p - Benvenuti al Laboratorio di Biochimica Clinica e Biologia ...

Prefazione
Nel corso degli ultimi anni, la rapida evoluzione delle metodiche e
degli strumenti a disposizione della biologia molecolare, ha fatto sì che il
sequenziamento del DNA divenisse una tecnica sempre più efficiente e
raffinata. La prima sequenza genomica ad essere stata pubblicata, nel
1995, è stata quella di Haemophilus influenzae, un piccolo batterio gram-
negativo con un genoma di circa 1,8 milioni di basi. Successivamente, nel
1996, è stato completato il sequenziamento del primo genoma eucariotico,
quello del lievito Saccharomyces cerevisiae, che comprende circa 13
milioni di basi organizzate in sedici cromosomi.
Nel 2001 è stato raggiunto l’obiettivo primario del Progetto Genoma
Umano, vale a dire la pubblicazione della prima bozza del genoma umano,
completata in maniera definitiva nel 2003. Questo evento ha dato un
grosso impulso alla bioinformatica e alla moltiplicazione delle informazioni
biologiche accessibili in modo più o meno libero sulla rete informatica.
Due aspetti rendono peculiari e complesse le informazioni relative
alle sequenze di genomi. Il primo aspetto è che la quantità e la varietà dei
dati ottenuti da queste ricerche non hanno precedenti nella storia della
biologia e probabilmente della scienza in generale. Il secondo aspetto, non
meno importante del primo, è che si tratta di problemi nuovi, mai
affrontati prima d’ora, che richiedono lo sviluppo di nuovi strumenti di
analisi.
La bioinformatica trova dunque nell’analisi di dati genomici un’area
di indagine veramente innovativa e stimolante. Determinare la sequenza di

un genoma, infatti, non significa comprendere automaticamente il
programma genetico che essa racchiude. Anche con i più sofisticati
sistemi attualmente disponibili si riescono ad interpretare solo
parzialmente ed approssimativamente gli elementi funzionali contenuti in
un genoma e, ancor meno, si riesce a comprendere il significato
dell’informazione genomica nella sua globalità.
Il problema principale consiste, quindi, nell’identificare le sequenze
di DNA che sono trascritte in RNA messaggero (mRNA) per essere poi
tradotte in proteine. L’analisi del trascrittoma, cioè dell’insieme degli RNA
trascritti, consente di mettere a fuoco la questione indagando direttamente
a livello di RNA, con due obiettivi principali:
− identificare e caratterizzare in modo diretto i trascritti,
sequenziandone sistematicamente i cDNA corrispondenti e
superando in questo modo i limiti di affidabilità degli attuali
programmi di predizione genica;
− determinare il livello di espressione di vari trascritti in cellule
diverse e in condizioni fisiologiche e patologiche diverse.
Anche nei più semplici procarioti molti geni sono regolati, cioè si
accendono e spengono in risposta a particolari situazioni. Il profilo
trascrizionale riflette quindi lo stato funzionale di una cellula; di
conseguenza, capire in quali circostanze un gene si è espresso è spesso un
presupposto essenziale per comprenderne la funzione.
La regolazione dell’espressione genica assume un’ulteriore
dimensione negli organismi multicellulari dove tipi diversi di cellule sono
caratterizzati da profili trascrizionali diversi. Lo studio sistematico del
livello di espressione dei trascritti è quindi di grande importanza per
almeno due distinte ragioni: in primo luogo per il fatto che il genoma di
qualsiasi cellula esprime in ogni determinato momento solo una parte dei
suoi geni; in secondo luogo perché non esistono ancora dei validi metodi
1

predittivi che, in base alla sequenza genomica, siano in grado di dare
indicazioni sulle condizioni in cui un gene viene espresso.
E’ quindi importante essere consapevoli dell’esistenza di un gene,
ma è altrettanto importante capire il contesto in cui esso viene espresso.
Gli acidi nucleici offrono un metodo di indagine diretta basato sulla
specificità di ibridazione di due eliche complementari, che possono fungere
da sonde per l’identificazione e la quantificazione di specifici mRNA. I
microarray rappresentano l’applicazione più avanzata di queste tecnologie
di ibridazione, essendo in grado di ospitare molte migliaia di sonde
diverse, corrispondenti ad altrettanti geni.
Le potenzialità dei microarray sono sfruttate sia per le scienze
agricole che mediche, rimpiazzando i tradizionali saggi biologici basati su
gel, filtri e colonnine di purificazione con piccoli chip di vetro contenenti
decine di migliaia di sequenze di DNA. Questi dispositivi possono essere
paragonati a microprocessori biologici poiché abilitano l’analisi rapida e
quantitativa di pattern di espressione genica, di genotipi, di cinetica del
farmaco e di malattie.
Un tipico esperimento con i microarray si articola in cinque fasi:
1. deposizione sui vetrini dei campioni di DNA che servono come
sonde e che devono essere saldamente bloccati al supporto del
microarray;
2. preparazione dei campioni fluorescenti, tipicamente marcati
con due tipi di cianine (Cy3 e Cy5), a partire dai due campioni
di RNA che si vogliono confrontare;
3. ibridizzazione dei campioni fluorescenti sul microarray; le
sequenze nel campione fluorescente marcato si ibridizzano
con le loro complementari sul chip consentendo di generare
un segnale di fluorescenza d’intensità proporzionale al
numero di copie trascritte del gene;
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4. lettura dei valori di fluorescenza, effettuata con uno speciale
scanner a due canali che genera due immagini indipendenti
relative ai due fluorocromi usati;
5. analisi statistica e gestione dei dati.
Scopo della tesi
Scopo della presente tesi è stato mettere a confronto in maniera
critica diversi approcci statistici utilizzati per l’elaborazione dei dati di
esperimenti di microarray.
Nel primo capitolo sono illustrati i principi biologici che sono alla
base dei microarray e le tecnologie utilizzate.
Il secondo capitolo riguarda il pre-trattamento dei dati ricavati a
partire dal processo di quantizzazione dell’immagine fino alla fase di
3

normalizzazione, fondamentale per l’eliminazione degli errori sistematici
che, inevitabilmente, si abbattono sull’insieme delle osservazioni.
Il terzo capitolo presenta alcuni criteri di analisi che fanno uso di un
valore di soglia per la selezione dei geni differenzialmente espressi, ma che
non possono essere rigorosamente definiti metodi statistici.
Nel quarto capitolo viene analizzato l’approccio empirico bayesiano
di stima dei parametri come metodo di selezione e viene illustrato l’uso
della statistica B nell’ambito di un modello gerarchico per i dati di
espressione genica.
Il quinto capitolo è dedicato al metodo di analisi della varianza dei
dati o ANOVA: partendo dall’identificazione delle sorgenti di variabilità
sperimentali o intrinseche dei dati è possibile definire dei modelli che
descrivono le osservazioni in modo da separare l’effetto del fattore che si
vuole studiare dagli effetti che, invece, si vogliono eliminare.
Infine, il sesto capitolo mette a confronto le metodologie di selezione
illustrate nei capitoli precedenti avvalendosi dei dati e dei risultati di uno
studio pubblicato il cui scopo è stato quello di individuare i geni coinvolti
nei processi di crescita e invecchiamento del nematode C. Elegans,
facendo uso di microarray a cDNA. Nello stesso capitolo viene presenta
una metodica incrociata per il trattamento statistico dei dati, individuata
attraverso tre diverse sessioni di prova realizzate sui dati a disposizione.
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Capitolo 1
Origini e tecnologia dei microarray
Il primo lavoro sui microarray è stato pubblicato nel 1995 da Mark
Schena e collaboratori (Schena et al., 1995) dell’università di Stanford.
L’idea ebbe origine dalla necessità di studiare l’espressione genica
delle piante attraverso la caratterizzazione dei loro fattori di trascrizione: la
difficoltà dovuta all’assenza di adeguati strumenti di analisi fece avanzare
la proposta di sviluppare degli appositi chip di vetro come dispositivi utili
allo studio dei trascritti.
Il Davis Laboratory e il dipartimento di biochimica di Stanford
realizzarono microscopici array (microarray) contenenti sequenze geniche
di piante bloccate su un substrato di vetro; i microarray furono poi
utilizzati per misurare l’espressione genica di tali piante in esperimenti di
ibridazione con campioni di mRNA (RNA messaggero) marcati in
fluorescenza. In condizioni sperimentali appropriate, i segnali fluorescenti
sulla superficie del vetrino producono una misura dell’espressione di ogni
gene rappresentato sul microarray: dalla quantificazione di tale
fluorescenza è possibile risalire al livello di espressione di ciascun gene.
Il laboratorio di Stanford utilizzò tecniche fotolitografiche, ink jetting
e contact printing per creare i microarray, mutuando tre approcci tradotti
in realtà solo negli ultimi ventanni in ambiente microelettronico per la
costruzione di circuiti microlavorati (MEMS): si può, quindi, comprendere
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il motivo di un tale divario temporale fra la comprensione del paradigma
biologico alla base dei microarray e la loro effettiva realizzazione.
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Capitolo 1: Origini e tecnologia dei microarray
1.1 La tecnologia alla base dei microarray a DNA
La tecnologia dei microarray a DNA si basa sulla capacità di
ibridizzazione degli acidi nucleici, secondo cui due filamenti di DNA
ibridizzano tra di loro se sono complementari l’uno all’altro. Questa
complementarità riflette la regola di Watson e Crick secondo la quale
l’adenina si lega alla timina e la citosina si lega alla guanina. Uno o
entrambi i filamenti di DNA ibridizzati possono essere sostituiti con RNA
che, pur differendo per la presenza dell’uracile al posto della timina, va
incontro ugualmente al fenomeno dell’ibridizzazione.
L’ibridizzazione è stata per decenni utilizzata in biologia molecolare
come principio base di metodiche quali il Southern blotting e il Northern
blotting; i microarray a DNA sono una massiccia parallelizzazione di
queste tecniche poiché sono in grado di analizzare migliaia di geni
contemporaneamente.
Figura 1.1: Ibridazione di DNA e RNA.
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Capitolo 1: Origini e tecnologia dei microarray
Nel caso dei microarray invece di distribuire le sonde
oligonucleotidiche su un gel che contiene i campioni di RNA o DNA, esse
vengono bloccate su una superficie di vetro. Sonde diverse possono essere
posizionate alla distanza di qualche micron l’una dall’altra in modo da
disporne un numero molto elevato in pochi centimetri quadrati. Il
campione in studio viene marcato con fluorocromi e lasciato ibridizzare
con le sonde presenti sul microarray. Dopo aver lavato l’eccesso di
materiale non ibridizzato, i fluorocromi legati al campione ibridizzato
vengono eccitati con un laser di opportuna lunghezza d’onda che
scandisce la superficie del chip. Poiché la posizione delle sonde è
individuabile grazie ad uno schema a mappa cartesiana, è possibile
quantificare l’ammontare di campione ibridizzato a partire all’immagine
generata con lo scanner.
La concentrazione di un particolare mRNA è il risultato
dell’espressione del gene da cui esso viene trascritto; per questo motivo le
applicazioni che fanno uso di microarray a cDNA vengono spesso
denominate analisi dell’espressione genica.
Figura 1.2: Processo di sintesi delle proteine.
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Capitolo 1: Origini e tecnologia dei microarray
Quando si vuole evidenziare la differente risposta di un gene alla
sua esposizione a trattamenti diversi o osservare la sua espressione in
momenti diversi si dice che si sta generando un profilo di espressione.
Un’altra applicazione tipica dei microarray è la rilevazione di
polimorfismi in geni specifici: la peculiare struttura parallela dei
microarray consente di rilevare simultaneamente numerosi polimorfismi
genetici in più geni, permettendo in questo modo di fare una
genotipizzazione.
Esistono diversi tipi di microarray, catalogati, a seconda del
materiale che viene utilizzato come sonde, in:
Microarray a cDNA, con sonde di lunghezza maggiore di 200
basi ottenute per retrotrascrizione da mRNA, frammentate,
amplificate con PCR e depositate su un supporto di vetro o di
nylon;
Microarray ad oligonucleotidi, con sonde di lunghezza fra 25 e
80 basi ottenute da materiale biologico o per via artificiale e
depositate su un supporto di vetro;
Microarray ad oligonucleotidi, con sonde di lunghezza fra 25 e
30 basi sintetizzate in situ con tecniche fotolitografiche su
wafer di silicio.
Per l’analisi dell’espressione sono presenti sul mercato due
tecnologie dominanti: Affymetrix, Inc. GeneChip e quella degli “spotted”
array a cDNA.
1.1.1 Tecnologia Affymetrix GeneChip
Affymetrix utilizza attrezzature simili a quelle che servono a
realizzare i chip di silicio per i computer, che consentono di avere una
produzione massiva di chip ad un costo ragionevole. Così come i chip per
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Capitolo 1: Origini e tecnologia dei microarray
computer sono fatti utilizzando maschere che controllano il processo di
deposizione e rimozione del silicio dalla superficie del chip, analogamente
Affymertix usa maschere di controllo della sintesi degli oligonucleotidi sul
microarray. Il risultato di questo processo è la produzione di alcune
centinaia di migliaia di oligonucleotidi differenti, ciascuno dei quali
presente in milioni di copie sul vetrino.
Figura 1.3: Microarray Affymetrix.
Per l’analisi di espressione sono utilizzati gruppi di sonde di almeno
40 oligonucleotidi
per gene; Affymetrix ha selezionato, per ogni gene, una
regione con la minor omologia con altri geni. A partire da questa regione
vengono disegnati da 11 a 20 oligonucleotidi rappresentativi del perfect
match (PM), cioè della perfetta complementarità con l’mRNA bersaglio, e
11-20 oligonucleotidi identici ai precedenti tranne che per il nucleotide
centrale, utili per rilevare il mismatch (MM), cioè la non perfetta
complementarità.
Affymetrix afferma
che gli oligonucleotidi MM sono capaci di mettere
in evidenza
la presenza di segnali aspecifici permettendo di rilevare con
maggior sicurezza i segnali deboli.
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Capitolo 1: Origini e tecnologia dei microarray
L’ibridizzazione di ogni oligonucleotide con il proprio complementare
dipende dalla sequenza specifica; poiché si è interessati alla misura del
cambiamento di espressione di un gene è necessario ottenere un dato
cumulativo da tutte le sonde che identificano quel gene. Affymetrix calcola
questo dato cumulativo facendo una media della differenza fra sonde PM e
MM dello stesso gene:
AvgDiff
=
∑N
( PM − MM )
dove N è il numero di sequenze specifiche che identificano un gene. Se il
numero che si ottiene da questo calcolo è negativo o molto piccolo significa
che il cDNA bersaglio è assente o che si è verificata un’ibridizzazione non
specifica.
Figura 1.4: Il principio della tecnologia Affymetrix
N
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Capitolo 1: Origini e tecnologia dei microarray
Tutti gli algoritmi che riguardano la rilevazione di ibridizzazione sul chip,
la generazione del dato cumulativo e la sua elaborazione sono protetti
dalla tecnologia proprietaria Affymetrix che, per altro, si riserva di
modificarli senza renderli noti.
Le fasi di un esperimento di analisi dell’espressione genica che fa
uso di chip Affymetrix sono:
Estrazione dell’RNA totale dal campione;
Separazione dell’mRNA dall’RNA totale utilizzando colonnine
con code di poly-T;
Conversione dell’mRNA in cDNA utilizzando la trascrittasi
inversa e i primer poly-T;
Amplificazione del cDNA utilizzando T7 RNA polimerasi in
presenza di biotina-UTP e biotina-CTP in modo da ottenere da
50 a 100 copie di cDNA marcato;
Incubazione del cDNA a 94°C in un buffer di frammentazione
per produrre frammenti di lunghezza tra 35 e 200 nucleotidi;
Ibridizzazione sul chip e successivi lavaggi;
Marcatura del cDNA ibridizzato con Streptavin-Phycoerythrin
e successivi lavaggi;
Acquisizione dell’immagine del chip con scanner laser;
Analisi dell’immagine per l’estrapolazione dei dati.
1.1.2 “Spotted” array
L’altra tecnologia largamente utilizzata per produrre microarray è
quella degli “spotted” array; in questo caso viene utilizzato un robot che
preleva una piccola quantità di sonda in soluzione da una piastra da
microtitolazione e la deposita sulla superficie del microarray. La sonda
può essere cDNA, prodotto mediante PCR od oligonucleotidi; ogni sonda è
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Capitolo 1: Origini e tecnologia dei microarray
complementare ad un unico gene. Esistono diversi metodi per fissare le
sonde alla superficie del vetrino; il più utilizzato consiste nel ricoprire il
supporto con uno strato di poli-lisina che determina la formazione di
legami aspecifici con le sonde.
Il processo di “spotting” di questi microarray può essere
schematizzato come segue:
Copertura del vetrino con poli-lisina;
Preparazione delle sonde in una piastra da microtitolazione;
Programmazione del robot per le operazioni di “spotting”
mediante pin e ugelli ink-jet;
Deposizione delle sonde in blocchi ordinati seguendo la
mappa programmata per stabilire la posizione e la
concentrazione di ogni spot;
Saturazione delle aree non stampate con anidride succinica
per sfavorire legami aspecifici fra il cDNA bersaglio e il
supporto;
Denaturazione delle sonde ad alta temperatura in modo che
siano a singolo filamento.
Una volta realizzato il microarray si può procedere alla preparazione
del campione e alla sua ibridizzazione come segue:
Estrazione dell’RNA totale dalle cellule;
Isolamento (opzionale) dell’mRNA grazie alla presenza delle
code di poly-A;
Retrotrascrizione dell’RNA in cDNA in presenza di amino-allil-
dUTP (AA-dUTP);
Marcatura dei filamenti di cDNA con i fluorocromi Cy3 e Cy5,
che si legano all’AA-dUTP;
Ibridizzazione del cDNA marcato con le sequenze presenti sul
vetrino;
Asportazione mediante lavaggi del materiale non ibridizzato;
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Capitolo 1: Origini e tecnologia dei microarray
Acquisizione dell’immagine del vetrino con scanner laser;
Analisi dell’immagine per l’estrapolazione dei dati.
Figura 1.5: Processo di spotting dei microarray e ibridazione del campione.
Rispetto alla tecnologia Affymetrix, negli “spotted” array l’irregolarità
nell’operazione di deposizione delle sonde si può ripercuotere sulla
corretta estrazione del dato. Inoltre, la presenza di sonde PM e MM sui
vetrini Affymetrix, conferisce a questi microarray una maggiore affidabilità
nella rilevazione di segnali di ibridizzazione aspecifica.
Il vantaggio principale degli “spotted” array, invece, consiste nella
possibilità che ogni laboratorio ha di disegnare le sonde da utilizzare nello
“spotting” e nella maggiore flessibilità di questa tecnologia rispetto ad
Affymetrix, i cui dati spesso non sono analizzabili con gli innumerevoli
software per l’elaborazione di dati disponibili.
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Capitolo 1: Origini e tecnologia dei microarray
1.2 Caratteristiche di un microarray
Un microarray può essere definito come una matrice ordinata di
elementi microscopici su un substrato planare che consente il legame
specifico di geni o di prodotti di geni. La parola microarray deriva dal greco
mikro, che significa piccolo, e dal francese arayer, che significa arrangiare;
i microarray, anche conosciuti come biochip, DNA chip e gene chip,
contengono, infatti, collezioni di microscopici elementi, spot, disposti in
righe e colonne.
Ogni riga di elementi deve essere disposta sul substrato lungo una
linea orizzontale e ogni colonna deve formare una linea verticale
perpendicolare alla riga. Gli elementi ordinati devono avere uguale
dimensione, uniforme spaziatura e posizione unica sul substrato (vedi
figura 1.6).
Figura 1.6: Microarray ordinato.
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Capitolo 1: Origini e tecnologia dei microarray
Su un singolo substrato planare possono essere combinati diversi
microarray e ciò è utile sia dal punto di vista dell’analisi successiva, sia
per i processi di realizzazione in parallelo di tali dispositivi.
L’ordinamento in righe e colonne degli elementi è un grande
vantaggio per l’analisi dei microarray, poiché questo tipo di disposizione
consente una rapida deposizione, individuazione e quantificazione degli
spot.
La disposizione degli spot in righe e colonne può essere ottenuta
utilizzando tecnologie standard di motion control, come attuatori lineari ed
encoder, e ciò permette un abbattimento dei costi di produzione, in quanto
i microarray possono essere stampati in modalità rapida e completamente
automatizzata, con una velocità e una precisione che non sarebbero
possibili con formati irregolari.
La regolarità della disposizione degli spot, inoltre, favorisce il
processo di quantificazione, poiché i software di elaborazione fanno uso di
griglie ordinate per l’estrazione del dato numerico e di una “mappa
cartesiana” per assegnare allo spot l’identificativo del gene che
rappresenta.
Figura 1.7: Printer-head di un robot per spotting di microarray e camera di
printing.
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Capitolo 1: Origini e tecnologia dei microarray
Un tipico spot contiene approssimativamente 10 9 molecole bloccate
sul substrato di vetro. Queste molecole sonda possono essere DNA
genomico, cDNA, mRNA, proteine, tessuti o altri tipi di molecole che
necessitano di un’analisi quantitativa. Oligonucleotidi sintetici, cioè
piccole molecole di DNA a singolo filamento sintetizzate chimicamente
possono costituire un tipo eccellente di sonda.
I vantaggi di avere elementi microscopici sono:
alta densità degli spot (> 5000 elementi/cm 2 );
rapida cinetica di reazione;
possibilità di analizzare interi genomi su un singolo vetrino.
Gli esperimenti che esaminano tutti i geni di un genoma su un
singolo substrato procurano una visione globale del fenomeno biologico,
impossibile da ottenere con tecnologie limitate a sottoinsiemi di geni.
Per substrato si intende un supporto parallelo e piatto sul quale
viene configurato un microarray. Uno dei materiali più utilizzati è il vetro
per la sua capacità ideale di consentire il legame con le molecole sonda,
ma possono essere utilizzati anche materiali plastici, silicio, filtri di nylon
e nitrocellulosa.
Per essere utilizzato per la costruzione di un microarray il substrato
deve essere planare: tutti i materiali planari sono solidi, ma non tutti
quelli solidi sono planari.
Il vantaggio di avere un substrato piatto su tutta la superficie si
ripercuote sull’automatizzazione della procedura di stampa mediante pin e
ugelli ink-jet o sulla precisione delle fotomaschere per la fotolitografia. I
materiali planari consentono anche un accurato “scanning” del
microarray, grazie alla precisa individuazione della distanza fra gli
elementi ottici dello scanner e la superficie del microarray (distanza del
fuoco ottico).
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Capitolo 1: Origini e tecnologia dei microarray
I materiali planari, inoltre, tendono ad essere impermeabili ai
liquidi, consentono di realizzare piccoli spot e di minimizzare il volume di
reazione durante l’ibridizzazione.
1.3 Applicazioni dei microarray
I microarray si stanno rivelando degli strumenti efficaci in differenti
campi di indagine. I primi esperimenti hanno fatto uso di questi supporti
per verificare ipotesi formulate in studi precedenti.
Ultimamente la tendenza si è invertita e i microarray vengono
utilizzati come dispositivi di indagine primaria, capaci di fornire risposte
robuste, ma anche di porre nuovi quesiti al ricercatore.
Da questo punto di vista il grosso vantaggio dei microarray, oltre
all’estesa potenza di calcolo parallelo, sta nella possibilità di poter
coinvolgere nella reazione di ibridizzazione molti geni sullo stesso
supporto. Questo dà un contributo alla possibilità di ricreare pathway di
co-regolazione e di analizzare le inter-relazioni tra geni diversi.
microarray.
Di seguito sono descritti alcuni esempi dei settori di applicazione dei
1.3.1 Tassonomia di tessuti
Cellule appartenenti allo stesso organismo possiedono lo stesso
genoma anche se differiscono per forma e funzione. La differenziazione di
ogni cellula in un tipo o in un altro si realizza grazie ad una
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Capitolo 1: Origini e tecnologia dei microarray
programmazione genetica ben definita che modifica nel corso dello
sviluppo l’insieme dei geni espressi.
Esaminando il pattern di espressione genica su scala genomica con i
microarray è possibile catalogare i differenti tessuti in modo da costituire
un database di espressione. Uno degli scopi degli studi di questo tipo è la
comprensione dei meccanismi che stanno alla base dello sviluppo e della
differenziazione cellulare, che, una volta alterati, possono determinare
l’insorgenza di malattie.
1.3.2 Identificazione delle basi molecolari delle malattie
Conoscere le basi molecolari di una malattia può aiutare a
comprenderne la trasmissione genetica, la modalità d’insorgenza e la
prognosi al fine di poter fare una diagnosi precoce o di agire con terapie
mirate. Il confronto dell’espressione genica tra tessuti sani e malati
mediante microarray può essere un valido strumento per l’identificazione
di quei geni che sono coinvolti nello sviluppo di una patologia, o come geni
causativi o semplicemente come fattori di rischio predisponenti.
Diversi gruppi di ricerca stanno facendo uso dei microarray per
creare una carta d’identità dettagliata dei vari tipi di tumore al fine di
costituire una vasta raccolta di profili di espressione genica da utilizzare a
fini diagnostici.
Si possono ricordare in questo ambito lo studio di Ross (Ross et al.,
2000) su sessanta linee cellulari differenti di cancro, denominato NCI60, o
gli studi estensivi sui linfomi a cellule B giganti di Alizadeh (Alizade et al.
2000), entrambi dell’Università di Stanford.
Riuscire ad effettuare una classificazione così dettagliata si riflette
sulla possibilità di riconoscere la malattia fin dai primi stadi di sviluppo,
in modo da poter programmare terapie più mirate.
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Capitolo 1: Origini e tecnologia dei microarray
1.3.3 Analisi del meccanismo di azione dei farmaci
I farmaci funzionano legandosi a specifiche molecole bersaglio e il
risultato di questa interazione può essere l’alterazione dell’espressione di
geni. E’ possibile utilizzare i microarray per individuare quei geni la cui
espressione viene modificata dall’impiego di farmaci, sia in studi in vitro su
linee cellulari trattate a confronto con le stesse cellule non trattate, sia in
trial clinici in cui si generano profili di espressione in pazienti sottoposti a
trattamento farmacologico. Il profilo di espressione in seguito a
trattamento farmacologico può essere utile anche per identificare
l’alterazione nell’espressione di geni che provocano effetti collaterali.
Un approccio di questo tipo può ridurre i costi di sviluppo dei
farmaci e produrre medicine più efficaci e con meno effetti collaterali.
Un’altra applicazione dei microarray in questo ambito è la
genotipizzazione dei pazienti, in modo da suddividere la popolazione in
soggetti farmaco-sensibili e farmaco-resistenti allo scopo di definire una
terapia più mirata.
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Capitolo 2
I primi passi del trattamento del dato e
le principali tecniche di normalizzazione
La facilità nel quantificare i dati provenienti da un microarray è fra
le principali caratteristiche degli esperimenti che fanno uso di questi
supporti e la rapidità con la quale questo processo viene eseguito consente
di rendere minimo il tempo che intercorre fra la realizzazione
dell’esperimento e l’ottenimento della risposta che si sta cercando.
Analisi
tradizionale
Esperimento
Dati
Analisi con
microarray
Dati
Esperimento
Tuttavia queste caratteristiche non devono portare alla conclusione
che le metodiche di estrazione e di trattamento del dato siano impostate
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Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
su basi matematiche semplici; in realtà, la teoria che è alla base della
quantizzazione dei segnali acquisiti, del calcolo del rapporto delle loro
intensità, della normalizzazione del dato e dell’estrazione del risultato è
estremamente sofisticata e pone pesanti problemi soprattutto dal punto di
vista dell’analisi statistica di dati generati con esperimenti simultanei su
migliaia di geni.
Prima ancora di occuparsi di analisi statistica, è necessario
comprendere quali siano i passi che portano ad ottenere un dato “ripulito”
dagli errori generati dallo stesso esperimento e dal processo di estrazione.
La mancata eliminazione di questi errori può rendere inconsistente
l’analisi ed invalidare l’intero esperimento.
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Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
2.1 Diagramma del trattamento dei dati
L’utilizzo sempre più diffuso dei microarray ha portato alla
formulazione di un vero e proprio diagramma di flusso universalmente
riconosciuto da chi lavora in questo settore, i cui passi consentono
operativamente di eliminare gli errori sistematici e di preparare il dato per
l’analisi conclusiva. Un esempio estensivo di tale diagramma è riportato in
figura 2.1.
Stima dei
parametri
Obiettivo dell’esperimento
Esperimento con microarray
Test delle
ipotesi
Disegno sperimentale
Analisi dell’immagine
Normalizzazione
Verifica biologica ed
interpretazione del risultato
Immagine 16-bit
formatoTIFF
Clustering Discriminazione
Figura 2.1: Diagramma di flusso operativo in un esperimento di microarray.
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Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
2.2 Il processo di quantizzazione del dato
Gli scanner per microarray acquisiscono i dati di intensità di
fluorescenza sottoforma di immagini in formato TIFF; l’immagine TIFF è
una mappa d’intensità in due dimensioni della superficie del microarray e
i segnali di fluorescenza sono immagazzinati nei suoi pixel. Ogni spot del
microarray, che spesso individua un unico gene, è formato da diversi pixel
ognuno dei quali contiene un’informazione quantitativa sullo spot.
Laser Fotomoltiplicatore conversione
Fluorocromo Fotoni Elettro Segnale
eccitazione amplificazione Filtraggio
Figura 2.2: Catena di generazione del segnale per eccitazione del fluorocromo con scanner
laser.
L’analisi dell’immagine di un microarray può essere suddivisa in
quattro fasi:
• posizionamento della griglia (gridding) dell’immagine;
• segmentazione;
• estrazione delle intensità o quantizzazione;
• correzione del background.
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Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
2.2.1 “Gridding” dell’immagine
Dopo aver portato a termine il protocollo di ibridizzazione dei
campioni sul microarray e aver acquisito l’immagine con lo scanner laser è
necessario identificare la posizione di ogni spot sul supporto. Ciò avviene
grazie all’allineamento sull’immagine di una griglia che viene generalmente
fornita dal costruttore del microarray. Ogni cerchietto di questa griglia
identifica l’ideale posizione dello spot, secondo quelle che sono le
specifiche costruttive del microarray, e fornisce all’analista diverse
informazioni sullo spot in esame grazie ad un file allegato che contiene, fra
tante altre informazioni, anche il nome del gene corrispondente ad ogni
spot e i suoi codici d’identificazione nelle banche dati genomiche.
Il corretto posizionamento della griglia permette di ricavare un dato
consistente sugli spot; per questo motivo, spesse volte è necessario
controllare l’allineamento spot a spot e intervenire manualmente su quegli
spot che non vengono esattamente centrati o delimitati dalla griglia.
E’ fondamentale, come è facile intuire, che il processo di deposizione
delle sonde sul supporto avvenga secondo un ben preciso schema di righe
e colonne, in modo da agevolare l’identificazione degli spot.
2.2.2 Segmentazione
Una volta che gli spot sono stati identificati, è necessario separare il
contributo del segnale da quello del background; per questo motivo deve
essere riconosciuta la forma di ogni spot attraverso una “spot mask”.
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Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
Background
Segnale
Figura 2.3: Separazione del background dal segnale attraverso una “spot mask”.
Generalmente si assume che gli spot abbiano forma circolare di
diametro costante; coerentemente con questa ipotesi si identifica come
segnale tutto ciò che cade all’interno del cerchio e come background tutto
quello che è all’esterno, operando una segmentazione spaziale.
Figura 2.4: Segmentazione spaziale dello spot con griglia di forma prefissata.
Questa semplice assunzione viene raramente rispecchiata dagli spot
sul vetrino e ciò è riconducibile solitamente ad errori nella fase di
deposizione delle sonde. Per questo motivo molti software di analisi
dell’immagine includono la possibilità di fare una segmentazione per
intensità dei pixel: in questo procedimento si sfruttano i valori di intensità
dei pixel per delimitare l’area da attribuire al segnale, utilizzando algoritmi
di “Seeded Region Growing” (SRG) comuni a molti software di
manipolazione di immagini.
26

Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
Figura 2.5: Segmentazione per intensità con algoritmo SRG.
2.2.3 Estrazione delle intensità di segnale e di background
Il processo che consente di passare dall’insieme delle informazioni
relative ad uno spot al suo valore numerico, rappresentativo della
concentrazione di mRNA di quel gene nel campione, prende il nome di
quantizzazione o quantificazione.
La quantizzazione assoluta porta ad ottenere un dato cumulativo
dell’intensità dello spot su un canale (ad esempio il rosso) senza metterlo
in relazione con quello ottenuto sull’altro canale (il verde); la
quantizzazione relativa, invece, ricava il rapporto delle intensità assolute
sui due canali, detto fold change, e serve ad avere informazioni sul livello
di espressione in un canale rispetto all’altro.
I valori di segnale e di background possono essere calcolati in diversi
modi, fra i quali il calcolo della media e della mediana sono fra i più
comuni.
Il calcolo della media del segnale o “average intensity signal”
consiste nel rapporto fra la somma delle intensità dei pixel identificati
come segnale e il numero totale dei pixel che appartengono alla regione di
demarcazione dello spot. Un calcolo analogo può essere fatto per la media
del background prendendo in considerazione solo i pixel identificati come
rumore di fondo dalla segmentazione.
Per calcolare la mediana, invece, si ordinano per valore ascendente o
discendente tutti i valori di intensità dei pixel della zona di demarcazione e
si prende l’intensità del pixel che si posiziona a metà dell’ordinamento
27

Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
come rappresentativa dell’intera zona. Il valore di mediana di uno spot è
generalmente più robusto di quello di media e ciò è dovuto al fatto che il
suo procedimento di calcolo scarta in maniera automatica quei pixel che
vengono definiti contaminanti, cioè quelli che non sarebbero dovuti
entrare a far parte della zona di demarcazione che si sta considerando.
Nel calcolo della media viene assegnato uno stesso peso sia a pixel
buoni che a pixel che dovrebbero essere scartati attraverso la
segmentazione; per questo motivo la media dei pixel si configura come un
parametro poco affidabile per stabilire il valore di intensità rappresentativo
dello spot. Una verifica sulla eventuale discrepanza fra i valori di media e
di mediana è un buon metodo per stabilire se la fase di segmentazione è
stata condotta correttamente o per valutare i limiti del programma che si
sta utilizzando.
Dal punto di vista del formato del dato, ogni canale viene
generalmente acquisito in immagini a 16 bit, cioè è possibile discriminare
65535 livelli d’intensità di segnale. Come regola generale i segnali che
arrivano a livello 50000 vengono considerati come limite superiore per una
rilevazione del dato affidabile; al di sopra di questo livello il segnale inizia
ad andare in saturazione e perciò può essere meno attendibile.
In realtà sarebbe consigliabile mandare in saturazione il minor
numero di spot e ciò può essere fatto modulando opportunamente il
guadagno del tubo fotomoltiplicatore dello scanner in fase di acquisizione
dell’immagine. E’ anche vero che mantenere un basso guadagno non
permette di sfruttare a pieno la dinamica dei fluorocromi e impedisce la
rilevazione di segnali deboli che spesso corrispondono a trascritti rari
difficilmente identificabili.
motivi.
2.2.4 Correzione del background
La presenza di un segnale di fondo sul microarray è dovuta a diversi
28

Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
Può accadere, per esempio, che parte della soluzione contenente le
sonde da depositare sul vetrino abbia contaminato aree esterne allo spot
consentendo, in questo modo, l’ibridizzazione del campione marcato anche
dove non dovrebbe avvenire
a)
Background alto
Segnale debole
c) d)
Figura 2.6: a):Microarray con background alto dovuto ad ibridizzazione fuori dallo
spot.
b) Microarray con “comete” dovute a spotting non preciso.
c) Microarray con depositi irregolari di soluzione buffer di spotting.
d) Microarray con spot sovrapposti e di diametro irregolare.
b)
29

Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
Un esempio tipico è la rilevazione, in fase di scansione del
microarray, delle cosiddette “comete”, che possono essere osservate in
figura 2.6 a e b. Nella stessa figura si osservano altri esempi di problemi
riconducibili alla fase di “spotting”.
Un altro fattore che contribuisce alla generazione di rumore è
l’instaurarsi di legami aspecifici fra il supporto del microarray e il
campione ibridizzato: in questo caso può essere utile sottoporre il vetrino
ad un procedimento che prende il nome di pre-ibridizzazione, allo scopo di
saturare questi legami e non renderli disponibili in fase di ibridizzazione
del campione marcato.
Può ancora succedere che i reagenti utilizzati nella soluzione di
“spotting” abbiano fluorescenza propria oppure siano riflettenti: anche in
questo caso è possibile scambiare per segnale ciò che in realtà è
esclusivamente background.
Questi valori possono essere esclusi dall’insieme di dati che vengono
in prima istanza considerati come segnale attraverso la correzione o
sottrazione del background.
Nella sottrazione locale del background viene identificato un intorno
sufficientemente ampio centrato sullo spot e viene considerata la media o
la mediana del pixel esterni allo spot ma interni alla zona di demarcazione
come valore locale del rumore; questo valore viene poi sottratto alla media
o mediana dello spot canale a canale.
Figura 2.7: Intorno dello spot per il calcolo del background in diversi software di
analisi.
30

Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
Con questa operazione è possibile gestire la variabilità locale del
rumore, tuttavia non è un procedimento privo di rischi; si pensi, per
esempio, a spot con segnale debole: in questo caso la sottrazione di un
livello locale di background che per qualche motivo risulti particolarmente
alto porterebbe all’esclusione dello spot dall’insieme di quelli considerati
accettabili. Inoltre è poco agevole fare un calcolo del genere quando il
microarray è particolarmente denso, per evidenti difficoltà che si creano
nell’identificare la zona sulla quale impostare il valore di correzione.
Per ovviare a questi inconvenienti l’alternativa possibile è calcolare il
valore di background su sotto-griglie del microarray; in questo modo si
conduce il calcolo su un ambito meno locale e si può riuscire a ricavare
una stima del rumore anche su array particolarmente densi di spot.
Figura 2.8: Sotto-griglia dell’array sulla quale calcolare il background.
Una via di mezzo fra i due procedimenti appena illustrati fa uso di
un’area centrata sullo spot di diametro tale da includere un gruppo di
spot. Lo scopo di questo procedimento è quello di mantenere il computo
del background su un ambito abbastanza locale ma non troppo ristretto in
modo da poter catturare anche la sua variabilità; grazie all’ampliamento
dell’intorno è possibile applicare questo metodo anche su array densi.
31

Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
Figura 2.9: Calcolo del background su un intorno ampio dello spot.
Esistono alcuni metodi di correzione che fanno uso di un fattore
correttivo calcolato su aree nelle quali non sono presenti spot. Lo scopo è
quello di stimare l’effetto dovuto all’interazione del substrato presente
sulla superficie del vetrino con il campione marcato. Questo metodo,
tuttavia, non è completamente affidabile in quando queste aree non sono
rappresentative di ciò che realmente avviene dove sono presenti le sonde.
Per questo motivo è più utile ricavare il valore di background su aree
specifiche sulle quali vengono appositamente depositate sonde di
controllo, che si sa non essere complementari alle sequenze del campione
in esame.
Figura 2.10: Calcolo del background su aree vuote del microarray.
32

Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
E’ già stato illustrato l’effetto che produce la sottrazione del
background su un segnale debole. Ciò deve invitare ad utilizzare cautela
nell’applicazione di questo procedimento. Non fare la correzione, tuttavia,
può corrompere i dati, dal momento che il contributo del rumore può
modificare il dato relativo all’intensità dello spot generando falsi positivi o
falsi negativi nella rilevazione dei geni differenzialmente espressi.
L’approccio migliore consiste nel fare una correzione con un fattore che
risulti da procedimenti globali, in modo da contenere al minimo gli errori
introdotti da questa operazione.
Il parametro universalmente accettato per la misurazione degli
effetti del rumore su un segnale è il rapporto segnale rumore (Signal to
Noise Ratio – SNR), definito generalmente come:
SNR = Mediana del segnale / STD del rumore
dove al denominatore vi è la deviazione standard (STD) del rumore.
Molti software di analisi di microarray utilizzano il valore di SNR
ricavato per ogni spot per escludere dal processo di normalizzazione quei
dati che hanno un rumore troppo alto: in tal caso viene fissata una soglia
per l’SNR, tipicamente pari a 3, in modo cha agli spot con un valore di
SNR più alto venga applicata una “flag”, ossia un punteggio, che li esclude
automaticamente dall’insieme degli spot utilizzati per la normalizzazione.
Sempre grazie all’applicazione di flag, che vengono assegnate in base
alla rispondenza delle caratteristiche dello spot a quelle specificate
dall’analista, è possibile escludere spot con forme irregolari, o con
percentuale di pixel saturati superiore ad una soglia definita come
accettabile. La selezione può escludere anche spot che vengono inseriti nel
microarray esclusivamente per facilitare l’operazione di allineamento della
griglia, oppure quegli spot che vengono lasciati appositamente vuoti. Si
effettua in questo modo un processo di controllo degli spot che prepara il
dato alla successiva operazione di normalizzazione.
33

Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
2.3 Normalizzazione dei dati
Molte variabili possono influire e distorcere i risultati di un
esperimento di microarray:
disomogeneità del processo di deposizione delle sonde,
quantità iniziali diverse di RNA,
diversa efficienza di incorporazione dei due fluorocromi
durante il procedimento di marcatura dei campioni,
disomogeneità di ibridizzazione sul vetrino,
diversa efficienza di emissione dei due fluorocromi,
diversa efficienza dello scanner nel leggere i due canali di
fluorescenza.
Tutti questi fattori possono influenzare pesantemente i dati
causando spostamenti nelle distribuzioni dei rapporti delle intensità dei
due fluorofori. E’, quindi, necessaria, prima di ogni tipo di analisi
statistica, una normalizzazione dei dati atta ad eliminare distorsioni
sistematiche. Un esempio di questo tipo di distorsioni si può vedere in
figura 2.11 in cui è mostrato un grafico della dispersione dei dati, detto
“scatterplot” dove sono messe a confronto le intensità dei segnali su due
microarray ibridizzati con lo stesso RNA.
34

Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
Figura 2.11: Scatterplot dello stesso mRNA ibridizzato su due microarray diversi.
Idealmente, le intensità relative ad ogni segnale dovrebbero
coincidere sui due microarray e i punti che individuano i valori di tali
intensità sullo scatterplot si dovrebbero posizionare sulla diagonale:
quando ciò non accade significa che sono presenti errori sistematici, se la
deviazione della diagonale è tutta dalla stessa parte, come in questo
esempio, oppure errori casuali (random), quando i punti si allontanano
dalla diagonale in entrambe le direzioni.
Questo errore diventa ancora più evidente quando si mettono a
confronto le due intensità di segnale ottenute da un unico microarray su
cui è stato ibridizzato lo stesso materiale marcato con entrambi i
fluorocromi. Questo grafico viene denominato MA e presenta in ascissa il
logaritmo della media geometrica delle due intensità (A), mentre in
ordinata vi è il logaritmo del rapporto dei due canali (M).
35

Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
A = ½ log (R*G)
M = log (R/G)
Figura 2.12: Grafico MA di un array su cui è stato ibridizzato lo stesso RNA
marcato con entrambi i fluorocromi
Il processo di normalizzazione è necessario anche per confrontare
dati provenienti da repliche dello stesso materiale. Solitamente in un
esperimento di microarray le repliche fra vetrini possono essere di due
tipi:
repliche sperimentali: quando l’mRNA sui due vetrini proviene
dalla stessa estrazione;
repliche biologiche: quando l’mRNA proviene da campioni
biologici dello stesso tipo ma distinti (ad esempio individui
diversi).
L’utilizzo di repliche biologiche consente di stimare l’errore random e
maggiore è il numero delle repliche meglio si riesce a dare una stima della
distribuzione di questo errore e del suo peso sui dati. Le repliche
sperimentali servono, invece, ad ottenere una stima migliore
dell’espressione di un gene sulla base della corrispondenza dei dati relativi
ai suoi spot su diversi microarray.
36

Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
E’ necessario che la normalizzazione tenga conto del disegno
dell’esperimento: la sua scorretta applicazione, infatti, invalida
completamente il dato e, di conseguenza, i risultati.
Si parla di normalizzazione within-array quando la tecnica scelta
viene applicata ad ogni vetrino singolarmente, nell’intento di correggere gli
errori sistematici su ogni array preso come unità a sé e
indipendentemente dal disegno sperimentale, mentre si fa una
normalizzazione between-arrays quando si cerca di ottenere un dato
uniforme considerando sia il disegno sperimentale applicato che il tipo di
campione biologico.
In ciascuna di queste situazioni è necessario scegliere un gruppo di
geni da utilizzare per la normalizzazione. Questi possono essere:
tutti i geni sull’array. Quasi tutti i geni sull’array possono
essere utilizzati per la normalizzazione quando è possibile
prevedere che solo una porzione relativamente piccola di geni
varierà significativamente in espressione fra i due campioni di
mRNA.
geni espressi in maniera costante. Invece di utilizzare tutti i
geni per la normalizzazione si può scegliere di usare un
piccolo sottoinsieme rappresentato dai geni housekeeping,
cioè quei geni che mantengono lo stesso livello di espressione
in condizioni sperimentali differenti. Non è facile identificare
questo sottinsieme, ma spesso è possibile trovare un gruppo
di geni che si comportano da housekeeping nelle condizioni
sperimentali considerate. Una limitazione nell’utilizzo dei geni
housekeeping è che essi tendono ad essere espressi molto e
quindi potrebbero non essere rappresentativi di altri geni di
interesse.
37

Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
controlli. Un’alternativa alla normalizzazione con geni
housekeeping è l’utilizzo di controlli spiked o di una serie di
sequenze di controllo a concentrazione scalare (titration). Nel
metodo dei controlli spiked, sequenze sintetiche di DNA o
sequenze selezionate da organismi differenti da quello studiato
sono depositate sull’array e incluse nei due differenti campioni
di mRNA in esame con identica concentrazione. Queste
sequenze di controllo possono essere utilizzate per la
normalizzazione perché daranno origine a segnali di uguale
intensità nei due canali. Nell’approccio della serie titration, si
utilizzano spot dello stesso gene a concentrazione scalare, con
uguale intensità sui due canali nel range considerato, in modo
da monitorare l’amplificazione lineare della risposta in
intensità rispetto alla concentrazione.
2.4 Normalizzazione within-array
In questo caso la normalizzazione viene applicata separatamente su
ogni array. Gli scopi principali sono la correzione del colore e dei problemi
dovuti ad un’eventuale deposizione scorretta delle sonde.
2.4.1 Normalizzazione globale
I metodi globali di normalizzazione assumono che le intensità dei
due fluorocromi siano proporzionali, cioè che valga la relazione R =K*G,
dove con R si indica il canale rosso, con G il canale verde e K è la costante
di proporzionalità. In funzione di questa legge e nell’ipotesi che la maggior
38

Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
parte dei geni non si esprima differenzialmente, la normalizzazione globale
sposta il logaritmo del rapporto dei due canali sullo zero, operando quello
che viene tipicamente denominato “centraggio” della distribuzione dei dati:
normalizzazione
log2 R/G - - - - - - - - - - - - - -> log2 R/G – c = log2 R/(KG)
dove c = log2 K.
Una particolare scelta per il parametro c è la mediana o, in
alternativa, la media dei rapporti logaritmici delle intensità.
I metodi di normalizzazione globale non hanno un effetto intensità-
dipendente sui dati e, quindi, non riescono a correggere le tendenze non
lineari dei dati dovute al diverso comportamento che i fluorocromi
presentano in emissione
b)
Figura 2.13:
a) Distribuzione dei dati prima della
normalizzazione (in rosso) e dopo
lo spostamento della media (in
blu).
b) Scatterplot dei dati prima della
normalizzazione (in rosso) e dopo
la normalizzazione (in blu).
39

Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
2.4.2 Normalizzazione intensità-dipendente
In molti casi gli errori sistematici riconducibili alla diversa efficienza
di emissione dei fluorocromi sono dipendenti dall’intensità del segnale,
come può essere evidenziato attraverso il grafico MA dei dati. In questi
casi si possono correggere le distorsioni attraverso tre metodi:
interpolazione di curve e correzione,
normalizzazione LOESS o LOWESS,
normalizzazione a tratti.
2.4.2.1 Interpolazione di curve e correzione
La normalizzazione del colore può essere realizzata attraverso
l’interpolazione di una curva sull’insieme dei dati dell’esperimento, da
utilizzare successivamente per apporre le dovute correzioni. Visualizzando
i dati su uno “scatterplot” che presenta in ascissa il log(R) e in ordinata il
log(G/R), si può osservare che la distorsione dei dati introdotta dai
fluorocromi ha generalmente un andamento esponenziale, come si può
osservare in figura 2.14. Sulla base di questa osservazione si possono
utilizzare i dati stessi per calcolare i parametri della funzione esponenziale
che li interpola.
La procedura di normalizzazione comporta la suddivisione dell’asse
delle ascisse in intervalli uniformi; questo corrisponde ad identificare
sull’asse delle ordinate il sottoinsieme dei dati che ha al denominatore del
rapporto logaritmico un valore di intensità compreso nell’intervallo fissato.
Per ogni intervallo si calcola il corrispondente centroide dei dati in esso
compresi, cioè un elemento rappresentativo di quel sottoinsieme di dati, e
si determina la curva esponenziale interpolante l’insieme dei centroidi:
y = a + b * e-c * x
40

Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
Scopo di questa interpolazione è trovare la combinazione di valori a,
b e c che genera la miglior curva esponenziale rappresentativa della
dislocazione dei centroidi; una volta trovata, la relativa curva viene
utilizzata per correggere i dati, così da posizionare i centroidi sull’asse
orizzontale log (G/R)=0.
Figura 2.14: Normalizzazione per interpolazione di una curva esponenziale
2.4.2.2 Normalizzazione LOESS/LOWESS
La trasformazione LOWESS (LOcally WEighted polynomial
regreSSion), così come la sua variante LOESS, divide i dati sull’asse delle
ascisse in intervalli sovrapposti e interpola una funzione con una
procedura simile a quella usata nella normalizzazione con curva
esponenziale, ma, in questo caso viene utilizzanta una funzione
polinomiale:
y = a0 + a1x + a2x 2 + …..
41

Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
I polinomi presentano la caratteristica di poter passare esattamente
per tanti punti quanto è il loro grado. Tuttavia, questo approccio presenta
il cosiddetto problema dell’“over-fitting”, ossia si ha un’approssimazione
quasi perfetta della funzione bersaglio nei punti conosciuti, ma oscillazioni
eccessive al di fuori di essi.
Per ovviare a ciò, l’approccio LOWESS utilizza polinomi di grado1,
mentre il LOESS fa uso di parabole in modo da contenere l’over-fitting e
l’eccessiva oscillazione fra i punti delle funzioni interpolanti.
Inoltre, poiché l’approssimazione polinomiale è precisa solo in piccoli
intervalli intorno al punto scelto, può essere necessario dividere il dominio
dei dati in finestre di dimensioni opportune con l’effetto collaterale di
incrementare anche notevolmente il carico computazionale.
La divisione in piccoli intervalli ha inizio all’estremità sinistra dei
dati con una finestra di larghezza data l e i dati che cadono in questi
intervalli sono utilizzati per interpolare il polinomio applicando ad essi dei
pesi diversi a seconda della loro posizione nell’intervallo: i dati prossimi al
punto di stima hanno un peso maggiore di quelli lontani e ciò può essere
realizzato utilizzando una funzione di peso w(x) della forma:
⎪⎧
w ( x)
= ⎨
⎪⎩ 0
3 ( 1−
| x | )
dove x è la distanza fra i punti stimati.
3
, | x | < 1
, |
x | ≥1
Il procedimento continua facendo scorrere la finestra verso destra e
interpolando localmente di volta in volta un nuovo polinomio: il risultato è
una curva di “smoothing” attraverso cui correggere i dati. L’effetto
dell’applicazione di questi metodi ad un insieme di dati può essere
osservato in figura 2.15, dove si può notare come la normalizzazione
agisca sui dati avvicinandoli all’asse delle ascisse ed eliminando o,
comunque, riducendo drasticamente l’andamento non lineare.
42

Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
LOWESS
Figura 2.15: Correzione dei dati con l’applicazione di una normalizzazione
LOWESS.
Il vantaggio del metodo LO(W)ESS è che non ha bisogno di
specificare una particolare funzione come modello: i soli parametri
necessari sono il grado dei polinomi d e il fattore di smoothing q, che
indica la larghezza della finestra.
Gli svantaggi del metodo LO(W)ESS includono il fatto che esso non
produce una funzione di regressione o un modello che sia facilmente
rappresentabile con una formula matematica. In particolare, il modello di
correzione della distorsione del colore trovato su un particolare insieme di
dati non può essere direttamente trasferito ad un altro: è necessario
riapplicare il metodo ogni volta che si ha un insieme di dati distinto e ciò
produce sottili differenze ad ogni applicazione.
Un ulteriore svantaggio è legato al fatto che la procedura è
computazionalmente molto pesante, anche se questo è un problema
minore nel contesto di tutte le altre problematiche collegate all’analisi dei
dati da microarray.
Il più importante svantaggio è la suscettibilità di questo metodo al
rumore e agli “outlier”, cioè a quei dati che si discostano drasticamente
43

Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
dalla maggioranza dei dati acquisiti o, per essere più precisi, che si
posizionano oltre 1.5 inter-quartile sopra il 75° percentile o sotto il 25°
percentile della distribuzione dei dati.
Figura 2.16: Identificazione degli outlier sulla distribuzione dei dati
Malgrado siano state apportate notevoli modifiche al metodo il
problema degli outlier resta tuttora irrisolto e, per questo motivo, è
necessario eliminarli prima dell’applicazione del metodo.
2.4.2.3 Normalizzazione a tratti
La normalizzazione a tratti, o “piece-wise”,è molto simile alla
LO(W)ESS, ma rispetto ad essa è computazionalmente più leggera, poiché
elimina molti calcoli che possono essere considerati in prima istanza
ridondanti per i dati ricavati da microarray. Questo metodo sostituisce
l’approccio a finestre mobili con un insieme fisso di finestre sovrapposte;
in ognuno di questi intervalli i dati sono approssimati grazie ad una
funzione lineare o quadratica. L’utente controlla le curve risultanti
scegliendo il numero di tali intervalli e il loro grado di sovrapposizione.
Il vantaggio di questo tipo di normalizzazione è la generazione di una
descrizione matematica compatta del modello dei dati che può essere
memorizzata e utilizzata su differenti insiemi. Tale descrizione sarà una
44

Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
funzione lineare a tratti o quadratica con tanti tratti quanti sono gli
intervalli specificati dall’utente.
outlier.
Come la LO(W)ESS, anche la normalizzazione a tratti è sensibile agli
Figura 2.17: Normalizzazione a tratti
2.4.3 Normalizzazione “within-print-tip-group”
Ogni blocco in un array è depositato utilizzando le stesse punte o
“print-tip”: modificando la configurazione secondo la quale viene realizzato
l’array è possibile correggere il “layout” dell’array.
Possono esistere alcune differenze fra le punte, dovute per esempio a
diversa larghezza dell’apertura o a deformazione dovuta ad usura.
Solitamente i gruppi di punte generano effetti spaziali simili sul vetrino,
per cui è necessario eseguire una normalizzazione fra gruppi in modo da
eliminarli.
45

Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
La normalizzazione “within-print-tip-group” dipende dal gruppo di
punte e dal valore di A = ½ log (R*G) secondo un modello che può essere
schematizzato con:
log2 R/G -> log2 R/G – ci(A) = log2 R/(Ki(A)*G)
dove la funzione di correzione ci(A) si trova facendo l’interpolazione
LO(W)ESS di M e A sul blocco i-esimo.
2.4.4 Normalizzazione “within-slide”
Dopo aver realizzato la normalizzazione “within-print-tip-group”,
tutte le distribuzioni relative a differenti gruppi di punte saranno centrate
sulla media del gruppo, tuttavia è possibile che le medie relative a diversi
gruppi di punte non siano uguali e si debba operare una riscalatura.
Un metodo per realizzarla può essere quello di assumere che tutti i
rapporti logaritmici relativi all’i-esimo gruppo di print-tip si distribuiscano
secondo una distribuzione normale con media nulla e varianza ai 2 σ 2 , dove
σ 2 è la varianza dei rapporti logaritmici ed ai 2 è il fattore di scala per l’i-
esimo gruppo di print-tip.
Poiché è necessario ottenere una stima di questo fattore di scala, si
procede massimizzando la funzione di verosimiglianza e si ottiene per ai la
seguente stima:
aˆ
i
=
I
n
i
∑
M
j=
1
I n
i
∏∑
k=
1 j=
1
2
ij
M
2
kj
46

Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
dove Mij denota il rapporto logaritmico j-esimo fra i due canali
all’interno del gruppo di punte i-esimo, ni è il numero di griglie depositate
con quella testina o gruppo di punte, e I è il numero di testine utilizzate
per stampare l’array.
Una robusta alternativa a questa stima è:
aˆ
i
=
I
MAD
I
∏
k=
1
i
MAD
dove MAD (Median Absolute Deviation) è definita come:
MADi= medianj{|Mij – medianj(Mij)|}
Questa procedura assume che solo una piccola porzione di geni vari
significativamente nel confronto fra due mRNA e inoltre, si ipotizza che la
dispersione della distribuzione dei rapporti logaritmici sia pressoché la
stessa per tutti i gruppi print-tip.
2.5 Correzione “paired-slide”
La correzione “paired-slide” si applica ad esperimenti nei quali due
campioni diversi vengono ibridizzati su due microarray scambiando la
marcatura, cioè il campione che sul primo microarray viene marcato in
rosso, sul secondo sarà marcato in verde e viceversa per l’altro campione.
Si denoti con log2R/G-c il rapporto logaritmico normalizzato fra i
due canali per il primo vetrino, con log2R’/G’-c’ quello per la seconda slide,
mentre c e c’ siano le due funzioni di normalizzazione per i due vetrini.
i
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Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
Nell’ipotesi che non vi siano comportamenti disuguali dei due fluorocromi
sui due vetrini, deve valere che c ≅ c’ e che log2R/G= log2G’/R’,cioè:
1
2
1
2
[ log R/G - c - ( log R' /G'-c')
] ≅ [ log R/G + log G'/R']
= log RG' /GR' = ( M − M ')
2
2
2
Con questo metodo è possibile scalare i livelli di espressione relativa
per i due microarray senza esplicitare la normalizzazione: questo
procedimento prende il nome di “self-normalization”.
La validità di questa assunzione può essere verificata utilizzando un
insieme di geni con livelli di espressione costante sui due canali. Poiché
l’assegnazione dei fluorocromi è invertita sui due microarray, ci si attende
che su tali geni il rapporto logaritmico normalizzato sui due vetrini abbia
uguale intensità ma segno opposto:
2
1
2
log2R/G-c ≅ -(log2R’/G’-c’)
Quindi, riarrangiando l’equazione e assumendo ancora che c ≅ c’ è
possibile stimare la funzione di normalizzazione c come:
1
2
c ≅ [ log R/G log R'/G']
1
2
2 + 2 = ( M + M ')
Da un punto di vista operativo, la funzione c = c(A) di correzione su
tutto il vetrino è stimata attraverso l’interpolazione LO(W)ESS di
1
1
( M + M ')
vs ( A + A')
.
2
2
2
1
2
48

Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
2.6 Normalizzazione “multiple-slides” o “between arrays”
Dopo la normalizzazione “within array” le distribuzioni dei dati
normalizzati di ogni microarray preso singolarmente saranno centrate
sulla propria media. I metodi di normalizzazione “multiple-slides”, il cui
scopo è quello di consentire confronti fra diversi array, servono per
operare una scalatura fra i dati acquisiti con differenti vetrini quando i
loro rapporti logaritmici normalizzati presentano dispersione. Non
effettuare una normalizzazione tra array può indurre un peso non reale
sui dati di un vetrino quando si effettua il confronto fra microarray.
a) b)
Figura 2.18: Box-plot degli array prima a) e dopo b) la normalizzazione between-arrays
E’ importante notare, tuttavia, che questo tipo di normalizzazione ha
senso esclusivamente fra campioni identici (repliche sperimentali); per
esempio, effettuare la normalizzazione tra array fra dati provenienti da un
tessuto sano e uno malato è un errore poiché si sta involontariamente
49

Capitolo 2: I primi passi del trattamento dei dati e le principali tecniche di normalizzazione
cercando di indurre un’omogeneizzazione delle dispersioni su campioni
differenti, introducendo un artefatto.
Le tecniche utilizzate per la normalizzazione “multiple slides” sono
uguali a quelle per i metodi “within array”.
50

Capitolo 3
Metodi di selezione a soglia e
analisi della significatività statistica
In questo capitolo verranno analizzate alcune tecniche utilizzate per
individuare quali geni risultano differenzialmente espressi in un
esperimento di microarray.
La tecnica più semplice fa uso di una soglia empirica
sull’istogramma del “fold change”, cioè del rapporto fra le intensità dei due
canali, per stabilire l’insieme dei geni che presentano espressione
differenziale.
Un metodo maggiormente adattativo è quello della distanza dalla
media, che pone una soglia dimensionata in base alla varianza della
distribuzione dei rapporti delle intensità.
Il criterio della soglia non lineare cerca, invece, di stabilire il livello
di abbattimento del rumore sui dati in modo da poter modellare una soglia
che tenga conto di questa informazione aggiuntiva.
Nessuno di questi metodi produce una valutazione statistica degli
errori che possono essere commessi nell’affermare che un gene è
differenzialmente espresso. Un miglioramento in questo senso viene
realizzato con l’analisi della significatività statistica dei microarray o SAM
(Significance Analysis of Microarray), che propone il False Discovery Rate
(FDR) come parametro statistico di confidenza nella risposta ottenuta.
51

Capitolo 3: Metodi di selezione a soglia e analisi della significatività statistica
3.1 “Fold change”
I dati di espressione genica ottenuti dal processo di normalizzazione
possono essere rappresentati sottoforma di matrice; ogni riga della tabella
individua un gene, o una sua sequenza specifica, mentre ogni colonna
contiene, generalmente, valori quali la media e/o la mediana sia del
segnale che del background, la mediana del segnale con il background
sottratto, i punteggi assegnati ad ogni spot dal controllo di qualità, le
percentuali di pixel saturati in ciascun canale per ogni spot, le posizioni
degli spot sul microarray, i nomi dei geni e i loro codici identificativi nelle
banche dati ed altro ancora.
Di particolare importanza è il valore relativo di espressione genica,
anche detto “fold change” , definito come il rapporto fra le intensità di
segnale misurate in entrambi i canali.
fold change = R/G
dove R è l’intensità del segnale generato dal campione marcato con il
fluorocromo Cy5 e G è quella prodotta dal campione marcato con il Cy3
per ogni spot. Il “fold change” è, dunque, il parametro che, in prima
istanza, può essere utilizzato per dichiarare se un gene è differenzialmente
espresso in uno dei due canali.
Il valore di questa grandezza, mai negativo in quanto rapporto di
quantità positive o nulle, è compreso nell’intervallo [0,+∞): i geni
sovraespressi sono identificati da valori del “fold change” compresi in
(1,+∞), mentre i geni sottoespressi presentano valori in [0,1).
E’ evidente che valori del “fold change” più grandi o più piccoli di 1
indicano una maggiore o minore espressione del gene in uno dei due
53

Capitolo 3: Metodi di selezione a soglia e analisi della significatività statistica
canali, mentre valori prossimi ad 1 indicano un’espressione simile in
entrambi i canali.
R
log 2
G
= −∞
0
log 2
R
= 1
G
R
G
= 0
log 2
R
= +∞
G
Figura 3.1: Rappresentazione del fold change in scala lineare e in scala
logaritmica
R
G
= +∞
Per ovviare alla differente ampiezza dei due intervalli di valori di
espressione viene solitamente applicata una trasformazione logaritmica ai
dati in modo tale che non sia più il semplice rapporto delle intensità il
valore di riferimento ma la sua trasformata logaritmica, generalmente in
base 2.
In conseguenza di ciò gli intervalli di variazione assumono
dimensioni uguali, rispettivamente ]0, +∞] per i geni sovraespressi e [-∞,0[
per i geni sottoespressi, e un gene viene considerato differenzialmente
espresso se il logaritmo del suo fold change non cade in un intorno
“sufficientemente” largo dello zero.
54

Capitolo 3: Metodi di selezione a soglia e analisi della significatività statistica
Figura 3.2: Trasformazione logaritmica sui dati di espressione differenziale
3.2 Metodo del valore di soglia
Un gene viene considerato differenzialmente espresso se il suo livello
di espressione si discosta in modo “significativo” da quello della condizione
di controllo. Il termine “significativo” è strettamente correlato alla teoria
statistica della verifica delle ipotesi, che valuta se gli scostamenti osservati
da una determinata condizione siano attribuibili o meno al caso.
Il metodo più semplice, e forse anche attualmente più usato, è il
metodo del valore di soglia; con questo criterio si determina sui valori del
“fold change” un intervallo simmetrico rispetto allo zero e i geni che hanno
livelli di espressione maggiori del suo limite superiore vengono considerati
55

Capitolo 3: Metodi di selezione a soglia e analisi della significatività statistica
sovraespressi, mentre quelli con livello minore del limite inferiore vengono
considerati sottoespressi.
Per visualizzare meglio questo metodo è possibile considerare
l’istogramma dei rapporti R/G, come in figura 3.3.
Partendo dall’ipotesi che molti geni non saranno differenzialmente
espressi, si dovrà trovare una distribuzione gaussiana del “fold change”
centrata sullo zero; per selezionare i geni differenzialmente espressi si deve
collocare una soglia bilaterale sulla distribuzione e considerare tutti quei
geni che sono posizionati all’esterno dell’intervallo così ottenuto.
Se, per esempio, si reputa che il valore di soglia sul “fold change”
possa essere fissato a ±2, allora i geni differenzialmente espressi saranno
quelli con rapporto logaritmico maggiore di +1 e minore di –1.
Figura 3.3: Istogramma del fold change con apposizione della soglia empirica bilaterale
per la selezione dell’espressione differenziale.
Dal punto di vista grafico, se su uno “scatterplot” del logaritmo delle
intensità del controllo verso il logaritmo di quelle del trattato si vogliono
visualizzare i geni differenzialmente espressi, basta tracciare due linee
parallele alla bisettrice del quadrante la cui distanza da quest’ultima
56

Capitolo 3: Metodi di selezione a soglia e analisi della significatività statistica
corrisponde al valore di soglia, e selezionare come differenzialmente
espressi i geni fuori dall’area delimitata dalle due rette.
Figura 3.4: Scatterplot del campione di controllo contro quello di trattato con
apposizione della soglia empirica bilaterale.
E’ possibile osservare l’effetto dell’apposizione della soglia anche in
un altro tipo di “scatterplot” dei dati, detto RI-plot, che ha in ascissa il
prodotto delle intensità e in ordinata il loro rapporto: anche in questo caso
la soglia bilaterale individua un’area al di fuori della quale i geni vengono
considerati differenzialmente espressi.
57

Capitolo 3: Metodi di selezione a soglia e analisi della significatività statistica
Figura 3.5: RI-plot dei dati di intensità con posizionamento della soglia bilaterale
Questo metodo di selezione pur avendo il vantaggio di essere molto
intuitivo ha, per contro, la totale mancanza di una teoria statistica alla
base della scelta dei valori di soglia. Se, per esempio, il trattamento non
provoca un’espressione differenziale dell’entità della soglia fissata, non
vengono rilevati geni sovra o sotto regolati anche se è molto probabile che
queste condizioni si siano verificate.
In termini statistici, come specificato nell’appendice A, questa
caratteristica si traduce nell’incapacità di rilevare i veri positivi, cioè la
metodica manca di sensibilità.
Analogamente, quando il trattamento è tale da provocare una
marcata espressione differenziale e la soglia selezionata è troppo bassa, si
evidenzia l’inadeguatezza del metodo nel rilevare i veri negativi, cioè la
metodica è poco specifica.
58

Capitolo 3: Metodi di selezione a soglia e analisi della significatività statistica
3.3 Metodo della distanza dalla media
Un approccio alternativo basato sul concetto di soglia, utilizzato per
individuare i geni differenzialmente espressi, consiste nel collocare la
soglia ad una distanza prefissata, prendendo come punto di riferimento la
media della distribuzione del rapporto dei due canali.
Ogni esperimento produce una diversa distribuzione ed essa è
generalmente di tipo gaussiano, per cui è possibile descriverla attraverso il
suo valore medio e la sua varianza σ 2 .
Questo metodo posiziona una soglia di selezione sulla base della
deviazione standard σ della distribuzione; tipicamente questa soglia viene
fissata a ±2σ.
Si può facilmente intuire che, rispetto al metodo di soglia empirica,
questo sistema consente di “adattare” la larghezza dell’intervallo alla
variazione di espressione in relazione al trattamento applicato, ossia si
adatta alla distribuzione dei dati.
Dal punto di vista grafico, per effettuare una scelta sulla base della
deviazione standard è necessario fare una trasformazione dei dati di “fold
change” in modo da sottrarre la media e dividere per la deviazione
standard, questo corrisponde a fare una trasformata z dei dati:
− μ
=
σ
X
Z
dove X sono i dati da trasformare, μ è la media della distribuzione e
σ è la sua deviazione standard.
La nuova distribuzione dei dati avrà media nulla e varianza unitaria,
quindi sul suo istogramma, che ha in ascissa la deviazione standard e in
ordinata il valore di z, si posizionerà una soglia su ±2 come nel caso del
valore empirico.
59

Capitolo 3: Metodi di selezione a soglia e analisi della significatività statistica
Figura 3.6: Distribuzione dei logaritmi dei rapporti con apposizione della soglia bilaterale
a ±2σ
Z
Posizionare la soglia a ±2σ coincide con il considerare il 5% di geni
come differenzialmente espressi e questo perché se si sommano la
probabilità che i nuovi dati trasformati siano +2 si raggiunge questa percentuale. Da questo semplice
calcolo si può osservare il limite più evidente del metodo: questa
percentuale resta fissa anche se in realtà non ci sono geni
differenzialmente espressi, o se ve ne sono di più di quanto ipotizzato.
Nel primo caso il problema è dovuto essenzialmente al fatto che i
dati provenienti da microarray sono sempre affetti da rumore. Si supponga
per esempio di fare un esperimento nel quale lo stesso materiale viene
marcato con entrambi i fluorocromi e poi ibridizzato su un microarray.
Idealmente a tutti i geni dovrebbe corrispondere lo stesso valore di
espressione nei due canali, ma ciò non si verifica per la presenza di
rumore nella misurazione.
Se la condizione ideale venisse rispettata la distribuzione dei
rapporti dovrebbe essere tanto stretta da poter essere approssimata con
un delta di Dirac centrato sullo zero e la deviazione standard dovrebbe
essere nulla. A causa della presenza del rumore, invece, la distribuzione
presenta una forma a campana e la deviazione è diversa da zero, per
questo motivo viene evidenziata un’espressione differenziale anche quando
σ
60

Capitolo 3: Metodi di selezione a soglia e analisi della significatività statistica
essa è assente. In termini statistici è stata rifiutata l’ipotesi nulla quando
essa è vera, per cui è stato commesso un errore di tipo I.
Nel secondo caso, la percentuale di geni differenzialmente espressi
rimane fissa anche quando ve ne è una quantità maggiore, evidenziando
l’incapacità del metodo di rilevare falsi negativi: ciò corrisponde a
commettere un errore di tipo II.
3.4 Metodo della soglia non lineare
Il rumore che presentano i dati di espressione genica non si abbatte
uniformemente su di essi, ma, poiché presenta una distribuzione
gaussiana, ha un maggior effetto sui dati a bassa intensità piuttosto che
su quelli ad alta intensità.
Figura 3.7: Distribuzione del rumore e banda di abbattimento sui dati
Per sfruttare questa informazione dal punto di vista della selezione
di geni differenzialmente espressi si può pensare di generare una soglia
61

Capitolo 3: Metodi di selezione a soglia e analisi della significatività statistica
non-lineare modulabile con il livello di rumore che viene riscontrato. L’idea
è quella di dare una caratterizzazione statistica al rumore e confrontare la
sua distribuzione con quella dei logaritmi del fold change in modo da
determinarne la “percentuale” di abbattimento sul dato a tutte le
intensità.
Da questo confronto si può ricavare una misura dell’affidabilità dei
dati non in maniera globale, ma puntualmente su ognuno di essi e in
modo da poter generare una curva non-lineare che funzioni da soglia per
la selezione dei geni differenzialmente espressi.
Figura 3.8: Distribuzione dei dati con apposizione della soglia lineare (in
arancione) e della soglia non lineare (in giallo)
3.5 Analisi della significatività sui microarray
I metodi precedentemente illustrati non sono realizzati su base
statistica; nessuno di loro, infatti, esprime un livello di confidenza sui geni
selezionati come differenzialmente espressi oppure quantifica il numero di
errori di tipo I per caratterizzare l’affidabilità del risultato
62

Capitolo 3: Metodi di selezione a soglia e analisi della significatività statistica
Sebbene i metodi a soglia siano estremamente intuitivi, la presenza
di rumore e di numerosi fattori di variabilità dei dati, non sempre ben
quantificabili ed eliminabili, rende necessaria l’adozione di approcci
statistici per la selezione dei geni differenzialmente espressi.
In questo contesto, il metodo che va sotto il nome di analisi della
significatività statistica (Tusher et al., 2001) conferisce una solida base
statistica ad un criterio di selezione a soglia.
Nell’analisi della significatività statistica (SAM) viene assegnato un
punteggio ad ogni gene effettuando misure virtuali ripetute della sua
espressione e considerando i cambiamenti relativi, rispetto alla deviazione
standard, di ogni livello di espressione.
Capita spesso che un metodo di analisi statistica utilizzi “bootstrap”
o permutazioni, cioè un campionamento dei dati con o senza sostituzione
delle osservazioni, per creare degli insiemi di dati surrogati a partire dai
quali effettuare le necessarie speculazioni statistiche; questi approcci
hanno tanto più valore quanto minore è il numero delle informazioni o dei
dati disponibili.
SAM si basa su un test statistico, noto come t-test, in cui vengono
messe a confronto le medie delle due distribuzioni di dati che si vogliono
paragonare, attraverso la verifica di due ipotesi: l’ipotesi nulla, secondo
cui i due campioni di dati provengono dalla stessa popolazione, e l’ipotesi
alternativa, che afferma che i dati appartengono a due popolazioni
distinte.
Dal punto di vista dell’espressione differenziale dei geni queste
ipotesi si possono definire come:
Ipotesi nulla: i due valori di espressione che si stanno
confrontando indicano che il gene non è differenzialmente
espresso;
Ipotesi alternativa: i due valori di espressione indicano che il
gene è differenzialmente espresso.
63

Capitolo 3: Metodi di selezione a soglia e analisi della significatività statistica
Calcolate le medie X A e X B delle misure relative ad ogni gene
nelle due condizioni, nell’assunzione che i dati siano normalmente
distribuiti, esse vengono confrontate attraverso una statistica, detta t, la
cui forma analitica è:
t
≡
( X A − X B )
− 0
e(
X A − X B )
dove al numeratore vi è la differenza fra le medie delle misure
associate ad ogni gene e la media nulla della distribuzione della statistica,
mentre al denominatore vi è l’errore standard relativo allo stesso gene
nelle due condizioni.
Questa statistica è una variabile aleatoria che segue una
distribuzione, nota come t-Student, il cui andamento è caratterizzato dai
gradi di libertà forniti dalle osservazioni disponibili. I gradi di libertà
vengono definiti come il numero di osservazioni indipendenti necessarie
per ottenere la misura della statistica rispetto al numero di osservazioni
totali.
Per affermare che l’ipotesi nulla è vera ( X A = X B ), o che bisogna
rigettarla ( X A ≠ X B ), occorre stabilire un livello di confidenza α,
generalmente posto uguale a 0.01 o 0.05 nella statistica biomedica, e
ricavare dalla distribuzione t-Student, per la quale si sono fissati i gradi di
libertà, il valore della variabile t, detto tα, cui corrisponde quel livello di
confidenza..
Dal confronto fra la variabile tα e la t ricavata dalle misure si
stabilisce che:
|t| < |tα|-> ipotesi nulla vera;
|t| > |tα|-> ipotesi nulla rigettata.
64

Capitolo 3: Metodi di selezione a soglia e analisi della significatività statistica
La soluzione di fare tanti t-test accoppiati per quanti sono i geni è
molto semplice ed intuitiva, tuttavia, come spiegato nell’appendice A, ciò
fa aumentare la probabilità di commettere almeno un errore di tipo I.
Per ovviare a questo problema, il metodo di analisi della
significatività concepisce una nuova statistica, molto simile alla statistica
t, con l’intento di generare un punteggio per il test che si sta effettuando;
questo punteggio viene poi utilizzato per verificare le ipotesi di test sia sui
dati originali che su quelli surrogati generati attraverso le permutazioni.
Per visualizzare meglio il procedimento, di seguito è riportato il
diagramma delle operazioni eseguite dall’analisi della significatività:
Definizione e calcolo
del punteggio d(i)
Dati di espressione genica
Normalizzazione
Identificazione dei geni
potenzialmente significativi
Stima di FDR*
Scelta di Δ
Selezione dei geni
differenzialmente espressi
Generazione delle
permutazioni
Definizione e calcolo
del punteggio d (i)
Figura 3.9: Diagramma delle operazioni effettuate nell’analisi della significatività
statistica .*FDR (False Discovery Rate)
p
65

Capitolo 3: Metodi di selezione a soglia e analisi della significatività statistica
Partendo dall’ipotesi che le fluttuazioni del rumore sul dato sono
gene specifiche, il primo passo del trattamento consiste nella
normalizzazione con i metodi usuali e nella visualizzazione dei dati
attraverso “scatterplot” o “cube root plot”, che è il grafico della radice
cubica delle due intensità e permette di evidenziare il comportamento dei
geni a basse intensità di fluorescenza e di identificare i geni
differenzialmente espressi a queste intensità, come mostrato nella figura
3.10.
Figura 3.10: Scatterplot e cube root plot dei dati
Il passo successivo calcola il punteggio d(i) per ogni gene i nelle due
condizioni che si vogliono verificare
dove:
d(
i)
=
x
C1
( i)
− x
s(
i)
+ s
C 2
0
( i)
al numeratore vi è la differenza fra le medie delle misure
relative alle due condizioni C1 e C2 per il gene i-esimo (possono
essere, per esempio, trattato e controllo);
66

Capitolo 3: Metodi di selezione a soglia e analisi della significatività statistica
al denominatore vi è la somma fra la stima della deviazione
standard del numeratore e un valore additivo s0, detto “fudge
factor”.
La deviazione standard del numeratore può essere calcolata in base
alla seguente formula di stima:
1 1 ⎛ +
n ⎞ 1
n2
n ⎧
1 n2
2
s(
i)
=
⎜
⎟
⎟⎨∑[
xh
( i)
− xC
( i)]
+
1 ∑[
x
⎝ n1
+ n2
− 2 ⎠⎩
h=
1
k=
1
dove:
k
( i)
− x
C
2
( i)]
le due sommatorie sono estese al numero di misure effettuate
nei due stati;
n1 è il numero di misure nello stato C1;
n2 è il numero di misure nello stato C2.
A bassi livelli di espressione la varianza di d(i) può essere alta a
causa di piccoli valori di s(i). Per assicurare l’indipendenza della
distribuzione dei d(i) dal livello di espressione del gene è necessario
aggiungere un fattore additivo so al denominatore del punteggio. Il valore
di s0 viene scelto in modo da minimizzare il coefficiente di variazione di d(i)
in funzione di s(i) attraverso un procedimento a finestre mobili sui dati.
In generale si sceglie s0 in maniera che il coefficiente di variazione di
d(i) sia approssimativamente costante al variare di s(i).
L’acquisizione di una stima di confidenza (FDR) sui dati richiede la
realizzazione di numerosi esperimenti al fine di ottenere un’informazione il
più possibile completa sui livelli di espressione di tutti i geni. Poiché
eseguire molti esperimenti è dispendioso sia in termini di tempo che
economici, vengono effettuate una serie di permutazioni dei dati, ognuna
2
⎫
⎬
⎭
67

Capitolo 3: Metodi di selezione a soglia e analisi della significatività statistica
delle quali produce un nuovo valore del punteggio d(i); tali permutazioni
devono essere bilanciate.
Una permutazione è bilanciata se per ogni gruppo di g esperimenti,
con g pari al numero di campioni che sono stati ibridizzati, vi sono g/2
esperimenti per campione.
Si analizzi, per esempio, l’esperimento effettuato da Tusher su due
linee umane linfoblastoidi “wild-type” (Tusher et al., 2001). In questo
esperimento le cellule di ogni linea sono state fatte crescere in uno stato
irradiato (I), sottoposte a 5 Gy di radiazione ionizzante per una durata di
quattro ore, e in uno stato non irradiato (U). I campioni sono stati, poi,
marcati e divisi in due aliquote uguali A e B; si hanno, quindi, otto
campioni U1A, U1B, I1A, I1B, U2A, U2B, I2A, I2B. I campioni sono stati
successivamente confrontati fra di loro in esperimenti con uguale linea
cellulare e aliquota, ossia (U1A vs I1A), (U1B vs I1B), ecc.
Per ognuna delle due condizioni sperimentali (U e I), costituite da
quattro campioni, due per linea cellulare, si possono ottenere
⎛4
⎞
⎜ ⎟ =
⎝2
⎠
4!
4*
3*
2
= = 6
2!
( 4 − 2)!
2*
2
raggruppamenti a due a due dei campioni stessi.
In questo caso, le permutazioni bilanciate sono date da tutti i
possibili accoppiamenti fra le coppie di campioni delle due condizioni
⎛ ⎞
sperimentali: si ottengono in totale ⎜ ⎟ = 36 permutazioni bilanciate.
⎝2⎠
4 2
Figura 3.11: Esempio di due permutazioni bilanciate con due linee cellulari (i colori
indicano il fluorocromo utilizzato per la marcatura dei campioni).
68

Capitolo 3: Metodi di selezione a soglia e analisi della significatività statistica
Per stimare l’ordine delle statistiche d(i), vengono calcolati per ogni
permutazione p i punteggi dp(i) da attribuire al gene i di ogni coppia di
esperimenti, secondo la definizione:
d
p
( i)
=
x
G1
( i)
− x
s(
i)
+ s
dove con Gi si indicano i due gruppi della permutazione, ossia le due
condizioni sperimentali.
G2
0
( i)
I punteggi così ottenuti sono ordinati in senso ascendente:
d p ( 1)
≥ d p ( 2)
≥ d p ( 3)
≥ ... ≥ d p
( k)
dove k indica la posizione del punteggio all’interno dell’insieme
ordinato dei dp(i) .
come:
Si definisce la differenza relativa attesa sul numero di permutazioni
d
E k (
come nell’esempio indicato in figura 3.12.
)
=
n p
d p ( k )
∑ n p
p=
1
Figura 3.12: Punteggi di permutazione e punteggio atteso su tutte le permutazioni
k)
69

Capitolo 3: Metodi di selezione a soglia e analisi della significatività statistica
Per identificare i geni significativamente espressi si ordinano i
punteggi dei dati originali in senso ascendente e si indica con d i (k) il
punteggio d(i) del gene che era in posizione i-esima e dopo l’ordinamento si
trova in posizione k-esima.
Per mettere in relazione i punteggi d i (k) con le differenze relative
attese dE(k) si fa uno scatterplot che prende il nome di “SAM plot”.
d i (k)≅dE(k).
Figura 3.13: “SAM plot”
Dalla figura 3.13 si può osservare che per diversi geni si ha che
Una volta stabilita una soglia Δ si individuano il più piccolo d(i)
positivo (t1) e il più grande d(i) negativo (t2) tali che:
i
d E
( k)
− d ( k)
e il gene i-esimo viene definito potenzialmente differenzialmente espresso
se vale che d i (k) ≥ t1 o d i (k) ≤ t2
≥
Δ
70

Capitolo 3: Metodi di selezione a soglia e analisi della significatività statistica
Figura 3.14: SAM plot con apposizione della soglia superiore t1 e della soglia
inferiore t2
Per dare una valutazione statistica dell’affidabilità con cui si è
individuato l’insieme di geni differenzialmente espressi si stima il False
Discovery Rate (FDR):
FDR
1
n p
n p p 1
≈ ∑ =
card{
i | d
card{
i | d(
i)
≥ t
p
( i)
≥ t
1
1
∨ d
p
∨ d(
i)
≤ t
( i)
≤ t
dove, fissati i valori di soglia t1 e t2 , al numeratore si ha la media del
numero di geni individuati come differenzialmente espressi attraverso le
permutazioni e al denominatore il numero di geni differenzialmente
espressi ottenuti dall’analisi dei dati reali.
I geni differenzialmente espressi prodotti da una permutazione p
sono detti “falsamente significativamente espressi” e sono individuati con
la stessa procedura con cui si selezionano i geni significativamente
espressi, ma sostituendo d i (k) con dp(k), ossia:
d p
E
( k)
− d ( k)
<
Δ
2
}
2
}
71

Capitolo 3: Metodi di selezione a soglia e analisi della significatività statistica
Ovviamente questa stima è differente a seconda della soglia
impostata, per cui è possibile determinare il valore di Δ a seconda del FDR
che
si desidera avere sui dati. Come si può osservare nella tabella 3.1, ad
un minore
FDR corrispondono Δ maggiori e, come immaginabile,
diminuisce il numero di geni differenzialmente espressi individuati.
Tabella 3.1: Lista dei geni differenzialmente espressi in funzione di FDR e Δ
Il metodo di analisi della significatività statistica utilizza, quindi, un
concetto
intuitivo come quello del valore di soglia, irrobustito da una
valutazione statistica del risultato ottenuto.
Rispetto alle metodiche illustrate nei precedenti paragrafi è bene
evidenziare alcuni sostanziali vantaggi che il metodo qui discusso
presenta.
Il criterio che individua i due valori di soglia nel SAM è di tipo
iterativo, permettendo un maggiore controllo sui dati e sulle loro
fluttuazioni;
queste ultime vengono catturate attraverso le permutazioni.
Il processo di permutazione dei dati consente, infatti, di considerare
i due insiemi di geni sovraespressi e sottoespressi come “indipendenti”,
ossia è possibile ricavare per essi due valori di soglia che possono portare
ad avere
un intervallo non simmetrico sull’istogramma. Ciò è conseguenza
del fatto che l’espressione differenziale non si manifesta necessariamente
con la stessa intensità relativa sui geni sovraespressi e sottoespressi, ma
può succedere che il “fold change” minimo per affermare la presenza di
espressione differenziale non sia lo stesso.
72

Capitolo 3: Metodi di selezione a soglia e analisi della significatività statistica
L’uso di permutazioni, inoltre, ha il vantaggio di riuscire a migliorare
la qualità dell’informazione in esperimenti che utilizzano un numero
piccolo di campioni, generando insiemi di dati surrogati, coerenti con
l’esperimento realizzato.
Purtroppo, nel caso opposto, ossia con campioni molto numerosi o
con molti geni per microarray,
il carico computazionale diviene
estremamente
oneroso e può risultare ingestibile se non si dispone di un
adeguato supporto hardware.
Infine, l’utilizzo di un parametro statistico come il False Discovery
Rate permette un’immediata stima
del livello di affidabilità dell’insieme di
geni selezionati come differenzialmente espressi, evidenziando la
percentuale di errori di tipo I che si commette selezionando Δ diversi.
73

Capitolo 4
Approccio statistico bayesiano e test multipli
in esperimenti di microarray
I metodi empirici bayesiani si dimostrano particolarmente efficienti
quando si vuole realizzare un test multiplo simultaneo di ipotesi su un
insieme numeroso di soggetti, per ognuno dei quali sono disponibili poche
osservazioni.
Questo è proprio il caso degli esperimenti di microarray, in cui il
numero di osservazioni per lo stesso gene è generalmente molto basso
rispetto al numero totale di geni analizzati.
In questo ambito, si possono ricordare gli studi di Efron et al.
(2001), Lönnstedt et al. (2001), Efron (2003), Newton (2003) e Smyth
(2004) che fanno uso di un approccio bayesiano al test delle ipotesi per la
selezione dei geni differenzialmente espressi.
L’elemento in comune a questi lavori è lo sfruttamento della capacità
insita in questi metodi di fare inferenza su ogni singolo gene, ossia di
generare delle stime dei parametri statistici che lo possono descrivere,
traendole da tutto l’insieme di dati: per questo motivo tali metodi vengono
detti empirici.
Un contesto operativo o “framework” bayesiano genera queste stime
avvalendosi del teorema di Bayes, di ipotesi sulle distribuzioni a priori dei
parametri formulate dall’analista e dell’insieme dei dati: sono queste le
componenti di un processo capace di produrre in maniera automatica un
aggiornamento dei parametri delle distribuzioni coinvolte, al fine di
generare gli elementi confrontati nella statistica caratteristica del
“framework”.
74

Capitolo 4: Approccio statistico bayesiano e test multipli in esperimenti di microarray
4.1 Inferenza statistica classica e approccio bayesiano empirico
Un processo di inferenza statistica su un insieme di dati ipotizza un
modello delle osservazioni collezionate e lo verifica attraverso l’analisi dei
dati stessi, producendo delle stime dei parametri descrittivi della
distribuzione dei dati ipotizzata. Per fare inferenza statistica esistono due
tipi di approcci:
Approccio frequentistico, detto anche analisi statistica classica;
Approccio soggettivistico, detto anche analisi bayesiana.
4.1.1 Fondamenti del metodo classico: test delle ipotesi
Un’ipotesi statistica, come illustrato in Appendice A, è
un’assunzione che viene fatta dal ricercatore sul problema di inferenza che
sta affrontando.
Si supponga di ipotizzare un modello per un insieme di dati, cioè
che essi si distribuiscano seguendo una determinata funzione di densità
di probabilità. Per verificare la veridicità del modello occorre determinare
l’incertezza sull’ipotesi formulata attraverso la probabilità condizionata
che il modello ipotizzato sia vero sulla base dei dati osservati, ossia:
P ( Modello ipotizzato è vero | Dati osservati )
Purtroppo, una tale probabilità non è stimabile; è, invece, possibile
esprimere la probabilità condizionata che si ottengano i dati osservati dato
il modello ipotizzato:
75

Capitolo 4: Approccio statistico bayesiano e test multipli in esperimenti di microarray
P ( Dati osservati | Modello ipotizzato)
ossia è possibile ipotizzare il modello e verificare se i dati sono
compatibili con esso. Questa verifica si può realizzare con un test delle
ipotesi strutturato nel seguente modo:
Passo 1: Definire l’ipotesi di ricerca.
Un’ipotesi di ricerca o alternativa è un’assunzione derivata
dalla teoria che il ricercatore intende verificare sui dati.
Passo 2: Definire l’ipotesi nulla.
L’ipotesi nulla è un’assunzione che non si deve mai
verificare se l’ipotesi alternativa è consistente con la realtà.
Passo 3: Condurre un’analisi dei dati per determinare se l’ipotesi
nulla è rigettabile con una determinata probabilità.
Attraverso questo procedimento è possibile rifiutare l’ipotesi nulla
con un adeguato livello di confidenza nel risultato del test, affermando,
così, che il modello ipotizzato per la distribuzione dei dati è effettivamente
coerente con le osservazioni.
In un problema di inferenza statistica classica si suppone che i dati
generati da un processo di misura possano essere considerati come un
insieme di variabili aleatorie, cioè di osservazioni prodotte attraverso un
processo statistico con distribuzione di probabilità sconosciuta sulla quale
si vuole “riferire qualcosa”.
In un contesto del genere, la definizione di probabilità si basa sul
concetto di realizzazioni del processo aleatorio, o uscite, ugualmente
probabili: la probabilità, infatti, viene vista come la frequenza relativa con
la quale una determinata uscita si realizza se si aumenta il numero di
realizzazioni all’infinito.
76

Capitolo 4: Approccio statistico bayesiano e test multipli in esperimenti di microarray
Quando si fa inferenza statistica secondo una prospettiva
frequentistica, si assume che i dati osservati siano un campione
rappresentativo di un’intera popolazione molto più numerosa.
Tale popolazione può essere rappresentata attraverso la media e la
varianza di popolazione, che sono parametri sconosciuti, mentre il
campione può essere descritto grazie alla media e alla varianza campione,
che possono, invece, essere calcolate e prendono il nome generico di
statistiche.
Media e varianza campione procurano una stima della media e della
varianza dell’intera popolazione; tuttavia, queste ultime non possono
essere conosciute con precisione, ma sono affette da incertezza che viene
riassunta con la distribuzione di campionamento o “sampling” del
parametro che si sta considerando.
La distribuzione di “sampling” è un’ipotetica distribuzione di tutti i
possibili valori della statistica di interesse per campioni di dimensione N,
tratti da una data popolazione.Per fare un esempio di quanto detto, la
media campione osservata non è altro che una realizzazione della sua
distribuzione di “sampling”.
4.1.2 Approccio bayesiano e interpretazione
soggettivistica della probabilità
Nell’approccio bayesiano, in contrasto con l’interpretazione
frequentistica, la probabilità può essere interpretata come l’aspettativa che
ciascuno esprime sulla possibilità che “verosimilmente” si possa ottenere
una determinata uscita di un qualche processo. Ciò significa che individui
differenti possono attribuire una diversa probabilità ad uno stesso evento.
Il concetto di probabilità assume, dunque, il significato che gli viene
attribuito nel linguaggio comune, ossia è una misura del “grado di fiducia”
nel verificarsi dell’evento; conseguenza diretta di tale interpretazione è che
si respinge il fondamento che vi sia un processo di generazione dei dati
77

Capitolo 4: Approccio statistico bayesiano e test multipli in esperimenti di microarray
verificabile attraverso un procedimento dicotomico quale il test delle
ipotesi.Il concetto intuitivo sfruttato nell’approccio bayesiano è che la
probabilità dipende dallo stato di conoscenza (o di ignoranza) del
fenomeno in esame; questa conoscenza è, in genere, differente da persona
a persona.
Tali concetti sono in conflitto con l’impostazione classica della
statistica, secondo cui le proprietà probabilistiche sono definite come
proprietà asintotiche, ossia legate ad un numero infinito di dati ottenibili
solo attraverso esperienze replicabili, e l’inferenza sui parametri è
effettuata escludendo l’eventualità di utilizzare informazioni pregresse sul
fenomeno che si sta analizzando.
Lo schema operativo dell’approccio Bayesiano alla modellazione dei
dati ha la seguente struttura:
Passo 1: Fare inferenza basata su tutte le informazioni a
disposizione e generare un’ipotesi di distribuzione a priori per
il parametro che si sta considerando.
Passo 2: Aggiornare le stime avvalendosi del teorema di Bayes,
illustrato nel paragrafo successivo, e delle distribuzioni a
priori, al fine di generare una distribuzione a posteriori del
parametro.
Passo 3: Verificare che i nuovi dati confermino le ipotesi a
priori.
Il metodo bayesiano è iterativo, cioè le stime dei parametri generate
al passo precedente sono gli ingressi del passo successivo e il processo si
interrompe quando non si osservano apprezzabili variazioni sui parametri
stimati.La differenza operativa più evidente fra l’approcco classico e quello
bayesiano è che mentre la statistica classica considera i dati D come
realizzazioni di variabili aleatorie ed i parametri ignoti θ come
78

Capitolo 4: Approccio statistico bayesiano e test multipli in esperimenti di microarray
deterministici, la statistica bayesiana considera i dati come costanti ed i
parametri ignoti sono variabili aleatorie caratterizzate da una funzione
densità di probabilità a priori P(θ).
4.1.3 Teorema di Bayes e inferenza sui parametri
L’approccio Bayesiano consente di aggiornare le informazioni a
priori contenute nella funzione densità di probabilità P(θ) dei parametri,
alla luce dei dati osservati. Tale aggiornamento si traduce, attraverso
l’applicazione del teorema di Bayes, in una funzione densità di probabilità
P(θ|D) a posteriori.
seguente:
dove:
Il teorema di Bayes per eventi discreti può essere espresso nel modo
Pr(
A
i
| B )
=
Pr(
Ai
) Pr(
B | Ai
)
Pr(A
) Pr(B|A
)
∑
k
k
Pr(Ai) = Probabilità a priori dell’evento Ai. Essa riassume le
convinzioni sulla probabilità dell’evento Ai prima che Ai o
l’evento B siano stati osservati
Pr( B | Ai ) = Probabilità condizionata di B dato Ai. Essa
riassume la probabilità che l’evento B si verifichi dopo che si è
osservato Ai.
Σk Pr( Ak ) Pr( B | Ak ) = Costante di normalizzazione o
probabilità totale. Essa è uguale alla somma delle quantità al
numeratore per tutti gli eventi Ak
k
79

Capitolo 4: Approccio statistico bayesiano e test multipli in esperimenti di microarray
Pr( A i | B ) = Probabilità a posteriori di A i dato B. Essa
rappresenta la probabilità dell’evento A i dopo che l’evento B si
è verificato.
Dal punto di vista dell’approccio bayesiano alla stima dei parametri,
ci sono quantità conosciute o osservabili, i dati D, e quantità sconosciute,
i parametri θ.
Per fare inferenza sulle quantità sconosciute si stabilisce una
probabilità congiunta p(θ,D) che descrive la personale “convinzione”
dell’analista, fondata sul suo grado di conoscenza dei dati.
Questa probabilità congiunta può essere riscritta in modo da
ottenere l’inferenza desiderata su θ:
p( θ, D) = p( θ | D)
=
e utilizzando il teorema di Bayes diventa:
dove:
p( θ ) p( D|
θ )
pD ( )
p(
θ ) p(
D | θ ) p(
θ ) L(
θ | D)
p( θ | D)
=
=
∝ p(
θ)
L(
θ | D)
p(
D)
p(
θ ) p(
D | θ ) dθ
∫
θ
L( θ | D ) è la funzione di verosimiglianza o ”likelihood” per θ,
ossia una misura della fiducia che si realizzi un determinato
valore di θ quando i dati D sono stati osservati (Spiegel, 1979);
80

Capitolo 4: Approccio statistico bayesiano e test multipli in esperimenti di microarray
∫
θ
p( θ ) p( D | θ ) dθ
è la costante di normalizzazione, o distribuzione
predittiva a priori, che assicura che la probabilità a posteriori
di θ integri a 1.
4.1.4 Scelta della distribuzione a priori e stimatori della
media e della varianza
La scelta della distribuzione a priori per i parametri che devono
essere stimati può essere effettuata sulla base del significato che si vuole
attribuire ad essa e delle diverse informazioni a disposizione dell’analista.
In generale esistono tre criteri per procedere a tale scelta e ognuno
di essi esprime un differente modo di intendere questa distribuzione:
Metodo bayesiano classico: assume che la a priori non deve
esprimere l’influenza del ricercatore, per cui si scelgono a
priori che siano il meno informative possibile sull’insieme di
dati.
Metodo bayesiano parametrico moderno: assume che la scelta
della a priori deve essere funzionale ad avere un processo
computazionale più snello, per cui si scelgono a priori con
proprietà convenienti.
Metodo bayesiano soggettivo: assume che la a priori è un
riassunto delle assunzioni del ricercatore, per cui si sceglie
una a priori basata su conoscenze precedenti (risultati di
precedenti studi, opinioni di altri gruppi di studio…).
81

Capitolo 4: Approccio statistico bayesiano e test multipli in esperimenti di microarray
4.1.5 Metodo bayesiano classico per la scelta delle
distribuzioni a priori
Si supponga di avere un insieme di dati che si distribuisce come
una variabile aleatoria normale
y ~ N( μ , σ 2 )
dove μ e σ 2 sono la media e la varianza della distribuzione e sono
entrambe variabili casuali sconosciute: per ottenere una stima dei due
parametri della distribuzione è necessario generare un modello multi-
parametro.
Il teorema di Bayes per due parametri si scrive:
p( μ , σ 2 | y) ∝ p(μ , σ 2 ) p(y | μ , σ 2 )
e, poichè si vogliono generare le distribuzioni di ogni singolo
parametro condizionate all’insieme di dati osservati, cioè p(μ | y) e
p(σ 2 |y), è conveniente studiare le distribuzioni marginali della
distribuzione condizionata p( μ , σ 2 | y) nei due parametri, ossia :
2
2
( | y)
∫ p(
μ | σ , y)
p(
σ | y)
2
p μ = dσ
2
σ
2
2
( | y)
= ∫ p(
σ | μ,
y)
p(
μ y)
p σ | dμ
μ
82

Capitolo 4: Approccio statistico bayesiano e test multipli in esperimenti di microarray
Se l’intento dell’analista è optare per distribuzioni a priori che siano
più generali possibile, senza sfruttare le informazioni disponibili
sull’insieme di dati, una buona scelta può essere una distribuzione a
priori uniforme per entrambi i parametri, cioè:
p( μ ) ∝ c -∞ < μ < +∞
p( σ 2 ) ∝ 1/σ0 2 0 < σ 2 < +∞
Nell’ipotesi che le distribuzioni dei due parametri siano
indipendenti, ossia che valga p(μ , σ 2 )= p( μ ) p( σ 2 ), si ottiene per la
distribuzione congiunta:
p(μ , σ 2 ) = c/σ0 2
Si può dimostrare che (Spiegelhalter et al., 2004):
μ − y
p( μ | y)
= p( |y)~t n
s / n
p(σ 2 | y) ~ Inv-χ2 (n-1,s2) ≡ Inv-Γ( (n-1)/2), (n-1)s2/2 )
dove:
y è la media di tutti i dati;
n è il numero di osservazioni;
s è la devianza d’errore sul campione;
s 2 è la varianza campione;
−1
83

Capitolo 4: Approccio statistico bayesiano e test multipli in esperimenti di microarray
con tn-1 si indica una variabile aleatoria che segue una
distribuzione t-Student con n-1 gradi di libertà;
con Inv-Γ( a,b ) si indica una variabile aleatoria che segue
una distribuzione gamma inversa con parametri
caratteristici a e b.
4.1.6 Metodo bayesiano parametrico moderno per la scelta
delle distribuzioni a priori
L’ipotesi sui dati afferma che essi si distribuiscono seguendo una
variabile aleatoria normale con media μ e varianza σ 2 , entrambe variabili
casuali sconosciute.
In questo approccio, la scelta delle distribuzioni a priori per i
parametri viene effettuata in base a considerazioni di ordine pratico, ossia
queste distribuzioni devono contribuire a semplificare il calcolo che
conduce, attraverso l’applicazione del teorema di Bayes, all’aggiornamento
del valore dei parametri considerati.
Si supponga di conoscere la varianza della popolazione σ 2 = σ0 2 , che,
per esempio, in prima istanza può essere ritenuta uguale alla varianza
campione. In quest’ottica una scelta conveniente per la distribuzione a
priori della media è la distribuzione normale N( m, d 2 ), dove m è la media
campione e d 2 è la varianza campione.
Questa scelta può essere operata sia in base alla congruenza con le
ipotesi sulla media espresse dall’analista che, soprattutto, osservando che
la distribuzione normale è una coniugata.
Una distribuzione a priori si definisce coniugata se, dopo aver
applicato il teorema di Bayes ad essa, la distribuzione a posteriori
risultante appartiene sempre alla stessa famiglia di distribuzioni, ad
esempio se la a priori è una distribuzione normale anche la a posteriori
sarà una distribuzione normale. Quello che cambia fra le due distribuzioni
84

Capitolo 4: Approccio statistico bayesiano e test multipli in esperimenti di microarray
sono i parametri, che vengono modificati dall’applicazione del teorema di
Bayes in virtù dei dati campionari disponibili.
p(μ) ~ N( m, d 2
) p(μ|y) ~ p(μ)p(y| μ) ~
dove:
m y
+
d σ
1 1
+ 2
d σ
2 2
ˆ μ =
0
e
2
ˆ σ μ
2
0
⎛ 1
=
⎜
⎝ d
2
n ⎞
+ 2 ⎟
σ 0 ⎠
−1
( ˆ,
ˆ2
μ)
σ μ N
sono i parametri della distribuzione a priori automaticamente aggiornati
dal teorema.
Un discorso simile può essere fatto con la distribuzione a priori della
varianza, per la quale una scelta opportuna è la distribuzione gamma
inversa, che è anch’essa una coniugata.
Effettuando queste scelte la distribuzione congiunta a priori dei due
parametri, nell’ipotesi che essi siano indipendenti, sarà una Γ normale-
inversa:
p( μ, σ 2 ) ~ N-Inv-Γ(μ 0, σ 0 2/k 0; v 0, σ 0 2)
dove μ 0, σ 0 2/k 0, v 0 e σ 0 2 sono i parametri descrittivi della
distribuzione.
85

Capitolo 4: Approccio statistico bayesiano e test multipli in esperimenti di microarray
Poiché il prodotto di due coniugate dà sempre una coniugata, la
distribuzione a posteriori dei due parametri, condizionata all’insieme dei
dati che si ottiene dall’applicazione del teorema di Bayes alla distribuzione
congiunta, appartiene alla stessa famiglia della distribuzione a priori, ma
con i parametri aggiornati:
dove:
p(μ,σ 2 |y) ~ N-Inv-Γ(μi, σi 2/ki; νi, σi 2)
k0
μi
=
k0
+ kn
μ0
+
k
ki
= k0
+ n
v = v + n
i
vσ
i
2
i
0
= v σ
0
2
0
+
0
n
+ k
y
n
2 0
( n −1)
s + ( y − μ0
k0
+ n
sono i parametri aggiornati ed i è il minimo indice di iterazione per il
quale le stime non variano significativamente.
4.1.7 Metodo bayesiano soggettivo per la scelta delle
distribuzioni a priori
In questo caso, la scelta delle distribuzioni a priori dei parametri che
si stanno considerando viene operata in funzione dell’insieme delle
informazioni a disposizione dell’analista, nonché degli accorgimenti utili a
migliorare il carico computazionale del procedimento bayesiano di stima.
Le informazioni utilizzate non devono essere necessariamente
relative all’insieme di dati osservato, ma possono anche provenire dalle
i
k
)
2
86

Capitolo 4: Approccio statistico bayesiano e test multipli in esperimenti di microarray
considerazioni su esperimenti simili realizzati da altri gruppi. Inoltre,
l’analista può modulare la scelta della distribuzione in base alla sua
conoscenza delle osservazioni o alla personale confidenza nel risultato che
sta cercando di verificare.
Dall’analisi di questo e dei precedenti metodi, potrebbe sembrare
che la scelta della distribuzione a priori non sia così vincolante.
In realtà non bisogna dimenticare che nel procedimento o
“framework” bayesiano i risultati della stima al passo precedente vengono
utilizzati come ingressi del passo successivo.
Essendo, inoltre, questo processo sempre convergente verso una
stima corretta del parametro in esame, la scelta di un’opportuna
distribuzione a priori comporta una riduzione del numero di iterazioni
necessarie, ossia un aumento della velocità di convergenza.
4.2 Statistica “B” e modello gerarchico per i dati di
espressione genica
Sulla base degli argomenti appena trattati è ora possibile introdurre
la statistica B, o fattore di Bayes, per la discriminazione dei geni
differenzialmente espressi, inserendola in un “framework” bayesiano
basato su di un modello gerarchico dei dati di espressione genica.
Si indichi con:
R
M ij = log2
G
ij
ij
87

Capitolo 4: Approccio statistico bayesiano e test multipli in esperimenti di microarray
il logaritmo del rapporto dei due canali per il gene i sull’array j, con
i=1,…,N e j=1,…,n.
Sono stati già illustrati nel capitolo 3 i limiti dei metodi che
stabiliscono una soglia su Mij per la selezione dei geni differenzialmente
espressi.
Da un punto di vista più strettamente statistico, è necessario
evidenziare alcuni problemi intrinseci alla struttura stessa dei dati; essi,
infatti, sono generalmente costituiti da un insieme assai limitato di
osservazioni per ogni singolo gene, rispetto al numero totale di geni
presenti sul vetrino.
Questa caratteristica può invalidare l’uso di statistiche classiche,
come la statistica t, per realizzare la selezione; ad esempio, un alto valore
di t può essere determinato da un errore standard estremamente
contenuto al suo denominatore e ciò può accadere anche quando la
differenza fra le medie al numeratore sia molto piccola.
Un tipico esempio di soluzione a questo problema è stato illustrato
con la statistica introdotta dal SAM, in cui la costante additiva al
denominatore agisce proprio in funzione di una limitazione degli errori di
primo tipo.
Un’alternativa ai metodi che fanno uso di statistiche t modificate
può venire proprio da un approccio empirico bayesiano ai dati di
espressione genica.
4.2.1 “Posterior odds” dell’espressione differenziale
Si supponga che i dati Mij, relativi ad ogni gene i, si distribuiscano
seguendo una variabile aleatoria normale con media μi e varianza σi 2 :
Mij | μi, σi 2 ∼ N(μi, σi 2) ∀ i
88

Capitolo 4: Approccio statistico bayesiano e test multipli in esperimenti di microarray
Per indicare se un gene g è differenzialmente espresso oppure non
ha mutato la sua espressione in seguito al trattamento effettuato, si può
utilizzare un insieme di indicatori o indici definito nel modo seguente:
I g
⎧0
= ⎨
⎩1
se il gene non è differenzialmente espresso
se il gene è differenzialmente espresso
Per ogni gene g, è possibile calcolare la probabilità a posteriori che
esso sia differenzialmente espresso (Ig=1) dato l’insieme di osservazioni Mij
e metterla in rapporto con la probabilità a posteriori che la sua
espressione sia rimasta immutata (Ig=0) dato l’insieme di osservazioni Mij;
ciò corrisponde a definire il rapporto degli “odds” a posteriori per il gene g.
La statistica B per ogni singolo gene viene definita come il logaritmo
del rapporto dei suoi “odds” a posteriori:
B
g
Pr( I
= log
Pr( I
g
g
= 1|
M
= 0 | M
per cui Pr(Ig=1|Mij) > Pr(Ig=0|Mij) se e solo se Bg > 0.
Applicando il teorema di Bayes all’espressione di Bg e nell’ipotesi che
gli Mij siano indipendenti al variare di i, si può scrivere:
dove:
B
g
p Pr( Mij | Ig=
1)
= log
1− p Pr( M | I = 0)
ij g
p Pr( M | 1) Pr( Mi | I 1)
i= g Ig=
g =
i≠g = log
1− p Pr( Mi= g| Ig= 0) ∏ Pr( Mi| Ig=
0)
i≠g p Pr( Mi= g| Ig=
1)
= log
1− p Pr( M | I = 0)
i= g g
∏
ij
ij
)
)
89

Capitolo 4: Approccio statistico bayesiano e test multipli in esperimenti di microarray
Mg è il vettore delle n osservazioni per il gene g;
p è la proporzione di geni differenzialmente espressi
nell’esperimento, definita come p = Pr(Ii=1) per ogni i=1,…,N.
Per calcolare BBg è necessario quantificare l’espressione di Pr(Mg|Ig=1)
e Pr(Mg|Ig=0), che sono le distribuzioni marginali di Mg rispetto agli indici e
che possono essere indicate seguendo la notazione statistica con:
Pr( M
Pr( M
i
i
| I
| I
g
g
= 1)
≡
=
0)
≡
f
I = 1
f
i
I = 0
i
( M
i
( M
Ciò può essere realizzatto attraverso la definizione di un modello
gerarchico dei dati, come si vedrà nel prossimo paragrafo.
marginali
4.2.2 Modello gerarchico e calcolo delle distribuzioni
Si supponga di avere a disposizione le osservazioni relative ad una
data variabile casuale Y e di averle collezionate da m popolazioni grazie ad
n osservazioni per ogni popolazione.
Sia yij l’osservazione j della popolazione i e si supponga che ogni yij si
distribuisca seguendo l’andamento di una variabile aleatoria
caratterizzabile attraverso i suoi parametri descrittivi:
yij ~ f(θi)
)
i
)
90

Capitolo 4: Approccio statistico bayesiano e test multipli in esperimenti di microarray
dove θi è il vettore dei parametri per la popolazione i.
Inoltre, per ogni θi sia possibile stabilire una distribuzione a priori
anch’essa descrivibile attraverso i suoi parametri:
θi ~ f(Θ)
In questo modo sono stati realizzati i passi del procedimento
bayesiano di stima dei parametri, come illustrato nei primi paragrafi di
questo capitolo.
Si assuma, ora, che anche i parametri Θ siano delle variabili
aleatorie casuali e che si debba specificare per esse una distribuzione
f(a,b):
Θ ∼ f(a,b)
allora Θ viene chiamata iper-priori e il modello dei dati viene definito
gerarchico, con ovvio riferimento ai diversi livelli di definizione delle
distribuzioni, come si può osservare nella figura 4.1.
Iper-priori
Θ
θ11 θ21 θ31
Priori
y11 y12 y13 y21 y22 y23 y31 y32 y33
Osservazioni
Figura 4.1: Schema del modello gerarchico per un insieme di dati
91

Capitolo 4: Approccio statistico bayesiano e test multipli in esperimenti di microarray
Tipicamente le osservazioni relative ad ogni gene in un esperimento
di microarray sono poche, mentre il numero di geni sul quale è necessario
effettuare un test simultaneo delle ipotesi è molto grande.
Definendo un modello gerarchico per le osservazioni è possibile
utilizzare le informazioni relative all’intero insieme di dati per descrivere le
distribuzioni marginali della media μi e della varianza σi 2 , cioè dei
parametri della distribuzione N(μi, σi 2 ) relativa alle osservazioni del gene i-
esimo.
Una possibile struttura gerarchica ipotizza che:
1/σi 2 si distribuisce seguendo una variabile aleatoria Γ ed
essa è una iper-priori del modello;
la distribuzione di μi condizionata a 1/σi 2 è normale ed essa è
una priori del modello.
Seguendo questo modello gerarchico, se si definisce per la media μi
una distribuzione tale che:
dove:
τi = na/2σi 2 ~ Γ(υ,1);
⎧0
μi | τi⎨
⎩N(0,
cna/
2 τi
)
υ sono i gradi di libertà della distribuzione;
a>0 e c>0 sono dei parametri di scala,
se Ii=0
se Ii=1
92

diventano:
Capitolo 4: Approccio statistico bayesiano e test multipli in esperimenti di microarray
allora le distribuzioni marginali per ogni livello della gerarchia
1 υ −1
−τ
f ( τ )
i
i = τi
e
Γ
( υ )
( )
Ii= 0 i
( μ ) = δ ( 0)
( )
( ) ∫∫ ( , , )
−1/2
1 2τ
i 2
1/2 1/2 na − μ
− − ⎛ ⎞
i
2 cna
fI 1 (2 )
i = μi τi = π c ⎜ ⎟ e
⎝2τi⎠ f
( , ) ( ) ( )
( Mij
μi
)
−n
/2 1 2τ
i
n /2 na − j −
− ⎛ ⎞ ∑
2 na
f Mi μi, τi = (2 π)
⎜ ⎟ e
⎝2τi⎠ e
f M = f M μ τ dμ dτ
=
=
Ii= 1 i Ii= 1 i i i i i
∫∫
f M μ τ f μ τ f τ dμ dτ
i i i Ii= 1 i i i i i
f ( M ) = f ( M μ , τ ) f ( μ τ ) f ( τ ) dμ
dτ
=
Ii= 0 i i i
∫
∫∫
( 0, ) ( )
= f M μ = τ f τ dτ
i i i i i
i Ii= 0 i i i i i
Dal risultato delle integrazioni si ottengono le espressioni delle due
distribuzioni marginali che vengono messe a confronto per ogni gene nella
statistica Bg:
2
93

Capitolo 4: Approccio statistico bayesiano e test multipli in esperimenti di microarray
f
f
Ii
= 1
Ii
= 0
( M )
i
( M )
i
⎛ n ⎞
Γ⎜υ
+ ⎟
=
⎝ 2 ⎠
Γ
( υ)
⎛ n ⎞
Γ⎜υ
+ ⎟
=
⎝ 2 ⎠
Γ
( υ)
⎛ na ⎞
⎜ ⎟
⎝ 2 ⎠
−n
/ 2
−n
/ 2 ( 2π
) ( 1+
nc)
−n
/ 2
−1/
2
−n
/ 2⎛
na ⎞ ⎡ 1 2 2
( 2π
) ⎜ ⎟ 1+
( s + M )
⎝
2
⎠
⎢
⎣
a
i
⎡ 1 ⎛
⎢1+
⎜ s
⎣ a ⎝
i.
⎤
⎥
⎦
2
i
⎛ n ⎞
−⎜υ
+ ⎟
⎝ 2 ⎠
2
M ⎞⎤
i.
+ ⎟
⎟⎥
1+
nc ⎠⎦
dove Mi. è la media delle osservazioni relative a tutti i geni.
Quindi, per ogni gene g la statistica B assume la forma:
B
g
⎡ ⎤
2 2
p 1 ⎢ a+ sg + M ⎥
g.
= log ⎢ ⎥ 2
1− p 1+
nc ⎢ M 2 g.
⎥
⎢ a+ sg+
⎣ 1+
nc ⎥
⎦
⎛ n ⎞
−⎜υ
+ ⎟
⎝ 2 ⎠
La sola parte gene-specifica della statistica B è il rapporto fra
parentesi quadre, che è sempre un numero ≥1 perché il denominatore è
sempre minore o uguale al numeratore; ciò significa che un incremento
nell’espressione differenziale, cioè un incremento della media Mg. fa
aumentare il valore della statistica anche quando la varianza è piccola e la
presenza della costante di scala a garantisce che il rapporto non assuma
valori troppo grandi a causa di medie Mg. troppo piccole.
E’ necessario, inoltre, porre l’attenzione sul fatto che, diversamente
da altre statistiche, non esiste un valore di soglia di B rispetto al quale
dichiarare che un gene è differenzialmente espresso. Al crescere del valore
della statistica si incrementa la probabilità che il gene possa essere
considerato a ragione differenzialmente espresso e, analogamente, per
valori negativi di B è molto più verosimile supporre che l’espressione
differenziale sia assente.
94

Capitolo 5
Modelli additivi ANOVA per l’analisi dei dati
di espressione genica
L’uso di un procedimento Bayesiano per l’analisi dei dati generati
con microarray, illustrato nel precedente capitolo, non considera la
struttura dell’esperimento, cosicché gli effetti del trattamento in esame
possono essere confusi con alcune delle sorgenti di variabilità tipicamente
presenti su questo tipo di dati.
Dal momento in cui queste fonti di variabilità vengono identificate,
si può pensare di misurare il loro effetto sul dato o, come si dice in termini
statistici, cercare di quantificare la varianza “spiegata” da tali sorgenti, in
relazione alla varianza totale dell’insieme di dati, nel tentativo di
eliminarla.
Questo può essere ottenuto disegnando in maniera opportuna
l’esperimento, in modo da raccogliere un’adeguata quantità di misure e
contribuire a monitorare gli effetti di alcune delle fonti di variabilità. Ad un
disegno sperimentale idoneo si deve aggiungere la capacità di realizzare
un modello descrittivo dei dati, che renda possibile la diversificazione
dell’effetto del trattamento di interesse da quelli legati a fonti di variabilità
indesiderate.
Kerr e Churchill (Kerr et al., 2001a, Kerr & Churchill, 2001b e Kerr
et al., 2002) sono stati i primi a studiare le potenziali sorgenti di variabilità
in esperimenti di microarray e ad incorporarle in un modello additivo
attraverso il metodo statistico di analisi della varianza a più fattori ANOVA
(ANalysis Of VAriance).
95

Capitolo 5: Modelli additivi ANOVA per l’analisi dei dati di espressione genica
In questo capitolo verranno illustrate le principali fonti di variabilità
dei dati, per poi metterle in relazione con diverse tipologie di disegno
sperimentale e con diversi modelli proposti per la loro quantificazione.
96

Capitolo 5: Modelli additivi ANOVA per l’analisi dei dati di espressione genica
5.1 Fonti di variabilità sui dati di espressione genica
Le sorgenti di variabilità che si hanno per i dati di espressione
genica possono includere sia fattori sperimentali sia rumore casuale o
“random”; il metodo dell’analisi della varianza cerca di quantificare tale
variabilità e di esaminare se sia statisticamente comparabile con quella
attribuita alle sorgenti “random”.
Si supponga, per esempio, di trattare con un farmaco un gruppo di
cavie e di confrontare mediante microarray i campioni ottenuti dopo il
trattamento con quelli di un gruppo di controllo non trattato: l’analisi
della varianza consente di esaminare le differenze rilevate fra i gruppi,
dividendole in effetto del trattamento ed effetto dovuto ai fattori
sperimentali che si abbattono sull’espressione differenziale.
Il processo è concettualmente simile alla normalizzazione, poiché si
tratta di eliminare, anche in questo caso, gli errori sistematici che
contribuiscono a corrompere il dato di espressione, ma, in più, l’analisi
della varianza permette di rilevare direttamente l’espressione differenziale
sui dati ripuliti.
Il tipo più semplice di esperimento microarray consiste nel cercare
di misurare i cambiamenti nell’espressione genica in campioni che
differiscono per un unico fattore, ad esempio la somministrazione di un
farmaco.
Si indicano con il termine varietà tutte le categorie del fattore di
interesse: nel caso della somministrazione del farmaco le due categorie
saranno trattato e non-trattato (controllo).
Nel loro lavoro Kerr e Churchill (Kerr e Churchill ,2001b) hanno
messo in evidenza che la variabilità può essere dovuta essenzialmente a
quattro sorgenti principali:
Effetto Array (A);
Effetto Fluorocromo (D);
97

Capitolo 5: Modelli additivi ANOVA per l’analisi dei dati di espressione genica
Effetto Varietà o Trattamento (V o T);
Effetto Gene (G).
Sotto il nome di effetto “Array” vengono classificate le variazioni di
segnale fra array, mediate su tutti i geni, i fluorocromi e i trattamenti. Una
problematica frequente che può condurre alla rilevazione di questo effetto
può essere la non uniformità del processo di ibridazione del campione
marcato.
L’effetto “Fluorocromo” o “Dye” misura le differenze intrinseche di
emissione dei due fluorocromi. Nel caso di microarray “dual-color”, dove si
fa uso di due cianine per marcare il campione, si può facilmente rilevare
sin dalla fase di acquisizione dell’immagine che il fluorocromo Cy5 (rosso)
ha un’efficienza di emissione più bassa rispetto al fluorocromo Cy3
(verde).
Questo comportamento è dovuto ad una differente sensibilità dei
due fluorocromi rispetto all’eccitazione indotta con il laser e si ripercuote
sul bilanciamento del segnale nei due canali.
L’effetto “Varietà” si riscontra quando le categorie del fattore di
interesse presentano livelli di espressione diversi, dovuti a fattori non
riconducibili al trattamento. Questo potrebbe verificarsi, nel caso della
somministrazione del farmaco, se venisse preso come controllo un tessuto
diverso da quello trattato: l’espressione differenziale sarebbe riconducibile
anche alle differenze fra i due tessuti.
L’effetto “Gene” si può verificare quando alcuni geni mostrano una
diversa risposta all’ibridazione; ciò si manifesta con la generazione di una
variazione del segnale, di intensità indipendente dalla quantità di
campione ibridizzato.
Gli effetti descritti sono soltanto i fattori principali. Con quattro
fattori principali è possibile considerare 2 4 =16 effetti complessivi ripartiti
in:
quattro effetti principali,
sei interazioni a due fattori,
98

Capitolo 5: Modelli additivi ANOVA per l’analisi dei dati di espressione genica
quattro interazioni a tre fattori,
una interazione a quattro fattori.
Anche nel caso dei fattori di interazione è possibile identificare
alcune cause alla base dell’insorgenza degli effetti combinati.
L’effetto combinato del fluorocromo e del trattamento (DV) si può
ricondurre ad una differente efficienza di incorporazione del marcatore nei
campioni di cDNA da analizzare. Si supponga, per esempio, che il
fluorocromo verde presenti una differente efficienza di incorporazione
rispetto a due diverse varietà, mentre il fluorocromo rosso si comporti in
maniera equivalente con entrambe. Questa situazione è schematizzata
nella figura 5.1, dove la linea orizzontale è indicativa del comportamento
costante del fluorocromo rosso, mentre quella obliqua evidenzia la
differenza di incorporazione del fluorocromo verde sui due campioni T1 e
T2.
Figura 5.1: Schematizzazione dell’effetto combinato DV
In un esperimento in cui venissero realizzate due ibridizzazioni su
due microarray con marcatura invertita dei campioni, sarebbero rilevate
delle differenze in espressione non imputabili ad un effetto del
trattamento, ma attribuibili al comportamento non omogeneo del
fluorocromo verde.
99

Capitolo 5: Modelli additivi ANOVA per l’analisi dei dati di espressione genica
L’ effetto di interazione fra l’array e il gene (AG) si può verificare se lo
stesso gene su diversi array è presente con una concentrazione diversa di
sonde di cDNA disponibili per l’ibridazione. Questo effetto viene spesso
denominato “Spot-effect” perché dipende fortemente dal processo di
deposizione delle sonde sul microarray e, per eliminarlo, si possono
seguire due strategie:
considerare ogni spot come un’unità a sé, anche se così
facendo si perdono le informazioni globali sul gene (per
esempio le repliche sperimentali);
cercare di ricostruire un modello statistico della densità dello
spot o delle proprietà della punta di deposizione.
Figura 5.2: Schematizzazione dell’effetto combinato AG
Generalmente è difficile riuscire a modellare lo “Spot-effect”, per cui
si tende a migliorare la misura relativa ad ogni spot aumentando il
numero delle repliche sperimentali, in modo da avere più dati a
disposizione per l’interpolazione del loro modello.
L’effetto Dye-Gene (DG) si realizza se ci sono interazioni gene-
specifiche fra il gene e il fluorocromo; questo tipo di effetto è abbastanza
raro e una sua schematizzazione è mostrata in figura 5.3.
100

Capitolo 5: Modelli additivi ANOVA per l’analisi dei dati di espressione genica
Figura 5.3: Schematizzazione dell’effetto combinato DG
L’interazione fra il trattamento e il gene (VG) si realizza quando un
gene mostra espressione differenziale nelle diverse varietà ibridizzate sul
microarray e questa differenza è riconducibile proprio al trattamento. La
quantificazione di questo effetto è l’obiettivo principale dell’esperimento e
la sua schematizzazione è mostrata in figura 5.4.
Figura 5.4: Schematizzazione dell’effetto combinato VG
Le interazioni AD, AT e ADT non sono gene-specifiche ed è difficile
connettere ognuno di questi effetti combinati ai processi che si realizzano
sui microarray.
101

Capitolo 5: Modelli additivi ANOVA per l’analisi dei dati di espressione genica
Le interazioni ADG, ATG, DTG e ADTG sono invece gene-specifiche.
La presenza di tali interazioni dimostrerebbe che ci sono variazioni
attribuibili a particolari coppie array-fluorocromo, array-trattamento,
fluorocromo-trattamento o combinazioni di array-fluorocromo-trattamento
in relazione ad un particolare gene. Queste interazioni di ordine superiore
al secondo sono difficili da collegare a processi fisici o chimici che si
realizzano nei microarray e generalmente si assume che non si verifichino.
Esistono diversi modelli per quantificare le fonti di variabilità
illustrate; la possibilità di valutare tutti gli effetti che compaiono in essi è
consentita, oltre che da un adeguato numero di dati sperimentali, anche
da un’opportuna pianificazione del modello statistico e del disegno
dell’esperimento.
5.2 Modelli additivi ANOVA per l’analisi dell’espressione
La formulazione di un modello dei dati di intensità è legata non
soltanto all’identificazione delle sorgenti di variabilità, ma anche ad
un’adeguata caratterizzazione statistica degli effetti.
E’ possibile distinguere fra effetti fissi, statisticamente modellabili
con variabili aleatorie indipendenti ed identicamente distribuite, ed effetti
“random”, che presentano le caratteristiche di variabili aleatorie generate
da processi tipicamente utilizzati per descrivere l’errore non sistematico di
misura o errore “random”.
Sulla base della descrizione statistica degli effetti, vengono definiti
modelli “random”, in cui tutti gli effetti coinvolti vengono considerati
casuali, modelli misti nei quali viene individuata una parziale componente
sistematica, e modelli fissi in cui tutti gli effetti sono sistematici a meno
dell’errore di misura.
102

Capitolo 5: Modelli additivi ANOVA per l’analisi dei dati di espressione genica
Per poter utilizzare questi modelli è necessario operare delle
trasformazioni sui dati in modo da renderli idonei per la successiva
elaborazione.
La trasformazione più frequentemente utilizzata sui dati grezzi di
intensità è quella logaritmica, al fine di generare un modello additivo
piuttosto che moltiplicativo. Utilizzando questa scala si indica con yijkg il
logaritmo dell’intensità della fluorescenza misurata per l’array i, il
fluorocromo j, la varietà k e il gene g.
Assumendo che lo stesso insieme di geni sia depositato su ogni
array dell’esperimento, si ha a disposizione un insieme completo di
osservazioni per ogni combinazione di array, fluorocromo e varietà: in
conseguenza di ciò l’effetto gene e le sue combinazioni sono ortogonali,
ossia indipendenti, a tutti gli altri effetti e l’esperimento si dice bilanciato.
Questo porta a suddividere gli effetti in due gruppi: effetti globali,
che coinvolgono solo gli effetti principali A, D e V, ed effetti gene-specifici,
che coinvolgono G. L’effetto di interesse VG è, quindi, gene-specifico.
Se gli effetti non sono ortogonali, ossia la quantificazione di uno
fornisce informazioni ridotte o complete anche sull’altro, si parla di
confusione dell’informazione, ossia di mascheramento parziale o totale
degli effetti.
5.2.1 Modelli additivi misti
La scelta più generale operabile quando non vi sono informazioni
per caratterizzare gli effetti come variabili indipendenti ed identicamente
distribuite è considerarli tutti come effetti casuali e generare un modello
“random”. Malgrado questa scelta garantisca la completa generalizzabilità
del modello, essa ha lo svantaggio di essere estremamente onerosa dal
punto di vista della quantificazione di questi effetti.
103

Capitolo 5: Modelli additivi ANOVA per l’analisi dei dati di espressione genica
Una valutazione più approfondita degli effetti e dei processi fisici che
essi cercano di modellare può portare alla definizione di un modello misto,
nel quale non tutte le sorgenti di variabilità vengono considerate casuali.
Questo tipo di modello per i dati di espressione genica è stato
introdotto per la prima volta nel lavoro di Wolfinger (Wolfinger et al.
(2001)) e si sviluppa in due stadi: un primo stadio di normalizzazione, cui
segue un secondo di calcolo degli effetti gene-specifici.
La normalizzazione serve ad eliminare il contributo degli effetti
principali globali ed essa viene realizzata attraverso la definizione di un
sotto-modello per la loro stima, diverso a seconda degli effetti globali da
stimare.
Un modello completo, in cui vengono presi in considerazione tutti gli
effetti globali e gene-specifici, può avere la seguente forma:
yijkg = μ + Ai + Dj + Vk + Gg + (VG)kg + (AG)ig + (DG)jg + εijkg
dove:
il termine μ si riferisce all’intensità media totale calcolata su
tutti i geni di tutti gli array;
il termine ε rappresenta l’errore “random”; questo è una
quantità aleatoria che si distribuisce secondo una variabile di
Fisher con media nulla e varianza σ 2 e rappresenta tutta
l’informazione che non si riesce a modellare.
Supponendo di aver utilizzato un disegno dell’esperimento che
mascheri l’effetto della varietà con quello combinato dell’array e del
fluorocromo (AD), come accade quando si inverte la marcatura dei due
104

Capitolo 5: Modelli additivi ANOVA per l’analisi dei dati di espressione genica
campioni confrontati nell’ibridizzazione su due vetrini, il modello parziale
di normalizzazione ha la seguente forma:
dove:
yijkg = μ + Ai + Dj + ADk + xijkg
xijkg rappresenta il termine dei residui del modello, che, per
ipotesi, hanno distribuzione normale.
La stima degli effetti globali A, D e AD e della media totale μ serve a
“centrare” la distribuzione dei dati rispetto a questi effetti e assolve,
quindi, lo stesso compito della normalizzazione globale illustrata nel
capitolo 2.
In questo modo i dati grezzi di intensità vengono “ripuliti” senza
ricorrere a tecniche di normalizzazione, ma solo attraverso la
quantificazione di queste sorgenti di variabilità.
Purtroppo, come evidenziato nel capitolo 2, spesso gli errori
sistematici riscontrabili sui dati sono non lineari rispetto all’intensità, per
cui è necessario fare una correzione che sia intensità-dipendente. A tale
scopo, prima di effettuare la successiva elaborazione per identificare i geni
differenzialmente espressi, è necessario operare una correzione del colore,
realizzabile tramite una normalizzazione LO(W)ESS.
I residui xijkg del modello del primo stadio diventano i dati del
modello del secondo stadio, che è, invece, un modello gene-specifico, come
deducibile dal pedice g di ogni effetto, e serve a generare la stima
dell’effetto di interesse VG e degli altri effetti combinati gene-specifici.
Questo avviene grazie all’interpolazione ai minimi quadrati della formula
che schematizza il secondo stadio del modello:
105

dove:
Capitolo 5: Modelli additivi ANOVA per l’analisi dei dati di espressione genica
xijkg = μg+ (VG)kg + (AG)ig + (DG)jg + εijkg
il termine μ g si riferisce all’intensità media totale calcolata
sul gene che si sta considerando.
Alcuni effetti possono essere considerati casuali in base alla
considerazione che non vi è un’effettiva certezza che essi si abbattano in
maniera sistematica su tutti i dati.
E’ questo il caso dell’effetto AG che, verosimilmente, potrebbe avere
un’entità diversa sullo stesso gene in array differenti. Dal punto di vista
statistico l’effetto AG viene, quindi, trattato come se fosse una variabile
aleatoria con distribuzione normale a media nulla e il modello così definito
viene detto misto.
5.2.2 Modelli additivi fissi
I modelli additivi fissi proposti da Kerr e Churchill ereditano, dal
modello misto appena illustrato, la formulazione a due stadi; anche in
questo caso, infatti, lo stadio gene-specifico di valutazione dell’effetto VG
viene preceduto da quello di normalizzazione.
Un modello ANOVA semplice include solo i fattori principali e
l’effetto VG e può essere schematizzato con la formula seguente:
yijkg = μ + Ai + Dj + Vk + Gg + (VG)kg + εijkg
106

Capitolo 5: Modelli additivi ANOVA per l’analisi dei dati di espressione genica
Un modello più plausibile aggiunge le variazioni spot a spot,
includendo l’effetto combinato AG, e la sua struttura è descritta dalla
formula seguente:
yijkg = μ + Ai + Dj + Vk + Gg + (VG)kg + (AG)ig + εijkg
Un’altra possibilità è quella di aggiungere l’interazione fluorocromo-
gene (DG), generando così il modello completo già illustrato nel paragrafo
precedente.
Questi modelli sono relativi a situazioni in cui ogni gene è presente
in una sola copia per array. Se i geni sono depositati in r copie per ogni
array, la varianza del termine di interesse VG decrementa di un fattore 1/r
ed è possibile inserire un “effetto replica S” nel modello, per catturare le
differenze fra gli spot duplicati all’interno dell’array, così come indicato
nella formula:
yijkgr = μ + Ai + Dj + Vk + Gg + (VG)kg + (AG)ig + (DG)jg +
Sr(ig)+ + εijkgr
Poiché si assume che tutti gli effetti presenti nei tre modelli siano
variabili aleatorie indipendenti e identicamente distribuite con media
nulla, a meno del termine di errore “random”, si parla di modello fisso.
Le stime degli effetti del modello sono realizzate attraverso
un’interpolazione ai minimi quadrati, minimizzando la quantità:
∑
[yijkgr
− μ
ijkgr
− A
i
− D
j
− V
k
− G
g
− (VG)
kg
− (AG)
ig
− (DG)
jg
− S
r(ig)
]
2
107

Capitolo 5: Modelli additivi ANOVA per l’analisi dei dati di espressione genica
con i vincoli che:
∑ i = ∑Dj= ∑Vk= ∑Gg= ∑ ( AG)
ig = ∑ ( AG)
ig = ∑ ( VG)
kg = ∑
=
A ( VG)
∑ ( ) jg = ∑ ( DG)
jg = ∑ Sr
( ) =
DG 0
g j r ig
g i
g k kg
L’effetto di interesse VGkg per ogni gene g e trattamento k è ottenuto
attraverso la stima ai minimi quadrati :
VGkg = t..
kg.
− t..
k..
− t...
g.
dove t rappresenta il logaritmo delle intensità e ogni punto dei pedici
+ t
identifica il termine sul quale è stata eseguita la media.
5.3 “Nested” F-test e determinazione dei geni
differenzialmente espressi
Una volta effettuata l’interpolazione ai minimi quadrati dei
parametri del modello si può passare alla determinazione dei geni
differenzialmente espressi.
.....
=
108

Capitolo 5: Modelli additivi ANOVA per l’analisi dei dati di espressione genica
Con questa tecnica di analisi dei dati di intensità, si decide se un
gene è differenzialmente espresso realizzando un test delle ipotesi sul
modello che è stato interpolato.
F-test.
Seguendo lo schema classico del test delle ipotesi si definiscono:
ipotesi nulla o modello nullo: il trattamento non ha effetto sul
gene e (VG)1g=…=(VG)kg=0 nel modello;
ipotesi alternativa o modello alternativo: il gene è
differenzialmente espresso e vi è almeno un k per il quale il
termine (VG)kg≠0 nel modello.
L’adeguatezza dei due modelli viene verificata attraverso un “nested”
Due modelli vengono dichiarati “nested” o “annidati” se il modello
definito completo o alternativo contiene tutti i termini del modello definito
parziale o nullo e almeno un termine addizionale diverso da zero.
Se si definisce il modello nullo secondo la classica formulazione
statistica come:
( y)
= β 0 + β1x1
+ β 2x
2 …+
g xg
E β
dove E(y) rappresenta l’aspettazione dei dati y, allora il modello
alternativo che lo contiene avrà la forma:
( y)
= β 0 + β1x1
+ β 2 x2
…+ β g x g + β g+
1x
g + 1 + …+
k xk
E β
109

segue:
Capitolo 5: Modelli additivi ANOVA per l’analisi dei dati di espressione genica
e dal punto di vista del test delle ipotesi, esse verranno definite come
H
H
0 : g+
1 = β g+
2
a
β = … = β = 0
: almeno un
k
parametro β con a = g + 1,... k
a
è diverso da
Per testare queste ipotesi è possibile utilizzare un F-test in cui la
classica statistica F viene sostituita con una che realizza il confronto fra i
residui dei due modelli piuttosto che fra le varianze dei dati e che è
definita come segue:
F
=
( SSE − SSE ) ( k − g)
reduced
SSE
full
full
[ n − ( k + 1)
]
dove SSE indica la somma degli errori quadratici dei residui per i
due modelli secondo la definizione classica, k sono i gradi di libertà per il
modello nullo, g quelli per il modello alternativo e n è il numero delle
osservazioni.
Questa statistica si distribuisce ancora come una variabile F di
Fisher con k − g gradi di libertà per il numeratore e n − ( k 1 gradi di libertà
per il denominatore. La regola di rigetto dell’ipotesi nulla stabilisce che il
modello nullo viene rifiutato se > Fk
−g
, n−
k+
1 ., dove F
critico della variabile tabulata.
+ )
F ( )
k-g,n-(k+1) è il valore
Questo test è anche conosciuto con il nome di “F-test parziale” e per
i dati di intensità ricavati dai geni si traduce in:
0
110

Capitolo 5: Modelli additivi ANOVA per l’analisi dei dati di espressione genica
F
( rss
=
0
− rss1)
/( df
rss / df
1
1
0
− df
dove rss è l’equivalente di SSE e df sono i gradi di libertà del
modello nullo (pedice 0) e alternativo (pedice 1). Questa statistica è gene-
specifica, poiché vengono utilizzati i dati dell’interpolazione del modello
gene-specifico.
In un procedimento di F-test è possibile utilizzare altre statistiche
per la discriminazione dei geni differenzialmente espressi.
Se, per esempio, si vuole considerare una varianza dell’errore
comune su tutti i geni di tutti gli array, la statistica F può essere definita
come:
F
( rss
=
0
− rss ) /( df
σ
1
2
pool
0
− df
1
1
)
)
2
σ pool
utilizzando un’informazione globale in supporto di quella gene-
specifica espressa dal numeratore.
Una via di mezzo fra le due statistiche appena definite può venire
dal considerare una combinazione di varianza globale e gene-specifica al
denominatore della statistica da computare:
( rss0
− rss1)
/( df0
− df1)
F =
2
( rss / df + σ ) / 2
1
1
pool
111

Capitolo 5: Modelli additivi ANOVA per l’analisi dei dati di espressione genica
Le tre statistiche sono praticamente equivalenti e l’adozione di una
di esse può dipendere dalle informazioni che si hanno sui dati e dalle
ipotesi fatte su di essi.
Una volta stabilito il criterio da adottare per verificare le ipotesi, si
può stabilire di effettuare delle permutazioni sui dati, senza o con
sostituzione (bootstrap), per irrobustire il risultato del test statistico e
acquisire un livello di confidenza opportuno.
A conclusione di tutto il procedimento è possibile realizzare un
clustering dei risultati per raggruppare i geni differenzialmente espressi in
base a profili di espressione comuni.
L’analisi dei residui del modello è utile non solo per determinare
l’espressione differenziale dei geni, ma ha anche lo scopo di verificare
l’adeguatezza del modello.
Infatti, dallo scatterplot dei residui è possibile rilevare la presenza di
andamenti non casuali (o tendenze) sui dati dei residui; ciò indica
l’inclusione di elementi di informazione in un elemento del modello che
viene considerato “random” e, quindi, per definizione non informativo.
Riscontrare una situazione del genere deve portare ad un’analisi più
approfondita degli effetti da considerare nel modello che viene interpolato,
per non rischiare di mantenere errori sistematici che corrompono i dati o
di non quantificare effetti di interesse.
5.4 Disegno di esperimenti con microarray
Una corretta definizione del modello non può prescindere dal
disegno sperimentale che è stato adottato, soprattutto, per determinare il
mascheramento degli effetti e per massimizzare l’informazione che si può
ottenere dall’esperimento stesso.
112

Capitolo 5: Modelli additivi ANOVA per l’analisi dei dati di espressione genica
Gli esperimenti che utilizzano microarray per l’analisi di espressione
genica generano un’insieme complesso e numeroso di dati multivariati.
L’aspetto più impegnativo della bioinformatica nel settore dei microarray è
la produzione di strumenti statistici e computazionali per l’analisi dei dati
prodotti, ma un compito di importanza non secondaria è la valutazione di
disegni sperimentali appropriati che rendano più efficiente e robusto il
processo di generazione di queste informazioni.
Il problema del disegno sperimentale è particolarmente rilevante in
esperimenti con microarray “two-color”, in cui è fondamentale stabilire
quali campioni devono essere ibridizzati su ogni microarray per poter
effettuare un’analisi di tipo comparativo fra le intensità dei due canali.
Su microarray di tipo Affymetrix il problema è meno stringente, per
il fatto che ogni campione viene ibridizzato separatamente su un
microarray dedicato e, poiché viene ricavato un valore assoluto
dell’intensità, è possibile simulare, mediante software, qualunque disegno
sperimentale accoppiando i campioni in fase di analisi.
Il principale compito del disegno sperimentale è rendere l’analisi dei
dati e l’interpretazione dei risultati più semplice e potente possibile, in
relazione alle domande cui l’esperimento deve dare una risposta e ai
vincoli sul materiale che lo sperimentatore ha a disposizione.
Da un punto di vista pratico, i problemi che bisogna considerare
quando si progetta un esperimento con microarray sono di diverso tipo:
Fissare l’obiettivo dell’esperimento:
- Domande biologiche alle quali si vorrebbe dare risposta;
- Priorità da assegnare ad ogni questione;
Stabilire il tipo e le concentrazioni minime dei campioni che
servono per realizzare l’analisi comparativa;
Decidere quali campioni devono essere messi a confronto sullo
stesso microarray e, di conseguenza, quale marcatura va
effettuata per ogni campione;
113

Capitolo 5: Modelli additivi ANOVA per l’analisi dei dati di espressione genica
Determinare il numero di vetrini che servono per realizzare il
disegno sperimentale adottato;
Definire un protocollo sperimentale per la preparazione, la
marcatura e l’ibridizzazione dei campioni;
Valutare il costo dell’esperimento ed apportare eventuali
modifiche in relazione al budget disponibile.
Prima di discutere gli elementi con i quali stabilire il disegno
sperimentale più opportuno, è utile illustrare le convenzioni grafiche
tipicamente utilizzate per una rappresentazione schematica (Yang and
Speed, 2002).
Uno schema tipico di un esperimento con microarray si ottiene con
l’utilizzo di un “multi-grafo orientato”. Ogni campione viene rappresentato
con un quadrato e ogni array con una freccia fra i campioni: la punta della
freccia indica il campione marcato in rosso, mentre l’altra estremità indica
quello marcato in verde. La presenza di un numero posizionato sulla
freccia indica il numero di array utilizzati per quel confronto, ossia il
numero di repliche sperimentali.
Figura 5.5: Grafo del confronto diretto fra due campioni A e B
La struttura del grafo determina quali espressioni differenziali
possono essere stimate e con che precisione: due campioni possono essere
confrontati solo se nel disegno sperimentale esiste un “percorso”, cioè una
sequenza di microarray con un campione in comune, che li unisce; la
114

Capitolo 5: Modelli additivi ANOVA per l’analisi dei dati di espressione genica
precisione della stima è inversamente proporzionale alla lunghezza del
percorso.
Si supponga di voler confrontare tre campioni A, B e C con un
disegno sperimentale denominato “loop”, spiegato in seguito in dettaglio,
osservabile in figura 5.6.
Figura 5.6: Grafo del disegno sperimentale a” loop”
Se si vogliono confrontare i campioni A e B esistono due percorsi per
farlo: il percorso diretto fra A e B di lunghezza 1 e quello indiretto che
passa da C di lunghezza 2. E’ facile comprendere come la stima del
confronto fra i due campioni sia più precisa sul percorso più corto,
piuttosto che su quello più lungo, dove si possono sommare errori dovuti
al confronto indiretto di A e B con il campione C.
5.4.1 Criteri per la scelta del disegno sperimentale
La scelta di un adeguato disegno per l’esperimento che si vuole
eseguire può dipendere da molteplici elementi.
Prima di tutto bisogna tenere in considerazione che su ogni
microarray è possibile ibridizzare solo due campioni, per cui ogni vetrino è
115

Capitolo 5: Modelli additivi ANOVA per l’analisi dei dati di espressione genica
un blocco sperimentale di dimensione due. Se ci sono più di due varietà
del fattore di interesse non è possibile confrontarle sullo stesso array, per
questo motivo si dice che il disegno sperimentale è a blocchi incompleti.
Chiarito questo aspetto è necessario decidere quali campioni devono
essere ibridizzati su ogni vetrino e quali marcatori utilizzare per ogni
campione.
La prima cosa da tenere in considerazione è lo scopo
dell’esperimento, in modo da cogliere eventuali suggerimenti o disegni
impliciti direttamente dalla modalità di trattamento dei campioni che si
vogliono confrontare.
Si supponga, per esempio, di voler studiare l’effetto della
somministrazione di diversi farmaci su un gruppo di cellule e che
l’interesse principale di questo esperimento sia confrontare il loro mRNA
con quello di un altro gruppo di cellule dello stesso tipo non sottoposto al
trattamento. In questo caso un disegno appropriato deve considerare le
cellule non trattate, o di controllo, come un riferimento de facto.
Figura 5.7: Grafo del confronto fra campioni trattati e campione di controllo
In un esperimento in cui si vogliano identificare sottogruppi di
tumori della stessa famiglia sarà necessario mettere in relazione fra di loro
i campioni tumorali provenienti dai diversi pazienti e ciò può essere
ottenuto solo attraverso una base comune di confronto rappresentata da
un RNA di riferimento. Se il numero di campioni è maggiore di tre, questo
116

Capitolo 5: Modelli additivi ANOVA per l’analisi dei dati di espressione genica
disegno sperimentale offre il vantaggio di consentire il confronto fra tutti
⎛n
⎞
gli n campioni in esame utilizzando n microarray piuttosto che ⎜ ⎟ .
⎝2
⎠
Figura 5.8: Grafo del disegno sperimentale con riferimento
Il disegno sperimentale, dunque, può essere suggerito direttamente
dalla questione biologica alla quale si vuole dare una risposta; tuttavia,
può succedere che disegni diversi descrivano ugualmente bene
l’esperimento. E’ necessario, in questi casi, considerare altri vincoli per
indirizzare la scelta sul modello migliore, ad esempio, decidere se
realizzare un confronto diretto o indiretto fra i campioni.
5.4.2 Confronto diretto ed indiretto
Si supponga di pianificare un esperimento in cui si ha a
disposizione un microarray e la quantità di mRNA ricavata dai campioni
non sia un fattore limitante. Per realizzare un confronto diretto fra un
trattato e un controllo si può pensare di marcare il trattato con Cy3 e il
controllo con Cy5 ed ibridizzare entrambi i campioni sullo stesso vetrino,
come illustrato in figura 5.5. In questo caso, poiché il risultato
dell’esperimento genera una sola osservazione del log(T/C) attraverso un
confronto diretto, la varianza di questa misura sarà σ 2 .
117

Capitolo 5: Modelli additivi ANOVA per l’analisi dei dati di espressione genica
Per migliorare la qualità dell’osservazione si può fare un confronto in
“dye-swap”: con questo criterio gli stessi campioni vengono ibridizzati su
due microarray diversi invertendo la marcatura con i fluorocromi.
Figura 5.9: Confronto diretto con scambio della marcatura
Se la varianza di ogni singola misura è ancora σ 2 , allora la varianza
della media delle due misure indipendenti è σ 2 /2 (figura 5.10).
La duplicazione della misura scambiando la marcatura è utile per
ridurre l’errore sistematico dovuto alla diversa efficienza di emissione delle
due cianine.
Se si fa uso di un riferimento comune o “reference”, denominato per
esempio con R, allora le due ibridazioni disponibili per confrontare in
maniera indiretta T e C saranno T rispetto ad R e C rispetto ad R. In
questo caso il log(T/C) potrà essere ricavato dalle singole misure di T e C
rispetto ad R. Essendo ancora la varianza di ogni singola misura pari a σ 2 ,
ne segue che la varianza della differenza delle due misure è pari a 2σ 2 .
Le varianze relative ai due disegni sperimentali differiscono per un
fattore quattro e questo può essere l’elemento critico che indirizza nella
scelta di un metodo di confronto diretto piuttosto che di uno indiretto.
118

Capitolo 5: Modelli additivi ANOVA per l’analisi dei dati di espressione genica
Direct
A B
Indirect
A
average(log(A/B)) log (A / R)–log (B/R )
σ 2
/2 2σ 2
Figura 5.10: Schema riassuntivo del confronto diretto ed indiretto
Il calcolo della varianza così come è stato eseguito considera i
microarray come blocco sperimentale, senza entrare nel dettaglio
dell’insieme di misure che sono state eseguite su tutti i geni o delle
sorgenti di variabilità incluse nel modello dei dati.
Da questo punto di vista la scelta di un disegno sperimentale può
essere influenzata dalla possibilità di quantificare tutti gli effetti presenti
nel modello e ciò è strettamente legato ai gradi di libertà che è possibile
riservare ad ognuno di essi e all’errore “random”.
Utilizzare un disegno con riferimento comporta di dover marcare con
lo stesso fluorocromo, su tutti i vetrini, il campione di riferimento e con
l’altro fluorocromo i campioni da analizzare: in questo modo le
informazioni relative alle varietà e ai marcatori si sovrappongono, cioè i
due effetti sono confusi o mascherati, e stimare l’uno o l’altro è
completamente equivalente.
Una conseguenza di questo mascheramento è che anche gli effetti di
interazione VG e DG si confondono, quindi, per utilizzare questo disegno
bisogna assumere che non ci siano effetti gene-specifici nella marcatura o
accettare che non possano essere quantificati.
E’ possibile classificare numerosi altri effetti di mascheramento,
riassunti, nel caso del disegno con riferimento, nella tabella 5.1. E’
interessante notare come l’effetto array è solo parzialmente confuso con
B
119

Capitolo 5: Modelli additivi ANOVA per l’analisi dei dati di espressione genica
l’effetto DV e questo sempre per il criterio con cui sono marcati i due
campioni ibridizzati; se, infatti, si può identificare l’array sul quale è stato
ibridizzato un campione quando si fissino i due indici di fluorocromo e di
varietà per il campione da analizzare, lo stesso non avviene quando
l’informazione riguarda il riferimento, per il quale la coppia di indici è
uguale su tutti gli array.
Tabella 5.1: Mascheramento degli effetti nel disegno sperimentale con riferimento
Il disegno con riferimento per k varietà ed n geni produce 2kn
osservazioni, quindi i gradi di libertà totali sull’insieme di dati sono 2kn-1.
Se si calcolano i gradi di libertà per ogni effetto del modello si troverà che:
la media e gli effetti principali A, V e G coprono 2k+(n-1) gradi
di libertà;
l’effetto combinato VG copre k(n-1) gradi di libertà;
l’effetto AG copre (k-1)(n-1) gradi di libertà;
non rimangono gradi di libertà per stimare l’errore.
L’analisi del disegno che realizza una comparazione diretta con
inversione della marcatura rivela che anche in questo caso vi sono
120

Capitolo 5: Modelli additivi ANOVA per l’analisi dei dati di espressione genica
mascheramenti di effetti. Si può facilmente verificare, infatti, che l’effetto
array si confonde con l’effetto combinato della marcatura e della varietà,
cioè una volta che viene fissata la coppia di indici che identifica il
campione e il fluorocromo con cui esso è marcato si individua anche
l’array su cui esso è stato ibridizzato.
Tabella 5.2: Mascheramento degli effetti nel confronto diretti con inversione della
marcatura
In questo caso, tuttavia, dal calcolo dei gradi di libertà si scopre che
rimane un margine per stimare l’errore; infatti:
la media e gli effetti principali A, V e G coprono 2k+(n-1) gradi
di libertà;
l’effetto combinato VG copre (k-1)(n-1) gradi di libertà;
l’effetto AG copre (k-1)(n-1);
rimangono n-1 gradi di libertà per stimare l’errore.
121

Capitolo 5: Modelli additivi ANOVA per l’analisi dei dati di espressione genica
La scelta del disegno sperimentale più appropriato può avvenire,
quindi, anche in base a quali effetti si desidera stimare o a quali si può
ammettere di confondere con l’errore “random”.
Esiste un terzo disegno sperimentale che cerca di mettere insieme i
pregi del disegno con riferimento e quelli del confronto diretto in “dye-
swap”: il disegno a “loop”, di cui si è già accennato in precedenza (figura
5.6).
Questo tipo di disegno utilizza lo stesso numero di array del disegno
con riferimento, ma supera il limite fondamentale di quest’ultimo, che
consiste nel collezionare il maggior numero di misure sul campione di
riferimento e non su quello di interesse.
Il disegno sperimentale a “loop” realizza il doppio delle misure sulle
varietà di interesse e compie un bilanciamento fra i marcatori e le varietà,
marcando ogni varietà una volta con un fluorocromo e una volta con
l’altro su due array diversi.
Questo bilanciamento permette di separare gli effetti D e V e, di
conseguenza, il loro effetto combinato; in questo modo è possibile rilevare
sia la differenza intrinseca fra fluorocromi che un eventuale effetto gene-
specifico della marcatura.
La stima dei gradi di libertà per questo disegno sperimentale è
uguale a quella del confronto diretto in “dye-swap” e anche in questo caso
rimangono n-1 gradi di libertà per stimare l’errore.
Un inconveniente pratico evidente di questo tipo di disegno è il fatto
che bisogna realizzare il doppio delle reazioni di marcatura perché ogni
campione deve essere marcato con entrambi i fluorocromi.
122

Capitolo 6
Confronto critico fra metodologie statistiche
di trattamento dei dati di espressione genica
In questo capitolo verranno presentati i risultati ottenuti dal
confronto critico fra i metodi di analisi della significatività statistica,
l’approccio empirico bayesiano e l’analisi della varianza per la selezione dei
geni differenzialmente espressi.
Questo confronto è stato realizzato utilizzando l’insieme di dati
relativi ad uno studio sull’organismo C. elegans (Golden et al., 2004), il cui
scopo è stato individuare i geni potenzialmente coinvolti nel processo di
crescita e invecchiamento del nematode.
Dopo aver individuato i criteri di pre-trattamento e normalizzazione
dei dati grezzi, i risultati dello studio sono stati analizzati ed utilizzati per
l’individuazione di un procedimento di validazione informatica incrociata.
123

Capitolo 6: Confronto critico fra metodologie statistiche di trattamento dei dati di espressione genica
6.1 Descrizione dell’esperimento
Il nematode C. elegans è un eccellente modello per studiare
l’invecchiamento sia perché è stato ben caratterizzato da un punto di vista
morfologico, sia perché sono disponibili numerosi mutanti che si
distinguono significativamente per la durata della loro vita.
Nello studio preso in considerazione sono state messe a confronto,
attraverso esperimenti con microarray a cDNA, l’espressione genica nel
nematode “wild-type” N2 e nel mutante daf-2 , che ha una durata della
vita pari al doppio di quella dell’organismo wild-type.
Sono stati analizzati cinque individui per ogni tipo e i dati di
espressione genica sono stati ricavati in quattro istanti temporali
differenti. In particolare, ogni individuo è stato caratterizzato a quattro
stadi di crescita corrispondenti al quarto, al nono, al quattordicesimo e al
diciannovesimo giorno dalla nascita. Le relative osservazioni sono state
indicate con: N24d, N29d, N214d, N219d, daf24d, daf29d, daf214d,
daf219d.
Per motivi non specificati, sono disponibili trentasette insiemi di
osservazioni, anziché quaranta.
6.2 Caratteristiche del microarray
I microarray utilizzati in questo studio sono stati prodotti dallo
stesso laboratorio che ha condotto il lavoro ed ognuno di essi è costituito
da 923 sequenze, rappresentative di 921 geni, scelti in base al loro
124

Capitolo 6: Confronto critico fra metodologie statistiche di trattamento dei dati di espressione genica
coinvolgimento in processi di risposta allo stress e agli interessi degli
stessi ricercatori.
A queste sequenze sono stati aggiunti 661 controlli negativi, cioè
spot sui quali non è stata depositata alcuna sequenza.
Vi sono, quindi, 1584 spot, ognuno dei quali è presente in
quadruplice copia su ogni array; in totale ogni microarray è composto di
6336 spot.
6.3 Disegno sperimentale
Lo scopo principale di questo studio è stato riuscire ad identificare
quali geni potessero essere responsabili della durata diversa della vita dei
due nematodi, confrontando l’espressione genica dei due tipi di individui
allo stesso stadio di crescita.
Un’altra questione di interesse è stata cercare di individuare i geni
coinvolti nel processo di invecchiamento di ogni organismo.
Per poter dare una risposta ad entrambi i quesiti biologici è stato
scelto un disegno sperimentale con riferimento, in modo da fissare una
base di confronto comune per tutte le osservazioni.
Il campione di riferimento era costituito da un “pool” di RNA estratti
dai nematodi N2.
125

Capitolo 6: Confronto critico fra metodologie statistiche di trattamento dei dati di espressione genica
6.4 Trattamento del dato
Le immagini dei microarray dopo l’ibridizzazione dei campioni sono
state acquisite con uno scanner Packard Bioscience; il dato è stato poi
quantizzato utilizzando il software Genepix (Axon) senza fare alcuna
selezione ulteriore dei dati.
Gli spot sono stati in seguito eliminati solo in base alla presenza di
artefatti spaziali o difetti di forma dello spot, ma, poiché il livello globale di
rumore non è stato giudicato alto, non è stata effettuata una correzione
del backgound o una selezione in base al valore del rapporto
segnale/rumore.
Gli spot giudicati idonei dopo questo esame sono stati normalizzati
applicando una normalizzazione LOESS globale su ogni array, mentre,
dopo aver osservato l’andamento dei dati normalizzati (figura 6.1), non è
stata ritenuta necessaria una normalizzazione “between arrays”.
Figura 6.1: Box-plot degli array dopo la normalizzazione LOESS globale
Gli spot replicati per ogni sequenza all’interno dello stesso array
sono stati utilizzati per ottenere una stima più affidabile del valore di
126

Capitolo 6: Confronto critico fra metodologie statistiche di trattamento dei dati di espressione genica
espressione, attraverso un’interpolazione lineare ai minimi quadrati delle
osservazioni intra-array. Analogamente, le repliche biologiche, cioè le
osservazioni inter-array della stessa sequenza, hanno subito lo stesso
processo di interpolazione allo scopo di ottenere un unico dato cumulativo
dell’informazione totale disponibile per ogni sequenza ad ogni stadio di
crescita.
6.5 Definizione dei contrasti per la selezione dei geni
differenzialmente espressi
I geni che presentano espressione differenziale nei diversi confronti
sono stati selezionati sulla base della definizione di contrasti, cioè
combinazioni lineari delle medie delle popolazioni coinvolte (Freund &
Wilson, 1997).
Questi contrasti, generalmente riassunti in una matrice, sono stati
poi utilizzati in un processo empirico bayesiano di stima dei parametri ed
è stata ricavata la statistica B per ogni gene.
Per determinare i geni che differenziano l’organismo N2 dal mutante
daf-2 allo stesso stadio di crescita, prendendo il quarto giorno come
riferimento per le osservazioni relative ad ogni genotipo, sono stati
selezionati tre contrasti e sono stati determinati tre insiemi di geni
potenzialmente espressi in maniera significativa in base al valore assunto
dalla statistica B per ogni gene identificato.
Sui dati relativi alle statistiche t di ogni gene è stato poi effettuato
un F-test in modo da identificare le interazioni significative che
coinvolgono sia i due diversi genotipi che lo stadio di crescita.
Per individuare i potenziali marcatori biologici del processo di
invecchiamento in individui dello stesso tipo sono stati impostati dei
contrasti più semplici che, prendendo come riferimento i dati ricavati al
127

Capitolo 6: Confronto critico fra metodologie statistiche di trattamento dei dati di espressione genica
quarto giorno di crescita, hanno consentito di osservare quali geni
presentano espressione differenziale per ogni stadio.
Infine, per osservare l’espressione differenziale fra genotipi diversi
della stessa età, sono stati studiati i contrasti derivanti dalle osservazioni
relative agli organismi N2 e daf-2 allo stesso stadio di crescita.
6.6 Definizione delle sessioni di prove
Lo scopo delle elaborazioni realizzate in questa tesi è stato osservare
il comportamento dei dati sottoposti a diversi processi di selezione e
normalizzazione degli spot e le potenzialità dei diversi approcci di analisi
statistica nell’individuare i geni differenzialmente espressi, allo scopo di
definire una metodica di validazione informatica incrociata dei dati di
espressione genica.
I metodi utilizzati per la realizzazione delle prove sono l’analisi della
significatività statistica, l’approccio bayesiano di stima dei parametri e
l’analisi della varianza. Tali metodi sono implementati da alcuni software,
disponibili in rete sui siti www.r-project.org e www.bioconductor.org nei
pacchetti “siggenes”, per l’analisi della significatività statistica, “Limma”
per l’approccio empirico bayesiano e “maanova” per l’analisi della
varianza. Questi pacchetti sono stati utilizzati dopo averli inseriti nel
software “R” di statistica biomedica come librerie.
Con ciascuno di questi metodi sono state realizzate tre sessioni di
prove utilizzando i dati forniti dallo studio di invecchiamento e
sottoponendoli a differenti processi di pre-trattamento e normalizzazione.
In particolare:
128

Capitolo 6: Confronto critico fra metodologie statistiche di trattamento dei dati di espressione genica
nella Sessione I di prove sono stati utilizzati dati che non
hanno subito il processo di sottrazione del background e di
selezione in base al valore di SNR sottoposti ad una
normalizzazione LOESS globale;
nella Sessione II di prove sono stati utilizzati dati a
background sottratto, selezionati in base ad un livello
accettabile di rumore e normalizzati con LOESS globale;
nella Sessione III di prove sono stati utilizzati dati a
background sottratto, selezionati in base ad un livello
accettabile di rumore e sottoposti ad una normalizzazione
“print-tip”.
La prima sessione di prove ha avuto lo scopo di riprodurre i risultati
che vengono presentati nello studio di Golden, utilizzando per
l’elaborazione l’approccio empirico bayesiano, in modo da poterli poi
confrontare con quelli ottenuti dalle elaborazioni realizzate con gli altri
metodi.
Nella seconda sessione di prove si è cercato di mettere in evidenza il
peso della sottrazione del background e della selezione degli spot in base
ad un valore di soglia per il rapporto segnale/rumore, sull’identificazione
dei geni differenzialmente espressi e sulla capacità dei tre metodi di
elaborare un insieme di dati ridotto a causa della selezione.
Infine, la terza sessione di prove ha avuto lo scopo di valutare il
grado di variabilità dei risultati a seconda del tipo di normalizzazione ad
essi applicata.
129

Capitolo 6: Confronto critico fra metodologie statistiche di trattamento dei dati di espressione genica
6.7 Risultati delle diverse sessioni di prove
Prima di descrivere i risultati è opportuno fornire una chiave di
lettura per i grafici ed illustrare i criteri che hanno portato alla
realizzazione dei confronti che seguiranno.
I contrasti utilizzati nelle sessioni di prova sono stati impostati in
maniera diversa a seconda del quesito biologico.
Per identificare quali geni risultano differenzialmente espressi fra i
due genotipi a parità di stadio di crescita e rispetto allo stadio iniziale di
riferimento sono stati utilizzati i seguenti contrasti:
(daf29d – daf24d) – (N29d – N24d);
(daf214d – daf24d) – (N214d – N24d);
(daf219d – daf24d) – (N219d – N24d).
L’insieme di questi contrasti è stato denominato durante le prove
con il termine “full” ed ogni contrasto C è stato caratterizzato con un
numero che indica la sua posizione nella lista appena descritta e con il
suffisso “f” che specifica la sua appartenenza a questo insieme di
contrasti. Secondo questa regola il contrasto C1f identifica il primo
contrasto della lista.
I geni differenzialmente espressi nello stesso genotipo rispetto al
quarto giorno di crescita sono stati estratti utilizzando i seguenti contrasti:
N29d – N24d;
N214d – N24d;
N219d – N24d;
daf29d – daf24d;
daf214d – daf24d;
daf219d – daf24d.
130

Capitolo 6: Confronto critico fra metodologie statistiche di trattamento dei dati di espressione genica
Ognuno di questi contrasti è stato contrassegnato nelle prove con
un numero che indica la sua posizione nella lista precedente, per cui, ad
esempio, il contrasto daf219d – daf24d sarà identificato con C6.
Per finire, i contrasti che hanno consentito di identificare i geni
differenzialmente espressi fra i due genotipi, a parità di stadio di crescita
sono:
daf24d – N24d;
daf29d – N29d;
daf214d – N214d;
daf219d – N219d.
L’insieme di questi contrasti è stato contrassegnato con il termine
“age” ed ogni contrasto è identificato con un numero che indica la sua
posizione nella lista precedente ed il suffisso “age” di appartenenza
all’insieme dei contrasti, quindi con C3age si indicherà, ad esempio, il
contrasto daf214d – N214d.
con:
Ogni identificativo dei contrasti sarà ulteriormente caratterizzato
“b”, se si riferisce a dati che non hanno subito la sottrazione
del background e la selezione in base alla soglia di rumore;
“bs” se è stato sottratto il background ed è stata utilizzata una
soglia di rapporto segnale/rumore per l’accettabilità dello
spot;
“loess” se la normalizzazione dei dati è stata realizzata
utilizzando il metodo di interpolazione LOESS;
“p-t” quando la normalizzazione è avvenuta con il metodo
“print-tip”
“limma” o “l” se è stato utilizzato l’approccio bayesiano per
l’elaborazione. A questo proposito si è scelto di dichiarare un
131

Capitolo 6: Confronto critico fra metodologie statistiche di trattamento dei dati di espressione genica
gene differenzialmente espresso quando la sua statistica B è
maggiore di zero.
“ADS” se si riferisce ad un’elaborazione con analisi della
varianza in cui il modello per i dati è stato formulato come
somma degli effetti “Array+Dye+Sample”. Nella formula del
modello non sono riportati esplicitamente i termini VG e G,
dal momento che qualunque applicazione dell’ANOVA
nell’analisi dei microarray è imprescindibile da questi.
“ADSS” se si riferisce ad un’elaborazione con analisi della
varianza in cui il modello per i dati è stato formulato come
somma degli effetti “Array+Dye+Sample+Spot”;
“sam” accompagnato da un valore in percentuale, se è stato
utilizzato il metodo di analisi della significatività statistica e la
selezione dei geni differenzialmente espressi è avvenuta
fissando il parametro FDR al valore indicato dalla percentuale.
A questo proposito è stato deciso di utilizzare il valore 20%
come soglia per questo parametro, così come suggerito dalla
letteratura.
6.7.1 Sessione I di prove
Lo scopo di questa sessione di prove è stato realizzare un confronto
fra le tre tecniche di elaborazione statistica a parità di metodo di
normalizzazione. I dati utilizzati non hanno subito il processo di
sottrazione del background e di selezione in base al rapporto
segnale/rumore.
La figura 6.2 mostra per il contrasto C4age un diagramma di Venn
delle intersezioni dei tre insiemi di geni differenzialmente espressi
identificati con i tre metodi. Si evidenzia come l’approccio empirico
132

Capitolo 6: Confronto critico fra metodologie statistiche di trattamento dei dati di espressione genica
bayesiano sia il più selettivo, cioè quello che individua l’insieme meno
numeroso di geni.
Figura 6.2: Diagramma di Venn del contrasto C4age nella sessione I di prove
Fra i 40 geni individuati dall’approccio bayesiano sono compresi i 22
geni individuati dallo studio di Golden, che sono anche quelli in comune
fra tutti e tre i metodi.
L’approccio bayesiano dimostra buone capacità di selezione anche
quando i geni differenzialmente espressi rilevati sono pochi, come per il
contrasto C1. In questo caso lo studio di Golden seleziona 2 geni
differenzialmente espressi e l’approccio bayesiano ne identifica 3, di cui i
due con statistica B più alta (>5) sono proprio quelli evidenziati nello
studio, mentre solo quello con statistica B maggiore è in comune fra i tre
metodi.
133

Capitolo 6: Confronto critico fra metodologie statistiche di trattamento dei dati di espressione genica
Figura 6.3: Diagramma di Venn del contrasto C1 nella sessione I di prove
Come si può osservare dal diagramma di Venn la differenza più
evidente fra i tre metodi è che, mentre l’approccio bayesiano identifica i
due geni differenzialmente espressi in un insieme di soli tre elementi, il
metodo di analisi della varianza trova un solo gene dei due in un insieme
di 63 elementi e l’analisi della significatività statistica, anche se identifica
entrambi i geni, li trova in un insieme di 395 geni con un FDR del 99%,
considerato pressochè inattendibile dal SAM.
In questa sessione di prove è stato anche osservato il
comportamento del metodo di analisi della varianza al variare del modello
utilizzato per interpolare i dati.
Le figure 6.4 e 6.5 mostrano due diagrammi di Venn nei quali gli
insiemi identificati con il metodo ANOVA utilizzano i modelli
“Array+Dye+Sample” e “Array+Dye+Sample+Spot”.
134

Capitolo 6: Confronto critico fra metodologie statistiche di trattamento dei dati di espressione genica
Figura 6.4: Diagramma di Venn del contrasto C4 con modello ADS nella sessione I di
prove
Aggiungere un effetto nel modello computato, qualora siano
disponibili i gradi di libertà per stimarlo ed esso sia ortogonale agli altri,
consente di migliorare la qualità dell’informazione estraibile; nelle nostre
prove a tale miglioramento ha sempre fatto seguito un ampliamento
dell’intersezione relativa ai geni differenzialmente espressi.
Figura 6.5: Diagramma di Venn del contrasto C4 con modello ADSS nella sessione I di
prove
135

Capitolo 6: Confronto critico fra metodologie statistiche di trattamento dei dati di espressione genica
Questo ampliamento può essere giustificato dal fatto che,
interpolare un modello più dettagliato, sempre che si abbiano le
informazioni sufficienti per farlo, consente di poter isolare meglio l’effetto
di interesse aumentando la sensibilità del metodo, ma ha come
conseguenza l’inclusione di geni non considerati, in precedenza, come
differenzialmente espressi.
6.7.2 Sessione II di prove
In questa sessione sono stati realizzati i confronti fra le tre tecniche
di elaborazione utilizzando dati che hanno subito il processo di sottrazione
del background e la selezione degli spot in base ad un adeguato livello del
rapporto segnale/rumore e mantenendo come metodo per la
normalizzazione l’interpolazione LOESS.
Applicando queste selezioni, l’insieme di dati disponibile per
l’elaborazione si riduce di circa 1/3, cioè geni che precedentemente
venivano inclusi nella normalizzazione e, quindi, nella valutazione
dell’espressione differenziale, vengono ora scartati perchè giudicati non
idonei.
La riduzione dell’insieme di dati ha un effetto negativo
sull’elaborazione realizzata con il metodo dell’analisi della varianza: a
causa dell’insufficiente quantità di informazioni il metodo non è in grado
di interpolare i modelli proposti sui dati a disposizione e, quindi, non è
possibile valutare l’effetto di interesse.
L’approccio empirico bayesiano non sembra essere particolarmente
sensibile al processo di selezione del dato operato in questa sessione di
prove, come è possibile osservare nell’esempio di figura 6.6.
136

Capitolo 6: Confronto critico fra metodologie statistiche di trattamento dei dati di espressione genica
Figura 6.6: Diagramma di Venn del contrasto C2 a parità di approccio di
elaborazione e di normalizzazione sui dati della sessione I e II.
Il metodo di analisi della significatività statistica mostra, invece, un
miglioramento, sia rispetto al numero di geni potenzialmente espressi in
maniera significativa per un FDR=20%, sia rispetto alla quantità di geni in
comune ai due metodi (figure 6.7 e 6.8).
In generale, dalle prove relative a questa sessione si può osservare
un abbassamento del valore di FDR per ottenere insiemi di numerosità
comparabile fra i due metodi, cioè l’analisi della significatività statistica
sembra acquisire maggiore sensibilità quando i dati vengono selezionati
con il procedimento descritto.
Figura 6.7:Diagramma di Venn del contrasto C2age per i dati della sessione I di prove
137

Capitolo 6: Confronto critico fra metodologie statistiche di trattamento dei dati di espressione genica
Figura 6.7:Diagramma di Venn del contrasto C2age per i dati della sessione II di prove
6.7.3 Sessione III di prove
Questa sessione è stata realizzata con dati che hanno subito il
processo di sottrazione del background e la selezione degli spot in base ad
un adeguato livello del rapporto segnale/rumore e per i quali è stato
adottato un metodo di normalizzazione “print-tip”.
Con questo tipo di normalizzazione gli insiemi di geni
differenzialmente espressi tendono ad essere meno numerosi rispetto a
quelli trovati con gli stessi contrasti nella sessione II di prove.
Come è possibile osservare nell’esempio di figura 6.9, per il
contrasto C4age a parità di metodo di elaborazione si selezionano 40 geni
differenzialmente espressi nella sessione I, 37 nella sessione II e 23 nella
sessione III.
Questo risultato può essere dovuto ad un intervento più “pesante”
del processo di normalizzazione sulla distribuzione dei dati ed invita ad
essere cauti nell’uso di una normalizzazione “print-tip”.
138

Capitolo 6: Confronto critico fra metodologie statistiche di trattamento dei dati di espressione genica
Figura 6.9: Diagramma di Venn del contrasto C4age a parità di metodo di elaborazione
per le tre sessioni di prova
6.8 Individuazione di una metodica incrociata per l’analisi
statistica dei dati di espressione genica
Dai risultati delle tre sessioni di prova realizzate è possibile
individuare una metodica da utilizzare per l’analisi statistica dei dati di
espressione genica.
E’ evidente che la procedura proposta necessita di essere adattata
sia alla qualità delle informazioni che si hanno a disposizione che alla loro
quantità. Tuttavia, la criticità dell’insieme di dati sul quale sono state
testate le capacità elaborative dei tre metodi, dovuta alla bassa
numerosità delle osservazioni a disposizione, ha consentito di evidenziare
i loro pregi, ma anche i limiti.
139

Capitolo 6: Confronto critico fra metodologie statistiche di trattamento dei dati di espressione genica
L’approccio bayesiano di stima dei parametri ha dimostrato di poter
gestire in maniera efficiente tutti i contrasti impostati per l’analisi dei dati
di invecchiamento.
Questo metodo, che si realizza operativamente grazie
all’interpolazione sui dati di modelli lineari o di polinomi di grado
superiore al primo, dimostra una buona robustezza nell’adattarsi
all’insieme di dati, anche se piccoli. I risultati prodotti concordano, almeno
per il 50%, con quelli presentati dallo studio di invecchiamento.
E’ possibile, quindi, individuare nell’approccio bayesiano di stima
dei parametri il metodo da utilizzare in prima istanza nell’analisi dei dati.
Se l’interesse dell’analista è quello di poter esprimere una maggiore
confidenza nel risultato ottenuto, è necessario procedere con una
validazione informatica incrociata dei risultati ottenuti con il metodo
giudicato più affidabile.
La scelta dei metodi da utilizzare per questo scopo può dipendere da
diversi elementi.
Un insieme di osservazioni troppo limitato non consente di utilizzare
il metodo ANOVA per evidenziare il contributo delle sorgenti di variabilità
che si vorrebbero quantificare.
Da questo punto di vista è importante sottolineare che, avere a
disposizione i gradi di libertà sufficienti per valutare tutti gli effetti
presenti nel modello utilizzato per interpolare i dati, non significa che tali
effetti possono essere sempre quantificati e, se necessario, eliminati.
Infatti, nella prima sessione di prove, malgrado i gradi di libertà
fossero sufficienti per la valutazione dell’effetto DG, non è stato possibile
quantificarlo perché è risultato non ortogonale agli altri effetti.
Il metodo ANOVA non può, quindi, essere sempre utilizzato, ma il
suo apporto, quando possibile, contribuisce ad aumentare il livello di
sicurezza dei risultati.
Il metodo di analisi della significatività statistica non mostra sempre
una grande capacità di produrre autonomamente risultati affidabili; ciò è
stato messo in evidenza dall’elevato valore della percentuale di FDR
140

Capitolo 6: Confronto critico fra metodologie statistiche di trattamento dei dati di espressione genica
necessaria per trovare, nell’insieme di geni potenzialmente espressi in
maniera significativa, tutti i geni differenzialmente espressi identificati
dall’approccio bayesiano (figura 6.3).
Nonostante questo limite evidente, utilizzare i risultati ottenuti con
questo metodo in un confronto incrociato con gli altri, concorre ad una
migliore definizione dell’insieme intersezione.
Per concludere, quindi, utilizzare una metodica incrociata di analisi
statistica dei dati, come quella illustrata in questa tesi, consente di
ottenere una maggior robustezza nel processo di elaborazione e una più
alta affidabilità del risultato. Questo permette di avere a disposizione un
insieme maggiormente attendibile di risultati dal quale partire per la
successiva validazione dei dati con procedure biologiche alternative quali il
Northern blot o la Real-Time PCR.
141

Test multipli
Appendice A: Statistica dei test multipli
Appendice A
Statistica dei test multipli
Si consideri il problema di testare simultaneamente n ipotesi nulle
H0i (i=1,…,n). Per ogni test i viene costruita una statistica dalla quale può
essere derivato un p-value Pi. Si respinge l’ipotesi nulla H0i se Pi ≤ t per
ogni i=1,…,n e un fissato valore di soglia t ∈[ 0,1 ].
Le diverse uscite per gli n test possono essere riassunte come nella
tabella A.1
non respinte respinte
ipotesi nulle vere U(t) V(t) n0
ipotesi nulle false T(t) S(t) n1
totale n-R(t) R(t) n
dove:
Tabella A.1: Tabella riassuntiva del test delle ipotesi
- n0 è il numero di ipotesi nulle vere;
- n1 è il numero di ipotesi nulle false;
- V(t) è il numero di falsi positivi, cioè di errori di I tipo;
- T(t) è il numero di falsi negativi, cioè di errori di II tipo;
- R(t) è il numero di ipotesi nulle rigettate.
142

Appendice A: Statistica dei test multipli
Di queste variabili si conoscono soltanto R(t) ed n, mentre sono
incognite n0, n1 e i processi random V(t) e T(t).
I metodi standard cercano i test che minimizzano il cosiddetto “error
rate” di tipo II, cioè massimizzano la potenza, fra le classi di test con “error
rate” di tipo I fissato ad un ragionevole livello α .
“Error Rate” di tipo I
Quando viene testata una singola ipotesi nulla H0, la probabilità di
errore di tipo I di rigettare l’ipotesi nulla quando essa è vera viene
tipicamente controllata ad un livello fissato α . Questa probabilità può
essere definita in un generico test bilaterale ricavando un valore critico
positivo cα e uno negativo c-α tale che Pr(h0 ≥ cα|H0) ≤ α e Pr(-h0 ≤ c-α|H0)
≤ α respingendo H0 quando h0 ≥ cα e -h0 ≤ c-α, dove h0 è il valore, ottenuto
dai dati a disposizione, della statistica che si sta utilizzando per realizzare
il test. Esiste una varietà di generalizzazioni di questa definizione per test
multipli; gli error rate di tipo I proposti di seguito sono i più standard
(Shaffer 1995).
Per-comparison error rate (PCER). Il PCER è definito come il valore
atteso del numero di errori di tipo I rispetto al numero di ipotesi
totale:
PCER = E(V)/n
Per-family error rate (PFER). Il PFER è definito come il valore
atteso del numero di errori di tipo I:
PFER = E(V)
143

Appendice A: Statistica dei test multipli
Family-wise error rate (FWER). Il FWER è definito come la
probabilità che ci sia almeno un errore di tipo I:
FWER = Pr (V ≥ 1)
False discovery rate (FDR). L’FDR di Benjamini & Hochberg
(1995) è la proporzione attesa di errori di tipo I fra le ipotesi
rigettate:
dove per definizione
Potenza
Q =
FDR = E(Q)
⎧V
/ R
⎨
⎩0
se R>0,
se R=0
Il concetto di potenza può essere generalizzato in vari modi; esistono
in letteratura tre definizioni di potenze:
La probabilità di respingere almeno un’ipotesi nulla falsa
Pr(S ≥ 1 ) = Pr(T ≤ n1-1)
La probabilità media di respingere le ipotesi nulle false o average
power
E(S)/n1
La probabilità di rigettare tutte le ipotesi nulle
144

come
Appendice A: Statistica dei test multipli
Pr(S=n1) = Pr(T=0)
In maniera analoga all’FDR la potenza può anche essere definita
E(S/R|R>0)*Pr(R>0) = Pr (R>0) - FDR
Confronto fra error rate di tipo I
In generale per una data procedura di test multipli vale la seguente
disuguaglianza (Dudoit et al. 2003):
PCER ≤ FWER ≤
PFER
Quindi, per un fissato livello α, i procedimenti che controllano PFER
sono più conservativi di quelli che controllano FWER o PCER. Per
illustrare le proprietà dei differenti error rate di tipo I, si può supporre che
ogni ipotesi Hj venga testata individualmente a livello αj e che la decisione
di rigettare o meno tale ipotesi sia basata esclusivamente su questo test.
Sotto l’ipotesi nulla completa, ovvero nessuna delle ipotesi nulle è
rigettabile, il PCER è semplicemente la media degli αj e il PFER è la somma
degli αj, mentre FWER non dipende da αj, ma coinvolge la distribuzione
congiunta delle statistiche Tj.
( α 1 + ... + α n ) / n ≤ max(
α1,...,
α n ) ≤ FWER ≤ PFER = α1
+ + n
PCER = ... α
Anche FDR dipende dalla distribuzione congiunta dei test statistici e
per un procedimento fissato FDR ≤ FWER, con FDR=FWER sotto l’ipotesi
nulla completa.
145

Appendice A: Statistica dei test multipli
Il problema principale nella valutazione dell’error rate di tipo I è che
la probabilità di avere almeno un errore di questo tipo incrementa
drasticamente con il numero di ipotesi testate. Come conseguenza di
questo comportamento di FWER, si rende necessaria la ridefinizione
dell’error rate di tipo I nel caso di test multipli, in modo da consentire un
controllo globale della porzione di errori sugli n test. Le soluzioni a questo
problema sono differenti a seconda del tipo di approccio statistico scelto.
Approccio frequentistico a test multiplo
La teoria frequentista della probabilità computa un p-value per ogni
test e inserisce il risultato in due tipi di framework per test multipli: i
procedimenti single-step e i procedimenti step-wise (Dudoit et al. 2003).
In un procedimento single-step la regione di rifiuto di ogni test è
costante e non dipende dal risultato di test su altre ipotesi.
Un esempio di procedimento di questo tipo è la correzione di
Bonferroni sul livello α di ogni singolo test. In questo caso è possibile
acquisire un livello di significatività globale α sui test anche confrontando
due campioni per volta. Si supponga, per esempio, di voler confrontare k
campioni a due a due utilizzando un t-test o un F-test. Il numero di
confronti possibile è:
nk
k
=
( k −1)
2
⎛k
⎞
= ⎜ ⎟
⎝2
⎠
Per ottenere un livello di significatività complessivo del test pari ad
α, ciascun confronto singolo deve avere un livello di significatività α' che
soddisfa la disuguaglianza di Bonferroni:
146

Appendice A: Statistica dei test multipli
α
α ≤
nk
'
Ad esempio, se per k = 3 si vuole α ≤ 0.05, deve essere α' ≤ 0.016,
cioè è necessario un livello di alta significatività per ogni singolo confronto.
In un procedimento step-down i p-value dei singoli test sono
ordinati dal più significativo al meno significativo e le corrispondenti
ipotesi sono considerate nello stesso ordine: appena si verifica la
condizione di rifiuto per un’ipotesi, anche le seguenti meno significative
vengono rigettate.
Esempi di questo framework sono il procedimento di Holm (1979) e
quello di Westfall & Young (1993).
Nella correzione step-down di Holm si procede nel modo seguente:
Si sceglie un livello di significatività α;
Si ordinano i geni seguendo l’ordinamento ascendente dei p-
value;
Si confrontano i p-value con una soglia che dipende dalla
p
posizione del gene nella lista di valori ordinati. La soglia viene
calcolata secondo la formula α / G per il primo gene, dove G è
il numero di geni, α / G-1 per il secondo gene e così via.
α
α
< , p < ,
1 G
2 G −1
p
α
< ,
3 G − 2
....
p k
α
< ,
G − k + 1
....
p G
α
<
1
Sia k il più grande indice per il quale vale pi < α / G-i+1.
Verranno respinte tutte le ipotesi per le quali i>k.
Il procedimento step-up lavora nella direzione opposta allo step-
down poiché i p-value sono ordinati dal meno significativo al più
147

Appendice A: Statistica dei test multipli
significativo e un esempio è la procedura di calcolo del False Discovery
Rate secondo Benjamini e Hochberg:
Si sceglie un livello di significatività α;
Si ordinano i geni seguendo l’ordinamento ascendente dei p-
value;
Si confrontano i p-value con una soglia che dipende dalla
posizione del gene nella lista di valori ordinati. La soglia viene
calcolata secondo la formula α / G per il primo gene, dove G è
il numero di geni, 2α / G per il secondo gene e così via.
p ,
1 G
α 2α
kα
< p < , ... p < , ... p < α
2 G
k G G
Sia k il più grande indice per il quale vale pi < α / G. Verranno
respinte tutte le ipotesi per le quali i

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154

Ringraziamenti
Il primo ringraziamento spetta sicuramente alla Dott.ssa
Silvia Pellegrini e al Prof. Pietro Pietrini che mi hanno dato un’opportunità
unica di ampliamento delle mie conoscenze, mi hanno accompagnato nella
stesura della tesi con il loro prezioso consiglio e mi hanno consentito di
fare un’esperienza irripetibile in laboratorio.
Un sincero grazie va all’Ing. Massimiliano Salerno per l’aiuto
che mi ha dato in tutte le situazioni difficili che si sono presentate durante
questa tesi, la collaborazione, il sostegno morale, ma, soprattutto, per
l’amicizia che mi ha dimostrato in ogni circostanza.
Ringrazio anche la Prof.ssa Arti Ahluwalia per l’estrema disponibilità
e la comprensione con la quale mi ha sempre accolto.
Non posso dimenticare tutti i collaboratori della Dott.ssa
Pellegrini e del Prof. Pietrini, in particolare l’Ing. Lorenzo Sani, per gli
insostituibili suggerimenti, la comprensione, la simpatia e la disponibilità
inesauribile.
Ma il ringraziamento più grande va ai miei cari genitori, alla
mia meravigliosa sorellina Noemi e al mio insostituibile Alfio per avermi
accompagnato con una infinita pazienza, una fiducia incondizionata e
tantissimo affetto durante tutto il mio percorso accademico e per aver
raggiunto qui, oggi, insieme a me questo meraviglioso traguardo.
Pisa, 5 Luglio 2005
155

INTRODUZIONE
INDICE
PREFAZIONE .........................................................................................................0
SCOPO DELLA TESI ..................................................................................................3
1. ORIGINI E TECNOLOGIA DEI MICROARRAY........................................5
1.1 LA TECNOLOGIA ALLA BASE DEI MICROARRAY A DNA ....................................7
1.1.1 Tecnologia Affymetrix GeneChip.............................................................9
1.1.2 “Spotted” array .....................................................................................12
1.2 CARATTERISTICHE DI UN MICROARRAY..........................................................15
1.3 APPLICAZIONI DEI MICROARRAY ....................................................................18
1.3.1 Tassonomia di tessuti.............................................................................18
1.3.2 Identificazione delle basi molecolari delle malattie ..............................19
1.3.3 Analisi del meccanismo di azione dei farmaci.......................................20
2. I PRIMI PASSI DEL TRATTAMENTO DEL DATO E LE PRINCIPALI
TECNICHE DI NORMALIZZAZIONE.......................................................21
2.1 DIAGRAMMA DEL TRATTAMENTO DEI DATI ....................................................23
2.2 IL PROCESSO DI QUANTIZZAZIONE DEL DATO..................................................24
2.2.1 “Gridding” dell’immagine ....................................................................25
2.2.2 Segmentazione........................................................................................25
2.2.3 Estrazione delle intensità di segnale e di background...........................27
2.2.4 Correzione del background....................................................................28
2.3 NORMALIZZAZIONE DEI DATI..........................................................................34
156

2.4 NORMALIZZAZIONE WITHIN-ARRAY ...............................................................38
2.4.1 Normalizzazione globale........................................................................38
2.4.2 Normalizzazione intensità-dipendente ...................................................40
2.4.2.1 Interpolazione di curve e correzione...........................................40
2.4.2.2 Normalizzazione LOESS/LOWESS...........................................41
2.4.2.3 Normalizzazione a tratti..............................................................44
2.4.3 Normalizzazione “within-print-tip-group”............................................45
2.4.4 Normalizzazione “within-slide” ............................................................46
2.5 CORREZIONE “PAIRED-SLIDE” ........................................................................47
2.6 NORMALIZZAZIONE “MULTIPLE-SLIDES” O “BETWEEN ARRAYS”....................49
3. METODI DI SELEZIONE A SOGLIA E ANALISI DELLA
SIGNIFICATIVITÀ STATISTICA...............................................................51
3.1 “FOLD CHANGE”.............................................................................................53
3.2 METODO DEL VALORE DI SOGLIA....................................................................55
3.3 METODO DELLA DISTANZA DALLA MEDIA ......................................................59
3.4 METODO DELLA SOGLIA NON LINEARE ...........................................................61
METODI
3.5 ANALISI DELLA SIGNIFICATIVITÀ SUI MICROARRAY .......................................62
4. APPROCCIO STATISTICO BAYESIANO E TEST MULTIPLI IN
ESPERIMENTI DI MICROARRAY ............................................................74
4.1 INFERENZA STATISTICA CLASSICA E APPROCCIO BAYESIANO EMPIRICO..........75
4.1.1 Fondamenti del metodo classico: test delle ipotesi ...............................75
4.1.2 Approccio bayesiano e interpretazione soggettivistica della
probabilità .............................................................................................77
4.1.3 Teorema di Bayes e inferenza sui parametri .........................................79
4.1.4 Scelta della distribuzione a priori e stimatori della media e della
varianza .................................................................................................81
157

4.1.5 Metodo bayesiano classico per la scelta delle distribuzioni a priori ....82
4.1.6 Metodo bayesiano parametrico moderno per la scelta delle distribuzioni
a priori ...................................................................................................84
4.1.7 Metodo bayesiano soggettivo per la scelta delle distribuzioni a priori.86
4.2 STATISTICA “B” E MODELLO GERARCHICO PER I DATI DI ESPRESSIONE
GENICA ............................................................................................................87
4.2.1 “Posterior odds” dell’espressione differenziale ...................................88
4.2.2 Modello gerarchico e calcolo delle distribuzioni marginali .................90
5. MODELLI ADDITIVI ANOVA PER L’ANALISI DEI DATI DI
ESPRESSIONE GENICA...............................................................................95
5.1 FONTI DI VARIABILITÀ SUI DATI DI ESPRESSIONE GENICA ...............................97
5.2 MODELLI ADDITIVI ANOVA PER L’ANALISI DELL’ESPRESSIONE..................102
5.2.1 Modelli additivi misti ...........................................................................103
5.2.2 Modelli additivi fissi.............................................................................106
5.3 “NESTED” F-TEST E DETERMINAZIONE DEI GENI DIFFERENZIALMENTE
ESPRESSI ........................................................................................................108
5.4 DISEGNO DI ESPERIMENTI CON MICROARRAY ...............................................112
5.4.1 Criteri per la scelta del disegno sperimentale.....................................115
5.4.2 Confronto diretto ed indiretto..............................................................117
DISCUSSIONE
6. CONFRONTO CRITICO FRA METODOLOGIE STATISTICHE DI
TRATTAMENTO DEI DATI DI ESPRESSIONE GENICA....................123
6.1 DESCRIZIONE DELL’ESPERIMENTO................................................................124
6.2 CARATTERISTICHE DEL MICROARRAY ..........................................................124
6.3 DISEGNO SPERIMENTALE..............................................................................125
6.4 TRATTAMENTO DEL DATO ............................................................................126
158

6.5 DEFINIZIONE DEI CONTRASTI PER LA SELEZIONE DEI GENI DIFFERENZIALMENTE
ESPRESSI ........................................................................................................127
6.6 DEFINIZIONE DELLE SESSIONI DI PROVE........................................................128
6.7 RISULTATI DELLE DIVERSE SESSIONI DI PROVE .............................................130
6.7.1 Sessione I di prove ...............................................................................132
6.7.2 Sessione II di prove..............................................................................136
6.7.3 Sessione III di prove.............................................................................138
CONCLUSIONI
6.8 INDIVIDUAZIONE DI UNA METODICA INCROCIATA PER L’ANALISI STATISTICA
DEI DATI DI ESPRESSIONE GENICA...................................................................139
APPENDICE A: STATISTICA DEI TEST MULTIPLI .................................142
TEST MULTIPLI....................................................................................................142
“Error Rate” di tipo I ....................................................................................143
Potenza...........................................................................................................144
CONFRONTO FRA ERROR RATE DI TIPO I ..............................................................145
APPROCCIO FREQUENTISTICO A TEST MULTIPLO .................................................146
BIBLIOGRAFIA..................................................................................................149
RINGRAZIAMENTI...........................................................................................155
INDICE .................................................................................................................156
159