Spettroscopia Spettroscopia MRS Spettroscopia Spettroscopia MRS

Spettroscopia MRS
Ing. Anna Gaglianese
anna.gaglianese@for.unipi.it

La risonanza magnetica nucleare (NMR) è
un metodo non invasivo utilizzato per
ottenere immagini cliniche e studi sul
metabolismo in vivo.
1. MRI (magnetic resonance imaging) : sfrutta
l’acquisizione del segnale dall’acqua, e quindi
degli atomi di idrogeno contenuti in essa per
ottenere immagini anatomiche
2. MRS (magnetic resonance spectroscopy)
utilizzata per l’individuazione dei metaboliti.
Permette di ottenere informazioni localizzate
di carattere biomichico da tessuti e organi.
Risonanza magnetica nucleare

• La spettroscopia NMR misura l’assorbimento di radiazione
elettromagnetica a frequenza radio in molecole immerse in un
forte campo magnetico (tipicamente idrogeno 1 H o carbonio
13 C o fosforo 31 P).
Principi fisici

• Le informazioni sulla presenza di determinati metaboliti vengono
dedotte osservando il comportamento dei nuclei atomici. Sono
infatti osservabili solo i nuclei che possiedono un momento
magnetico nucleare di spin, e che quindi si comportano
come l’ago di una bussola che si può orientare in un campo
magnetico applicato.
Principi fisici

• I nuclei
B0
1H e13C possiedeno uno spin risultante diverso da zero
e possono presentare due orientamenti rispetto all’azione di un
campo magnetico statico B0 esterno.
• I nuclei in eccesso allineati con il campo magnetico Bo sono
quelli che permettono di generare il segnale NMR.
Principi fisici

ω = γ ΒΒο
ΒΒο
B 0
Equazione di Larmor:
Frequenza di
Campo magnetico statico
precessione
Principi fisici
Rapporto giromagnetico
Il moto di precessione dei momenti magnetici nucleari avviene con una
frequenza proporzionale alla differenza di energia tra i due livelli detta
frequenza di Larmor

• Se i protoni posti nel campo magnetico statico B 0 vengono
eccitati con un impulso a frequenza ω pari alla frequenza di
Larmor si ha il fenomeno della risonanza magnetica nucleare
Principi fisici

• L’energia assorbita dai nuclei viene lentamente ceduta agli
atomi vicini a causa di fenomeni di rilassamento spinreticolo
(con i dipoli delle molecole circostanti) e
spin-spin (con i nuclei di idrogeno vicini)
• Il segnale raccolto è un segnale oscillante con frequenza
ω, la frequenza di Larmor del nucleo in esame, che si
smorza nel tempo e che viene detto FID (Free
Induction Decay), libero decadimento
dell’induzione.
Impulso di
eccitazione RF
Antenna (bobina) RF
Principi fisici
FID: Segnale ricevuto

Trasformata di Fourier: permette di passare dal grafico in
funzione del tempo, il FID, al grafico in funzione delle
frequenze, lo spettro NMR.
Ciascun picco rappresenta la concentrazione di un
determinato metabolita che risuona a frequenza f
Principi fisici
f

I passaggi essenziali per ottenere lo spettro NMR di un
campione sono quindi i seguenti:
1) Introduzione del campione all’interno di un forte campo
magnetico Bo per orientare gli spin nucleari nella
posizione allineata con il campo o contro il campo.
2) Applicazione di un impulso di radiofrequenza per
produrre un eccesso di nuclei eccitati con lo spin in
opposizione al campo (durata: alcuni microsecondi).
Principi fisici

3) Registrazione del FID, il segnale emesso dai nuclei mentre
gli spin nucleari ritornano alla situazione di equilibrio
(durata: circa un secondo).
4) Elaborazione matematica dei dati al computer applicando
la Trasformata di Fourier per ottenere lo spettro NMR in
funzione delle frequenze.
Principi fisici

• Tutti i nuclei di un certo tipo risuonano però a frequenza diverse a
causa di piccoli campi magnetici indotti dai legami con altri atomi
H legato ad atomi poco
elettronegativi.
Gli elettroni di legame sono più vicini
a H.
Effetto di schermatura più forte:
gli elettroni di legame producono un
campo magnetico bi (in opposizione
a Bo) che investe l'idrogeno.
Spostamento chimico
H legato ad atomi più
elettronegativi.
Gli elettroni di legame sono più
lontani da H.
Effetto di schermatura piccolo:
gli elettroni di legame
producono un campo magnetico bi
(in opposizione a Bo) che investe
l'idrogeno solo marginalmente.

In generale, idrogeni legati ad atomi più elettronegativi risultano
deschermati quindi sentono un campo magnetico applicato più intenso
e subiscono la transizione a frequenze maggiori e, nello spettro, si
trovano più a sinistra, ad uno spostamento chimico più alto.
Idrogeni legati ad atomi più elettronegativi risultano deschermati
quindi sentono un campo magnetico applicato più intenso e subiscono la
transizione a frequenze maggiori e, nello spettro, si trovano più a sinistra,
ad uno spostamento chimico più alto.
H deschermati sentono un campo
magnetico più forte subiscono
transizione a frequenze maggiori
hanno spostamenti chimici maggiori
Spostamento chimico
H più schermati sentono un campo
magnetico più debole subiscono
transizione a frequenze minori hanno
spostamenti chimici minori

Tutti i nuclei di un certo tipo risuonano quindi a frequenza
diverse a seconda dei legami con altri atomi
Il segnale NMR di ogni nucleo risulta spostato nello spettro
a frequenze più alte o più basse a seconda del suo
intorno chimico.
Lo spostamento chimico è la differenza tra la frequenza
(in Hz) del segnale NMR del nucleo in esame rispetto
all’assorbimento di un campione di riferimento:
Essendo simmetrica è uguale su tutti gli strumenti
indipendentemente dall’intensità del loro campo magnetico.
Spostamento chimico
ppm (parti per milione)
La molecola usata come riferimento e quella del TMS
(tetrametilsilano (CH 3) 4 )

Scala da 0 a 220
ppm
(Frequenze di risonanza
13C molto bassa
difficile da misurare)
Spostamento chimico
Scala da 0 a 12 ppm
(nucleo più utilizzato)

Applicazioni e esempi clinici

La spettroscopia consente quindi di definire
specie chimiche, strutture molecolari ed
ambienti chimici in vivo.
Le applicazioni della spettroscopia MRS sono
molteplici e permettono la diagnostica di
diverse patologie in diversificati tessuti:
Tumori (cervello, prostata, addome)
Metabolismo cardiaco
Metabolismi in vari tessuti ( fegato, muscolo,
rene)
Applicazioni

Strumentazione
STRUMENTAZIONE MRS in vivo:
1. Magnete per generare il campo
statico B0
2. Bobina per inviare impulso a
radiofrequenza
3. Bobina per ricevere il segnale
FID
4. Working station per elaborare i
segnali

MRS
Applicazioni
MRI
MRSI

Misure del metabolismo cerebrale
mediante 1 H MRS

1. Il primo passo consiste nel trasporto e nel metabolismo dei carburanti
primari, e cioè glucosio, chetoni, aminoacidi e lipidi.
2. I frammenti formati subiscono un processo di ossidazione nel ciclo di
Krebs, con conseguente formazione di ATP per fosforilazione ossidativa,
all’interno dei mitocondri. Un insuccesso a questo punto del processo, priva
il cervello di ATP, portando alla formazione di lattato dal piruvirato.
3. L’ATP viene sintetizzato in un complesso ad alta energia, e cioè la
fosfocreatina PCr, dall’enzima reversibile creatina chinasi. La PCr così
formata è una fonte aggiuntiva di ATP per il cervello, perché rilascia
creatina.
Metabolismo ossidativo

Metabolita Spostamento chimico (ppm)
N-acetilaspartato (primo picco, NAA1) 2.01
N-acetilaspartato (secondo picco, NAA2) 2.6
N-acetilaspartato (terzo picco, NAA3) 2.5
Creatina (Cr) 3.03
Colina (Cho) 3.22
Glucosio 3.36
Glutammato e Glutammina (Glx) 2.3-2.5
Glx (secondo picco) 3.65-3.8
Alanina 1.48
Acido γ-amminobutirico 2.9
Lattato (Lac) 1.33
Lipidi 0.9-1.3
Spettro metaboliti

Creatina : Rappresenta la
riserva energetica cellulare
ed è un marker metabolico
generalmente poco sensibile
alle modificazioni indotte da
diverse patologie: per
questo motivo è possibile
normalizzare alla creatina i
valori degli altri picchi
metabolici ed analizzare i
dati in maniera
semiquantitativa mediante
l’andamento dei rapporti
NAA/Cr, Cho/Cr
Lattato : Il lattato è il prodotto finale della glicolisi. Certi tumori come il
glioma, presentano un aumento della concentrazione di lattato. Il picco di
lattato indica inoltre una possibile interruzione del ciclo di Krebs. Alti livelli di
Lac possono essere dovuti anche all’infiltrazione di cellule infiammatorie.
Significato clinico metaboliti

N-Acetylaspartato: rappresenta il picco più alto dello spettro cerebrale, a
2.02ppm. Come marcatore assonale, l’NAA viene trasportato velocemente
attraverso gli assoni, dal sito in cui avviene la biosintesi nei mitocondri
neuronali. Di conseguenza questo metabolita è rilevabile anche nello spettro
della materia bianca. La scomparsa del picco dell’NAA indica una morte
neuronale, presumibilmente irreversibile, e una lesione assonale, generalmente
recuperabile.
Glutammato e glutammina (Glx): Il glutammato fa parte del ciclo
metabolico che porta alla accumulazione del lattato, e se presente in
concentrazioni superiori a quelle richieste per la trasmissione neuronale può
diventare una neurotossina. Valori anormali possono essere indicativi di
epilessie o malattie neurodegenerative.
Lipidi: più del 20% del peso bagnato del cervello è composto da lipidi, nella
forma di membrane associate a mielina, fosfolipidi, sfingomielina e lecitini. I
lipidi possono dominare lo spettro della risonanza in caso di infezioni,
infiammazioni, necrosi di tumore.
Colina: meno conosciute in termini di neurochimica. Somma di fosforilcolina e
glicerolfosforilcolina, meno del 5% del picco è dovuto alla sola colina
Myo-inositolo: Il myo-inositolo è prevalentemente concentrato negli astrociti
all’interno dei quali viene riconosciuto come il più importante osmolita e
marcatore neuronale.
Significato clinico metaboliti

Particolarmente utilizzata la spettroscopia protonica per le
patologie del cervello umano
mI Cho
Cr
Glx
NAA
4 3 2 1 0 ppm
Spettro 1H corteccia occipitale

Spettro 1H : esempi

Soggetto sano Soggetto patologico
Tipico spettro MRS in caso di tumore cerebrale avanzato (glioma). Scomparsa del
picco dell’aceticol-colina, livelli di cholina, creatina e myo-inositolo inferiori rispetto al
soggetto sano (sinistra)(Neurosurg Focus. 2003;15(1))
Esempi clinici clinici: : glioma

1 H MR spettro di un neonato a seguito di ipossia perinatale: presenza
del picco del lattato (Eur. Jour. Rad. 2008; 67-2)
Esempi clinici : ipossia postnatale

Corteccia
cerebrale
scimmia
sana
Cr Cr
NAA
4.5 2.0 ppm 4.5
2.0 ppm
Corteccia
patologica
NAA
Esempi clinici clinici: : sclerosi multipla

Misure del metabolismo muscolare
mediante 1 H MRS e 31 P

• Il nucleo 31 P permette il riconoscimento dei gruppi fosfatici dell’ATP
rispetto a misure 1 H
Metabolismo ossidativo muscolare
muscolare: :
1 H vs 31 P

Metabolismo ossidativo: misura
dinamica mediante 31 P MRS

Paziente normale
Paziente obeso
IMCL:intra myocellular lipid
EMCL:extra myocellular lipid
Metabolismo muscolare
muscolare: : 1 H MRS

Metabolismo e Carbonio 13:
nuove frontiere

Il [1- 13 C]piruvato può essere iniettato all’ interno del paziente
dopo essere stato iperpolarizzato per amplificare il segnale
ricevuto. Esso è al centro di fondamentali vie metaboliche, dalle
quali è possibile estrarre importanti informazioni diagnostiche.
Iperpolarizzazione 13 13C

1. L’ osservazione delle varie vie metaboliche in cui si
inserisce il [1-13C]piruvato iperpolarizzato iniettato,
consente di monitorare lo stato di salute di organi e
tessuti specifici.
2. Il piruvato si trova al centro di fondamentali vie
metaboliche e cataboliche, esso rappresenta la chiave di
accesso per il ciclo di Krebs in cui la sua conversione in
lattato, alanina o bicarbonato dipende dallo stato di
salute delle cellule.
3. Il piruvato, una volta entrato nella cellula muscolare,
produce lattato ed alanina, che esprimono la generale
attività metabolica della cellula, ma anche bicarbonato il
quale è in equilibrio con il diossido di carbonio. Questi
ultimi due invece riflettono l’ attività mitocondriale della
cellula.
Metabolismo e carbonio 13

.
Fonte: “Metabolic Imaging by Hyperpolarized 13 C Magnetic Resonance Imaging for in vivo Tumor Diagnosis”.
Da il [1- 13 C]piruvato iniettato si creano ulteriori metaboliti come
[1- 13 C]lattato, [1- 13 C]alanina e [1- 13 C]bicarbonato.
Metabolismo della cellula

13C- lactate
13C- alanine
Spettro 13 C cuore
13C- pyruvate
13Cbicarbonate

Le concentrazioni di piruvato, alanina, lattato e
bicarbonato potessero essere indici univoci di
presenza di infarto in cellule del miocardio.
Ad esempio l’assenza di alanina e lattato all’interno
delle cellule miocardiche indicano la presenza di
gravi danni cellulari, come avviene nel caso di
ischemie, o addirittura la morte delle stesse cellule,
nel caso di infarto
Applicazioni cliniche