卵巣、脊髄、精巣、子宮、胎盤など
に少量発現していたが、スキルス胃癌の癌部では正常胃粘膜と比較して平均13万倍
以上と、発現が著明に増加している遺伝子であった。
図S
ReIatIveexpresslonrate
Awmge
10,000
88●22.9
蓬
88823.2
888●29.731
8888133,359
88888121,529
●●●16.3
888●8.79
●
7.6
5.6
88●93,279
88●28.2
●●●6.7
図5.スキルス胃癌のcDNAマイクロアレイ解析データの解析
これらの遺伝子は、スキルス胃癌患者20例中10例以上で、非癌部より癌部で5倍以上の発現増
加がみられる遺伝子である。この中から、SPARCを免疫療法の標的抗原の候補として選んだ。SPARC
遺伝子は、20例中11例において非癌部より癌部で5倍以上(平均133,359倍)の発現増加が認め
られる遺伝子であった。
26

図⑪
君涙忠e雷韻卜旧廻邑くこめ
89,350
20 且
5 0 5 0
1 1
¯ﾛ--------¯¯I■¯¯●□■¯--¯¯■■■■■■■■-1■-¯--●-¯------¯------¯●■■¯■■■¯¯■■■■¯¯¯¯--¯■●----■■--
¯●¯¯----¯■■¯■■¯¯--¯¯●¯¯¯¯¯¯■■¯¯--¯¯¯¯-句一一一一一一■■■■¯¯¯■¯¯¯牢の¯¯.■■■¯----¯■■¯¯¯¯¯■■■¯¯¯-¯¯
¯の■Ⅱ¯¯¯¯¯¯--¯■■●¯¯¯¯¯¯¯--¯¯¯¯¯¯¯¯--¯¯--｡¯¯¯●¯■■¯■■--¯¯--｡¯----¯
脂骨脳大心腎肝肺リ乳卵膵前唾骨小脊脾胃胎胸
肪髄腸臓臓臓ン腺巣臓立液格腸髄臓盤腺
組パ腺線筋
織節
成人
気管
甲状腺
胎児肝臓
胎児腎臓
胎児脳
胎盤
子宮
-瀧
図6.正常組織でのSPARC遺伝子の発現解析(cDNAマイクロアレイ解析
による)
正常および胎生期の組織におけるSPARC遺伝子の発現をcDNAマイクロアレイ解析データにより
解析したところ、SPARC遺伝子は脂肪組織、乳腺、卵巣、脊髄、精巣、子宮、胎盤などに少量の発
現を認めたが、スキルス胃癌では異常な高発現を認めた。
27
スキルス
胎児肺
胃癌

7-2)RT-PCRによる正常組織における
SPARC遺伝子の発現解析(RTFCR)
16種類の正常組織におけるSPARC遺伝子の発現をRT-PCR(図7)にて確認し
た。その結果、SPARC遺伝子は、脊髄に発現力$認められ、大腸、肺、小腸、精巣で
も弱い発現が認められた。正常な胃組織では発現は認められなかった。
図7
SPARC
β-aDUh
Ⅱ
■■■■
■■■■■■ ﾛppppBp
■■■
■■■■
⑭9期KSB
･Ni簿iFFl
韓騨群
_…噸:鶚…串……:毎穐…….…禽鼬螺･辮露 穀挿..f･凸･ﾛ...;+j#H;;HPH鞘鞘39
■■■■
も
越豊鐘.鶏騨騒駕譲;麗
脳大心腎肝
腸臓臓臓
露辮蕊露蕊露:蕊露･蕊瀧穀i騨翻識:蕊NiNR83辮鍾繊鐸噸騨’1N蝋Mi1i鶴9331恕ii鰯騨
肺
前立腺
骨格筋
小脊脾
腸髄臓
胃
精巣
甲状腺
胎児脳
掴(メラノーマ細胞株)
胎児肝臓
図7.ヒト正常組織におけるSHRCmRNAの発現
胎生期の臓器を含む15種類の正常組織における、SPARC遺伝子の発現をRT-PCRにて確認した。
その結果、SPARC遺伝子は、脊髄に発現が認められ、大腸、肺、小腸、精巣でも弱い発現が認めら
れたが、正常な冑組織では発現は認められなかった。陽性対照としてメラノーマ細胞株164を用いた。
28

7-3)ヒト正常組織におけるSPARC蛋白質の発現
(免疫組織化学的解析)
cDNAマイクロアレイおよびRT-PCRにおいて、SPARCの発現を認めた乳腺、
子宮、大腸、小腸、肺、精巣の組織について、パラフィン包埋標本を用いてSPARC
蛋白質の発現を検討した。その結果、精巣においてのみSPARC蛋白質の発現が認
められた(図8F)が、子宮、大腸、小腸、肺では認められなかった(図8A-E)。そ
の他、大脳、心臓、肝臓、腎臓などの臓器にも、明らかな発現は認めなかった(未
発表データ)。
図'8
壽篝 A巳
CD
蕊
蕊蕊蕊霧蕊議蕊蕊蕊議;蕊蕊蕊蕊蕊蕊i蕊!
露
､
群::二二審鐘斡罫浮:き:
、もも
騒茂
■も
蕊
語鱒
F
■
鱗鑛 ;
曰
蕊蕊蕊
蕊
｡
灘ii1LiiLiii
薑
図8・ヒト正常組織におけるSEARC蛋白質の発現
乳腺(A)、子宮(B)、大腸(C)、小腸の)、肺(E)および精巣『)におけるSPARC蛋白質の
発現を免疫組織化学的解析にて検討した。精巣においてSPARCの発現が検出されたが、その他の臓
器では明らかな発現の増加は認めなかった。(x2OO)
29

7-4)ヒトメラ’一マ細胞株におけるSPARCmMA
および蛋白質の発現
・11種類のメラノーマ細胞株と1種類の培養メラノサイト細胞における、SPAR幻
mRNACD発現をQuantitativeRT-PCRにて確認した(図9A)。その結果､調べた11
種類中10種のメラノーマ細胞株と培養メラノサイト細胞株においてSPARC遺伝子
の発現が観察された。
さらに、同じ細胞株におけるSPARC蛋白質心発現をVVesternblot法にて確認し
た(図,B)。その結果、RT-PCR法と同様に、11種類中10種のメラノーマ細胞株
と培養メラノサイト細HfZMi栄においてSPARC蛋白質の発現を認めた。
図少
A
2515 ひ
1 0
(E芯平二○匹江こい)轡扇巨⑩〕巨一⑩シ渭一⑩世
|lRllllll■|
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詩山一の昼
臓如、錘毎一コ⑩一
野エニ鱒六○
m印、障句『。⑪一.
鍔○コF一m割嬉
卑、不二mF‐岬、
劃二頓曼口
興⑦噂四
鱒伽不二mF上鍾
一房。。一.色、
宝、エニ鐘▲
】鱒エ、三コ
‐可
且」
SPARC蕊鯉
1234567BglO1112
三
円
譲議…。
6口蘭域i 』蕊?q･UUUv:SF 45四、
図9.メラノーマ細胞株におけるSHRCmRNAおよび蛋白質の発現
(A)real-timeRT-PCR法によるヒトメラノーマ細胞株〔LancSl-11)および培養メラノサイト
(HEMn;Lanel2)におけ患SPARCmRNA②発現解析。SPARCmRNAの相対比はSPARC/pactin比として算出したoLanesl:164,2:888meL3:HM3K0,4:CRL1579,5:S26meL6:G361,7:
MWVo,8;8K-11匹L-28,9;SK-通L-19,10:Cclo38,11:H邸V-L1Z:HEIVIn(B)杭ヒトSPARCモ
ノクローナル抗体を用いたウエスタンプロット法によるヒトメラノーマ細胞株(LanesL11)および培
養(HEnln;Lanel2)におけるSPARC蛋白質②発現解析。Laneは図Aと同様。
3D

7-5)ヒトメラノーマ組織および巨大先天性母斑組織
におけるSPAR⑰蛋白質の発現(Westernblot法)
巨大色素性母斑患者の摘出組織と、メラノーマ患者の正常皮膚、メラノーマ組織
(Radicalgrovvthphase、VbrticalgrowthphaSe)および転移性リンパ節組織における
SPARC蛋白質の発現をWcsternblot法にて確認した(図1｡)。その結果、いずれ
②原発性メラノーマ患者(患者46,66,84および89)においても、メラノーマの
VbrticalgrowthPhasc組織においては、SEARC蛋白質の発現の著明な増加を認めた。
また、転移性リンパ節組織においても著明なS]PlARC蛋白質の増加を認めた。また、
メラノーマのRadicalgrovvthphasc組織においては、SEARC蛋白質は中等度の発現を
認めた。一方、正常組織では、弱い発現を認め、巨大先天性母斑の組織でも、低~
中等度のSEARC蛋白質の発現を認めた。
図川
SPARC
ppactin
12345sTBglO11121S14151S
M⑧IanocytI⑥
mvl
H
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11
PLB4
’1・雪
く廻今-3|垣『C員コロコ蝕切⑱(。圏患)
くき一・里□『・賢ゴロ三越鰯⑩-
.m昌皿一宮C薯三面ゴロ、⑩
之。『『ゴ些跡六ヨ
碑か擁(
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乏示導皿⑭→四芦冒一色『ゴ。『(「等0m⑩)
ペ、弓一,四一垣『◎夢再ゴロ二四餌、
]
幻必亘冒一回『○薯→コロコ働鋤⑩
zCココ数一切六ヨ
図1⑪、色素性母斑、メラノーマ組織におけるSMRnmRNAおよび蛋白質の発
現
巨大色素性母斑(Lanesl-5)と、メラノーマ患者(Lanes6-16)ぬ正常皮層、メラノーマ組織(Radical
grovvthphasB、Verticalgrowthpha8e)および転移性リンパ節組織におけるSPARC蛋白質の発
現をVVestemblot法にて検討した。メラノーマ患者84:Lane6(正常皮層),Lane7(Radialgrowth
phase),Lane8(Vcrticalgrowthphase),メラノーマ患者66:Lane,(正常皮膚),LanelO(Radial
growthPhagc),Lanell(Verticalgrovvthphase),メラノーマ患者89;Lanel2(Radialgrowth
phaseルメラノーマ患者46:Lanel3(正常皮膚LLa劫el4(Radialgrowthphase),Lane15(Vertical
grcwthPhase),and患者61:Lanel6(リンパ節転移光患者番号は表2と対応。
31
尻

7-6)ヒトメラノーマ組織および巨大先天性母斑組織
におけるSPARC蛋白質の発現(免疫組織化学的解析)
SPARCの免疫組織化学的解析を33例の原発性メラノーマ、7例の転移性メラノ
ーマおよび14例の色素性母斑組織において検討した。(表Zおよび図11)
免疫組織化学的解析では、SPARCはすべての原発性および転移性メラノーマ組織
において検出された。その発現の程度は、原発性メラノーマ組織では、強陽性12例、
中等度陽性14例、弱陽性7例と様々であった。転移性メラノーマ組織においては、
強陽性5例、中等度陽性2例、弱陽性O例と、比較的強い発現を認めた。メラノー
マ細胞におけるSPARCの発現は、主に細胞質に認められた。
また、14例すべての色素性母斑組織においても、SPARC蛋白質の発現を認め、
強陽性4例、中等度陽性6例、弱陽性4例と、その発現レベルは様々であった。
図11
HleIanoma
図11.色素性母斑、メラノーマ組織におけるSEARC蛋白質の発現
巨大色素'性母斑(A､B)､原発性メラノーマ(C､D)および転移性リンパ節組織巴､F)におけるSPARC
蛋白質の発現を免疫組織化学的検査にて検討した。SPARCは、すべての原発性および転移性メラノ
ーマ組織において検出された。Scalebar:200Mm(A,B,E,F)、S0Um(CD)
32

7-7)ELISA法を用いたメラノーマ細胞株培養上濱中の
可溶性SPARC蛋白質の検出
抗ヒトSPARCモノクローナル抗体及びピオチン化抗ヒトSPARCボリクローナル
抗体を用いたサンドウィッチELISA法を用いて、可溶'性SPARCの検出を行った。
全11種類のうち、10種類のメラノーマ細胞と、培養メラノサイトHEMnの培
養上清中にSRARC蛋白質が検出された(図12)。mRNAおよび蛋白質レベルでの発
現を認めなかったHMVL1の培養上清中には、可溶性SPARC蛋白質は検出されなか
った。各細胞の培養上漬中の可溶性SPARC蛋白質の分泌量と、mRNAの発現量とを
比較してみたが、必ずしも一致しなかった。
図、
(lEaE)②EgqE①ロゴ⑩の二一EE①←。』旦○にく△⑩
1250
1000
750
500
250
0
」叩一のら
閏四mmロ『ゴの|
鱒エヨ②六○
m皿、いの『ゴの一
奇○ヵF一m『の
卑の六0三mFI-c
司三の三。
9。②の一
図、､EmSA法を用いたメラノーマ細胞株培養上濱中の可溶性SMRC蛋白質
の検出
ヒトメラノーマ細胞株(Lanesl-11)および培養メラノサイト(HBM､;LanclZ)の培養液上清中の、
可溶性SPARC蛋白質をELISA法にて検出した。全11種類のうち、HMV-1を除く10種類のメ
ラノーマ細胞株と、HEMnの培養上漬中にSRARC蛋白質が検出された。
33
Pの六‐ヨmF呂
堅◎頤oolo②の
ニ的エニご」
些呼エ、ヨコ

7-8)ELISAによるメラノーマ患者、健常人
および先天性色素性母斑患者血清中可溶性SPARC蛋白質の検出
次に、メラノーマ患者血清中の可溶性SPARC蛋白質の定量を行った。109名の
術前メラノーマ患者から血液サンプルを採取し、医療記録から患者の臨床所見を集
めてTNM分類に基づいて臨床段階を決定した。109名のメラノーマ患者及び61
名の健常人の血清中のSPARC蛋白質の量をELISA法により評価した(表2,図
13)。
まず、市販のSPARC蛋白質を用いて、ELISA法におけるSPARCの定量の精度を
評価した。SPARC蛋白質を段階希釈したものを用いて、そのELISA法により得られ
た吸高度(OD)に基づいてSPARC蛋白質を定量するための標準曲線を作製した(図
13A)。その結果、SPARC濃度がO~80,9/mLの範囲で直線性は保たれていた。よっ
て、200倍希釈血清を用いる場合は、OUg/mL~l6ILg/mLの範囲で、可溶性SEARC蛋
白質の定量が可能であることが明らかとなった。
健常人血清中にも血小板由来と思われるSPARC蛋白質が検出されたが、メラノー
マ患者の一部では、より高値のSPARC蛋白質が検出された。つまり、メラノーマ患
者109例の血清SEARC値は、2.02±1021｣g/mLであり、健常人の値1.62±0.36149/mL
より有意に高値であった(P=0.001)(図13B)。
健常人の平均値十2S,(Z34ILg/mL)をカツトオフ値とした場合、メラノーマ患者
109人中36人(33.0%;3.21±0.70119/mL)、健常人では61人中3人(4.9%;2.46±
OO8ILg/mL)、色素性母斑の患者では、5人中2人(40%)が、SEARC高値と判断さ
れた。よって、この検査法によるメラノーマ検出の特異度は924%と算定された。
メラノーマ患者では､健常人より多くの血清SPARC蛋白質が検出されたことより、
メラノーマ細胞より血清中にSPARCが分泌されていることが示唆された。
34

図、
9876543210
●□■、■、□●□
000000000
A
□囚ゴロ。
0 80
2040GO
SPARCpmteIn(ngmlI)
C
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1528281919
MoIanomapathnts
Stag⑧
、
図13.EuSA法を用いたメラノーマ患者血清中のSMRC蛋白質の検出
(A)段階希釈したヒトSPARC蛋白質の測定値を基に、吸光度よりSPARC蛋白質を定量するため
の標準曲線を描いた。
(B)109例のメラノーマ患者、5例の巨大先天性母斑および61例の健常人血清中のSPARC蛋白質
をELISA法で測定した。健常人の平均値十2SDである2.34149/mLをカヅトオフ値とすると、
メラノーマ患者では33.0%(36/109)が、陽性となり、巨大先天性母斑および健常人では、それ
ぞれ40%(2石)、4.9%(3/61)の偽陽性を認めた。
(C)臨床ステージで分類したメラノーマ患者の血清SPARC値の比較。血清中SPARC値は、臨床
ステージの進行とは無関係に、比較的早期のメラノーマ患者でも陽性例を認めた。
35
6-
5‐
4‐
3‐
2.
1.
0可 0■■■
jCut゜ff
Vnlu｡
y=1390.6x3-228D5x2+17.169x+0.1516
R2=0.9999
¯
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¯●¯
-/
_/
兵/~
「
Sノ⑥1
(4.096)
銅/1”。
(鋼兜) 。
2ノ5。
(4016)9
◎
。
..……dRl…………………….…….…
-コODC
0
｡ H、

表ユ
メラノーマ患者113例のプロフィールと、血清SPARC、GPC3および
5-S-CD値の比較
PtlDstage*AgeSexType Serumconcentrationsoftumormarkers
SPARCSPARC
stainlng↑(Ug/ml)*
GPC35-S-CD
(U/ml)SS(nmol/L)?
123456789mⅢ炮旧川幅
000000000000000
印餌ね昶顕ね娼閏寵電罰布印哩砺
MFFMFMFFFMFFMFM
巫但巫墾四亟巫稻空辿旧巫辿旧稻
0000蜜0題聖日o堅旦0型0
689228367885804
■●●●■B■●●■●B■●の
422633324615620
++
161A33MMUCOUS1.8」Q且1.9
17IAB2FLMMNT皿5.5
181A75FSSM1.8題3.9
191A41FSSM1.82口2.3
201A70FMUCOUS2.302.4
211A78MALM+十1.201｣Q
聖1A60FALMNTOae
231A61MALMO
aa1.0
241A62FALM1.205.9
251A73MALMOo703.6
201A70MLMM1.7、8.0
271A“FMUCOUS2.3辺3.0
28Mk66MALM1.205.9
29MI76MALM1.305.8
301A58FALM1.504.4
31IABgMLMMo50.Z且
Z」
型IAB7FALM1.8NT
331A81FALM+十1.404.5
鋼1A68FLMM++1.5ZZ1.8
0-----¯¯¯------------¯----¯-------------¯¯¯-¯---¯¯¯¯---¯--
日1
35旧58FALM0.62.5
36IBsBFMUCOUS2208.6
聖
37IBB6FMUCOUS2.02.9
3BIB58FSSM2.0皿2.3
m
3gIBe4FALM+++2日7.5
40旧84FALM2.002.0
41旧79MALM2日07.3
42IB76FALM2205.7
“IB74FALM1.602.8
“旧75MLMM++a」06.s
45I?B2FALM1.so2.9
AAAAA
I--11
-II-1
媚幻犯姻釦
O
FMFMF
45447
77764
『洲州艸》
必型担00
四m鋼妬“
率、旧型型
++
+++
ConlinuBdonthelb1Iowingpago
36

表2(続き)
PLlDstage★ Age Sex Type SerumconcentIationsoftumormarkers
SPARC
stainlng↑
SPARC
(ug/ml)*
GPC3
(U/mOSS
5-S-CD
(nmol/L)1
副壁軍勢
AAAA
ⅡⅡⅡⅡ
万四両ね
FFFM
艸螂艸辨
3903
●●■白
1122
四0聖廻
9040
a4a4
++
+++
西
55IIB50FSSM++1.4Gb4
Za
56IIB72MLMM2.07.0
57ⅡB関MALM1.801.2
58IIB田MALM,1.6oa7
5911日万MSSMaQONT
迫
60IIB69MALM1.04.6
3且
G1IIB57MN-MO3.4
厘IIBGgFALMo・eoa3
e3IIB71MALM++1.704.7
ezIlIB85FLMM2回四4.8
65IIB72MJN-M1.8daa3
空
GGlIB70MALMOO4
aa
B7IIB園FALM+++1.24.0
●¯---¯¯---¯------¯¯¯¯¯------¯¯¯¯--¯¯¯¯¯¯¯¯¯-----¯¯¯---¯¯¯
25
鴎llC7gFALMNTaB
△2
69IIC42MSSM+++06.3
701ICねFALM+22oaB
71IIC75FMUCOUS+1.8087
垣
72ⅡC万MALM+++0.6Z4
ねI1CB3MSSM1.4jQ」且旦
匁
7qlICBuIMLMM1.64.2
75IlCglFALM1.106.0
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76IlIAB3MALM+++07.7
万ⅢA55MN-M+++12082
ねⅡIABBFALM++1.709.7
79Ⅱ1A79FALM++0.6oal
BOⅡ1A70MALM2.1o4p
B1ⅢABSFSSM2,3皿」｣-日
目且旭
璽ⅢA79MNM40
2」
83Ⅱ1A53FMUCOUSOa2
111:鴎MALM塾且型。2
85
86IIIB5BMLMM2ZO｣旦旦
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87IIIB59MMUCOUSO1.2
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■¯¯¯----¯¯¯¯--¯¯¯¯¯¯--¯¯--------¯------¯¯--¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯---
89Ⅲc35FNM+++1.6ia28.4
90ⅡIC田FALM+++a目担4.9
91IIIC50Funknown1.2oag
g2IIICdI7MMUCOUSa且O1Qa
g3ⅢC70MALM1.222242
gulⅡIC由MALM+++2.201A」
勇究鋺顯虫、
vvVVVV
I1111I
FMMMFF
幻万雷ね印だ
SSM
ALM
unknown
MUCOUS
SSM
MUCOUS
亜空雪空相川
頭00000
埋塑狸》》川
+
+
+++
ConlinuedonthefolIowingpag曰
37

表2続き)
Serumconcentrationsoftumormarkers
Pt､1,stage★Sex
AgeType
5-S-CD
(nmoVL)?
GPC3
(wml)ss
SPARC
(ug/ml)*
SPARC
stainingT 廻塾宰躯墾趣麺塗、麹醒墾埋
00皿日000麺00型0題
叩叩叩巫0型0巫醒巫幻墾西
SSM
SSM
unknown
MUCoUS
NM
SSM
NM
unknown
NM
ALM
unknown
ALM
unknown
FFFFMMFMMFMFF
VVVVVVVVvvvvV
I11--111-1111
ねね娼印ね釦幻翠頚ね餌髄的
、哩四叫琿叱硴阻四旭川但旧
1111111111111
++十
率い町坦
32
2.1
M
0.1
0000
Congsnital
Congenital
CongenitaI
Congenilal
》
MMMFM
引望電餌
uuuu
甑剖副副
NNNN
亜顕餌9
21
29
0
Conqenilaj
Nevus5
4
*臨床病期分類は、UICC/AJCCのTNM分類にしたがっておこなった。
ナ免疫組織学的検査によるSPARC蛋白質の発現
*ELISA法で測定した血清中SPARC蛋白質。2.34Mg/mLをカヅトオフ値とした。
§ELISA法で測定した血清中GPC3蛋白質。1unit/mLをカットオフ値とした。
1HPLC法で測定した血清中S-S-CD蛋白質。lOnmol/Lをカヅトオフ値とした。
Congenital:Congenitalmelanocyticncvus,NT:Nottcsted.
38

7-9)メラノーマ組織におけるSPARC蛋白質の発現と
患者血清中の可溶性SPARC蛋白質との関係
30例のメラノーマ患者において､メラノーマの免疫組織化学的方法によるSPARC
蛋白質の発現解析と患者血清中のSPARC蛋白質の測定を同時に施行することが出来
たため、両者の関係について検討した。30例中9例(30%)の患者において、血清
SPARC値の増加を認めた(表2)。その9例中6例(患者39,42,50,76,90およ
び112)の患者は免疫組織学的にも強陽性であり、2例(患者44および49)は中等
度陽性であった。残りの1例(患者96)は弱陽性であった。また、組織学的にSEARC
蛋白質が強陽性であった13例中の7例は、血清SEARC蛋白質の増加を認めなかっ
た。したがって、メラノーマ組織におけるSPARC蛋白質の発現と患者血清中の可溶
性SPARC蛋白質の間には相関関係は認められなかった。
一方、先天性色素性母斑の患者においては、血清と組織を同一患者から得ること
が出来なかったため、組織学的なSPARCの発現と血清SPARC値の相関を検討する
ことは出来なかった。
血小板にSEARCの発現が認められ、血液中に少量のSEARCが検出されることが
知られている。今回の健常対照群とメラノーマ群の血小板数を比較したが、健常人
では、ZL3±09万個/mm3であり、メラノーマ患者では、ZL6±08万個/mm3と、有
意な差を認めなかった。しかしながら、健常人の血清中にも、血小板由来と思われ
るSPARC蛋白質が検出されたため、血小板由来のSPARC蛋白質の影響を排除す
る目的で、11名のメラノーマ患者及び21名の健常人の血漿SEARC蛋白質をELISA
法により定量した(図14)。メラノーマ患者21例における血漿SEARC値は、0.61
±O65Mg/mLであり、健常人の値0.14±014119/mLより有意に高値であった(P=
0.003)。
健常人の平均値十2S,(O43Ug/mL)をカツトオフ値とした場合、メラノーマ患者
11例中4例(36.4%)が陽性となるが、健常人でも21例中1例(4.9%;2.46±0.08
Mg/mL)が陽性となり、メラノーマ検出における特異度は、血清SPARCとほぼ同等
の95%となった。
39

図Ⅱ
(|E一望》⑪Eの③一旦⑩二】臣』
E己o』ユ○匹江旦の
2.5
0505
2110
0
I
)
HeaIthy
donors
n=21
Melanoma
patients
n=11
Cutofr
vaIue
図14.ELISA法を用いたメラノーマ患者血漿中のSMRC蛋白質の検出
11例のメラノーマ患者と21例の健常人血漿中のSPARC蛋白質をELISA法で測定した。健常人の
平均値+2sDである0.43Mg/mLをカヅトオフ値とすると、メラノーマ患者では36.3%(4/11)が、
陽性となり、健常人では4.8%(1/21)の偽陽性を認めた。
40
o (巳。
o !§
『

7-10)ステージ別に見たメラノーマ患者血清中のSPARC、GPC3
およびS-S-cysteinyldopa濃度の比較
さらに、同じメラノーマ患者血清について、従来の腫瘍マーカーであるS-S-CDと、
新規腫瘍マーカーとして当教室の中面らが先に報告したGPC3を測定し、SPARCの
値と比較検討した(表Zおよび3)。なおGPC3の測定はELISA法を用いて行い、s-
S-CDの測定は高速液体クロマトグラフィー法を用いて行った。GPC3については、
1unit/mLをカツトオフ値とし､S-S-CDに関しては10nmol/Lをカツトオフ値とした(43,
44)｡全メラノーマ患者の陽性率は、それぞれSEARCが33.0%(109例中36例)､GPC-3
が42.5%(113例中48例)、S-S-CDが22.7%(110例中25例)であった。
表3には､それぞれステージ別のメラノーマ患者の血清SPARC､GPC3および5-S-CD
値を示している。ステージ別に陽性率を解析してみると、従来の腫瘍マーカーであ
るS-S-CDは、ステージⅡ1,1Vのように進行してからでないと陽性にはならなかっ
たが､SRARCおよびGPC3はステージにかかわらず陽性例を認め､ステージOのinsitu
メラノーマであっても、それぞれ533%、46.7%が陽'性であった。特にStage0,1,11
では、S-S-CDと比較して高い陽性率を示し、両者を併用するとstagcO~nのメラ
ノーマの66%が陽性であり、早期メラノーマの検出に有用であることが示された。
さらに、血清SEARC値が増加している36例中の18例では、GPC3およびs-S-CD
が共に陰性であり、その多くは比較的早期のステージO~Ⅲの患者であった。一方、
ステージ1VにおけるS-S-CDの陽性率は､84.2%(19例中16例)であり､SPARCとGPC-3
のそれと比較して有意に高率であった。
これらの3種類の腫瘍マーカーの間には、明らかな相関関係は認められなかった。
そこで、これら3種類の腫瘍マーカーを併用すると、実に72.9%(107例中78例)
のメラノーマ患者を検出することが可能であった。
表S
ステージ別に見たメラノーマ患者血清中のSMRC、GPC3および5.s‐
cysteimyldopa濃度の比較
s画g⑨SPARC(%)GPC3(%)sSCD(%)GPCS+SPARC*(96)GPC3+SPARC+
母S･CD↑(%)
13/15(86.7)
W28(50.0)
20/28(71.9
12/19(63.2)
12/19(63.2)
13/15(86.7)
15/27(55.6)
19/27(70.4)
13/19(68.4)
18/19(94.7)
8/15(53.3)
4/28(14,3)
7に8(25.0)
B/19(42.1)
g/19(47.4)
7/15(46.7)
12/30(40.0)
15/30(53.3)
7/19(36.8)
e/19(31.6)
0ハ5(0.0)
2尼9(6.9)
2/28(7.1)
5/19に6.3)
15/19(842)
0
Ⅱ
111
1V
TotaI36/109(33.0)48/113(42.5)25/110(22.7)71/109(65.1)78/107(72,9)
SmRC、GPC3および5-S-CDの各腫瘍マーカーの陽性率を、ステージ別に検討した。SEARCおよび
GPC3は、ほぼステージに関係なく陽性例を認め、比較的早期のメラノーマでも陽性例を認めた。一
方、5-S-CDは陽性例のほとんどがステージ1Vの進行癌であった。
*GPC3+SBdLRC:GPC3とSBdLRCのいずれか、あるいは両方が陽性。
fGPC3+SEARC+S-S-CD:3種類の腫瘍マーカーの少なくとも一つが陽性。
41

7-11)肉眼分類別メラノーマ患者における血清SPARC値の比較
また、メラノーマの肉眼分類別にメラノーマ患者血清中のSPARC陽性率を検討し
た。表4に示すように、血清SPARCはメラノーマの肉眼分類の違いによらず、様々
な肉眼分類を呈する患者の約20~50%において増加を認めた。
この結果は、日本人に多い足の裏にできる末端黒子型や、欧米人に多くみられる
表在拡大型や悪性黒子型などの肉眼分類の違いによらず、血清SPARCの定量が様々
な肉眼分類の診断に貢献することを示すものである。
表Z
肉眼分類別メラノーマ患者における血清SMRC値の比較
Type
ALM
SSM
LMM
NM
Mucous
inSItu
SPARC(%) GPC3(%) らS-CD(%)
12/46(26.1)
5/15(33.3)
印10(30.0)
1/5(20.0)
4/12(25.の
8/15(53.3)
15/49(30.6)
9/15(60.0)
8/11(72.7)
2/5(40.0)
3/12(25.0)
7/15(46.7)
句47(12.8)
8/14(57.1)
2/11(18.2)
3/5(60.0)
2/12(16.7)
0/15(0.0)
Tbtal 33/103(31.4) 44/107(40.6) 21/104(20.2)
SBARC、GPC3および5-S-CDの各腫癌マーカーの陽性率を、肉眼分類別に検討した。いずれの腫癌
マーカーも、特に肉眼分類の違いによらず、様々な肉眼分類で増加を認めた。
42

7-12)外科的切除前後のメラノーマ患者における血清SPARC値
の推移
術前の血清SPARC値が陽性であった症例で、術後も経過を追うことの出来た13
例について、血清SPARC、血清GPC3および血清s-S-CD値を測定し、その変化
について検討した(表5)。その結果、13例中10例において、外科的切除後に血清
中SPARC値はカットオフ値以下に減少した。このことより、血清中SPARC値の
測定は、治療効果の判定に有用であると考えられた。一方、これらの13例において
は、術前、術後を通じてGPC3およびS-S-CDはほとんどが陰性であった。
経過中にメラノーマが再発した3例中2例(患者87および92)においては、血
清SPARC値が外科的切除後に一旦カットオフ値以下にまで減少したが、再発後に
再度増加した。S-S-CD値は、再発したすべての患者で増加していた。血清SPARC
値の測定が、再発の判定に有用か否かについては、さらなる症例の蓄積が必要であ
ると考えられた。
43

表s
術前の血清SMRC値高値症例における術後の血清SMRC、GPC3
およびS-S-CD値の推移
Pt・ID★ PreopePOD566
SPARC(Ⅱg/mI)
GPC3(U/mI)
AZ
O
1.6
0
1
]InmDIJIh4-sa-E
】I】1△円。
SPARC(Ⅱg/mⅡ
GPc3(u/mO
5-S-CD(nmol/L)
亜旦”
服0“
9
PreopePOD15
SPARC(Ⅱg/mリ
GPc3(u/mO
5-S-CD(nmol/L)
30噸
】0頭
10
己reopePoE
SPARC(l4g/mO
GPcs(U/mI)
墾而
率⑩
12
|】Innl2q
回向n口P【】、
SPARC(l｣Lg/mO
GPCS(U/inl)
ao
a2
0
13
5-S-CD(nmol/U6.755
PreopePOD274
SPARC(I｣Lg/mD
GPcs(u/mO
aa
O
叩0
23
]rnnTq
ヨrgon⑨POD140PC田
SPARC(149/mD
GPcs(U/mI)
aj
O
20
率0
44
]fnrn圧
SPARC(Ⅱg/mD
GPC3(U/ml)
2日
0
1.6
0
49
|]InmDImb△田
rnDDpP【】I]1,【]日
SPARC(Ⅱg/mリ
GPC3(U/mリ
a2
O
aa
O
2Q
O
50
I、
ロ、、F【】Ⅱ
SPARC(ILg/mリ
GPc3(u/mO
a且
0
28
0
61
_】in庁Mq
PreopePOD32gPOD462(Meta)POD55g(Free)
SPARC仲gｿmI)
GPc3(u/m、
生2
0
20
so
1
0.4
0
69
[】1,,1個
9ODsPQIDRつP｡、Rq5POI。
SPARC(149/ml)
GPc3(u/mO
a2
0
2』
0
40
1
亜聖
87
】1,1,征
ヨreobePOD4S5P｡、R7BPO厄
SPARC(I4g/mO
GPcs(u/iTIO
5-S-CD(nmol/L)
聖0座
型0雨
昭0油
率0m
92
術前の血清SB8LRC値が陽性であった症例で、術後も経過を追うことの出来た13例について、血清
SBdLRC、GPC3およびs-S-CD値を測定し、その変化について検討した。その結果、13例中10例に
おいて、外科的切除後に血清SPARC値はカットオフ値以下に減少した。陽性値には下線を引いた。
POD:postoperativedays,Free:diseasefiree
44

7-13)BALB/cマウスを用いたSPARC特異的
CTLエピトープの同定
選択したH2-Kdに結合親和性を示すと推定されるSPARC由来のペプチド4種類
のうち、SPARC特異的にCTLを誘導出来るエビトープベプチドをELISPOTアッ
セイにて探索した(図15A)。それぞれのSPARCペプチドを提示させたBM-DCに
より、BALB/cマウスをinvivoで感作(免疫)した後に、脾細胞をinvitroで再
刺激後した。その後に、ELISPOT解析を行ったところ、刺激細胞としてペプチドKd-
4を負荷したBM-DCを用いた場合に生じたスポット数は、1×105個のCD4陰性
脾細胞あたり68.5±2.1個であり、一方コントロールとしてペプチド負荷しない
BM-DCに対しては11.3±40個であり、Kd-4ベプチドが最も強くSPARC特異的
CTLを誘導した(p

図燗
A Day-21 Day-14 Day･7 DayO
B
BM-DCvacclm
LP
BM･DCvaccIm
I・P.
DayO Day6
望巨。。。』□△⑩.山
Invnmro･BOhnuhtIon
CD4dopl⑧伯dBpImnceIb+B腓DCB
印lsmwlU10achp⑧pUdo
80
60
40
20
IFN-YEUSPoT
ELISPOTassay
O
SPARC
ｮIlnB
pepUde +- +- +ロ +-
図15. BALB/cマウスを用いたSPARC 由来のHjKd拘束性CTLエピトー
プの同定
(A)CTLエピトープ同定のための実験プロトコール。BALB/cマウスのBM-DCにH2-Kd拘束性
SPARCペプチド4種類の混合物を負荷し、1週間毎に2回、5×101個ずつ腹腔内投与(ip.)にて免
疫し、7日後に脾細胞を回収した。CD4陰性脾細胞を分画し、invitroにて再びBM-DCにそれぞ
れのSPARCペプチドを負荷したものと共培養し、6日後にELISPOTアヅセイにてペプチド特異的
なCTL応答を検討した。ELISPOTの際には刺激細胞としてペプチドを負荷したBM-DCと、負荷
しないBM-DCを用い、両刺激の間でスポット数の差が有意に大きいものをエピトープ候補とした。
(B)FN-YELISPOT法によるスポット数を示す。SPARC-Kd-1およびSPARC-Kd-4についてペプチ
ド特異的なCTL応答を認め、CTLエピトープと判定した。
46
■■
■■

図Ⅷ
の一の勇一g』一○の□の 52
刀印即如釦印加0
SPARCKd-1peptIde SPARCKd-4peptide
102030
E/TratIo
刀釦印印加加相
En℃ctor:CD4depI⑨tedspIeoncoIIs
mrget:TZ-Kdpop(+) -B
TZ-KdpopO 4
methA -士
RL31 0
0
102030
E/TratIo
Expression
ofSPARC
(mRNA)
+
図16.SPARCペプチドを用いたSPARC特異的なCTLの誘導
BALB/cマウスのBM-DCにH2-K.拘束性SPARCエビトープペプチド(SPARC-Kd-1および
SPARC-Kd-4)を負荷し、1週間毎に2回、5×103個ずつ腹腔内投与にて免疫し、7日後に脾細胞を
回収した。脾細胞から、CD4陽性細胞を磁気ビーズで除き、invitroにて再びBM-DCにそれぞれの
SPARCペプチドを負荷したものと共培養し、6日後にELISPOTアヅセイにてペプチド特異的なCTL
応答を検討した。
ELISPOTアヅセイにおけるペプチド特異性は、T2-K.細胞にSPARCエピトープを負荷したもの
(□)に対する傷害活性と、陰性対照としてペブチドを加えないもの(■)に対する傷害活性を比較した。
癌細胞に対するH2-K.拘束性SPARC特異的な細胞傷害活性は、共にH2-K.陽性で内因性SPARC
を発現する細胞株であるMethA(▲)と、SPARC陰性の細胞株であるRL31(●)に対する傷害活
性の有無で検討した。これらの癌細胞に対する細胞傷害活性を比較することにより、腫癌が発現して
いるSPARC蛋白質から生成されるエビトープペプチドとMHC分子(H2‐Kd)の複合体を認識し
てCTLが細胞傷害活性を示していることがわかった。
47
■■

7-15)SPARCペプチド負荷BM-DCを免疫したマウスにおける
腫瘍増殖の抑制
BALB/cマウスに、H2-K.拘束性SPARCエビトープペプチドKd-1と4を混合
して負荷したBM-DCを1週間間隔で2回免疫し､2回目の免疫の1週間後にSPARC
を高発現繊維肉腫細胞株McthAを側背部に皮下移植して、腫瘍増殖抑制効果につ
いて検討した。ペプチドを負荷しないBM-DC投与群、あるいは非投与群をコント
ロールとして用いた。BALB/cマウスに生着したMCthA細胞が形成した腫瘍の大
きさの経時的変化を図17A、B、Cに示す。エピトープペプチドを負荷したBM-DC
で免疫したマウスでは、一旦生着した腫瘍が10匹中8匹で完全に拒絶され、コン
トロールのBM-DC非投与群と比較して明らかな腫瘍増殖抑制が認められた(P<
0.05)。なお、コントロールのBM-DC投与群でも、10匹中4匹において腫瘍拒絶
が認められたため、エピトープペプチドを負荷したBM-DCと比較して有意差は認
められなかったが(p=0.07)、腫瘍増殖の抑制傾向(Day31:267.8±252.8VS51.3
±82.1)が認められた。
SPARCエビトープペプチド負荷BM-DC群、コントロールBM-DC群、非投与
群の生存曲線を図17,に示す。エピトープペプチド負荷BM-DC群と非投与群では、
生存期間においても有意な差が生じた(p

汀EE〉①凶⑩』。Eコト
図 Ⅱ7
くま)の旨』|里』シ』。の
A B
P●餌｡●Pu瞳dBM･DC群(､=10リ P●〆､●ImPuね●dBM⑩C群(-1句
N函坤、群(摩10リ
120, 120,
麺函 迦
Hm 函
訳､ﾛ/:pE
4麺0
1
函函 迩 亜 麺
1
⑥
曲亘鍾7
OB 1015 20253035
6100
、
DaysaItertumorchallenge
四 0
麺函 函 2
≦騨鑛目HP
11
m
DB101520253⑨=DB1015麺25m鐙
DaysaftertumorchaIIenge
図17.SPARCペプチド負荷BMDCワクチンによる腫瘍増殖抑制効果と、
生存期間延長効果の検討
H2-Kd拘束性SPARCエピトープペプチド(SPARC-Kd‐1およびSPARC-Kd-4)を負荷したBM
DCワクチンを、1週間間隔で2回BALB/cマウスの腹腔内に免疫し、2回目の免疫のさらに1週間
後に、マウスの側背部皮下にMethA細胞を移植し、腫瘍増殖抑制効果と、生存期間延長効果につい
て検討した。
(A、B、C)SPARCエピトープペプチド負荷BM-DC群(▲)、コントロールBM-DC群(□)、非投
与群(●)のマウスにおける腫瘍の大きさの変化を、それぞれ図16A、B、Cに示した。SPARCエ
ビトープペプチド負荷BM-DC群では、一旦生着した腫鰯が10匹中8匹で完全に拒絶された。
腫瘍の大きさは長径×短径で表した。SPARCエピトープペプチド負荷BM-DC群と非投与群と
を比較すると、明らかな腫瘍増殖抑制が認められた(p

7-16)ペプチド負荷BM-DCの投与を受けた
BALB/cマウスの病理組織学的解析
癌免疫療法の臨床応用を目指す際には、癌特異的抗原に対壜する免疫応答が自己免
疫現象を誘導するか否かに留意しなければならない。例えば、良く知られているメ
ラノーマの分化抗原のMAR、やgplOOは、メラノーマの免疫療法に有用であるが、
自己免疫反応として白斑やブドウ膜炎を誘導する場合があることが報告されている
(46)。エピトープペプチドSPARC-Kd-1およびSPARC-Kd-4を含むSPARCペプ
チドを負荷したBM-DCにて2回免疫したBALB/cマウスについて、重要臓器(脳、
心、肺、肝、腎)へのCD8陽性T細胞または、CD4陽性T細胞の浸潤を免疫組織化
学的解析にて検討したところ、細胞浸潤を認めなかった。また、マウスは体重減少、
活動'性の低下、麻痒や下痢などの症状を示さず、自己免疫病は発生していないもの
と判断した(図18)。
図18
B『劇in 鑿鑿篝鑿
》》一》三一一三一一一■》■一口一ヨコニヨヨ・皿□{一一一一》》一一》一》一一一エコー■一一一一■}一己》》
鍵鑿鑿蕊
鐵鑿蕊鱗一
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鑑鞍輸螺唖
》田畑汕汕皿汕皿田一M舐叩
奔肝黙鍔鐸
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識鍵碑懲
lLlIillIilililIiillilliIi
鍵 ;:塾;が:塀
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印・凸・凸・別・いみ曲
鴻蕊軒議》
》’鞆・叩・叩’穂稲印
】200
ざ
寸
li鱗illiij
鍵雛
、 》蕊》
牛、
anti-CDB
篝
】α0゜
図18.ペプチド負荷BM-DCワクチンの投与を受けたマウスの病理組織学的
解析
SPARCペプチド(SPARC-Kd‐1およびSPARC-Kd-4)を負荷したBM-DCワクチンを腹腔内投
与した1週間後に脾臓を採取する際に、同時に重要臓器への細胞浸潤の有無を検討した。抗CD8抗
体および抗CD4抗体を用いて脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、脊髄へのCD4陽性およびCD8陽性T細
胞浸潤の有無を検討したが、浸潤は認められなかった。(脾臓は陽性対照)
50

8考察
癌免疫療法の標的抗原として理想的なものは、腫瘍細胞中で自然にプロセッシン
グされて出来たベプチドが、細胞表面上にMHC分子と共に提示される抗原で、か
つ免疫系からの逃避が起こりにくい抗原、すなわち癌細胞の悪性形質転換、組織浸
潤や転移に重要な役割を担っている分子で、癌細胞がその発現を欠落すると、癌の
悪性形質を失うものがあげられる(18,47)。今回われわれが同定したSPARC遺伝子
は、正常では脂肪組織、乳腺、卵巣、脊髄、精巣、子宮、胎盤などに少量発現して
いるが、スキルス胃癌において発現が著明に増加する遺伝子であり、その他の癌腫
におけるcDNAマイクロアレイ解析でも、膵癌、大腸癌などの75%以上の患者で、
癌部に異常な高発現を認めるものである(未発表データ)。SPARC蛋白質の発現を免
疫組織学的解析により確認したところ、正常精巣、メラノーマ細胞で強い発現が認
められたが、その他の正常臓器には、ほとんど発現を認めなかった。
SPARCは様々な癌腫で高発現する事が報告されており、局所の浸潤度、リンパ節
転移、肝転移、予後や生存の不良などとの関連が報告されている(39,48-59)。一方、
卵巣癌では、悪性度と逆の相関が報告されている(58)。多くの癌では、SPARCは、
癌の間質細胞に発現しており、癌細胞自身にはほとんど発現していない(48,55)。し
かしながら、ヒトメラノーマ細胞にはSPARCが高発現することが報告されており、
その発現が腫瘍の浸潤性や悪性度と正の相関を示すとされている(39,40)。これらの
ことより、SPARCは多様な癌の免疫療法において、有効な標的抗原となる可能性が
あると考えられた。
まず、我々はメラノーマ細胞株とメラノーマ組織において、mRNAおよび蛋白質
レベルでSRARCが高発現していることを確認した。また、メラノーマ細胞株培養上
清中に可溶性SEARC蛋白質が分泌され、これを検出できることを発見した。さらに、
実際にメラノーマ患者の血清中にも可溶'性SPARC蛋白質が分泌され、診断に有用で
はないかと考えた。実際に、今回の研究では、メラノーマ患者の33%において、
血清中のSEARC値が増加しており、メラノーマの検出に有用であることが証明され
た。
一般に、血清腫瘍マーカーの値と、病気の進行度は相関している(44)。しかしなが
ら、今回の検討では、血清中SEARC値と、メラノーマの進行度には、明らかな相関
が見られなかった。検討したほとんどすべてのメラノーマ組織およびメラノーマ細
胞株にSPARCが発現しているのに、なぜ33%の限られた症例のみでしか、血清中
のSPARCが高値にならないのであろうか。メラノーマ細胞株において、蛋白質の発
現と、培養上漬中に分泌される可溶'性SPARCの量は、完全には相関していなかった
(図gBおよび図12)。同様のことは、患者のデータにおいて観察され、SEARCの免
疫組織化学的解析で、中等度あるいは強陽性であった24例中16例が、血清中の
SPARCが低値のままであった(表2)。これらのことより、すべてではなく一部の
51

メラノーマ細胞が、SPARCを分泌しているのではないかと考えられた。メラノーマ
細胞株を培養した場合、培養上清中に分泌される可溶性SPARC蛋白質は、培養ディ
ッシュ中の細胞数にほぼ相関していた(未発表データ)。しかし血清SPARC値は、
腫瘍の大きさやステージとは明らかな相関を示さなかった。今回の検討では、むし
ろ早期癌に比べて、ステージ1Vの進行癌では、血清SPARC値は比較的に低値であ
った｡メラノーマからのSPARC分泌の機構は明らかになっていないが、血清SPARC
は、比較的早期のメラノーマの検出に有用なマーカーである事が示唆された。
正常人においても、血小板由来のSPARC蛋白質が血清中に存在し、血小板数と
相関するとの報告がなされている(60)。我々の検討でも、健常人においては、血清
SPARC値と血小板数とは、ほぼ正の相関を示していた(未発表データ)。さらに、今
回健常対照群と、メラノーマ群の血小板数を測定したところ、その数に全く有意差
は認められなかった(21.3±0.9万個/mm3対21.6±0.8万個/mm3)。
今回の、血清SPARC値の検討では、健常対照群で3例(4.9%)の偽陽性例を認
めたが、そのSEARC値は、多くのSPARC陽'性メラノーマ患者の値よりも低かった。
よって、そのSEARC値の増加は、血小板増加などの因子が関与しているのではない
かと疑ったが、そのような例は認めなかった。血漿中のSPARCを測定することによ
り、血小板の影響を抑えることが出来るため、血漿での検討を行ったが、結果的に
は、健常人では21例中1例(4.8%)の偽陽性を認め、メラノーマ患者の陽性率も、
血清サンプルと明らかな差を認めなかった(36.4%対33.0%)。これらのことより、
メラノーマ患者の血清中で増加しているSEARCは、血小板由来のものではなく、メ
ラノーマ細胞から分泌されているものと推測された。
免疫組織化学的解析によると、色素'性母斑はSEARCおよびGPC3を共に高発
現している。巨大先天性母斑患者5例においては、GPC3値の上昇は見られなかった
が、2例(40%)において血清SPARC値の増加を認めた。母斑症例については、偽
陽性の危険性が高いために、メラノーマの鑑別診断における血清SPARC値の利用に
は注意を要すると考えられた。
今回の研究では、日本人のメラノーマ患者検体のみを用いた。日本人は欧米人と
比較し、ALMの発生率が圧倒的に高いが、欧米人ではSSMやLMMの頻度が高い。
臨床的、病理学的、また分子遺伝学的にもALMは他のタイプと異なると報告され
ている(61-64)。そこで、これらの臨床型別にSPARCとGPC3の陽性率を比較して
みた。その結果、臨床型とこれらのマーカーの陽性率には、明らかな相関は認めな
かった。このことより、SPARCとGPC3という2種類の腫瘍マーカーは、日本人
のみではなく、欧米白人のメラノーマにも応用可能であると考えられた。
SPARCは、特に早期のメラノーマの腫瘍マーカーとして有用である事が示唆さ
れた。また、S-S-CDとGPC3という2種類の腫瘍マーカーと同時に測定すること
により、検出率はさらに向上し、メラノーマの診断、治療成績の向上に寄与するも
のと考えている。現時点では、Atypicalncvisyndromcや、他のメラノーマのハイリ
スク群におけるこれらの腫瘍マーカーの検討はなされていない.新しい腫瘍マーカ
52

-であるSPARCおよびGPC3を臨床応用するためには、これらの症例を含めた、さ
らなる検討が必要である。一方、われわれはメラノーマの他に、乳癌患者(通常型
10例、スキルス型10例)の血清についても、血清SPARCを測定したが、有意
な血清SPARC値の増加は認めなかった(未発表データ)。また、膵癌20例につい
て血清SPARC値が測定されているが、有意な増加は認めなかったと報告されてい
る(65)。SPARCが他の癌腫についても、腫瘍マーカーとして有用であるか否かにつ
いては、さらなる検討が必要である。
本研究で、われわれは、BALB/cマウスの系において、Kd拘束性のSPARC由来
CTLエピトープを同定し、これらのペプチドを用いてBALB/cマウスを免疫するこ
とにより、その脾臓細胞からSPARCに反応するCTLを誘導出来た。これらのペプ
チドを負荷したBM-DCによるワクチンは、BALB/cマウスに有害な自己免疫反応
を引き起こすことなくCTLを誘導できた。われわれは、同様の方法で同定したH2-
KdとHLA-A24に共通した結合モチーフをもつGPC3由来エピトープペプチドが、
HLA-A24陽性のHCC患者の約50%においてCTLを誘導できることを報告してい
る(33)。このことはBALB/cマウスがHLA-A24拘束'性CTLエピトープの同定に
有用であることを示唆しており、今回同定したSPARCエピトープペプチドについ
ても、HLA-A24陽性のメラノーマ患者からCTLを誘導できる可能性が高いと考え
ている。
われわれは、BALB/cマウスに、SPARCエピトープペプチド負荷BM-DCを
予防的に投与することにより、その後に皮下移植したMethA細胞の増殖が抑制さ
れ、生存期間も延長することを観察した。しかしながら、ベプチドを負荷しない
BM-DCを投与したマウス群でも、一部で腫瘍増殖抑制効果が観察された。この機
序として、BM-DCの培養の際に用いたFCS由来の蛋白質が、抗原として作用し、
それを認識する癌細胞に非特異的なCTLやヘルパーT細胞が誘導されて、腫瘍増殖
抑制に働いた可能性が考えられた。現在、SPARCを高発現するその他の腫瘍につい
て、同様の検討を行っている。また、実際に生着した腫瘍にCTLを注入する養子免
疫療法の有用性についても、検討する予定である。
SPARCは、従来のように腫瘍反応性T細胞や癌患者血清中の抗癌抗体を用いて
同定された抗原ではなく、cDNAマイクロアレイ解析の結果から抗原となりそうな
候補分子を推測し、その分子のアミノ酸配列からCTLエピトープを予測する方法に
よって同定された腫瘍拒絶抗原である。この様な方法で同定された抗原の免疫原性
については十分に確認する必要があるが、癌細胞における発現が非常に高く、また
癌患者における発現頻度も高い分子を選択できるという利点がある。また、その分
子の機能を解明しておくことも、治療の標的分子として臨床的に利用する際には必
要であり、その解析も今後行うべきであろう。
最後に、本研究で同定したSPARCはメラノーマ、スキルス胃癌のみならず、膵
癌、大腸癌患者にも高頻度で発現していることから、多様な癌の診断薬および免疫
療法における効果的な標的抗原となる可能'性がある。さらに、腫瘍の間質細胞から
53

分泌されるSPARCが間質を増生させることにより腫瘍の増殖を促進させ、SPARC
ノックアウトマウスでは、この現象がなくなるために腫瘍の増殖が抑制されるとの
報告があり(41)、腫瘍細胞のみならず、間質のSPARCをターゲットとした免疫療法
が有効となる可能性も考えられる。現在、われわれは、ヒトへの応用を考えて、
HLA-AZtransgcnicマウスを用いたHLA-A2拘束性エピトープの同定、および間
質細胞をターゲットとした腫瘍免疫療法について解析中である。
54

,結語
cDNAマイクロアレイ解析を用いて同定された新規癌抗原SPARCが、メラノーマ
の腫瘍マ〒カーとなるとともに、マウスの系において、腫瘍免疫療法の標的分子に
なりうることを示した。今後、SPARCがヒトのSPARCを発現する癌の患者におい
てもCTLを誘導し、腫瘍を傷害することが可能か否かを検討することは重要な課題
である。抗腫瘍ワクチンとして、また当教室で進めている樹状細胞療法と組み合わ
せることによって、
腫瘍免疫療法の一翼を担えればと期待している。
55

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