ruolo dei microrganismi nella produzione di biocombustibili
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DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA CELLULARE E DELLO SVILUPPO<br />
UNIVERSITA’ DI PALERMO<br />
RUOLO DEI MICRORGANISMI<br />
NELLA PRODUZIONE DI BIOCOMBUSTIBILI<br />
PAOLA QUATRINI<br />
LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA MOLECOLARE ED APPLICATA<br />
DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA CELLULARE E DELLO SVILUPPO
COSA SONO I MICRORGANISMI<br />
c. algae<br />
a. bacteria<br />
1 μm<br />
d. protozoa<br />
b. fungi: yeasts and molds<br />
e. viruses
Cellula procariotica Cellula eucariotica
L’ALBERO DELLA VITA<br />
MONERA<br />
MONERA<br />
PROTISTA<br />
FUNGI<br />
PLANTAE<br />
ANIMALIA
NONSOLOPATOGENI
NONSOLOPATOGENI
PROPRIETÀ CATABOLICHE DEI MICRORGANISMI<br />
“bioreme<strong>di</strong>ation”<br />
Menu<br />
Idrocarburi (n-alcani)<br />
Idrocarburi (aromatici e poliaromatici)<br />
Esplosivi (Trinitrotoluene TNT)<br />
Bifenili policlorurati<br />
organoclorurati<br />
Pestici<strong>di</strong> (organofosfati)<br />
Erbici<strong>di</strong> (atrazina)<br />
Alcaloi<strong>di</strong> (nicotina)
DIVERSITA’ METABOLICA DEI MICRORGANISMI<br />
O 2<br />
RESPIRAZIONE AEROBIA<br />
CO 2 , H 2 O, BIOMASSA, ENERGIA<br />
ATP<br />
FERMENTAZIONI<br />
ACIDI ORGANICI<br />
ETANOLO<br />
H 2<br />
O 2<br />
RESPIRAZIONE ANAEROBIA<br />
NO3<br />
SO4<br />
CO2 N2<br />
H2S<br />
CH4
METABOLISMO ENERGETICO
METABOLISMO ANAEROBIO:<br />
FERMETAZIONE ALCOLICA
La fermentazione alcolica<br />
Alcol <strong>dei</strong>drogenasi
AGENTI DELLA FERMENTAZIONE ALCOLICA:<br />
I LIEVITI<br />
Funghi unicellulari che si riproducono<br />
principalmente per via vegetativa<br />
(gemmazione o fissione)<br />
Basi<strong>di</strong>omiceti, Ascomiceti e<br />
Deuteromiceti<br />
Metabolismo: Aerobi obbligati o<br />
anaerobi facoltativi<br />
Osmofili e alofili. Su frutti e vegetali.<br />
Agenti della fermentazione alcolica<br />
(vino, birra pane).<br />
Eucarioti modello<br />
Saccharomyces cerevisiae
CONVERSIONE DELLE<br />
BIOMASSE IN BIOCARBURANTI<br />
• Fattori geopolitici<br />
• Ambiente<br />
• tecnologie
PRODUZIONE DI ETANOLO DA AMIDO DI<br />
MAIS<br />
AMIDO saccarificazione GLUCOSIO fermentazione ETANOLO<br />
α-amylasi<br />
• Tecnologia matura<br />
Saccharomyces<br />
• Efficienza (amilasi a basso pH, attive su amido grezzo e crudo)
OCCORRONO ALTRE BIOMASSE<br />
• L’incremento <strong>nella</strong> <strong>produzione</strong> <strong>di</strong> etanolo<br />
(che non competa con l’alimentazione<br />
umana ed animale) può derivare solo<br />
dall’uso <strong>di</strong> altri substrati<br />
• Tali substrati alternativi sono definiti<br />
“biomasse” ed includono residui<br />
dell’agricoltura, legno, rifiuti soli<strong>di</strong> urbani e<br />
colture de<strong>di</strong>cate<br />
•…E DOBBIAMO LIBERARCI DEI RIFIUTI!
BIOETANOLO DA BIOMASSE LIGNOCELLULOSICHE<br />
Più equa <strong>di</strong>stribuzione geografica<br />
delle risorse. Risorse domestiche<br />
Il materiale lignocellulosico non<br />
compete con le risorse alimentari,<br />
costa meno e richiede minori input<br />
energetici e fertilizzanti/pestici<strong>di</strong><br />
Basso effetto serra<br />
Impiego in aree rurali<br />
Hahn-Hagerdal et al., Trends Biotech. 2006
BIOMASSE<br />
Key global biomass resources from agricultural residues, wood, and herbaceous<br />
energy crops.
Component<br />
Cellulose<br />
Hemicellulose<br />
& pectin<br />
Lignin<br />
Extractives<br />
COMPOSIZIONE DEL LEGNO<br />
% w/w approx<br />
40-50<br />
20-35<br />
15-25<br />
5<br />
State<br />
Crystalline<br />
Semicrystalline<br />
Amorphous<br />
Monomeric<br />
Made of<br />
Glucose<br />
Galactose<br />
Mannose<br />
Xylose<br />
Phenylpropane<br />
Terpenes<br />
Phenolics<br />
Functions<br />
Microfibre<br />
Matrix<br />
Matrix<br />
Toxicity
STRUTTURA DELLE PRINCIPALI MOLECOLE<br />
CELLULOSA<br />
Polimero Po cristallino del<br />
glucosio<br />
LIGNINA<br />
etropolimero degli<br />
alcol del fenilpropano<br />
(sinapyl, coumaryl,<br />
coniferyl)<br />
EMICELLULOSE E PECTINE<br />
Polimeri <strong>di</strong> galattosio, pentosi (xilosio e mannosio)e altre molecole<br />
G, galactose A, arabinose; FeA, ferulic acid;; Glc, glucuronic acid; X, xylose
overall conversion process of an energy crop to ethanol
SCHEMA DI PROCESSO DI UNA<br />
BIORAFFINERIA<br />
GRAY ET AL.2006
INTEGRAZIONE DEI PROCESSI<br />
Resa in zuccheri ed etanolo <strong>di</strong> materiale lignocellulosico <strong>di</strong> abete pre-trattato con<br />
vapore .<br />
EH, resa in zucchero dopo idrolisi enzimatica<br />
SSF, resa in etanolo dopo saccarificazione e fermentazione simultanea;
ATTACCO ENZIMATICO<br />
DEI POLIMERI LIGNO-CELLULOSICI<br />
.<br />
White = glucose, green = xylose, yellow =<br />
glucuronic acid, red = arabinose,.<br />
Acetate groups are shown as triangles,<br />
phenolic groups as <strong>di</strong>agonals, and methyl<br />
groups as rombs.<br />
CELLULOSA<br />
XILANO<br />
ENDOGLUCANASI: taglio casuale del legame<br />
Β-1,4 glicosi<strong>di</strong>co interno alla molecola<br />
EXOGLUCANASI: taglio alle estremità <strong>di</strong> residui<br />
oligosaccari<strong>di</strong>ci corti solubili (es cellobiosio)<br />
Β-GLUCOSIDASI: idrolizzano gli oligosaccari<strong>di</strong> a<br />
glucosio
PRODUTTORI DI ENZIMI<br />
DEGRADATORI<br />
• Representative Cellulase-producing Microorganisms<br />
• Fungi<br />
Acremonium cellulolyticus Aspergillus acculeatus Aspergillus niger<br />
Aspergillus fumigatus<br />
Irpex lacteus Penicillium funmiculosum<br />
Phanerochaete Fusarium solani<br />
Schizophyllum commune<br />
Sclerotium rolfsii Sporotrichum cellulophilum Talaromyces emersonii<br />
Thielavia terrestris Trichoderma koningii Trichoderma reesei Trichoderma<br />
viride<br />
Bacteria<br />
Clostri<strong>di</strong>um thermocellum Ruminococcus albus<br />
• (Actinomycetes) Streptomyces sp. Thermoactinomyces Thermomonospora<br />
curvata
PRODUTTORI DI ENZIMI<br />
DEGRADATORI<br />
• Fungo (ascomicete) filamentoso<br />
cellulosolitico<br />
• Secerne enzimi cellulosolitici<br />
(cellobioidrolasi e endoglucanasi) ed<br />
emicellulosolitici nel mezzo <strong>di</strong> coltura.<br />
• Prodotti commerciali<br />
• Genoma 7 cromosomi, 33Mb<br />
• Geneticamente manipolabile<br />
• Vari mutanti termostabili ed efficienti<br />
Tricoderma reesei
Impianti attivi
ETANOLO DA MATERIALE LIGNOCELLULOSICO:<br />
QUALI OSTACOLI<br />
1. Effciente depolimerizzazione <strong>di</strong> cellulosa ed emicellulose in zuccheri<br />
solubili<br />
2. Efficiente fermentazione dell’idrolizzato composto da esosi e pentosi in<br />
presenza <strong>di</strong> inibitori (es composti fenolici)<br />
3. Riduzione dell’input energetico<br />
4. Utilizzazione della lignina
Produzione <strong>di</strong> biomasse<br />
Overview of plant traits that can be targeted by accelerated domestication<br />
for enhanced plant biomass production and processing
ETANOLO DA MATERIALE LIGNOCELLULOSICO:<br />
NUOVE STRATEGIE<br />
• NUOVI CEPPI MICROBICI<br />
• INGEGNERIA GENETICA<br />
DNA ricombinante<br />
• INGEGNERIA METABOLICA<br />
Approccio multi<strong>di</strong>sciplinare. Mo<strong>di</strong>fica del metabolismo me<strong>di</strong>ante<br />
utilizzazione <strong>di</strong> tecniche ricombinanti include: inserimento <strong>di</strong> nuovi<br />
pathway, Miglioramento efficienza <strong>dei</strong> pathway esistenti.
ETANOLO DA MATERIALE LIGNOCELLULOSICO:<br />
NUOVE STRATEGIE<br />
• NUOVI CEPPI MICROBICI<br />
• INGEGNERIA GENETICA<br />
DNA ricombinante<br />
• INGEGNERIA METABOLICA<br />
Approccio multi<strong>di</strong>sciplinare. Mo<strong>di</strong>fica del metabolismo me<strong>di</strong>ante<br />
utilizzazione <strong>di</strong> tecniche ricombinanti include: inserimento <strong>di</strong> nuovi<br />
pathway, Miglioramento efficienza <strong>dei</strong> pathway esistenti.
Clostri<strong>di</strong>um CLOSTRIDIUM thermocellum<br />
• anaerobio<br />
• sporigeno<br />
• termofilo (60°c)<br />
• Ridotta biomassa<br />
• Bilancio energetico<br />
• elevata crescita su<br />
cellulosa cristallina<br />
• Assimila cellodestrine<br />
(non cellobiosio) me<strong>di</strong>ante<br />
sistemi trasporto ABC<br />
•sistemi celulosolitici complessi (Cellulosomi)
SCHEMA DI PROCESSO SSF<br />
PER LA CONVERSIONE DI BIOMASSE AD ETANOLO
Cellulosomes<br />
. Transmission electron micrographs of Clostri<strong>di</strong>um thermocellum cells<br />
showing cellulosome aggregates on cell surfaces (in<strong>di</strong>cated by<br />
arrows; A), and, at higher magnification, in<strong>di</strong>vidual cellulosomes of<br />
Clostri<strong>di</strong>um papyrosolvens (B). Also shown is a model of C.<br />
thermocellum cellulosomes and an associated cell-surface anchoring<br />
protein.
IL CELLULOSOMA DI<br />
• Cellulosomes are cell protuberances<br />
which tightly bind to crystalline<br />
cellulose<br />
CLOSTRIDIUM<br />
• They me<strong>di</strong>ate a close neighborhood<br />
between cell and substrate and thus<br />
minimize <strong>di</strong>ffusion losses of hydrolytic<br />
products,<br />
• A cellulosome preparation contains a<br />
number of <strong>di</strong>fferent proteins, most of<br />
them having enzymatic activity<br />
• This dockerin module binds<br />
specifically to the cohesin modules,<br />
located in a non-catalytic cellulosome<br />
component, for which the term<br />
"scaffol<strong>di</strong>n" was coined (cellulosome<br />
structure).
The clostri<strong>di</strong>al coculture process<br />
•The clostri<strong>di</strong>al coculture process in which C. thermocellum serves as the<br />
cellulase and hemicellulase producer. The hemicellulose-derived pentoses<br />
can be utilized by C. thermosaccharolyticum but not C. thermocellum.<br />
•C. thermosaccharolyticum uses cellobiose faster and is a better ethanol<br />
producer. In ad<strong>di</strong>tion to cellobiose, cellodextrins are also produced from<br />
cellulose and can be utilized <strong>di</strong>rectly.<br />
Demain et al., 2005
ETANOLO DA MATERIALE LIGNOCELLULOSICO:<br />
NUOVE STRATEGIE<br />
• NUOVI CEPPI MICROBICI<br />
• INGEGNERIA GENETICA<br />
DNA ricombinante<br />
• INGEGNERIA METABOLICA<br />
Approccio multi<strong>di</strong>sciplinare. Mo<strong>di</strong>fica del metabolismo me<strong>di</strong>ante<br />
utilizzazione <strong>di</strong> tecniche ricombinanti include: inserimento <strong>di</strong> nuovi<br />
pathway, Miglioramento efficienza <strong>dei</strong> pathway esistenti.
L’INFORMAZIONE GENETICA<br />
Un Gene è una sequenza <strong>di</strong> DNA<br />
che co<strong>di</strong>fica per una proteina, un<br />
tRNA o un rRNA
DNA<br />
ricombinante
Clonaggio <strong>di</strong> <strong>di</strong>versi<br />
frammenti <strong>di</strong> DNA<br />
in un vettore<br />
Analisi del gene<br />
Espressione eterologa e recupero della proteina
Screening <strong>dei</strong> cloni ricombinanti<br />
Attività betaglicosidasica<br />
Attività cellobioidrolasica
ETANOLO DA MATERIALE LIGNOCELLULOSICO:<br />
NUOVE STRATEGIE<br />
• NUOVI CEPPI MICROBICI<br />
• INGEGNERIA GENETICA<br />
DNA ricombinante<br />
• INGEGNERIA METABOLICA<br />
Approccio multi<strong>di</strong>sciplinare. Mo<strong>di</strong>fica del metabolismo me<strong>di</strong>ante<br />
utilizzazione <strong>di</strong> tecniche ricombinanti include: inserimento <strong>di</strong> nuovi<br />
pathway, Miglioramento efficienza <strong>dei</strong> pathway esistenti.
CEPPI METABOLICAMENTE INGEGNERIZZATI PER<br />
L’UTILIZZAZIONE DI PENTOSI<br />
Either the tail end, as in Escherichia coli and Klebsiella oxytoca, or the front end<br />
of metabolism, as for Saccharomyces cerevisiae and Zymomonas mobilis, have<br />
been engineered. Abbreviation: rec, recombinant.
Zymomonas mobilis, a metabolically<br />
engineered bacteria used for fermenting both<br />
glucose and xylose to ethanol.<br />
Science, February 2007<br />
applicazioni<br />
An 8000-liter fermentation tank<br />
used to start the process of<br />
turning cellulosic material into<br />
ethanol.
FERMENTAZIONE IN CLOSTRIDIUM<br />
• Ethanol, lactate, and acetate fermentation<br />
by C. thermocellum.<br />
• 1, enzymes of Embden-Meyerhof<br />
pathway;<br />
• 2, lactate dehydrogenase;<br />
• 3, pyruvate-ferredoxin oxidoreductase;<br />
• 4, acetaldehyde dehydrogenase;<br />
• 5, alcohol dehydrogenase;<br />
• 6, phosphotransacetylase;<br />
• 7, acetate kinase.
CBP: consolidated bioprocessing<br />
STRATEGIE<br />
Lynd et al., Current opinion in Biotechnology 2005
Obiettivi della ricerca<br />
• migliorare l’idrolisi enzimatica e ridurre i costi.<br />
• sviluppare <strong>microrganismi</strong> “robusti” più tolleranti agli inibitori che<br />
fermentano tutti gli zuccheri con alte rese in etanolo.<br />
• estendere l’integrazione <strong>dei</strong> processi riducendo gli steps, ridurre gli<br />
input, eliminare l’uso <strong>di</strong> acqua, riutilizzare gli scarti
Figure 5. Biorefinery – integration of a combined heat and<br />
power plant with an ethanol production plant.
metanogenesi<br />
La bioconversione del materiale organico<br />
complesso richiede 4 fasi e cinque gruppi<br />
fisiologici <strong>di</strong> <strong>microrganismi</strong><br />
a. Idrolisi delle macromolecole a monomeri e<br />
fermentazione (m. fermentanti)<br />
b. Ossidazione degli aci<strong>di</strong> organici a acetato<br />
e idrogeno. Acetogenesi (batteri<br />
acetogenici)<br />
c. Produzione <strong>di</strong> acetato da H 2 e CO 2<br />
(acetogeni e omoacetogeni)<br />
d. Conversione dell’acetato a metano e<br />
anidride carbonica (Metanogeni<br />
Idrogenotrofi)<br />
e. Metanogenesi (Metanogeni acetoclasti)
La terra: il pianeta <strong>dei</strong> <strong>microrganismi</strong>