E. Testai - Istituto Superiore di Sanità

Metabolismo e tossicocinetica
degli xenobiotici durante la
gravidanza e
nelle varie fasi dello sviluppo
Emanuela Testai
Istituto Superiore di Sanità -Dipartimento Ambiente
e Connessa Prevenzione Primaria- Roma (Italy)
testai@iss.it

XENOBIOTICO: Chi è costui?
Ogni sostanza chimica estranea all’organismo è
definita uno xenobiotico.
Additivi alimentari, aromatizzanti, coloranti, emollienti,
emulsificanti, pesticidi, sottoprodotti della combustione e della
clorazione delle acque, inquinanti ambientali, farmaci, prodotti
‘naturali’ e voluttuari sono xenobiotici.
Che cosa accade quando
un organismo viene
esposto ad uno
xenobiotico?
Assorbimento
Distribuzione
Metabolismo
Escrezione
La fase
tossicocinetica

Assorbimento
Distribuzione
Avviene attraverso membrane biologiche
Quasi tutti gli xenobiotici sono liposolubili
Gli xenobiotici sono distribuiti ai diversi organi
attraverso il circolo sanguigno (essenzialmente
legati alle proteine plasmatiche). Nei vari distretti
possono accumularsi (membrane e tessuto adiposo)
⇒ EFFETTI TOSSICI se si supera la soglia di
tossicità
Durante la gravidanza possono raggiungere il
prodotto del concepimento attraverso la placenta,
entrando sia per diffusione passiva che in alcuni
casi per trasporto attivo ⇒ Aborti, effetti
teratogeni, effetti sullo sviluppo post-natale .
Escrezione Avviene principalmente attraverso soluzioni
acquose

La funzione delle reazioni di biotrasformazione è
quella di aumentare la idrosolubilità degli
xenobiotici, evitandone l’accumulo negli organismi
favorendone l’escrezione in
ambiente acquoso
Reazioni di fase I: inseriscono o smascherano
gruppi funzionali (-OH, -NH 2 )
Reazioni di fase II: coniugano al parentale o al
prodotto di reazione della fase I molecole
endogene altamente solubili

Metabolismo degli xenobiotici
Gli enzimi coinvolti nel metabolismo degli xenobiotici (CYP,
GST, UDPGT, idrolasi, esterasi) li trasforma in:
• Metaboliti con attività < o nulla rispetto al parentale
(Es: OPT, triazine): detossificazione
• Metaboliti con attività biologica > del composto
parentale (Es: OPT, carbammati): bioattivazione
TOXIC CHEMICAL
---------------------------------------------------------------------
X X*
---------------------------------------------------------------------
METABOLISM TOXICITY TOXICITY
high
low

Variabilità indotta da
fattori socioambientali
Dieta
Fumo
Bevande alcoliche
Farmaci
Inquinanti
Stati patologici
Induzione
Inibizione
Xenobiotico
ORGANISMO
Farmaco/tossicocinetica
RISPOSTA
Effetto Terapeutico
Tumore
Tossicità
Variabilità indotta
da fattori genetici
Recettori
Modificati
Variazioni geniche
Espressione
Polimorfica di
enzimi del
metabolismo
Sistemi di difesa
Modificati
(DNA-Repair)

Nessuna esposizione
a tossici
Sviluppo embriofetale
buono
Esposizione materna a
xenobiotici tossici
Possibilità di:
aborto, difetti alla
nascita, disfunzioni
funzionali

DEVELOPING ORGANISMS ADULT ORGANISMS
Rodents Humans Rodents
Humans
N° + ++ +++++++
++++
Levels -/+ ++
+++++ ++++
of activity
Grandi differenze di specie nell’ontogenesi dei sistemi
enzimatici
la specie umana ha capacità metaboliche relativamente
buone a livello epatico nel periodo perinatale, al contrario
dei roditori
Il profilo metabolico del concepito varia dinamicamente
durante lo sviluppo
L’identificazione dello stadio gestionale in studio è
cruciale per la produzione di dati scientificamente validi

La maggioranza delle reazione di biotrasformazione
degli xenobiotici avviene nel fegato dell’adulto
Gli studi sugli organismi in via di sviluppo si sono
concentrati per analogia sullo stesso organo e tra i
sistemi enzimatici il più studiato è quello del
citocromo P450.

Il citocromo P450
Il P450 è una famiglia multigenica di
emoproteine che catalizzano la monoossigenazione
di substrati endogeni ed esogeni
Cytochrome P450
CYP 2 E 1
Gene number
Gene subfamily
Gene family
Same gene family : sequence similarity >40%
Same subfamily : sequence similarity >55%
Same gene n° in different species: orthologous enzymes

Il citocromo P450
Co-substrates NADPH, O 2
Coupled enzymes Cytochrome b 5 , Cyt.P450-reductases
Isoforms >500
Substrates organic compounds with/without
eteroatoms (N,S,Se,P)
Localization microsomes, mitochondria
Tissues-Organs Liver, Kidney, Lung, Adrenal, Skin, Brain,
Placenta, Reproductive organs
Inductors Many (PB,TCDD, EtOH)
Inhibitors Competitive Substrates, Inactivators
I CYP che metabolizzano gli xenobiotici appartengono alle
famiglie. 1-4
Un singolo CYP può metabolizzare substrati differenti e
lo stesso xenobiotico può essere metabolizzato da vari
CYP con affinità diversa.

METODI PER DETERMINARE LA PRESENZA DI CYP E LORO
ATTIVITA’ NEGLI ORGANISMI IN VIA DI SVILUPPO
A) Detection of specific enzymatic activities with model (probe)
substrates (Substances which are specifically metabolized by one CYP
leading to a easily detectable product)
CYP1A1
Ethoxyresorufin Resorufin (Fluorescent)
CYP3A4
Eritrhromycin Demethylated product + HCHO
LIMITS: Low activities (below limit of detection) Overlapping in substrate
specificity, Probe substrates suitable for adult CYPs.
A) Enzyme localization by means of immunoblotting or immunohysto-
chemical tecniques
LIMITS: Cross-reactivity of antibodies towards rat/mouse CYP(s) with more
than one human CYP.
A) Use of PCR and reverse-transcriptase (RT)-PCR to detect even small
quantities of specific mRNA
ADVANTAGES: increase in sensitivity and specificity.

FAMIGLIA 1
Isoforme CYP1A1 CYP 1A2 (CYP 1B1)
Ortologhi nei roditori e nell’uomo
Substrati: idrocarburi policiclici aromatici (IPA) bifenili
policlorurati (PCBs -procarcinogens) , ammine aromatiche
RODENTS
CYP1A1
Non espresso costitutivamente in alcun tessuto e stadio di sviluppo
prenatale
Altamente inducibile per esposizione transplacentare da induttori
noti di CYP1A1 (PAH, TCDD, PCBs)
CYP 1A2
Non espresse in tessuti prenatali
Esperrso dopo la nascita nel fegato e nel tratto GI

HUMANS
CYP1A1 e CYP1A2
Presente nel fegato di embrione/feto
Le evidenze per una sua espressione costitutiva sono comunque
contrastanti per l’impossibilità di escludere induzione
transplacentare
Per esposizione significativa della gestante a fumo di sigaretta,
caffeina, IPA, flavoni, indoli.
CYP1A1 è espresso nell’adulto in tessuti extraepatici
CYP 1A2 si esprime dopo la nascita a livelli gradualmente più elevati
fino a raggiungere i livelli tipici dell’adulto a 1 anno di vita postnatale

FAMIGLIA 2
Famiglia molto eterogenea con molto sottofamiglie diverse
Rappresenta una gran percentaule del contenuto totale del
fegato adulto .
RODENTS
Principali isoforme nel ratto CYP2A, CYP2B1/2, CYP2C11,
CYP2E1 (ortologa a quella umana)
CYP2B1: la più studiata; non espressa nei tessuti prenatali di
ratto. Espressione immediata dopo la nascita. Massimi
livelli: 24h post natali
CYP2A1: espressa subito dopo la nascita Massimi livelli: 1
settimana dopo la nascita
CYP2A2: espresss alla pubertà solo nei maschi

HUMANS
Principali isoforme nell’uomo : CYP2A6 CYP2B6 CYP2C8, 9, 19
CYP2D6 CYP2E1
CYP2E1
Substrati: etanolo, alcooli, solventi, composti a basso peso
molecolare ( i.e. benzene, nitrosoammine)
Dati contradditori sulla presenza di 2E1 cataliticamente attivo nel
fegato durante la vita prenatale ma
2E1mRNA è presente nel fegato fetale a 16 settimane di gestazione
e determinazione di attività di ossidazione di etanolo inibita da
anticorpi anti-2E1

Presenza di 2E1mRNA e della relativa attività enzimatica
nel tessuto cerebrale embrionale al 45-53° giorno di
gestazione, sovrapponibile alla organogenesi (giorni 50-
60)
Livelli massimi nel cervello : 80-84° giorno di gestazione.
I livelli di CYP2E1 nel feto possono essere indotti dal
consumo di etanolo, da inadeguqti apporti nutrizionali
(elevati intake di grassi o bassi livelli di Vit. E e A)
durante la gravidanza
La presenza di CYP2E1 nel cervello fetale (organo
bersaglio della teratogenesi indotta da etanolo è stata
considerata una delle possibili cause della FAS (Fetal
Alcohol Syndrome)

CYP2E1
Etanolo Acetaldeide, radicali liberi di O2 Radicali liberi derivati da etanolo
Effetti sulla sintesi proteica e degli acidi nucleici
Perossidazione lipidica delle membrane cerebrali,
ricche in acidi polinsaturi )
Danno ossidativo sul DNA (Single strend breaks)
Disfunzioni postnatali
del SNC

I danni nei neonati correlati al consumo di alcol durante la
gravidanza includono:
aborti spontanei
ridotta crescita fetale
anomalie nello sviluppo cranio facciale
ritardi nello sviluppo neurologico
L’ alcol altera fattori nutrizionali e ormonali cruciali nello
sviluppo cellulare negli stati embrionali
Possibile ruolo dei polimormismi degli enzimi del metabolismo
nella insorgenza della FAS ⇒ il picco ematico di alcol nel
circolo della madre dipende dalle sue capacità metaboliche e
regola la esposizione del feto.
Metabolismo diverso ⇒ diversa esposizione fetale

FAMIGLIA 3
Le principali isoforme del ratto sono 3A1 and 3A2.
Nell’uomo gli enzimi corrispondenti sono 3A4 and 3A5, che
rappresentano il 40% circa del contenuto totale di P450 epatico
nell’adulto e nell’intestino. Molti farmaci e anche molti ormoni
steroidei sono metabolizzati dalla famiglia 3A
RODENTS
Le isoforme del 3A sono assenti nelle varie fasi dello sviluppo
prenatale dei roditori e si esprimono solo dopo la nascita.

HUMAN
Il contenuto fetale di CYP 3A oscilla tra il 30 e il 100% del
contenuto di 3A tipico della vita adulta.
3A7è il solo CYP conosciuto finora che si esprime specificamente
durante il periodo perinatale. Nell’adulto è presente
nell’endometrio e nella placenta delle donne in gravidanza.
Rappresenta il CYP principale presente nei tessuti epatici umani
embrionali e fetali (30% del totale). Non è mai stato
identificato in altri organi (days 50-60).
Metabolizza sostanze esogene ma soprattutto ormoni steroidei.
Alla nascita la sua espressione cessa e viene immediatamente
rimpiazzato dal 3A4.

Rodents
L’esposizione fetale è dovuta al passaggio di
OPT attraverso la placenta, dopo
somministrazione orale alla femmina gravida
Humans
Arch. Toxicol. 76: 452-459 (2002)
OPT e i loro metaboliti presenti nel meconio
post-partum (contenuto intestinale del feto)
Esposizione prenatale dovuta a :
•absorption across the umbilical cord
•diffusion across the placenta surface
•swallowing of amniotic fluid
Environm. Health Perspec. 109: 417-420 (2001)

Nessuna informazione disponibile sul ruolo del
3A7 umano nella bioattivazione di OPT
Caratterizzazione della bioattivazione di chlorpyrifos (CPF),
parathion (PAR), malathion (MAL) e fenthion (FEN) con CYP
3A7 ricombinante
Fornire dati sul metabolismo fetale per la stima della tossicità
durante lo sviluppo neurologico consguente alla esposizione agli
OPT in utero

Intrinsic Clearence (CLi) della formazione di
oxons/sulfoxide da CYP3A4, 3A5 and 3A7
3A4
3A5
3A7
CPF
33 ± 2
18.8 ± 0.9
8.4 ± 0.2
PAR
32.7 ± 0.7
0.88 ± 0.02
6.6 ± 0.1
MAL
22.6 ± 0.6
2.1 ± 0.1
9.9 ± 0.3
FEN
19 ± 2
(49 ± 5) a
Nd
(28 ± 8) a
Nd
(2 ± 1) a
(pmol oxon • (nmolP450 •min •μM) -1 ) a = sulfoxide CLi value
Il feto può bioattivare diversi OPT in situ se esposto in utero a
questa classe di pesticidi.
Sebbene diversa in dipendenza del singolo OPT, l’efficienza della
forma fetale in vitro è solo leggeremnte più bassa ma dello stesso
ordine di grandezza del 3A4, la forma principale dell’adulto, e simile
se non più elevata del CYP3A5.

Durante la gravidanza le capacità metaboliche della madre diminuscono,
ma l’aumento di circa il 30% del peso del fegato compensa questo calo.
La placenta, placenta organo primario di comunicazione madre - feto non è una
barriera protettiva che impedisce l’esposizione del feto. Gli xenobiotici
attraversano la barriera placentare (passivamente e/o attivamente)
entrando nella circolazione fetale.
La placenta contiene enzimi del metabolismo e biotrasforma gli
xenobiotici, sia detossificandoli che bioattivandoli. Il profilo enzimatico
placentare cambia durante la gravidanza (> espressione nel 1° trimestre)
Gli enzimi placentari possono essere indotti/inibiti durante la
gravidanza per l’esposizione della madre (es:fumo di sigaretta).
Il livello di attività degli enzimi placentari è basso rispetto a quelli della
madre e del feto (ruolo nel metabolismo degli ormoni steroidei).
E’ importante considerare l’intero sistema
madre-placenta-feto

Table 3
Ontogenesis of main human alcohol metabolizing enzymes
Gene Placenta Fetal
Brain
CYP2E1
+
+
Liver
Prenatal trimester
1
?
2
+?
3
+?
Liver
Neonate
+
Liver
1 month to 1 year
ADH1 + - + + + + -
ADH2 + - - + + + +
ADH3 + - - - + + +
+: activity or protein detectable;
-: activity or protein not detectable
?: unclear results
+

Ontogenesi degli enzimi di Fase I
Fasce d’età Attività enzimatica
CYP1A2 CYP1B1 CYP2A6 CYP2B CYP2D6 CYP3A4 CYP3A7
Neonato +/- + ? ? +/- +/- +++
Prima infanzia + + + ++ + ++ +
Bambino +++ + ++ ? + +++ -
Adulto +++ + ++ + + +++ -
Attività uguale
al livello adulto 5-6 mesi ? 6-13a > I a 3-5*a 1 anno calo nel
* 20% del livello adulto a 1 mese
infanzia I anno**
** Attività alta nel feto, con un picco nella prima settimana dalla nascita. Sostituito
successivamente dal CYP3A4

Ontogenesi degli enzimi di Fase II
Fasce d’età Attività enzimatica
UGT1A1 NAT Sulfotransferasi
Neonato +/- +/- +
Prima infanzia + +/- +
Bambino + + +
Adulto + + +
Attività uguale
al livello adulto 3-6 mesi 10-12 mesi dalla nascita

L’età in cui il metabolismo del
bambino è simile all’adulto
dipende dagli enzimi coinvolti e
cambia con la sostanza