universita' degli studi di trieste celiachia e diabete tipo 1 - Clinica ...

UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI TRIESTE
Sede Amministrativa del Dottorato di Ricerca
UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI TORINO
Sede convenzionata
Dipartimento Univ. Clinico di Scienze della Riproduzione e dello Sviluppo
I.R.C.C.S. BURLO GAROFOLO
XVIII CICLO del
Dottorato di Ricerca in
Medicina materno-infantile, pediatria dello sviluppo e
dell’educazione, perinatologia
(Ssd: Area 06-Scienze Mediche MED/38-pediatria generale e specialistica)
Dottoranda:
CELIACHIA E DIABETE TIPO 1:
CONFRONTO DI MINI-LIBRERIE
ANTICORPALI “PHAGE DISPLAY”
Dott.ssa Fabiana Ziberna
Anno Accademico 2004-2005
Coordinatore:
Chiar.mo Prof. Domenico Tecilazich
(Università di Trieste)
Tutore e Relatore:
Dott. Tarcisio Not
(Università di Trieste)

INDICE
INDICE 2
RIASSUNTO E SCOPO DELLA TESI 5
CELIACHIA 7
INTRODUZIONE 7
PATOGENESI 9
GENETICA 12
ANTIGENI 13
ANTICORPI 15
FATTORI AMBIENTALI 16
GLUTINE 16
CELIACHIA ED ALTRE MALATTIE AUTOIMMUNI 19
DERMATITE ERPETIFORME (DH) 19
ARTRITE REUMATOIDE (RA) 20
LUPUS ERITEMATOSO SISTEMICO (LES) 21
ENTEROPATIA 22
DIABETE MELLITO INSULINO-DIPENDENTE 24
INTRODUZIONE 24
PATOGENESI 25
GENETICA 26
ANTIGENI 27
GAD 27
IA-2/IA-2β 27
INSULINA 28
ANTICORPI 29
ICA 30
GADA 30
IA-2A/IA-2A 31
IAA 31
FATTORI AMBIENTALI 31
GLUTINE 32
CELIACHIA E DIABETE 33
TOPO NOD 35
INTRODUZIONE 35
PATOGENESI 36
GENETICA 39
ANTIGENI 40
ANTICORPI 40
FATTORI AMBIENTALI 41
GLUTINE 42
PHAGE DISPLAY 44
RISULTATI 48
LIBRERIE UOMO 48
LIBRERIE TOPO 56
DISCUSSIONE 61
DISCUSSIONE TECNICA 61
DISCUSSIONE TOPO NOD 62
2

DISCUSSIONE UOMO 64
MATERIALI E METODI 68
A) COSTRUZIONE DI MINI-LIBRERIA ANTICORPALE FAGICA 68
A1.PREPARAZIONE DEI FRAMMENTI VH5 68
A1.1) ESTRAZIONE DI RNA DA TESSUTO BIOPTICO TRAMITE TRIZOL 68
A1.2) TRATTAMENTO DI RNA CON DNasi 68
A1.3) PRODUZIONE DI cDNA 69
A1.4) 1° PCR 69
A1.5) 2° PCR (aggiunta del linker) 69
A1.6) DIGESTIONE DEL FRAMMENTO VH 70
A2.PREPARAZIONE DEL VETTORE 70
A2.1) ESTRAZIONE DI DNA PLASMIDICO 70
A2.2) DIGESTIONE DEL VETTORE 70
A3.PREPARAZIONE DEL LIGATO 71
A3.1) LIGAZIONE 71
A3.2) PRECIPITAZIONE DEL LIGATO 71
A4.ELETTROPORAZIONE 72
A4.1) PREPARAZIONE DI CELLULE ELETTRO-COMPETENTI 72
A4.2) TRASFORMAZIONE DI CELLULE COMPETENTI MEDIANTE
ELETTROPORAZIONE 72
A5.RACCOLTA 73
A6.SELEZIONE 73
A7.ELISA 74
A8.FINGERPRINTING 74
A8.1) PCR 74
A8.2) DIGESTIONE 75
A9.SEQUENZIAMENTO 75
A9.1) PRE-PCR DI SEQUENZA 75
A9.2) PURIFICAZIONE DELLA PRE-PCR DI SEQUENZA 76
A9.3) PCR DI SEQUENZA 76
A9.4) PRECIPITAZIONE DELLA PCR DI SEQUENZA 76
A10.PRODUZIONE DELLA htTG 76
A10.1) PRODUZIONE 76
A10.2) SEPARAZIONE MEDIANTE CROMATOGRAFIA D'AFFINITA' 77
A10.3) ANALISI DELLA PROTEINA MEDIANTE SDS-PAGE 77
A10.4) WESTERN BLOTTING 77
A10.5) IMMUNO BLOTTING 77
A11.REAGENTI 78
A11.1) SOLUZIONI 78
A11.2) ANTIBIOTICI 79
B) COSTRUZIONE DI LIBRERIA TOTALE ANTICORPALE FAGICA 79
B1.PREPARAZIONE DEL scFv 79
B1.4) 1° PCR 79
B1.5) 2° PCR (aggiunta del linker) 80
B1.6) ASSEMBLING (VH+linker+VL) 81
B1.7) DIGESTIONE DEL scFv 81
B2.PREPARAZIONE DEL VETTORE 82
B2.1) ESTRAZIONE DI DNA PLASMIDICO 82
3

B2.2) DIGESTIONE DEL VETTORE 82
B8.FINGERPRINTING 82
B8.1) PCR 82
B9.SEQUENZIAMENTO 83
B9.1) PRE-PCR DI SEQUENZA 83
GLOSSARIO 84
ABBREVIAZIONI 85
BIBLIOGRAFIA 87
RINGRAZIAMENTI 93
4

RIASSUNTO E SCOPO DELLA TESI
Il progetto di ricerca, svolto nell’ambito del Dottorato, si proponeva l’obiettivo di cercare
delle correlazioni a livello anticorpale tra due malattie autoimmuni molto diffuse (celiachia
e diabete mellito insulino-dipendente) al fine di ipotizzare possibili spiegazioni sui
meccanismi patogenetici che intervengono nello scatenamento di esse.
L’associazione tra celiachia e diabete è in realtà nota da tempo ma la sua natura non è
conosciuta. Entrambe le patologie hanno un'eziopatogenesi multifattoriale e multigenica.
Inizialmente è stato analizzato un modello animale del diabete umano: il topo NOD, ma
che in realtà può considerarsi un elemento di collegamento con la celiachia, in quanto
presentante caratteri tipici di entrambe le malattie.
Tramite la tecnica del Phage Display sono state costruite 2 librerie anticorpali fagiche
totali di classe IgA rispettivamente dalla biopsia dell’intestino e della milza di un topo
NOD, posto a dieta standard (SD) contenente glutine, e di un topo BALB/c posto a SD,
come controllo.
Le librerie sono state selezionate su 2 antigeni: transglutaminasi tissutale murina (mtTG) e
IA2 umano (hIA2).
I risultati ottenuti da questo studio possono essere così riassunti:
nel topo NOD vengono prodotti anticorpi anti-mtTG, anche se a bassi livelli, soprattutto
nell'intestino; essi sono specifici; riconoscono un epitopo conformazionale e subiscono uno
switching isotipico tra intestino e sistema periferico (milza).
Nell’intestino non sono stati isolati scFvs anti-IA2 ad indicare che l’intestino non è
probabilmente la sede di produzione di tali anticorpi.
Dopo questo lavoro, si è passati alla costruzione di librerie anticorpali fagiche da biopsie
intestinali di soggetti umani. Si sono sottoposti a biopsia 45 soggetti suddivisi in 5 gruppi:
4 soggetti sani (gruppo di controllo negativo), 14 pazienti celiaci (gruppo di controllo
positivo), 2 pazienti celiaci in remissione, 12 pazienti diabetici di tipo 1 (gruppo in esame),
13 pazienti con altre patologie autoimmuni o con quadro clinico non definito.
Sono state costruite 43 mini-librerie anticorpali fagiche IgA da biopsia intestinale ed
inoltre 1 mini-libreria e 1 libreria totale IgA da biopsia della mucosa orale di 1 celiaco.
Gli esperimenti eseguiti hanno portato ai seguenti risultati:
5

− la mucosa orale rappresenta una prima barriera della risposta immune glutine-
dipendente ed usa le stesse famiglie geniche della mucosa intestinale per la formazione
degli anticorpi anti-tTG;
− è stata confermata la presenza di anticorpi anti-tTG umana a livello intestinale nei
soggetti celiaci;
− è stata confermata l'assenza di anticorpi anti-tTG nei soggetti sani, tranne in casi di
infiammazioni del tratto gastro-intestinale;
− è stata riscontrata una positività variabile di anticorpi anti-tTG a livello intestinale in
soggetti con altre condizioni autoimmuni;
− è stata rilevata una positività variabile di anticorpi anti-tTG a livello intestinale nei
pazienti affetti da IDDM. Si nota una correlazione tra la presenza di anticorpi anti-tTG
sierici e la presenza di anticorpi anti-tTG intestinali. Inoltre questi anticorpi sono
costituiti soprattutto dalla VH1;
− dalle biopsie intestinali indotte dei due soggetti celiaci in remissione si registra un
aumento, anche se lieve, della produzione di anticorpi anti-tTG.
Interessante è stato il risultato ottenuto dai 2 pazienti diabetici. La selezione delle librerie
di entrambi, inizialmente fortemente positive alla tTG, eseguite nuovamente dopo un anno
di dieta senza glutine, hanno dato esito negativo o quasi.
Questa tesi ha dimostrato l’esistenza di una risposta infiammatoria umorale anti-tTG
glutine-dipendente della mucosa intestinale, come nei celiaci, sia nel modello animale del
diabete, il topo NOD, che nei soggetti umani affetti da diabete mellito insulino-dipendente.
In base ai risultati ottenuti, si è avanzata un’ipotesi che possa spiegare il ruolo svolto
dall’enzima tTG nello sviluppo del diabete. L’enzima, per la sua capacità cross-linkante,
potrebbe legare non solo la gliadina ma anche antigeni tipici del diabete. Il complesso tTG-
antigene verrebbe riconosciuto dagli anticorpi espressi dai linfociti B. Questi
presenterebbero il complesso ai linfociti T attivandoli e quindi scatenando una risposta
autoimmune anche nei confronti di tale enzima e dei suoi substrati.
La dieta a-glutinata in soggetti predisposti al diabete di tipo 1 sembra preservare la
funzionalità delle cellule , aiutare a migliorare il controllo metabolico, ed eventualmente a
ridurre il fabbisogno insulinico, e prevenire possibili complicanze “silenziose”. Quindi si
pensa che la dieta senza glutine possa essere un utile strumento di prevenzione del diabete
e che possa offrire almeno ad una parte dei soggetti una riduzione del rischio.
6

CELIACHIA
INTRODUZIONE
La celiachia (CD) è un’enteropatia glutine-dipendente: malattia infiammatoria cronica
della mucosa dell’intestino tenue, caratterizzata da un’intolleranza immunomediata nei
confronti della gliadina, frazione del glutine principale componente proteico del frumento.
L’eziogenesi è multigenica e multifattoriale.
L’intolleranza ha per conseguenza non una reazione allergica (come per esempio nel caso
del latte vaccino) ma una reazione con alterazioni immunologiche del tutto equiparabile a
quella che si sviluppa contro un batterio patogeno, ed è perpetuata dall’assunzione
dell’alimento che comporta una cronica stimolazione del sistema immunitario in cui manca
l’instaurazione di una tolleranza immunologica nei confronti della gliadina. L’ipotesi
immuno-allergica, secondo la quale il glutine o un suo prodotto catabolico, agirebbe da
antigene, suscitando una reazione immunologica con effetto citotossico sulla mucosa
intestinale, ha numerose prove a suo favore (l’elevata frequenza di alcuni antigeni di
istocompatibilità, le alterazioni delle immunoglobuline (Ig) sieriche e tissutali e la presenza
di anticorpi circolanti anti-gliadina). È probabile che la stessa enteropatia, attraverso
un’aumentata permeabilità intestinale a macromolecole e attraverso un danno dell’apparato
della tolleranza immunologica, conduca al riconoscimento patologico di molecole self e
quindi all’autoimmunità.
Le evidenze suggeriscono che il danno mucosale sia prevalentemente mediato dall’azione
di linfociti T. L’endotelio intestinale presenta alterata permeabilità e squilibrio nella
produzione di citochine ad effetto morfogeno e ad effetto immunomodulante, che alterano
rispettivamente la proliferazione e la maturazione degli enterociti, cellule epiteliali
intestinali. Il glutine provoca lesione nel duodeno, parte prossimale dell’intestino tenue,
alterando la normale struttura della mucosa. Si ha una progressione del danno intestinale
che porta ad atrofia dei villi ed iperplasia delle cellule della cripta, rilevabili da una biopsia
intestinale piatta. Perciò vengono colpiti l’epitelio superficiale, le cripte epiteliali e la
lamina propria coinvolgendo così la mucosa e la sottomucosa intestinale. La biopsia
duodenale viene sottoposta a valutazione istologica (rapporto delle dimensioni tra i villi e
le cripte), morfometrica (conta dei linfociti intraepiteliali (IELs)) o immunoistochimica
(ricerca dei linfociti CD3 e ).
7

La malattia celiaca fu descritta per la prima volta da Samuel Gee nel 1888. Questa malattia
si è diffusa da Est ad Ovest seguendo proprio la diffusione delle colture cerealicole [1].
Nel corso degli ultimi anni le conoscenze su questa patologia sono radicalmente mutate, in
particolare in campo epidemiologico: considerata un tempo una malattia rara e di
pertinenza prettamente pediatrica, oggi si sa che è una delle malattie croniche
gastroenteriche più frequenti in assoluto. Diffusa tra le donne in misura doppia rispetto agli
uomini è sicuramente sottodiagnosticata. La celiachia presenta notevole variabilità nella
distribuzione geografica: la frequenza nella popolazione europea, in Australia e nel nord
America è di 1/100 [2], rara nella popolazione nera sub-sahariana d’Africa e negli asiatici
Cinesi e Giapponesi [3], la più alta (1/88-120) nell’Europa del Nord (Irlanda Occidentale)
[4].
La celiachia non si manifesta sempre in modo palese. La variabilità di presentazione
sintomatologica e clinica (classica o tipica, atipica, silente o asintomatica, potenziale o
latente) rende difficile la diagnosi e addirittura in alcuni casi il sospetto clinico.
Bisogna quindi considerare un ampio spettro di manifestazioni cliniche: quella tipica o
classica con sintomatologia gastro-intestinale marcata; atipica caratterizzata da
manifestazioni lievi (colite o colon irritabile, carenza di ferro resistente alla terapia); silente
o asintomatica caratterizzata da assenza di sintomi ma dopo l’avvio del trattamento si
registra un miglioramento del benessere psico-fisico.
La forma tipica esordisce precocemente, in genere a distanza di alcuni mesi dall’inizio
dello svezzamento, con i sintomi classici del malassorbimento intestinale: diarrea cronica,
vomito, meteorismo colico con distensione addominale, stipsi, enteropatia proteino-
disperdente, disturbi della nutrizione con inappetenza marcata, dolori addominali
ricorrenti, ritardo della crescita con calo ponderale e bassa statura.
La forma atipica si manifesta tardivamente con sintomi prevalentemente extra-intestinali:
stanchezza, debolezza, fragilità ossea, osteoporosi, anemia (soprattutto anemia microcitica
ipocromica dovuta a mancanza di ferro), aumento delle transaminasi epatiche, ipoplasia
dello smalto dentario, distrofia ungueale, dermatite erpetiforme, calcificazioni
endocraniche (non periventricolari), deficit di vitamine e sali minerali, stomatite aftosa,
ritardo dello sviluppo puberale, amenorrea e turbe della fertilità quali tendenza alla
poliabortività (per malassorbimento di nutrienti come l’acido folico), allergie ed
intolleranze.
8

Alla celiachia si associano, specie negli adulti, una lunga serie di patologie autoimmuni
anche severe, quali diabete di tipo 1, miastenia, alopecia, vitiligine, artrite reumatoide,
cirrosi biliare primitiva, malattie del tessuto connettivo, colangite sclerosante [5], epatite
[6], tiroidite autoimmune (di Graves e di Hashimoto) [7], malattie sindromiche (sindrome
di Sjögren, sindrome di Down [8]) e malattie neurodegenerative (atassia, epilessia) [9], che
sembrano essere tutte glutine-dipendenti.
Solo in alcuni casi, molto rari, la celiachia può manifestarsi in modo evidente fin
dall’inizio con complicanze gravi come la digiuno-ileite ulcerativa, caratterizzata dalla
presenza di multiple ulcerazioni dell’intestino tenue. Nei pazienti celiaci che non rispettano
la dieta correttamente o sono stati diagnosticati in età avanzata è stata osservata
un’aumentata predisposizione allo sviluppo di neoplasie del tubo digerente (linfomi e
adenocarcinomi intestinali), del cavo orale, della faringe e dell’esofago.
PATOGENESI
La celiachia presenta caratteristiche di autoimmunità: 1) la presenza di autoanticorpi
specifici 2) la presenza di linfociti intraepiteliali che possono mediare una citotossicità
diretta sugli enterociti esprimenti molecole di stress in maniera antigene non-specifica.
Nella malattia è prevalente la risposta cellulare. I linfociti T helper 1 (Th1) attivati dai
peptidi di gliadina, deamidata dall’enzima transglutaminasi tissutale (tTG), presentati dagli
antigeni leucocitari umani (HLA) di classe II, producono IFN che induce ulteriore
espressione di tTG e rilasciano TNF che stimola i fibroblasti a secernere nella matrice
extracellulare le metalloproteasi (collagenasi, stromolisina,…) che distruggono la mucosa.
Inoltre vengono attivati i linfociti Th2 che insieme a IL2, prodotta dai linfociti Th1,
stimolano la maturazione dei linfociti B. La continua ingestione di glutine porta alla
perpetuazione di questo ciclo con la produzione di citochine infiammatorie (IL15, IFN e
NF-kB) che sopraffanno le capacità difensive dell’organismo nel riparare il danno alla
barriera mucosale. Inoltre il glutine aumenta l’espressione di IL15 da parte delle cellule
epiteliali e della lamina propria. Questa citochina altera le proprietà dei linfociti
intraepiteliali in 2 modi: 1) inducendo IFN nei linfociti e attivando così macrofagi e
cellule T 2) promuovendo la trasformazione delle cellule T antigene-specifiche ad un
fenotipo natural killer (NK).
9

L’attivazione di NF-kB è uno step cruciale nell’amplificazione dell’espressione genica
proinfiammatoria. Quando i macrofagi reagiscono alla gliadina, NF-kB segnala
direttamente al DNA di trascrivere mediatori infiammatori [5].
Fig.1 Le cellule T attivate dal glutine stimolano altre cellule immunitarie promuovendo le loro
rispettive attività: le cellule B a creare anticorpi contro l’antigene, le cellule APCs a distruggere
l’antigene. Quando l’anticorpo lega l’antigene formano un complesso che viene neutralizzato
dal sistema del complemento e/o tramite fagocitosi. Tutte le cellule secernono citochine che
fungono da comunicatori immunoendocrini a corto e lungo raggio. L’IFN, la principale
citochina prodotta, attiva altri linfociti T e promuove il potere distruttivo dei macrofagi.
I linfociti intraepiteliali sono normalmente regolati dai recettori NKG2 delle cellule NK,
che riconoscono molecole HLA non classiche indotte da IFN (HLA-E) e molecole da
stress (MIC) sulle cellule epiteliali intestinali. I celiaci non trattati hanno una gran quantità
di cellule TCR + CD8 + CD4 - e TCR + CD8 - CD4 - nell’epitelio dei villi che aumentano
l’attivazione dei recettori NKG2. In seguito a dieta priva di glutine il numero di IELs
TCR + CD8 + CD4 - torna ad un livello normale mentre rimane alto il livello di IELs
TCR + CD8 - CD4 - . In particolare nei celiaci è presente in gran quantità il sottogruppo
cellulare V1V1 T che riconosce le molecole espresse sulla membrana dagli enterociti
10

in condizioni di stress. Queste cellule aumentano l’attivazione dei recettori NKG2 che
potrebbero a loro volta così favorire l’eliminazione di tali enterociti da parte dei IELs.
L’up-regolazione dei recettori NKG2 sembra essere guidata dall’IL15, espressa dagli
enterociti. Questa molecola sembra svolgere un ruolo critico nell’espansione dei IELs e
nell’induzione delle molecole di stress sulle cellule epiteliali intestinali. Il meccanismo che
porta all’aumento dell’espressione di IL15 da parte degli enterociti è però poco conosciuto.
Nelle biopsie di soggetti affetti da celiachia il peptide p31-43 -gliadinico induce
l’attivazione della MAP-chinasi negli enterociti e aumenta l’espressione di IL15. Quindi
tale peptide potrebbe scatenare un segnale tramite una via non ancora ben definita.
Il challenge o carico di gliadina in vitro, è un utile strumento per riprodurre varie
caratteristiche immunologiche che si verificano nei soggetti celiaci. Dopo 24 ore di
induzione con gliadina di una biopsia intestinale di paziente celiaco si osserva un aumento
dell’espressione di ICAM1, recettore per l’IL2, di molecole CD80 nelle cellule
mononucleari della lamina propria e l’infiltrazione dell’epitelio superficiale da parte di
cellule CD3 + . Inoltre è utile per studiare gli eventi patogenici precoci come l’aumentata
espressione, dopo 1 ora, di HLA-DR negli enterociti dei villi e nei macrofagi della lamina
propria [10]. Ad essa segue l’induzione di molecole HLA-DQ. Quindi solo negli stadi
successivi si ha l’attivazione delle cellule T e di tutte le modificazioni immunologiche
conseguenti.
Nei soggetti celiaci in fase acuta, lo strato delle cellule epiteliali diventa pseudostratificato
a causa dell’infiltrazione di plasmacellule nella lamina propria e di linfociti nello strato
epiteliale cosicché il numero di linfociti intraepiteliali in rapporto a quello degli enterociti
risulta aumentato. La maggior parte dei linfociti intraepiteliali esprime l’antigene
linfocitario CD3, il 70% esprime il fenotipo soppressore/citotossico CD8, il 5% esprime il
fenotipo helper/induttore CD4 e il 20% delle cellule sono CD3 + CD4 - CD8 - [11].
La risposta immune al glutine è sicuramente centrale nella patogenesi. Non è però chiaro
se gli anticorpi giochino anch’essi un ruolo nella patogenesi della malattia. Anche le
persone sane producono anticorpi anti-tTG ma in esse sembra che vengano prodotti anche
e in maggior quantità gli anticorpi anti-anticorpi anti-tTG cioè gli anti-idiotipo. Gli anti-
idiotipo sono un mimotopo dell’antigene. La risposta anti-idiotipo costituirebbe un sistema
per tenere sottocontrollo la risposta anticorpale.
11

GENETICA
Il ruolo della componente genetica è dimostrato dalla ricorrenza familiare di questa
malattia, circa 10 volte più comune nei parenti di soggetti affetti da celiachia rispetto alla
popolazione generale (rischio del 10-15% nei familiari di I°, del 2-4% nei familiari di II°)
[12]. Tuttavia non sono noti tutti i numerosi geni che contribuiscono alla predisposizione
ereditaria. Tra questi comunque il principale fattore genetico predisponente, identificato
nel 1965, è il sistema HLA, un complesso di geni con la funzione primaria di riconoscere
le molecole estranee all’organismo. Il sistema genico HLA è disposto nell’uomo sul
cromosoma 6p21.3 ed occupa circa l’1% dell’intero genoma. La funzione di queste
molecole è quella di presentare peptidi al recettore dei linfociti T: rispettivamente le
molecole HLA di classe I ai linfociti CD8 + mentre quelle di classe II ai linfociti CD4 + .
Il 90-95% dei celiaci presenta l’aplotipo HLA II DQ2 dato dagli alleli DQA1*0501 e
DQB1*0201 in cis (DR3) o in trans (DR5/7) mentre il rimanente 5-10% presenta l’aplotipo
DQ8 dato dagli alleli DQA1*0301 e DQB1*0302 soprattutto in cis (DR4) [13]. Questi due
aplotipi sono considerati dei marcatori di predisposizione genetica dell'intolleranza. Hanno
un valore predittivo positivo basso (infatti questi genotipi si riscontrano nel 20-30% di
soggetti sani della popolazione generale ma solo lo 0,1% sviluppa la malattia) ma un
valore predittivo negativo elevato [14].
La capacità di questi alleli nel conferire suscettibilità al glutine risiederebbe nella loro
peculiare affinità nel legare amminoacidi carichi negativamente come quelli presenti nei
peptidi gliadinici in seguito a deamidazione da parte della tTG [15]. La componente
genetica potrebbe agire non solo inducendo un’immunità anomala ma anche influenzando
la gravità degli effetti patologici.
Tuttavia l’avere questi aplotipi è una condizione necessaria ma non sufficiente per
sviluppare la malattia. Infatti i gemelli monozigoti hanno una concordanza solo del 70-
80% e quelli dizigoti di appena del 10-20% [16]. Quindi sono sicuramente coinvolti altri
geni. A tal proposito sono stati compiuti analisi di linkage con marcatori genetici
polimorfici sul genoma per trovare geni non HLA eventualmente associati alla celiachia
ma i risultati sono stati vari e contrastanti (CD28, CTLA4, ICOS sul cromosoma 2q33, geni
sul cromosoma 5q31-33, geni sul cromosoma 19p13) [17,18].
12

ANTIGENI
L’antigene riconosciuto dagli autoanticorpi nell’endomisio, struttura del tessuto connettivo
propria della matrice e della muscolatura liscia, è stato identificato nel 1997: l’enzima
transglutaminasi tissutale (tTG) o II (TG2) [19].
Le transglutaminasi (R-glutamilpeptidi: amino--glutamil transferasi) sono una famiglia di
enzimi che, in presenza di calcio, catalizzano la formazione di legami crociati (cross-
linking) tra proteine, trasferendo un gruppo -carbossiammidico di un residuo
dell’amminoacido glutammina (Gln) su un gruppo -amminico di un residuo
dell’amminoacido lisina (Lys) con rilascio di NH3 [20].
Fig.2 La tTG catalizza 2 reazioni, transamidazione o deamidazione, di specifici residui
glutaminici in proteine o polipeptidi. La propensione per la deamidazione aumenta
all’abbassarsi del pH e all’aumentare della concentrazione di substrati glutaminici.
Nei Mammiferi sono stati identificati 8 isozimi [21] tra cui: TG1-transglutaminasi
cheratinocita (TGk) sul cromosoma 14q11 di 106 kDa legata alla membrana plasmatica
delle cellule soprattutto degli strati spinoso e granulare dell’epidermide, coinvolta nei
rivestimenti cheratinocitici durante la differenziazione delle cellule epidermiche [22];
TG2-transglutaminasi tissutale (TGc o tTG) di 75 kDa; TG3-transglutaminasi epidermica
(TGe) di 77 kDa espressa soprattutto sulla superficie delle spine e nei strati granulari
dell’epidermide, è prodotta nei cheratinociti come zimogeno ed è proteolizzata in un
frammento di 47 kDa e uno di 30 kDa che si riassociano a formare l’enzima attivo durante
la differenziazione epidermica, la TGe e la TGc hanno in certe regioni un’omologia
aminoacidica del 64% e sono filogeneticamente strettamente correlate [23]; TG5-
transglutaminasi X (TGx) di 72/81 kDa espressa nei cheratinociti, recentemente scoperta
ma ancora da caratterizzare [24]; TG6-transglutaminasi espressa soprattutto nel cervello
13

che si pensa sia coinvolta nelle manifestazioni neurologiche della celiachia [25]; TG7-
transglutaminasi Z (TGz) di 80 kDa espressa nei fibroblasti dermici e nei cheratinociti;
transglutaminasi del plasma (TGplasma)-il fattore XIIIa della coagulazione di 77 kDa
espresso in forma di zimogeno tetramerico dato da 2 subunità A catalitiche e 2 B non
catalitiche, la forma attiva (2A) è data dal taglio operato dalla trombina o tripsina, presente
nei dendrociti dermici [26].
La tTG è ubiquitariamente presente in differenti tessuti e cellule e la maggior parte è
localizzata nel citoplasma. Viene espressa costitutivamente dai fibroblasti della lamina
propria, dagli enterociti dei villi, nei cheratinociti basali e anche nelle cellule endoteliali
del derma, nell’endotelio e nella muscolatura liscia di arterie, vene e capillari. L’enzima è
presente anche nella matrice extracellulare, associato con fibronectina, collagene tipo I e
laminina.
Il gene che codifica per la tTG umana II si trova sul cromosoma 20q12. E’ formato da 13
esoni e 12 introni. La proteina è costituita da 687 aa con un peso molecolare (PM) di 75
kDa. E’ composta da 4 domini: N-terminale N1 (1-139 aa) - CORE (140-454 aa) - loop
(ansa) - C-terminale C1 (479-585 aa) - C-terminale C2 (586-687 aa). Il sito catalitico e i
siti di legame per il calcio si trovano nel Core [27].
Fig.3 La figura illustra la struttura secondaria dell’enzima transglutaminasi tissutale (tTG) in
cui sono evidenziati i vari domini.
La tTG ha 2 attività enzimatiche antagoniste: 1) attività transglutaminasica dipendente da
calcio 2) attività GTPasica (il sito di legame per la molecola GTP si trova nel Core).
L’enzima tTG svolge diverse funzioni: 1) funge da recettore -adrenergico per attivare la
fosfolipasi C 2) modula la progressione nel ciclo cellulare 3) è coinvolto nell’endocitosi
mediata da recettore 4) attiva il TGF che stimola la differenziazione delle cellule
dell’epitelio intestinale 5) è coinvolto nell’adesione e mobilità cellulare: ancora i
14

fibroblasti alla matrice extracellulare tramite interazioni con integrine e fibronectina [28]
6) è coinvolto nel processo apoptotico stabilizzando i corpi apoptotici [29] 7) è coinvolto
nell’esocitosi legata alla secrezione dell’insulina.
ANTICORPI
Inizialmente il primo test utilizzato per la diagnosi di celiachia si basava sulla ricerca degli
anticorpi anti-gliadina (AGA) IgA/IgG. L’esame sierologico ha alta sensibilità ma bassa
specificità, quindi risulta essere piuttosto impreciso [30].
Poi si è passati alla ricerca degli anticorpi anti-endomisio (EMA) IgA mediante
immunofluorescenza indiretta su sezioni di cordone ombelicale (sensibilità 93%) o di
esofago di scimmia (sensibilità 97%). Il test ha alta specificità (98-99%) ma è piuttosto
costoso ed operatore-dipendente [31].
Infine con la scoperta dell’enzima transglutaminasi è stata elaborata una nuova metodica
che va a rilevare gli anticorpi anti-tTG (AtTGA) IgA/IgG in ELISA. Il test con una
specificità e sensibilità di quasi il 100% è attualmente il migliore [32].
Gli anticorpi anti-tTG, impedendo le normali funzioni dell’enzima quale la mobilità dei
fibroblasti e dei monociti, interferirebbero con la migrazione dei fibroblasti e delle cellule
epiteliali dalle cripte all’apice dei villi causando così l’atrofia dei villi stessi.
Nei pazienti che non presentano atrofia della mucosa un utile criterio diagnostico è il test
che rileva gli anticorpi tTG-specifici in situ. Esso rileva i depositi di IgA tTG-specifici
nell’intestino. In caso di deficit di IgA o si ricercano gli anticorpi anti-tTG IgG ma più
sensibile è rilevare i depositi di IgM tTG-specifici [33].
In un recente lavoro è stato dimostrato che è possibile isolare anticorpi anti-tTG in forma
di scFv (single chain fragment variable) solo da librerie di paziente celiaco ottenute
partendo dai linfociti intestinali (IBLs) e non da quelli del sangue periferico (PBLs). Al
contrario sono stati isolati anticorpi anti-gliadina da entrambi i tipi di libreria. Questo
risultato indica che la risposta umorale contro la tTG avviene solo a livello locale [34].
I complessi glutine-tTG, in forma di tiolesteri, potrebbero permettere, con un meccanismo
intramolecolare, ai linfociti T autoreattivi tTG-specifici di aiutare i linfociti B ad eseguire il
cambio isotipico e a differenziarsi in plasmacellule secernenti anticorpi IgA anti-tTG.
Questa ipotesi potrebbe spiegare perché tali anticorpi sierici spariscono nei celiaci a dieta.
15

I soggetti celiaci non trattati hanno un’alta probabilità di sviluppare col tempo anticorpi
contro autoantigeni caratteristici di altre patologie autoimmuni come: anti-GAD65 e anti-
IA2 del diabete, anti-TPO (perossidasi tiroidea) e anti-tg (tireoglobulina) della tiroidite,
anti-recettore dell’acetilcolina della miastenia, anti-nucleo del Lupus eritematoso [35].
FATTORI AMBIENTALI
La sovrapposizione di concause ambientali (dieta, infezioni da microrganismi virali
(adenovirus) e fungini (Candida albicans), tossine, età, sesso, ormoni sessuali e stress
emotivo) e genetiche è alla base dell’eziogenesi della celiachia. Comunque il principale
fattore eziologico che scatena la risposta autoimmune è la gliadina, contenuta nel glutine.
GLUTINE
La celiachia è una patologia autoimmune causata da intolleranza al glutine e proteine simili
presenti nelle cariossidi dei cereali (grano, frumento, orzo, segale, le rispettive farine, e
farro, spelta, kamut o teff, sorgo e triticale). Il ruolo patogenetico del glutine fu evidenziato
da Dike nel 1970. Il glutine costituisce fonte di azoto e carbonio per la crescita dei semi
durante la germinazione. Esso è una miscela di proteine di riserva presente
nell’endosperma dei cereali, che può essere separata in: glutenine-molecole acido solubili
polimeriche, unite da ponti disolfuro, ad alto e basso peso molecolare; prolamine-molecole
alcool solubili monomeriche, ricche in glutammina e prolina (Pro). Le prolamine del
frumento vengono chiamate gliadina (36 kDa), suddivisibili in base alla crescente mobilità
elettroforetica a pH=4 in 4 famiglie (). Le prolamine del segale sono dette secaline,
quelle dell’orzo ordeine.
La gliadina potrebbe essere responsabile della patogenesi della celiachia indirettamente in
2 modi: 1) bloccando l’apoptosi necessaria durante la selezione negativa dei cloni
autoimmuni 2) per mimetismo molecolare (1. con la molecola BM180 presente sulla
membrana basale 2. con un ipotetico autoantigene della frazione nucleare delle cellule
intestinali 3. con un antigene derivante da fibroblasti 4. con la calreticulina degli enterociti
5. con la proteina Elb dell’adenovirus sierotipo 12).
La gliadina deamidata ha più potere immunogeno. La deamidazione consiste nella
trasformazione dell’amminoacido Gln in acido glutammico (Glu). Ai fini della tossicità
non sembra essere importante la struttura terziaria della gliadina ma piuttosto la
formazione di mono- o di-peptidi, dovuti ad un’incompleta digestione da parte degli
16

enzimi gastro-pancreatici (proteasi/peptidasi) es: i peptidi 31-49 [36] e 57-73 [37] della A-
gliadina, 62-75 della -2 gliadina e 57-68 della -9 gliadina [38], 56-89 (33-mer) [39]. Nei
soggetti sani i peptidi non completamente idrolizzati vengono assorbiti per via
transcellulare e degradati dagli enzimi intraluminali nei compartimenti endolisosomiali
degli enterociti [40].
In seguito ad un regime alimentare privo di glutine si assiste alla scomparsa delle
manifestazioni cliniche, alla normalizzazione degli esami sugli anticorpi e delle eventuali
alterazioni metaboliche, alla regressione della lesione fino al ripristino della normale
struttura della mucosa intestinale. I miglioramenti dei sintomi e della funzionalità
intestinale precedono la guarigione istologica che procede preferenzialmente in senso ileo-
digiunale. Attualmente l’unica terapia è la dieta priva di glutine che porta naturalmente
però ad una riduzione della compliance ovvero alla qualità della vita e soprattutto i soggetti
giovani ne soffrono psicologicamente.
Sono allo studio delle cure alternative alla dieta senza glutine come 1) la creazione di
varietà di frumento meno tossiche rimuovendo o modificando la sequenza della gliadina,
2) la somministrazione orale dell’autoantigene per indurre tolleranza, 3) enzimi in grado di
metabolizzare gli elementi proteici più “indigesti” per il celiaco, 4) farmaci competitori
con attività anti-transglutaminasi, 5) anti-citochine ed immunomodulatori in grado di
bloccare la risposta abnorme nei confronti del glutine, 6) immunosoppressione tramite
anticorpi anti-idiotipo, 7) blocco degli anticorpi tramite peptidi inibitori.
Le possibili terapie alternative alla dieta senza glutine prevedono in particolare di agire su:
1) gliadina - diminuendo il carico dell’antigene tramite selezione o produzione di varietà
prive di sequenze biologiche rilevanti; tramite terapia enzimatica supplementare; tramite
digestione di cereali tossici mediante proteasi batteriche (es: trattamento con PEPs =
prolilendopeptidasi, enzimi endoproteolitici che si ottengono dai lieviti che idrolizzano i
peptidi) 2) CTLA4 - interferendo con il passaggio intestinale della gliadina 3) peptidi -
interferendo con la presentazione della gliadina alle cellule T tramite inibizione della tTG o
il blocco delle molecole HLA 4) IL15 - interferendo con l’attività delle cellule T con anti-
CD3, anti-CD154, con complessi solubili HLA-peptide, con analoghi di peptidi
immunogenici 5) IL10 e 6) TNF - utilizzando citochine antinfiammatorie e
immunoregolatrici.
17

Tutte queste soluzioni sono però palliativi, degli interruttori intermedi, in quanto non
vanno ad agire veramente a monte del problema. Al momento le prove di efficacia di
questi potenziali trattamenti alternativi sono ancora in fase “embrionale”. Il tutto è
rallentato dalla mancanza di un modello animale di celiachia.
18

CELIACHIA ED ALTRE MALATTIE AUTOIMMUNI
Qui di seguito una breve descrizione di alcune malattie autoimmuni associate alla celiachia
con certezza (Dermatite Erpetiforme e Artrite Reumatoide) e non (Lupus Eritematoso ed
Enteropatia autoimmune) che sono state riscontrate in alcuni soggetti appartenenti allo
studio.
DERMATITE ERPETIFORME (DH)
La Dermatite Erpetiforme, infiammazione della pelle a grappoli, fu descritta per la prima
volta da Duhring nel 1884. E’ una malattia autoimmune cronico-recidivante, rara
nell’infanzia, caratterizzata da depositi granulari di IgA lungo la membrana basale del
derma papillare. Il rash (lesione/eritema della cute) dermico è dato da eritemi, placche
orticarie, papule, vescicole erpetiformi ed escoriazioni con una distribuzione caratteristica
sul corpo (cuoio capelluto, avambracci, gomiti, ginocchia, natiche). E’ una condizione
papulo-vescicolare persistente e pruriginosa. Le caratteristiche cliniche sono: 1) vescicole
dovute a microascessi di neutrofili che rilasciano enzimi (elastasi) che causano il danno
alla giunzione derma-epiderma 2) lesioni eritematose ponfoidi 3) esiti ipopigmentali. La
malattia è istologicamente caratterizzata da vescicole subepidermiche con infiltrato
infiammatorio costituito soprattutto da neutrofili e monociti. L’infiltrato linfocitico è
solitamente accompagnato da fibrosi e dilatazione capillare delle papille dermiche [41].
Si rileva una frequenza maggiore nella fascia d’età tra i 20-50 anni, soprattutto nelle
femmine. L’86% dei soggetti con DH sono DQ2 positivi. Studi su gemelli monozigoti
mostrano una non completa concordanza ad indicare che nel determinare il fenotipo
intervengono anche fattori ambientali o epigenetici. I pazienti con DH hanno spesso altre
malattie autoimmuni associate: la più comune è la tiroidite, seguita da diabete insulino-
dipendente e lupus eritematoso.
Il principale antigene presente negli immuno-precipitati dermici è l’enzima
transglutaminasi epidermica (TGe o TG3). Gli anticorpi sono principalmente di tipo IgA1.
Il test degli anticorpi anti-TGe è in questo caso quello con maggior sensibilità e specificità.
Infatti i pazienti con DH presentano anticorpi anti-transglutaminasi epidermica, non cross-
reattivi con la tTG, ad alta avidità e ad alta affinità. Il 70% dei pazienti con DH hanno
anticorpi IgA sierici contro gliadina, tTG, reticolina ed endomisio. Questo dato rafforza
19

l’ipotesi della natura autoimmune di questa patologia e riflette lo stato di enteropatia
presente nei soggetti con DH.
La dermatite erpetiforme viene perciò considerata una manifestazione cutanea
extraintestinale della sensibilità al glutine. Una dieta priva di glutine permette la
remissione dei sintomi cioè la scomparsa delle lesioni sulla pelle. Tanto è vero che il 75%
dei pazienti che soffrono di questa malattia presenta una mucosa atrofica. La DH si
sviluppa in genere in soggetti celiaci che hanno una forma latente o silente della malattia. I
celiaci possono però presentare anche altre malattie dermatologiche oltre alla dermatite
erpetiforme. Il primo articolo riportante un’associazione tra celiachia e dermatite
erpetiforme risale al 1966 (Marks J, Shuster S, Watson A J Small-bowel changes in
dermatitis herpetiformis. Lancet 2: 1280-1282 (1966)). Sebbene sia la celiachia che la
DH presentano una combinazione delle risposte cellulare e umorale, la DH è considerata
una malattia prevalentemente Th2 mediata, mentre la celiachia una malattia Th1 mediata
[23].
Esiste un modello animale di dermatite erpetiforme creato dall’incrocio tra un topo NOD
(Non Obese Diabetic) e un topo HLA-DQ8 + transgenico mancante del MHC II murino
endogeno. Il fenotipo murino presenta delle somiglianze con la patologia umana
(dipendenza da DQ8, depositi di IgA sotto la lamina densa, dipendenza da ingestione di
glutine) ma anche alcune differenze (mancanza di enteropatia e di anticorpi circolanti
contro l’endomisio e la tTG). Si è dimostrato che il background genetico fornito dal topo
NOD è necessario per lo sviluppo di questa patologia autoimmune ma non sono chiari
quali precisi elementi vi contribuiscano [42].
ARTRITE REUMATOIDE (RA)
L’artrite reumatoide è una malattia infiammatoria cronica autoimmune che colpisce la
membrana sinoviale delle articolazioni che aumenta di volume invadendo la cartilagine
provocandone l’erosione e la graduale distruzione. Questo processo proliferativo si estende
fino all’osso interessando tutti i tessuti che circondano l’articolazione.
Si stima che in Italia la popolazione colpita si aggiri attorno all’1%. Colpisce
preferibilmente le donne (3:1). Sebbene sia possibile la sua comparsa nell’età pediatrica si
rivela per lo più tra i 35-50 anni. Presenta un decorso ciclico con fasi di acutizzazione che
si alternano a periodi di remissione. Sintomi tipici sono: anemia, febbre, astenia (debolezza
20

muscolare), dolore articolare caratterizzato da tumefazione (gonfiore) e da rigidità
articolare. La malattia colpisce le articolazioni in modo simmetrico.
Le cause scatenanti sono multifattoriali tra cui infezioni virali (Epstein-Barr virus o
Citomegalovirus) e predisposizione ereditaria (persone con consanguineo affetto da RA
hanno una probabilità 4 volte maggiore di essere colpite dalla malattia).
L’associazione tra RA e celiachia è ben documentata. Elevati titoli di fattore reumatoide
(FR) IgA e IgM sono stati rilevati in pazienti affetti da celiachia sia prima che dopo la
manifestazione di sintomi di artrite. Il fattore reumatoide è composto da un gruppo di
anticorpi, per lo più della classe IgM, che reagiscono contro le IgG di varia origine nei
liquidi organici, formando immunocomplessi che danneggiano i tessuti. La presenza di FR-
IgA nel fluido digiunale e la sua non determinabilità in caso di deficit di IgA suggeriscono
la sede di produzione di tale FR. Alcuni autori hanno inoltre ipotizzato un ruolo concausale
di antigeni del Proteus in pazienti celiaci affetti da artrite reumatoide [43].
LUPUS ERITEMATOSO SISTEMICO (LES)
Il nome lupus eritematoso sistemico risale all’inizio del XX secolo. Lupus è una parola
d’origine latina, che si riferisce al caratteristico rash a forma di farfalla riscontrata sul viso
di molti pazienti con LES, che ricordava ai medici i contrassegni bianchi presenti sul muso
dei lupi. Sistemico significa che interessa diversi organi del corpo. Eritematoso in greco
vuol dire rosso e si riferisce al rossore dell’eritema cutaneo.
E’ una malattia sistemica autoimmune che colpisce parecchi organi quali reni (nel 50% dei
casi), polmoni, cervello (raro), cuore, sangue, cute ed articolazioni. La malattia ha un
quadro clinico estremamente vario, caratterizzato da fasi di attività alternate ad altre di
remissione. L’inizio o la ricaduta del LES può essere scatenato da vari fattori, quali lo
sbilanciamento degli ormoni durante la pubertà, l’esposizione ai raggi ultravioletti del sole,
alcune infezioni virali e certi medicinali. All’esordio, i sintomi più comuni sono disturbi
non specifici, come stanchezza, senso di affaticamento e malessere generale. In molti casi
c’è una febbre intermittente o continua, calo di peso e perdita dell’appetito. In seguito,
appaiono segni specifici causati dall’interessamento di uno o più organi del corpo. La cute
e le mucose sono spesso coinvolte mostrando diversi tipi d’eritema, fotosensibilità e
ulcerazioni nel naso e nella bocca. Il tipico eritema a “farfalla”, che si estende fra gli
zigomi coprendo i lati del naso, è presente in un terzo dei bambini affetti. I sintomi
21

possono manifestarsi anche con dolore alle articolazioni, dolori muscolari, anemia,
ecchimosi, mal di testa, convulsioni e dolori al petto.
Attualmente in Italia i malati di LES sono circa 50000, con un numero di circa 1500-2000
nuovi casi diagnosticati ogni anno. Si tratta di una malattia diffusa in tutte le aree
geografiche anche se sembra più comune nelle popolazioni d’origine afro-americana,
ispanica, asiatica e indigena del nord America. Colpisce particolarmente il sesso
femminile. L’esordio può avvenire a qualsiasi età. Per le donne, comunque, il picco
massimo d’incidenza è a 37 anni, nel pieno cioè del periodo fertile. Per il sesso maschile la
tipica età di insorgenza è identificata attorno ai 50 anni. L’esordio della malattia è raro
prima del quinto anno d’età ed insolito prima dell’adolescenza.
E’ caratterizzata dalla presenza di anticorpi diretti contro antigeni nucleari quali gli
anticorpi anti-nucleo (ANA), che si riscontrano però anche in altre malattie (esempio
l’artrite idiopatica giovanile) e persino nel 5% dei bambini sani, gli anticorpi anti-dsDNA,
gli anticorpi anti-fosfolipidi e gli anticorpi anti-Sm. Questi ultimi autoanticorpi si trovano
quasi esclusivamente in pazienti con il LES e spesso aiutano a confermare la diagnosi.
Oltre agli anticorpi antinucleo, nel lupus sono importanti gli anticorpi diretti contro le
cellule del sangue.
In letteratura vengono descritti pochi casi di SLE e CD in combinazione anche se viene
riportata una prevalenza di anticorpi anti-gliadina nei pazienti con SLE sino al 23%. La
maggior parte non mostra segni di enteropatia nella biopsia. Sebbene queste due malattie
non sembrano essere legate da un punto di vista sierologico, sono accomunate dal substrato
genetico. Infatti nel 40-70% di pazienti con SLE è presente l’aplotipo HLA-DQ2/DR3
[44]. A tal riguardo sono stati compiuti degli studi utilizzando proprio il topo NOD che con
l’età sviluppa alcune caratteristiche del LES quali l’anemia emolitica e gli anticorpi anti-
nucleo. Sono state identificate 4 regioni geniche sui cromosomi murini 1, 10, 16 e 17 che
potrebbero essere implicate nello sviluppo della malattia [45].
ENTEROPATIA
Nell’enteropatia da glutine il quadro clinico è caratterizzato da diarrea cronica secretiva,
aumento delle IgA e delle IgM mucosali dopo esposizione alla gliadina, depositi di
immunocomplessi, sintomi da malassorbimento nel bambino con diarrea intermittente,
dolore addominale, irritabilità, steatorrea, possibile evoluzione con edemi periferici da
enteropatia proteino-disperdente, anemia, diatesi emorragica da deficit di vitamina K,
22

tetania da deficit di calcio e magnesio e deficit di crescita; perdita di peso nell’adulto.
L’enteropatia autoimmune è caratterizzata dalla presenza di autoanticorpi circolanti diretti
contro l’orletto a spazzola e/o contro il citoplasma degli enterociti. L’epidemiologia
genetica ha dimostrato che esiste una predisposizione genetica associata agli aplotipi HLA
B8 e DW3. Studi genomici suggeriscono che contribuiscono alla suscettibiltà anche altri
loci non MHC. L’esatto ruolo di questi geni addizionali, che potrebbero essere coinvolti
nell’inizio e nella progressione della malattia, rimane da stabilire.
23

DIABETE MELLITO INSULINO-DIPENDENTE
INTRODUZIONE
Il termine diabete deriva dal greco diabetes e significa passare attraverso. Infatti uno dei
segni clinici più distintivi di tale patologia è la presenza di zucchero nelle urine, che vi
giunge attraverso il rene quando la sua concentrazione nel sangue supera un certo valore.
L’Organizzazione Mondiale della Sanità ha stabilito che il livello massimo di glicemia a
digiuno è di 126 mg/dl.
Il diabete mellito insulino-dipendente (IDDM) o di tipo I o 1 è una malattia poligenica ad
ereditarietà autosomica e multifattoriale con fattori genetici, ereditari, ambientali (dieta,
infezioni da virus o agenti di natura non infettiva come tossine, interferenze ormonali),
immunologici e fenomeni acquisiti che governano la sua insorgenza.
E’ una patologia cronica autoimmune organo-specifica ed è la più comune tra le malattie
endocrine, caratterizzata da alterazioni metaboliche che colpiscono vari organi.
L’IDDM insorge soprattutto in età pediatrica per questo è conosciuto anche come "diabete
giovanile". E’ raro prima dei 9 mesi di età, si registra un picco tra i 5-15 anni, con
un'uguale incidenza in entrambi i sessi. E’ la forma meno frequente (circa il 5% di tutti i
diabetici). La frequenza della malattia varia molto nel mondo: 0,06% in Giappone, 1,3%
negli USA, 0,26% in Italia con l’eccezione del 1,5-2% in Sardegna, in Europa il tasso di
incidenza è alto al nord, nord-ovest [46].
Mentre i sintomi (poliuria, polidipsia, polifagia, ipoinsulinemia, iperglicemia, progressiva
perdita di peso, in alcuni casi comparsa di chetoacidosi) appaiono improvvisamente, lo
sviluppo della malattia richiede tempi molto lunghi.
Il diabete è una malattia complessa e può comportare complicanze serie, legate ad un
insufficiente controllo glicemico, se non è tempestivamente diagnosticata: retinopatia
(cecità), nefropatia (insufficienza renale), neuropatia (macroangiopatia) e problemi
cardiovascolari (infarto miocardico).
Spesso viene riscontrata una storia familiare di diabete mellito tipo 1, celiachia o altri
disturbi endocrini di natura autoimmune come la tiroidite di Hashimoto, vitiligine o anemia
perniciosa. Inoltre il 6% dei pazienti stessi può avere associata la celiachia o, in una
percentuale quasi doppia, può comparire all'epoca della pubertà la tiroidite autoimmune.
24

Sindromi genetiche a volte associate con il diabete sono la sindrome di Down, di
Klinefelter, di Turner, l’atassia di Friedreich, la Corea di Huntington, la distrofia miotonica
e la porfiria [47].
Il diabete di tipo 1 si manifesta a seguito della distruzione progressiva e altamente selettiva
delle cellule degli isolotti di Langerhans pancreatiche, unica fonte dell'organismo di
insulina, ormone chiave per controllare il glucosio nel sangue, ad opera di linfociti T
citotossici attivati, provocata da una reazione autoimmunitaria in corso. La distruzione del
patrimonio cellulare del pancreas è irreversibile. L’unica terapia è la somministrazione di
insulina.
PATOGENESI
C’è sia una risposta autoimmune cellulare che anticorpale. Si ritiene che il danno sia
dovuto soprattutto alla risposta cellulare mentre gli anticorpi costituirebbero un
epifenomeno che aiuterebbe a perpetuare la reazione autoimmune, favorendo la
presentazione degli autoantigeni ai linfociti T. Mediante tecniche genetiche e sierologiche
è stato però dimostrato che anche le cellule B svolgono un ruolo essenziale nello sviluppo
delle insuliti e del diabete. Altri fattori, correlati ai linfociti B, altrettanto importanti sono le
citochine che alterano sia la loro funzione che la loro specificità antigenica.
Nella fase iniziale, clinicamente silente, linfociti T autoreattivi ed altre cellule
infiammatorie invadono gli isolotti pancreatici distruggendoli provocando così l’insulite
cioè necrosi insulare con infiltrazione linfocitaria [48].
L'insulina è abbondantemente espressa negli isolotti pancreatici ma ci sono cellule anche
nel timo che esprimono antigeni periferici come l'insulina e GAD65. Dal momento che
quindi ci sono cellule APC esprimenti insulina ci si chiede come possono i linfociti T
autoreattivi sfuggire nel timo alla selezione negativa. Due spiegazioni sono possibili: 1) i
peptidi riconosciuti dai linfociti T non sono presenti ad una concentrazione sufficiente ad
indurre la selezione negativa o 2) le cellule APC esprimono sulla loro superficie di
membrana molecole MHC II che legano debolmente i peptidi antigenici [81].
La prima fase è caratterizzata dalla comparsa nelle cellule insulari di un infiltrato costituito
da macrofagi, linfociti B, cellule NK, linfociti T CD8 + e linfociti CD4 + con un profilo
citochinico di tipo Th1. I linfociti Th1 tramite la produzione di IFN e TNF scatenano
una risposta infiammatoria attivando macrofagi, stimolando la produzione di anticorpi IgG,
attivando una risposta citotossica. I linfociti creano un microambiente ricco di citochine
25

infiammatorie e fattori di crescita che potenziano e mantengono la risposta autoreattiva.
L’IL1 inibisce la secrezione di insulina delle cellule e ad alte concentrazioni è
citotossica. L’IFN stimola l’espressione di molecole HLA ed è chemiotattico verso altri
linfociti. Oltre a queste reazioni di citotossicità T-mediata importanti sono i fenomeni
apoptotici. Infatti i mediatori rilasciati nel microambiente inducono l’espressione sulle
cellule pancreatiche di Fas, iniziatore del programma di morte cellulare. I topi NOD con
difetto genetico del Fas sono protetti dallo sviluppo del diabete. La molecola interagirebbe
con il suo ligando (Fas ligando) presente sulle cellule mononucleate infiltranti. I corpi
apoptotici non rimossi, per alterazioni dell’attività dei fagociti, costituiscono una ricca
fonte di autoantigeni [49].
GENETICA
Gli studi effettuati hanno dimostrato una certo substrato genetico: i figli di un ammalato
hanno maggiori probabilità di contrarre la patologia rispetto a chi non ha familiari diabetici
(intorno al 5-10%). Le possibilità aumentano ancora se entrambi i genitori ne soffrono
(circa il 23%). In ogni caso non si può parlare di una vera e propria ereditarietà ma di
predisposizione.
Il principale fattore genetico correlato al rischio di diabete è probabilmente il sistema HLA.
Circa il 90% dei soggetti con IDMM hanno l'aplotipo HLA-DQ8/DR4 o HLA-DQ2/DR3.
Il 40-50% dei soggetti diabetici è doppio eterozigote DR3-DR4. In realtà si è visto che
alcuni aplotipi HLA conferiscono un aumento del rischio di sviluppare il diabete mentre
altri risultano quasi protettivi (Tab.1-pag. successiva) [50].
Solo il 10% degli individui eterozigoti che hanno l'aplotipo HLA a più alto rischio sviluppa
il diabete di tipo 1. Perciò per lo sviluppo della malattia è necessaria la suscettibilità ad
altri loci ma l'identificazione e la funzione di questi sono ancora ampiamente sconosciuti.
Altre regioni cromosomiche potrebbero contribuire alla suscettibilità: sul cromosoma 2 il
locus IDDM12 (2q33) che contiene il gene per CTLA4 e il locus IDDM10 che contiene il
gene per GAD65; sul cromosoma 11 il locus IDDM2 (11p55) che contiene il gene per
l’insulina; sul cromosoma 10 il locus IDDM7 (10p) che contiene il gene per un fattore di
trascrizione espresso durante lo sviluppo del pancreas [51].
Comunque la mancanza di una completa concordanza per la malattia nei gemelli omozigoti
pone in rilievo l’importanza dei fattori ambientali.
26

RISCHIO
Elevato
Moderato
Basso o poco protettivo
Molto protettivo
HLA-DRB1
0401 (DR4)
HLA
HLA-DQA1 DQB1
0402 (DR4)
0405 (DR4)
0301 0302 (DQ8)
0301 (DR17(3)) 0501 0201 (DQ2)
0801 (DR8) 0401 0402 (DQ4)
0101 (DR1) 0101 0501 (DQ5)
0901 (DR9) 0301 0303 (DQ9)
0401 (DR4) 0301 0301 (DQ7)
0403 (DR4) 0301 0302 (DQ8)
0701 (DR7) 0201 0201 (DQ2)
1101 (DR11(5)) 0501 0301 (DQ7)
1501 (DR15(2)) 0102 0602 (DQ6)
1401 (DR14(6)) 0101 0503 (DQ5)
0701 (DR7) 0201 0303 (DQ9)
Tab.1 Tabella indicante l’associazione tra gli aplotipi HLA e il grado del rischio di sviluppare
il diabete insulino-dipendente.
ANTIGENI
Le proteine riconosciute dagli autoanticorpi nei pazienti diabetici sono: 1) GAD65 2) IA-2
o IA-2 3) insulina. E' possibile che più di un antigene possa essere coinvolto nelle fasi
precoci della malattia [81].
GAD
L’enzima glutammico decarbossilasi (GAD) esiste in due forme codificate
indipendentemente da 2 geni localizzati rispettivamente sui cromosomi 10 e 2: GAD65 di
65 kDa e GAD67 di 67 kDa, che differiscono nella sequenza aminoacidica all'estremità N-
terminale. Questa proteina è importante nel sistema nervoso centrale dove catalizza la
trasformazione dell’acido glutammico in acido -aminobutirrico (GABA),
neurotrasmettitore inibitore [52]. E’ un enzima citoplasmatico, si trova soprattutto nei
tessuti nervosi endocrini ed ha una regione la cui sequenza aminoacidica è simile a quella
della proteina P-2C del virus Coxsackie B. Quindi un'ipotesi sul suo ruolo patogenico nel
diabete di tipo 1 potrebbe coinvolgere il fenomeno del mimetismo molecolare [81].
IA-2/IA-2β
Il gene per IA-2 si trova sul cromosoma 2q35 e codifica per una proteina di 979 aa. Il gene
per IA-2β è situato sul cromosoma 7q36 [53]. IA-2 e IA-2β, o ICA512 o fogrina, due
proteine appartenenti alla famiglia delle tirosinfosfatasi (PTP), sono i maggiori
27

autoantigeni nel diabete. IA-2β differisce da IA-2 per la mancanza di 388 aa all’estremità
N-terminale e di 65 aa a quella C-terminale. Vengono espresse nei tessuti neuroendocrini,
incluse le isole pancreatiche. Entrambe le proteine sono formate da: un peptide segnale,
una regione extracellulare di 20 kDa, un dominio transmembrana, una regione citosolica di
42 kDa che include all'estremità C-terminale un dominio PTP di 18 kDa [54].
Gli epitopi riconosciuti dagli autoanticorpi mappano nella regione citosolica e si
distribuiscono tra il dominio PTP (79% di omologia tra le due proteine) e il precedente
segmento giustapposto alla membrana (juxtamembrane-JM) (60% di omologia). Sembrano
esserci ampi cambiamenti nella specificità epitopica degli anticorpi durante la progressione
della malattia dalla fase pre-clinica a quella post-clinica.
Il progressivo ampliamento (spreading) della risposta autoimmune ai diversi epitopi delle
tirosinfosfatasi, con massima specificità per quello JM, si verifica nella stragrande
maggioranza dei casi entro i primissimi anni di vita e rappresenterebbe il miglior indicatore
indiretto della distruzione autoimmune della cellula. Ciò suggerisce che probabilmente la
regione JM possa contenere qualche epitopo criptico nei confronti del quale è
primariamente diretta l'autoimmunità anti-cellula pancreatica e la cui identificazione
potrebbe aiutare la prevenzione primaria della malattia [55].
INSULINA
Il gene codificante l’insulina si trova sul cromosoma 11p15. La sequenza di amminoacidi
dell'ormone fu stabilita da Sanger nel 1960. Ciò condusse alla sintesi completa della
proteina nel 1963 e alla determinazione della sua struttura tridimensionale per opera di
Hodgking e collaboratori.
Le cellule degli isolotti di Langerhans sintetizzano l'insulina partendo da un precursore:
la pre-pro-insulina. A livello della membrana del reticolo endoplasmatico si origina la pro-
insulina costituita da 3 domini: 1 catena B N-terminale, 1 catena A C-terminale e 1 peptide
C di collegamento. Nella conversione della pro-insulina in insulina, 4 amminoacidi basici e
il restante peptide di connessione vengono asportati per proteolisi. Questo distacco dà
origine alle due catene polipeptidiche A e B che costituiscono la molecola di insulina. La
catena A contiene un ponte disolfuro al suo interno (tra gli amminoacidi 6 e 11) e due ponti
disolfuro uniscono le due subunità tra loro. L'insulina è una proteina risultante dalla
polimerizzazione di più unità elementari costituite ciascuna da 51 radicali amminoacidi
riuniti in due catene polipeptidiche (A e B). Infatti la catena A è costituita di solito da 21
28

esidui aminoacidici e la catena B da 30. Il suo PM è circa 5800. Le due catene
dell'insulina formano una struttura altamente ordinata con più regioni ad -elica sia nella
catena A sia nella catena B. Le catene isolate dell'insulina sono inattive [56].
Fig.4 Raffigurazione tridimensionale della struttura dell’insulina. La formula è
C254H377N65O76S6: in rosso gli atomi di C, in verde quelli di O, in blu quelli di N e in rosa quelli
di S.
Sebbene la sequenza di amminoacidi dell'insulina si sia conservata in gran parte invariata
nel corso dell'evoluzione, essa presenta variazioni importanti tra le specie che spiegano le
differenze sia nella potenza biologica sia nell'immunogenicità. Nella maggior parte delle
specie esiste un unico gene per l'insulina e un unico prodotto proteico. Fanno eccezione i
ratti e i topi che hanno due geni codificanti l'insulina e sintetizzano due molecole che
differiscono tra loro per due residui aminoacidici nella catena B [57].
L'insulina svolge essenzialmente due importanti funzioni:
− garantisce il trasporto del glucosio nei vari tessuti dell'organismo
− permette la trasformazione del glucosio in glicogeno (glicogenosintesi).
L'insulina in realtà evoca un ampio spettro di risposte biologiche: 1) promuove il deposito
di grasso e di glucosio (entrambi fonti di energia), convertendolo in trigliceridi, all'interno
di cellule bersaglio specializzate 2) influenza la crescita cellulare e le funzioni metaboliche
di una grande varietà di tessuti (fegato, tessuto muscolare e tessuto adiposo) 3) interviene
nella sintesi proteica e nella sintesi di acidi nucleici [58].
ANTICORPI
I più importanti anticorpi nell’ambito del diabete insulino-dipendente sono: 1) gli anticorpi
anti-cellula pancreatica (ICA) contro aspecifici autoantigeni cellulari, 2) gli anticorpi
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anti-glutammicodecarbossilasi (GADA), 3) gli anticorpi anti-tirosinfosfatasi (IA2A/IA-
A) e 4) gli anticorpi anti-insulina (IAA).
Dopo l'inizio della terapia insulinica tali anticorpi a poco a poco diminuiscono e quelli che
hanno una più lunga durata sono quelli anti-GAD che si sono dimostrati positivi, in alcuni
casi, perfino dopo 10 anni dalla comparsa del diabete mellito tipo 1.
Il rilevamento di anticorpi anti-GAD, anti-IA2 e anti-insulina è un metodo usato di routine
per lo screening. Essi costituiscono i marcatori principali della fase preclinica del diabete
di tipo 1. In genere infatti la presenza degli anticorpi precede di anni lo sviluppo della
malattia.
Se c’è un solo tipo di autoanticorpo non ha forte valore prognostico. La contemporanea
presenza di più tipi di autoanticorpi, perdurante nel tempo, ha invece un alto valore
predittivo. Il loro rilevamento combinato rappresenta il miglior test predittivo nei parenti
prediabetici di 1° grado di pazienti affetti da IDDM. Infatti identifica il 90% degli individui
a rischio [59].
Tutti questi autoanticorpi appartengono soprattutto all'isotipo IgG1, indicando che vengono
indotte cellule Th CD4 + autoantigene specifiche.
Gli autoanticorpi caratteristici del diabete presentano alcune regioni geniche V uguali a
quelle impiegate per la formazione degli autoanticorpi anti-DNA e anti-FR espressi nei
disordini autoimmuni sistemici [74].
ICA
Gli anticorpi anti-insula pancreatica sono organo-specifici di classe IgG, identificati per la
prima volta nel 1974. Si rilevano tramite test di immunofluorescenza indiretta su sezioni di
tessuto pancreatico umano. Da dati riguardanti i marcatori immunologici ottenuti nei
parenti di 1° grado di diabetici di tipo 1 si è visto che la presenza di anticorpi ICA ad alto
titolo (>20 JDF unità) configura un 40-60% di rischio di diabete tipo 1 nei successivi 5-7
anni [60].
GADA
Gli anticorpi contro GAD65 sono diretti principalmente contro la porzione centrale (245-
449 aa) e C-terminale (450-585 aa) della proteina [56].
30

IA-2A/IA-2A
Gli anticorpi anti-IA2 rappresentano uno dei più importanti marcatori immunosierologici
del diabete di tipo 1. La presenza di autoanticorpi verso queste proteine si rileva nel 70% di
pazienti neodiagnosticati e nei loro parenti di primo grado.
L'anticorpo per la regione JM dell'antigene (IA-2JMA) compare generalmente per primo
negli infanti e determinerebbe una più rapida progressione per il diabete (diabete ad
insorgenza infantile rispetto a quello del giovane o del giovane adulto) sia quando presente
da solo ma soprattutto quando eventualmente si verifica il fenomeno dello spreading
autoanticorpale con la comparsa associata degli autoanticorpi anti-IA-2 e anti-IA-2. E'
stato anche ipotizzato che l'autoanticorpo anti-IA-2JM possa influenzare la processazione
dell'antigene determinando un’attivazione delle cellule T con inasprimento ed
autoperpetuazione della cascata autoimmune anti-cellula , i cui indicatori indiretti
sarebbero proprio gli autoanticorpi anti-IA-2 e anti-IA-2. Essi reagiscono soprattutto con
il dominio intracellulare delle proteine [61].
La maggior parte dei sieri che riconoscono IA-2 riconoscono anche IA-2 ma non
viceversa. Perciò gli autoanticorpi anti-fogrina sembrano esser un sottogruppo di quelli
anti-IA-2 [53].
IAA
Gli anticorpi anti-insulina hanno un alto valore predittivo per uno sviluppo rapido della
malattia conclamata. Sono di classe IgG. La misurazione degli IAA è importante per la
diagnosi ma soprattutto per la predizione dell'IDDM. Infatti gli IAA sono tra i primi
autoanticorpi a comparire. Gli autoanticorpi sono diretti contro epitopi che mappano
soprattutto sulla catena B della proteina [82].
FATTORI AMBIENTALI
Principalmente 3 fattori ambientali sono ritenuti importanti nella patogenesi dell’IDDM: 1)
infezioni virali (in particolare da enterovirus: Rubella congenita, Citomegalovirus) 2) latte
vaccino e 3) glutine. Tutti e tre entrano in contatto con l’organismo a livello della mucosa
intestinale.
Il meccanismo con cui le infezioni da enterovirus avviino l’autoimmunità nel pancreas non
è noto. Una possibile spiegazione prevede la teoria del mimetismo molecolare cioè la
somiglianza tra proteine virali e pancreatiche [62].
31

La precoce introduzione del latte vaccino scatena una risposta immune contro l’insulina
bovina in esso contenuta e provoca un minor effetto protettivo garantito invece dal latte
materno. Gli anticorpi che reagiscono con l’insulina bovina non sono però correlati agli
IAA. Il ruolo del latte vicino è comunque controverso [63].
GLUTINE
Più complesso è il ruolo giocato dal glutine.
La frequenza del diabete è in aumento nei Paesi industrializzati e negli ultimi anni si è
assistito ad un’anticipazione dell’età di comparsa (sotto i 4 anni). Di conseguenza i fattori
ambientali dovrebbero agire in età precoce. Quindi si suppone che l’aumento del rischio sia
imputabile a fattori ambientali legati alla dieta. Si devono perciò analizzare i cambiamenti
avvenuti soprattutto nell’alimentazione dei bambini quali la precoce introduzione del latte
vaccino, come detto precedentemente, e un’aumentata introduzione di glutine. Nel secolo
scorso sono cambiate le abitudini dietetiche non tanto con l’introduzione ma con l’aumento
delle quantità. Tale variazione è avvenuta in un lasso di tempo (poco più di un secolo) così
breve da non permettere l’adattamento della specie umana in termini di selezione naturale,
non c’è stato il tempo sufficiente per permettere cambiamenti genetici nella popolazione
(adattamento) [64].
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CELIACHIA E DIABETE
L’associazione tra celiachia e diabete è in realtà nota da tempo: fu descritta per la prima
volta nel 1969 [65] ma la sua natura non è conosciuta.
Alterazioni intestinali sono frequenti nei diabetici all’esordio. Infatti si riscontrano
frequentemente sintomi gastrointestinali come nausea, vomito, dolori addominali, diarrea e
costipazione.
Diversi studi compiuti su popolazioni differenti hanno cercato di valutare l’associazione tra
queste due malattie autoimmuni. E' risultata un'alta prevalenza della malattia celiaca (10%
circa) ed una maggiore predisposizione a sviluppare la malattia in pazienti con diabete ad
esordio precoce.
E’ vero anche viceversa: pazienti celiaci possono sviluppare nel tempo, soprattutto se non
sottoposti a trattamento, il diabete [66].
Le due patologie hanno un comune substrato genetico dato dagli stessi HLA (DR3/DR4,
DQ2 e DQ8). La predisposizione genetica determina rischio anche nei parenti di soggetti
celiaci e di diabetici [67].
Comunque il background genetico simile non è la sola caratteristica che hanno in comune
le due malattie. Si ipotizza infatti un ruolo causale dell’intolleranza al glutine nello
sviluppare la reazione autoimmunitaria contro il pancreas. Il glutine è ritenuto perciò uno
dei fattori ambientali che possa influenzare il rischio di sviluppare il diabete.
Quest’affermazione si basa su diverse osservazioni:
− anticorpi anti-pancreas, se presenti in pazienti celiaci, tendono a scomparire in seguito a
dieta senza glutine [68]
− regioni geografiche (Giappone, Corea, Polinesia) con basso consumo di farina di grano
hanno una minor incidenza di diabete [83]
− nei soggetti diabetici si assiste spesso ad una tarda positivizzazione agli anticorpi anti-
tTG ad indicare l’insorgenza di un’intolleranza nei confronti del glutine.
L’identificazione di una risposta autoimmune contro la tTG a livello mucosale in soggetti
diabetici costituisce quindi un fattore di rischio per lo sviluppo di malattie autoimmuni
come appunto la celiachia.
Uno studio condotto dal professor Panizon (Clinica Pediatrica, Università di Trieste) porta
all'ipotesi che i virus, il latte vaccino e il glutine, quest'ultimi se introdotti più
33

precocemente nella dieta rispetto all'allattamento al seno, possano determinare l'insorgenza
del diabete di tipo 1 attraverso una modificazione della permeabilità intestinale (teoria
della "bystander suppression") [69].
Non è però chiaro come un’infiammazione nell’intestino sia legata al processo di
distruzione delle cellule . La scoperta di segni di attivata immunità mucosale cellulo-
mediata nell’intestino di pazienti IDDM è coerente con una risposta T mucosale anormale
al glutine [70]. La spiegazione potrebbe venire dall’osservazione della presenza di cellule
T diabetogeniche, con proprietà di homing mucosale, nel sistema immunitario associato
all’intestino. L’ipotesi suggerita di legame tra i due organi è che i linfociti autoreattivi
infiltranti gli isolotti esprimendo recettori homing associati all’intestino possano circolare
liberamente tra pancreas e intestino [71].
In realtà secondo un lavoro presente in letteratura ci sarebbe una finestra temporale di
esposizione ai cereali al di fuori della quale esisterebbe un rischio di sviluppare il diabete
in bambini con predisposizione: prima dei 4 mesi o dopo i 7 mesi di età [71].
Concludendo:
− la diagnosi precoce di celiachia potrebbe ridurre il rischio di sviluppare il diabete
mellito insulino dipendente
− la dieta a-glutinata in soggetti predisposti al diabete di tipo 1 sembra preservare la
funzionalità delle cellule .
La cura della celiachia ha quindi un effetto positivo sul diabete sia perché aiuta a
migliorare il controllo metabolico, ed eventualmente a ridurre il fabbisogno insulinico, sia
perché aiuta a prevenire possibili complicanze “silenziose” quali l’anemia e l’osteoporosi.
34

TOPO NOD
INTRODUZIONE
Il topo NOD (Non Obese Diabetic) ha avuto origine in Giappone circa 20 anni fa (Makino
S, Kunimoto K, Maraoka Y, Mizushima Y, Katagiri K, Toshino Y Breeding of a non-
obese, diabetic strain of mice. Exp Anim 29: 1-13 (1980)).
Esso sviluppa spontaneamente diverse malattie autoimmuni come il diabete insulino-
dipendente, la sindrome di Siögren, il Lupus eritematoso sistemico e l'artrite reumatoide.
Di queste però, la malattia meglio caratterizzata è l’IDDM, accompagnata da
manifestazioni cliniche quali glicosuria, polifagia, polidipsia, poliuria, ipercolesterolemia e
chetoanemia [44]. L'insulite nel topo NOD appare spontaneamente attorno alle 3-4
settimane di età. La progressione a diabete avviene tra le 10-30 settimane di vita. I topi
NOD femmina mostrano una più alta incidenza (10-40%) di IDDM rispetto ai maschi,
discrepanza che non si riscontra nell'uomo [72]. Non sempre lunghi periodi di insuliti
progrediscono necessariamente nella malattia. Il passaggio da questo stato di “insulite
tollerata” al diabete coinvolge un cambiamento nel potenziale patogenico della
popolazione linfocitaria [73].
Rappresenta il miglior modello animale che ha fornito essenziali informazioni sui
meccanismi patogenetici del diabete autoimmune [74]. Alcuni di questi potrebbero agire
anche nella patogenesi del diabete umano. In realtà vi sono contrastanti osservazioni
sull'efficacia di alcuni agenti terapeutici (citochine, -galactosilceramide, antiossidanti,
nicotinamide, molecole che distruggono i radicali liberi,...) contro lo sviluppo del diabete
testati nei topi NOD. Ciò suggerisce che nella patogenesi del diabete autoimmune siano
coinvolti differenti meccanismi in specie diverse. Perciò questi modelli animali potrebbero
essere considerati non come modelli del diabete in sè ma piuttosto modelli dei meccanismi.
Questi animali condividono comunque importanti caratteristiche immunologiche con il
diabete umano: 1) associazione genica, in particolare con i geni MHC 2) profilassi
mediante immunosoppressione 3) trasmissione della malattia mediante trapianto di linfociti
T o cellule ematopoietiche staminali del midollo osseo [75].
35

PATOGENESI
La nostra comprensione del diabete autoimmune, largamente basata sui risultati
provenienti dagli esperimenti sui topi NOD, indica il verificarsi di 2 gruppi di eventi
cruciali:
1) l'attivazione di cellule T patogeniche capaci di distruggere le cellule β pancreatiche
2) l'induzione di meccanismi immunoregolatori responsabili della corretta soppressione di
risposte immuni potenzialmente patogeniche.
Una lieve alterazione di questo equilibrio, data per esempio da un'infezione virale o da un
altro fattore ambientale, darebbe il via all'insorgenza della malattia [74].
Nel topo NOD all'inizio della periinsulite si riscontrano delle anormalità delle cellule T:
iporesponsività proliferativa dei linfociti T, diminuzione del livello di IL2, assenza di
secrezione di IL4 e perdita della funzione regolatoria delle cellule T. Inoltre nel timo e nel
sistema periferico del topo NOD a 3 settimane di età si verifica una riduzione nel numero e
nella funzionalità delle cellule tipo-NK. Ciò comporta una ridotta produzione di IL4 che a
sua volta determina una minor differenziazione di cellule Th2 generando così un
disequilibrio fra linfociti periferici Th1 e Th2. A partire dalle 4-6 settimane si osserva
un'alterazione nella secrezione di citochine da parte delle cellule T infiltranti gli isolotti. In
particolare si verifica un aumento nel rapporto tra IFNγ e IL4 che è predittivo
dell'insorgenza del diabete [72].
L'insulite inizia con un accumulo di macrofagi e cellule dendritiche attorno agli isolotti
pancreatici di Langerhans. Il motivo di tale fenomeno è sconosciuto. In altri organi
endocrini (tiroide, ghiandola pituitaria e ovarica) le cellule dendritiche sono coinvolte nella
regolazione delle risposte endocrine. Perciò si ipotizza che l'accumulo di cellule APC nel
pancreas sia causato da un'errata funzione endocrina degli isolotti. Difatti si registra
un’iperattività endocrina precedente all'infiltrazione degli isolotti pancreatici. Quindi la
loro iperproliferazione non è causata dall'infiltrazione dei linfociti B [76].
Sembra che i linfociti T regolatori CD4 + CD25 + svolgano nel topo NOD un ruolo
importante nel controllare la progressione della malattia poichè una riduzione del numero
di queste cellule correla con un'acutizzazione e accelerazione della patologia. Dagli
esperimenti condotti sul modello animale, sia le cellule T CD4 + che quelle CD8 + risultano
importanti per lo sviluppo del diabete. Le prime sembrano essere necessarie per
l'instaurarsi dell'insulite, per la distruzione delle cellule β pancreatiche citochine-mediata e
36

probabilmente per l'attivazione delle cellule T CD8 + . Queste a loro volta medierebbero la
distruzione delle cellule β tramite l'azione citotossica data dal rilascio di granenzimi,
perforina, IFNγ e TNFα [75]. Infatti sembra che il TNFα endogeno alteri la soglia richiesta
per la selezione negativa e positiva delle cellule T nel timo del topo NOD in maniera età
dipendente [72].
Fig.5 Schema delle cellule patogeniche e protettive coinvolte nella patogenesi del diabete
autoimmune. APCs, cellule dendritiche (DCs) e macrofagi (M) possono secernere, in seguito
ad attivazione da parte di differenti stimoli di origine batterica o virale, citochine con effetti
opposti come l’IL12 e IL10. Se prevale l’IL12 vengono indotti soprattutto i linfociti Th1 che
inducono a loro volta la produzione di IL12 da parte delle DCs tramite il legame CD40-
CD154. Inoltre le cellule Th1 producono alte quantità di IFN che amplifica l’espressione di
IL12 indotta dalle Th1 stesse. L’IFN attiva i M a secernere citochine tossiche (IL1, TNF e
specie ossigeno reattive (ROS)) per le cellule pancreatiche. In più IFN e IL2 stimolano le
cellule T CD8 + citotossiche (CTL) che uccidono le cellule tramite i meccanismi mediati da
Fas, TNF o perforina. I linfociti Th1 possono danneggiare anche direttamente le cellule
mediante la secrezione di citochine come IFN e TNF. Tutti questi meccanismi portano
quindi alla distruzione delle cellule pancreatiche e al rilascio di antigeni propri di queste
cellule (proinsulina, GAD e IA2) che possono venir presentati a specifiche cellule T da parte di
APCs pancreatiche. Le cellule T regolatorie CD4 + CD25 + , esprimenti CD152, possono però
inibire l’attività patogenica delle cellule Th1 mediante contatto diretto cellula-cellula. Un ruolo
inibitore può esser svolto dai linfociti Th2 che secernendo IL10 inibiscono la produzione di
IL12 da parte delle DCs e l’attivazione dei linfociti Th1. Anche le cellule NK svolgono un
ruolo inibitorio. Questi 3 sottogruppi di cellule T soppressorie sono difettivi nel topo NOD.
Nel topo NOD, oltre ai linfociti T, lo sviluppo del diabete di tipo I è associato alla presenza
di linfociti B che potrebbero essere importanti nella patogenesi della malattia. Questa
ipotesi è rafforzata dall'osservazione che nel topo NOD compaiono precocemente cloni di
linfociti B naive (vergini) autoreattivi verso antigeni tipici del diabete [77].
In realtà dagli esperimenti condotti sugli animali è nato un nuovo concetto
dell'autoimmunità: la malattia non è dovuta alla diretta rottura della tolleranza immunitaria
37

ma piuttosto alla rottura di sistemi secondari di controllo [73]. In particolare nella
patogenesi del diabete sembrano esserci 2 punti di controllo fondamentali: il primo regola
la composizione della popolazione cellulare APC e l'espressione di integrine e molecole di
adesione che aumentano il potenziale homing delle cellule T verso gli isolotti; il secondo
sovrintende il passaggio dall'insulite al diabete tramite l'espressione di citochine,
l'equilibrio tra cellule Th1-Th2, la modulazione di recettori di superficie come CD152,
CD25 e recettori tipo-NK, il reclutamento di cellule patogeniche e cellule APC, il controllo
del numero e delle funzioni di cellule regolatorie [74].
Più precisamente:
1) il checkpoint 1 controlla l'insorgenza dell'insulite - Prima delle 3 settimane di vita non si
osserva infiltrazione negli isolotti pancreatici sebbene circolino in gran quantità nel sistema
immunitario cellule T potenzialmente aggressive. Il superamento di questo punto di
controllo comporta un flusso massiccio di cellule T negli isolotti.
2) il checkpoint 2 controlla l'insorgenza del diabete - A dispetto di un'estesa e attiva
insulite, ci sono cellule β intatte che persistono per lunghi periodi. Quando questo punto di
controllo viene superato, le insuliti diventano aggressive.
Le possibili spiegazioni di malfunzionamento del punto di controllo 1 sono: 1) l'assenza o
la presenza di cellule APC funzionalmente deficitarie 2) cambiamenti nel potenziale
homing delle cellule T che conferiscono ai linfociti la capacità di migrare negli spazi
connettivi pancreatici 3) cambiamenti nell'espressione di molecole di adesione
nell'endotelio dei vasi sanguigni pancreatici attorno alle zone di insorgenza delle insuliti.
Le possibili spiegazioni della rottura del punto di controllo 2 sono: A - eventi intrinseci alle
cellule che riflettono modificazioni delle cellule CD4: 1) l'acquisizione di nuove capacità
effettrici 2) la perdita della sensibilità al controllo negativo da parte di molecole di
superficie (CTLA4, recettore dell'IL2, recettore MHC delle cellule NK); B - eventi
estrinseci alle cellule che corrispondono a cambiamenti in altri tipi cellulari o a segnali che
influenzano l'attività delle cellule T autoimmuni: 1) il reclutamento di cellule CD4 + o
CD8 + 2) la perdita del sistema di controllo negativo tramite l'inattivazione di certe
popolazioni cellulari o tramite la secrezione di citochine inibitorie (TGFβ, IL10) 3) la
perturbazione della rete regolatoria anti-idiotipica 4) il reclutamento nel sito di lesione di
tipi cellulari accessori come i macrofagi [73].
38

GENETICA
Come già detto, il diabete è una malattia poligenica. Infatti la perdita della tolleranza
immunitaria dei linfociti T viene associata nel modello animale a ben 19 loci genetici
sebbene il ruolo dominante di suscettibilità sia imputato all'unica molecola MHC di classe
II presente nel topo NOD I-A g7 , nel locus Idd1 sul cromosoma 17, che è strutturalmente e
funzionalmente omologa a quella umana HLA DQ8 [74]. Sostituendo la molecola I-A g7
MHC II con quella equivalente umana DQ8, il topo NOD sviluppa ugualmente il diabete
[78]. Perciò l’HLA-DQ8 è associato alla celiachia e al diabete. Inoltre è riportato in
letteratura di un ceppo ibrido murino, ottenuto dall’incrocio tra un topo NOD con un topo
transgenico per il DQ8 umano che sviluppa una risposta anticorpale contro la gliadina e la
tTG in seguito ad immunizzazione con gliadina e presenta un’architettura dell’intestino
tipica del celiaco con l’accorciamento dei villi e un aumento delle dimensioni delle cripte
[79]. Sembra che la molecola I-A g7 leghi debolmente i peptidi antigenici rendendoli
difettivi nel mediare la selezione timica negativa delle cellule T autoreattive [74].
Altri loci genici non MHC murini candidati diabetogenici sono: Idd3 sul cromosoma 3 che
comprende il gene che codifica per l'IL2; Idd5 sul cromosoma 1 che include i geni che
codificano per CTLA4 e CD28; Idd9 sul cromosoma 4 che comprende i geni per CD30,
TNFR2 e CD137; Idd4 che mappa nella regione centrale del cromosoma 11 che include la
famiglia genica delle CC β-chemochine. Infatti si è visto che differenti rapporti nei livelli
di espressione intrapancreatica di certe β-chemochine possono influenzare positivamente o
negativamente l'insorgenza del diabete [72]. Un ulteriore gene implicato nello sviluppo del
diabete nel topo NOD è Bcg che rende l’animale capace di controllare la proliferazione di
parassiti intracellulari come il Mycobacterium spp. Infatti nei topi NOD infettati con
Mycobacterium avium la severità delle insuliti risulta minore [80].
La parte distale del cromosoma 1 del topo NOD è importante per parecchie malattie
autoimmuni anticorpo-dipendenti ma sorprendentemente in questa regione non ci sono loci
diabetogenici. Ciò potrebbe indicare un ruolo minore degli autoanticorpi nella patogenesi
del diabete.
39

Fig.6 Mappa dei possibili loci genici del topo NOD coinvolti nello sviluppo del diabete
insulino-dipendente.
ANTIGENI
La tecnologia transgenica è stata ampiamente utilizzata nei topi NOD per identificare i
possibili autoantigeni isolotti-specifici contro cui i linfociti T autoimmuni rispondono.
Negli isolotti pancreatici del topo NOD sono state identificate cellule T CD4 + che
riconoscono un peptide formato dagli aa 9-23 della catena B dell'insulina e cellule T CD8 +
che riconoscono invece un peptide formato dagli aa 15-23 della stessa proteina. Quindi la
catena B dell'insulina nel topo NOD è chiaramente un bersaglio antigenico.
Per quanto riguarda GAD la distribuzione delle isoforme della proteina differisce tra uomo
e topo. Infatti nel pancreas murino prevale il GAD67 mentre in quello umano il GAD65.
Finora nel topo NOD non sono state isolate cellule T CD8 + diabetogeniche che
riconoscono GAD, sebbene queste ultime siano state invece trovate nell'uomo.
Inoltre nel topo NOD la proteina hsp60, in particolare il peptide p277, sembra essere un
possibile candidato antigenico ma per ora non si è trovata una molecola umana equivalente
[81].
ANTICORPI
Nel topo NOD si registra un alto livello di IAA a 8 settimane di età. Questo dato correla
fortemente con un alto rischio di sviluppare la malattia molto precocemente (16-18
settimane di età).
Inoltre linfociti T diretti contro GAD e insulina sono isolabili molto precocemente, già alla
3°- 4° settimana di vita. La comparsa degli anticorpi anti-GAD coincide con l’instaurarsi
dell’insulite. Trasferendo gli autoanticorpi da un animale malato ad un altro non si induce
40

la malattia. Indicazione che probabilmente gli anticorpi hanno solo una funzione indiretta
nella patogenesi della malattia [82].
FATTORI AMBIENTALI
Fattori ambientali quali la nutrizione possono contribuire allo sviluppo di processi
autoimmuni. Nei topi NOD è stato ampiamente provato che il diabete è una malattia
influenzata dalla dieta: la farina di grano e le proteine della soia sono stati identificati come
i maggiori componenti diabetogenici presenti nel cibo ma i meccanismi con cui questi
fattori agiscono nello sviluppare la malattia non sono chiari [83].
Un possibile meccanismo con cui la dieta potrebbe influenzare lo sviluppo del diabete
riguarda i cambiamenti nella composizione della microflora intestinale fisiologica. La
microflora commensale rappresenta un fattore critico per lo sviluppo e la maturazione del
sistema immunitario mucosale intestinale, importante sito di induzione delle risposte
immuni regolatorie. Lo sviluppo del diabete di tipo 1 potrebbe quindi dipendere dalla
qualità della barriera protettiva microbiologica.
La microflora intestinale endogena ha parecchie funzioni ma due aspetti potrebbero essere
rilevanti nell’effetto protettivo. Primo, la funzione metabolica della microflora nel colon
include la fermentazione di grandi polisaccaridi e di oligo o disaccaridi non assorbibili.
Sembra che i composti acetato, propionato e butirrato, prodotti dai batteri, riducano la
risposta glicemica al glucosio introdotto per via orale influenzando la resistenza insulinica
e l’attività delle cellule e perciò lo sviluppo del diabete. Secondo e probabilmente
l’aspetto più importante, la microflora intestinale fisiologica rappresenta la maggior forza
di maturazione dello sviluppo del sistema immunitario della mucosa intestinale. La
superficie mucosale è una delle maggiori interfacce tra l’organismo e l’ambiente e
costituisce il principale sito di induzione per le risposte immunitarie regolatorie.
Cambiamenti nella composizione della microflora commensale, formata da Gram-
anaerobi, potrebbero alterare questa regolazione immunitaria agendo sulle funzioni delle
cellule dendritiche mucosali. Più precisamente i composti batterici potrebbero fornire un
segnale tramite i recettori tipo-toll (TLR). Infatti TLR4 è attivato dal lipopolisaccaride
presente nei Gram- mentre TLR2 è specifico per i componenti dei Gram+ [80].
41

GLUTINE
Anche il glutine, fattore di rischio nei topi NOD, potrebbe avere un effetto diretto sulle
cellule dendritiche. Quindi una dieta priva di glutine (GFD) potrebbe prevenire lo sviluppo
del diabete agendo sulla microflora intestinale. Infatti si è osservato che i topi NOD posti a
dieta priva di glutine presentano, rispetto a quelli nutriti con una dieta standard (SD), un
minor numero di batteri nell’intestino cieco. Più precisamente essi hanno meno batteri
aerobici e microaerofilici, meno batteri Gram+ catalasi-, più batteri corineformi. Per
quanto riguarda i batteri Gram- non si rilevano differenze [80].
Inoltre nei topi NOD posti a dieta priva di glutine, anche per un breve periodo dopo lo
svezzamento, si osserva, rispetto a quelli sottoposti ad una dieta standard: 1) una minor
incidenza del diabete (a 43 settimane di età l’incidenza del diabete nei topi NOD SD è del
97% mentre in quelli GFD è del 65%) 2) un’insorgenza più tardiva (l’età media di
insorgenza nei topi NOD SD è di 19 settimane mentre in quelli GFD è di 28 settimane) 3)
un minor titolo anticorpale di IAA 4) un minor numero di insuliti 5) un aumento
dell’espressione di IL4 6) una maggior altezza dei villi (ma nessuna differenza nella
profondità delle cripte) 7) una diminuzione dell’infiltrazione intraepiteliale di cellule CD3 +
8) una minor espressione di molecole H2-IA sull’epitelio intestinale 9) più bassi livelli
mucosali di citochine infiammatorie (IFN, TNF) 10) più bassi livelli di linfociti Th1.
Fig.7 Confronto dell’architettura della mucosa intestinale e del livello di infiltrazione
linfocitaria CD3 + intraepiteliale nell’intestino di topo NOD a) GFD e b) SD.
42

Da notare che la privazione di frumento e orzo solamente durante la gestazione e
l’allattamento non è sufficiente però a ridurre l’incidenza di sviluppo del diabete [80,83].
Inoltre introducendo in una dieta GFD solamente la gliadina, l’incidenza della malattia non
viene significativamente modificata. Quindi altre proteine del grano, come Glb1, globulina
di riserva recentemente scoperta [84], possono essere implicate nella patogenesi del diabete
[85]. Anche tra i topi GFD e quelli MGFD (GFD + proteine del grano) vi sono
significative differenze: non nella struttura architettonica intestinale (altezza villi e
profondità cripte) e non nei livelli di mRNA di citochine bensì nel numero di cellule
intraepiteliali CD3 + . I topi MGFD presentano maggior infiltrazione epiteliale e maggior
incidenza del diabete [86].
In conclusione a parità di altri fattori, la precoce introduzione di glutine nella dieta di
questi animali aumenta fortemente l’incidenza del diabete e ne anticipa la comparsa.
43

PHAGE DISPLAY
Per l’analisi della risposta anticorpale si è ricorsi alla tecnica del phage display che
permette di ricreare l’intero repertorio anticorpale di un individuo tramite il trasferimento
di alcuni geni del sistema immunitario in un batterio e la successiva espressione degli
anticorpi funzionali in fusione con proteine fagiche [87]. Diversi studi ormai attestano la
validità di questa tecnica per l’indagine del repertorio anticorpale caratterizzante un
determinato stato patologico [88,89,90].
Innanzitutto il materiale di partenza è costituito dai linfociti B isolati dal sangue o dai
tessuti linfoidi (milza, intestino, rene, tonsille, linfonodi, pancreas). Da questi si estrae
l’RNA, lo si retrotrascrive in cDNA e tramite PCR, con opportuni oligonucleotidi, si
amplificano separatamente le regioni variabili dell’anticorpo, coinvolte nella specificità del
riconoscimento dell’antigene [91]. Solitamente gli anticorpi possono essere riprodotti in
forma di:
scFv - costituiti dalla sola regione variabile di ciascuna catena, leggera (L) e pesante (H),
unite da un linker flessibile di 15-20 aminoacidi [92];
Fab - formati da due frammenti anticorpali, uniti tra loro da ponti disolfuro, costituiti
ciascuno da un dominio variabile e uno costante per ogni catena.
Fig.8 Rappresentazione schematica della struttura di un frammento scFv e di un frammento
Fab.
In breve il scFv viene clonato in un vettore fagmidico. Un opportuno ceppo batterico viene
transfettato con il costrutto. Si induce la replicazione batterica. Alla fine si ottengono fagi
che espongono sulla loro superficie proteine ricombinanti date dal scFv in fusione con una
proteina fagica. In questo sistema è anche possibile far esprimere l’inserto anticorpale in
forma solubile nello spazio periplasmico del batterio. A seconda del tipo di espressione che
si vuole ottenere della proteina clonata, il vettore va transfettato in un ceppo batterico di
44

Escherichia coli opportuno: 1) DH5F’ (soppressore) - per la proteina in forma
ricombinante 2) HB2151 (non soppressore) - per la proteina in forma solubile, in quanto
tra la proteina esogena e il gene p3 c’è un codone Amber che in questo ceppo batterico
viene letto come codone di stop.
I scFvs anticorpali prodotti sono monovalenti cioè legano una molecola e monospecifici
cioè riconoscono un solo epitopo. Essi possono venir caratterizzati mediante test
immunoistochimico o immunoenzimatico (ELISA).
Nel phage display si utilizzano fagi filamentosi non litici Ff (M13, fd, fl) che infettano
batteri Gram negativi dai quali vengono rilasciati, attraverso la membrana plasmatica,
senza danneggiare la cellula ospite [93]. I fagi filamentosi possiedono un capside flessibile
dalla forma di cilindro allungato lungo 900 nm e con un diametro di 6-7 nm; hanno un
DNA a singolo filamento covalentemente chiuso di 6400 pb che comprende 11 geni di cui
5 (g3p, g6p, g7p, g8p, g9p) codificano per proteine di rivestimento.
Potenzialmente tutte le proteine del capside batterico possono venir utilizzate per la
creazione di proteine chimeriche; in realtà la scelta dipende fondamentalmente dalle
dimensioni della proteina da inserire:
− p8: è la proteina principale del capside, responsabile del suo assemblaggio. E’ presente
in 2700 copie. In questo caso la grandezza ottimale del peptide in fusione è di massimo
6-10 amminoacidi in quanto se di dimensioni maggiori provocherebbe ingombro sterico
e quindi difficoltà nell’assemblaggio del fago stesso determinandone bassi livelli di
espressione [94];
− p3: è coinvolta nell’infezione della cellula ospite poichè prende contatto con il pilo
batterico. E’ presente in 3-5 copie. In questo caso si possono aggiungere proteine di
maggiori dimensioni. E’ strutturalmente formata da 3 domini separati da regioni ricche
di glicina: il primo dominio N-terminale (N1) è essenziale nella penetrazione, il secondo
(N2) lega il pilo avvicinando N1 alla membrana del batterio, il terzo C-terminale è un
dominio idrofobico che ancora la proteina p3 alla membrana interna del batterio [95].
45

Fig.9 Rappresentazione schematica di un fago.
Il sito per eccellenza di inserzione di proteine esogene è proprio a monte del gene che
codifica per p3 al N-terminale. Infatti la proteina clonata, pur provocando una riduzione
dell’infettività, a causa del suo ingombro sterico che inibisce l’interazione tra N2 e pilo,
assicura ugualmente alti livelli di espressione fagica.
Tuttavia i vettori fagici hanno alcuni svantaggi:
− genoma a filamento singolo perciò poco manipolabile;
− instabilità genomica in caso di inserti di grosse dimensioni che porta all’estrusione
dell’inserto stesso;
− riduzione dell’infettività per la presenza di proteine p3 ricombinanti.
Per questa serie di motivi si ricorre all’uso di vettori chimerici detti fagmidi. Un fagmide è
dato dalla combinazione di elementi plasmidici:
− origine di replicazione batterica
− promotore inducibile lacZ a monte del sito di clonaggio
− gene per la resistenza ad un antibiotico
ed elementi fagici:
− origine di replicazione fagica
− gene per la proteina p3 del capside
ed inoltre presenta:
− un sito multiplo di inserzione
− una sequenza segnale o leader per la secrezione della proteina, in fusione o in forma
solubile, nello spazio periplasmico
e, nel nostro caso, a monte del sito di clonaggio anche:
− codone Amber - per esprimere la proteina esogena in forma solubile
− SV5tag - per verificare in ELISA ed in immunoblotting la presenza di scFv tramite
l’anticorpo secondario anti-SV5 [96].
46

− sequenza di 6 His - per purificare i scFvs solubili tramite cromatografia.
Un fagmide presenta perciò i seguenti vantaggi:
− DNA a doppia elica, perciò più facilmente modificabile
− maggior tolleranza nei confronti di DNA esogeno e quindi maggior stabilità
− possibilità di selezione dei batteri infettati grazie al gene per la resistenza ad un
antibiotico.
L’unico svantaggio nell’usare un fagmide è quello di ottenere una progenie fagica
eterogenea in quanto proteine p3 ricombinanti provenienti dal genoma fagmidico sono
affiancate da proteine p3 wild type (tipo selvatico) provenienti dal fago helper. Infatti per
produrre i fagi ricombinanti è necessario la coinfezione con fago helper che fornisce le
proteine per la costruzione dell’intero capside [97]. Poiché la coespressione di p3 wild type
e ricombinanti determina l’esposizione della proteina di fusione solo sull’1-10% dei
fagmidi, l’effetto di affinità per il bersaglio prevale su quello di avidità, permettendo il
rilevamento anche di piccole differenze derivanti da mutazioni.
La selezione di una libreria fagica o fagmidica può esser condotta con diverse metodiche:
tramite cromatografia d’affintà; contro molecole bersaglio esposte su cellule batteriche o
eucariotiche; con antigeni biotinilati e mediante panning.
Concludendo la tecnica del phage display possiede diversi vantaggi:
− la brevità del ciclo replicativo fagico
− la possibilità di clonare inserti di grandi dimensioni senza alterare l’efficienza di
replicazione e di assemblaggio del fago
− la selezione di batteri tramite la resistenza ad antibiotico
− la possibilità di controllare la quantità di progenie fagica tramite il promotore
− la stretta associazione tra fenotipo e genotipo permettendo così di ottenere
contemporaneamente la proteina e la corrispondente sequenza genica codificante
l’anticorpo.
Perciò questa tecnica si presta bene per svariate applicazioni quali: 1) l’identificazione di
ligandi 2) l’isolamento di anticorpi ad alta specificità 3) la mappatura di epitopi.
47

RISULTATI
LIBRERIE UOMO
Lo scopo della tesi è stato quello di cercare delle correlazioni a livello anticorpale tra due
patologie autoimmuni, la celiachia e il diabete di tipo 1, mediante l’applicazione della
tecnica del phage display. In particolare lo studio si è focalizzato sulla ricerca della
risposta umorale anti-tTG a livello intestinale.
I campioni bioptici analizzati per la ricerca svolta nell'ambito del Dottorato sono stati
ottenuti grazie alla collaborazione con l'Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico
(I.R.C.C.S) Burlo Garofolo di Trieste. Inoltre 4 biopsie, rispettivamente 2 indotte e 2 non
indotte, provenienti da 2 pazienti celiaci in remissione sono state gentilmente fornite dal
professore Riccardo Troncone della Clinica Pediatrica dell’Università degli Studi di Napoli
“Federico II”.
I pazienti sono stati suddivisi in 4 gruppi: sani (gruppo di controllo negativo), celiaci
(gruppo di controllo positivo), diabetici (gruppo in esame) e soggetti con altre patologie o
disordini di tipo autoimmune o in cui il quadro clinico tra CD e IDDM non era ben
definito.
Nella tabella seguente è riassunto in parte il quadro clinico dei pazienti, con informazioni
riguardanti gli anticorpi coinvolti nella celiachia (EMA, AtTGA-IgA) e nel diabete
(ICA,GADA IAA), l’HLA ed eventuali manifestazioni cliniche o diagnosi (Tab.2-pag.
successiva).
48

Paziente Sesso Età 1 EMA AtTGA
IgA
ICA GADA IAA DQ Clinica
1 F 51 CD
2 F
- CD
3 F CD
4 M 35 - - 2/8 IDDM
5 F 29 + + CD
6 F
7 F 39 + +
8 F 37 - 2
9 F 51 +
10 F 46 + + + atassia
11 F 13 + CD
12 F 20 - gastrite da HP 2
13 M
gastrite cronica
linfocellulare
14 M 30 + DH
15 F LES
17 M Enteropatia
18 F 31 - rettocolite ulcerosa
19 F esofagite
20 M 8 - - osteopenia
21 M 3 IDDM
22 M CD asintomatica
23 F 14 - - + - - 2 RA
24 F 43 - + - - 2
25 M 7 - 8 CD
26 F 48 - 2
DAR 3 , lesioni allo
smalto
27 F 11 + 2
28 F 33 + + CD
29 M CD in remissione
30 M CD in remissione
33 M 7 + + CD
34 F 10 - CD,vitiligine
35 F 37 - 8 IDDM,anemia,vitiligine
36 M 2 - + 2/8
37 M - 2
38 M 11 - - Crohn
40 M 35 + + Diabete I-II
41 M 2 + - sospetta CD
43 M 5 + +
46 M 14 + + IDDM
47 M 14 + + IDDM
48 M 16 + + IDDM
49 M 11 + + IDDM
50 F 6 - - IDDM
51 M 6 - - IDDM
52 M 8 - - IDDM
Tab.2 Tabella riassuntiva dei dati riguardanti il sesso, l’età, la sierologia, la genetica e la
clinica dei pazienti dello studio.1: età in anni; 2: HP = Helicobacter Pilori; 3: DAR = dolori
addominali ricorrenti.
49

Si sono sottoposti a biopsia 45 soggetti, 23 maschi e 22 femmine, con un’età media di 21
anni così suddivisi nei gruppi: 4 soggetti (2M, 2F) sani (12-13-19-20), 14 pazienti (5M,
9F) celiaci (1-2-3-5-9-10-11-22-25-28-33-34-38-41), 2 pazienti (2M) celiaci in remissione
(29-30), 12 pazienti (10M, 2F) diabetici (4-21-35-36-40-46-47-48-49-50-51-52), 13
pazienti (4M, 9F) con quadro clinico non chiaro (6-7-8-14-15-17-18-23-24-26-27-37-43).
Per quanto riguarda il gruppo dei celiaci viene rispettato il rapporto F:M di 2:1 (9:5).
Sono state costruite 43 mini-librerie IgA da biopsia intestinale così ripartite nei 4 gruppi:
sani - 4/4, celiaci - 12/14, diabetici - 12/12 + 2 (4 e 36) in doppio (al tempo 0 e dopo 1
anno GFD), altri - 9/13; 2/2 in doppio (indotta/non indotta) da celiaci in remissione. Inoltre
1 mini-libreria e 1 libreria totale IgA da biopsia della mucosa orale di 1 celiaco (38)
(Tab.3).
Tipo biopsia MUCOSA INTESTINALE MUCOSA ORALE
Tipo libreria
Gruppo
MINI TOTALE MINI TOTALE
SANI 4/4
CD 12/14 1 1
IDDM 12/12+2
ALTRO 9/13
CD IN REMISSIONE 2/2x2
Tab.3 Tabella riassuntiva di tutte le librerie fagiche costruite suddivise in base alla
provenienza della biopsia (intestino, bocca), al tipo di libreria (mini, totale) e al gruppo di
appartenenza del paziente.
Dai linfociti della mucosa, ottenuta dalla parte prossimale dell'intestino tenue e dalla bocca,
si è estratto l'RNA totale. L'RNA di ogni campione è stato controllato mediante corsa
elettroforetica su gel d'agarosio. L'RNA è stato pre-trattato con DNasi per migliorare la
specificità della retrotrascrizione. Quindi si è proceduti alla retrotrascrizione in cDNA a
filamento singolo utilizzando una DNA polimerasi RNA dipendente (M-MLV trascrittasi
inversa) ingegnerizzata, con ridotta attività RNAsi H.
Nelle librerie anticorpali phage display in realtà non viene clonato l'intero anticorpo ma
solo la parte variabile della catena pesante e leggera unite da un linker di 60 amminoacidi a
formare il scFv. La costituzione del scFv avviene in 3 tappe: 1) amplificazione separata di
tutte le catene pesanti e leggere, ciascuna con una lunghezza di circa 400 pb 2) ad ogni
catena viene aggiunto un oligonucleotide che contiene siti di taglio per alcuni enzimi di
restrizione utili per il clonaggio 3) le due catene vengono unite sfruttando la
complementarietà del linker. Si ottiene così un costrutto di 800 pb detto assembling.
50

Quindi si procede all'amplificazione separata della parte variabile delle catene pesanti e di
quelle leggere. In particolare per amplificare la catena pesante di tutte le famiglie (7VH) si
è usato un primer specifico per le varie famiglie e uno per la classe anticorpale IgA,
specifico per i primi 6 amminoacidi della regione CH1 sia di IgA1 che di IgA2, in quanto
caratteristica degli anticorpi secreti dalle mucose. Per amplificare la parte variabile della
catena leggera si sono usati primers distinti per le varie famiglie delle catene leggere tipo
K (3VK) e tipo λ (4Vλ).
Fig.10 Schema dei passaggi essenziali per la costruzione del scFv.
Nel caso delle mini-librerie per quanto riguarda la catena pesante si amplifica solo una
particolare famiglia e per la precisione la famiglia VH5 perchè da precedenti studi si è
visto essere quella maggiormente utilizzata dal sistema immunitario dei soggetti celiaci per
la formazione degli anticorpi anti-tTG. Le regioni immunoglobuliniche VH5 sono state
amplificate usando un primer specifico per le regioni V disegnato sulla base dei primi 36
nucleotidi della famiglia VH5 (VH5 fam).
Diversi studi hanno portato all'osservazione che un numero limitato di famiglie V formano
anticorpi funzionali contro l’autoantigene tTG. Questo sembra accadere sia per le catene
pesanti che per quelle leggere, il cui appaiamento sembra essere limitato anche se non si
può affermare che i scFvs ottenuti in vitro siano una reale rappresentazione degli
accoppiamenti che avvengono in vivo. In un recente lavoro è stato però dimostrato che tutti
i scFvs isolati contro la tTG reagiscono con una regione antigenica conformazionale ben
definita, in parallelo con gli anticorpi di sieri di celiaci. Questo risultato sembra confermare
che la selezione dei scFvs anti-tTG sia ristretta solo a quei scFvs che riproducono gli
accoppiamenti in vivo richiesti per il corretto riconoscimento anticorpo-antigene [98].
Sembra probabile che la risposta intestinale anti-tTG sia dovuta ad una sottopopolazione di
linfociti originanti da precursori esprimenti anticorpi anti-tTG VH5-VK1-3. Poiché alcune
catene leggere formano degli anticorpi più stabili e affini sono state scelte 4 catene leggere
51

(VL2.4-VL2.8-VL2.12-VL4.1 precisamente VL2.4-2.8-4.1 sono VK1 L12a mentre
VL2.12 è Vλ2 DPL11) che sono state inserite direttamente nel vettore [34]. Si prepara una
mix di vettori pDAN5 [99] formati ciascuno dalla VH C5.22 (contro il fattore 5 del
complemento) e da 1 delle VL pre-scelte. Quindi si amplifica la famiglia VH5 dal cDNA,
si aggiunge il linker, tramite l’amplificazione con il primer VHPTL, che introduce anche il
sito di taglio per l’enzima di restrizione XhoI, e il primer VHmix, miscela equimolare di 4
primers specifici per la regione JH contenente il sito di taglio per l’enzima di restrizione
NheI. Questa seconda amplificazione elimina le sequenze CH1 non necessarie per la
costruzione del scFv e introduce i siti di restrizione alle estremità della VH per permettere
l’inserzione nel vettore fagmidico pDAN5. Il frammento così ottenuto viene clonato nel
vettore previa digestione. L'amplificato delle VH5 e la mix dei vettori vengono infatti
tagliati con gli stessi enzimi (in questo caso NheI e XhoI) al fine di creare estremità coesive
utili per la ligazione. Con questo sistema viene eliminata la VH presente nel vettore e
sostituita dalle VH amplificate del campione. L'insieme dei vettori con i scFvs così
ricostituiti vengono utilizzati per trasformare, mediante elettroporazione, le cellule di un
appropriato ceppo batterico di E.coli.
Le mini-librerie ottenute hanno un ordine di grandezza compreso tra 10 4 -10 6 cloni. L’unica
libreria totale presenta un ordine di 10 6 cloni per le VK e di 10 7 cloni per le Vλ.
A garanzia di una buona rappresentazione dei scFvs clonati, in tutti i casi il rapporto tra
numero di cloni della libreria e numero di cloni ottenuti dalla sola ligazione del vettore
(vettore richiuso) era superiore a 100. Inoltre la variabilità delle librerie è stata valutata
mediante fingerprinting. Sono stati scelti a caso 10 cloni per ogni libreria. Si sono
amplificate e digerite tramite BstNI le VH. Il pattern di bande di ogni VH è stato
confrontato tra i vari cloni di ciascuna libreria e con quello della catena VH C5.22 per
verificare che non si trattasse di un clone originale dato dalla richiusura del vettore. In
alcuni casi si è trovata una corrispondenza con la VH C5.22 ma in percentuale così piccola
da considerare la diversità anticorpale all'interno di ciascuna libreria comunque buona e
accettabile. Nel caso della libreria totale è stato eseguito separatamente il fingerprinting
delle VH e delle VL. Oltre al confronto delle VH, sono stati osservati anche i bandeggi
ottenuti dalle digestioni delle catene leggere comparandoli tra loro e con quelli delle catene
originariamente presenti nel vettore (VL2.4-VL2.8-VL2.12-VL4.1). E’ stata valutata una
buona diversità anticorpale per entrambe le catene.
52

Le selezioni sono state effettuate secondo il protocollo [100] sulla tTG umana prodotta per
ricombinazione come descritto in letteratura [101]. Sono state selezionate rispettivamente:
5/12 mini-librerie da soggetti celiaci, 4/4 mini-librerie da soggetti sani, 14/14 mini-librerie
da diabetici, 5/9 mini-librerie da soggetti con patologie varie e 4/4 mini-librerie da celiaci
in remissione. La selezione è stata eseguita volutamente su un numero limitato di celiaci,
circa la metà, a conferma del dato già noto in letteratura, solo per avere un controllo
positivo all'interno del gruppo di studio. La diversità dei cloni risultati positivi è stata
valutata inizialmente mediante fingerprinting.
MINI-LIBRERIE VH5 INTESTINALI
PAZIENTE CLONI hTG + % POSITIVITA’ FINGERPRINTING
3 0/30 0% -
11 21/30 70%
25 1/30 3,3% -
33 6/30 20%
38 9/47 19% 7/9
12 1/45 2,2% -
13 4/30 13,3% 2/4
19 3/30 10%
20 0/45 0% -
4 5/10 50% 3/5
4-II 0/30 0% -
21 3/12 25% 1/3
35 0/45 0% -
36 16/30 53,3% 10/16
36-II 5/93 5,4% 5/5
40 7/30 23,3% 3/7
46 38/45 84,4% 10/38
47 13/45 29% 7/13
48 33/45 73,3% 16/33
49 19/45 42,2% 11/19
50 1/45 2,2% -
51 0/45 0% -
52 3/45 6,7% 3/3
14 12/30 40% 5/12
15 3/30 10% 3/3
17 0/30 0% -
26 13/30 43,3% 3/13
27 18/45 49% 6/18
29 24/30 80% 1/15
29I 29/30 97% 1/14
30 0/45 0% -
30I 4/45 9% 4/4
Tab.4 Risultati delle selezioni in ELISA su tTG umana ricombinante delle mini-librerie IgA da
biopsia intestinale.
53

La libreria relativa al soggetto celiaco 3 è risultata stranamente negativa.
Tra il gruppo dei sani solo un paziente è risultato negativo (20), uno debolmente positivo
(12), i rimanenti due (13-19) positivi.
Nei diabetici si riscontra una positività variabile. Da notare che le mini-librerie dei pazienti
4 e 36 eseguite dalle biopsie effettuate al tempo 0 sono fortemente positive con una
percentuale che si aggira intorno al 50%. Invece i risultati delle selezioni delle mini-librerie
degli stessi pazienti eseguite a 1 anno di distanza in cui è stata osservata una dieta
alimentare priva di glutine danno un valore molto più basso, nel caso del soggetto 4
addirittura non è stato trovato alcun clone legante tTG.
Nei soggetti affetti da altre patologie autoimmuni o con sintomatologia non definita la
positività è variabile.
Per quanto riguarda i due celiaci in remissione, in realtà solo 1 si è negativizzato (30)
mentre l’altro (29) sembra essere molto positivo. E’ stato fatto il fingerprinting di metà dei
24 cloni tTG positivi selezionati in ELISA. Tutti hanno lo stesso pattern di bande quindi si
tratta dello stesso clone sovraespresso o sovraamplificato. Dopo induzione entrambe le
librerie risultano leggermente più positive. Il soggetto 29 nuovamente presenta alti valori
ma dovuti anche questa volta ad una forte ridondanza. Infatti il fingerprinting di metà dei
scFvs risulta uguale. Inoltre il pattern di bande è identico a quello del precedente clone
sovraespresso.
MINI-LIBRERIA VH5 ORALE
PAZIENTE CLONI hTG + FINGERPRINTING
38 0/45 -
Tab.5 Risultati delle selezioni in ELISA su tTG umana ricombinante della mini-libreria IgA da
biopsia orale.
La mini-libreria da mucosa orale ha dato esito negativo. Perciò è stata costruita la libreria
totale IgA per rilevare la presenza di eventuali scFvs anti-tTG che non usano la famiglia
VH5.
LIBRERIA TOTALE ORALE
PAZIENTE CLONI hTG + % POSITIVITA’ FINGERPRINTING
38 1/45 2,2% -
Tab.6 Risultati delle selezioni in ELISA su tTG umana ricombinante della libreria totale IgA
da biopsia orale.
In questo caso è stato trovato 1 solo clone positivo.
54

Alcuni scFvs sono stati sequenziati. Le sequenze sono state analizzate utilizzando il
database V-BASE Sequence Directory Tomlison et al, MRC Centre for Protein
Engineering, Cambridge,UK (http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/DNAPLOT.php?menu=901).
CLONE VH Gene V CDR3
Lungh
CDR3 (aa)
J
25.1 VH5 DP-73/V5-51…+ GYSYGLDAFDI 11 JH3b
38.2 VH5 VHVCW/COS-24+ VPEGGDILTGTFDY 14 JH4b
38.4 VH5 COS-25+ PRGGDRMDAFDI 12 JH3b
38.6 VH5 VHVCW/COS-24+ PRHYETTGPFDS 12 JH4b
38.7 VH5 VHVCW/COS-24+ PRGGDRMDAFDI 12 JH3b
38.9 VH1 DP-7/21-2...+ AQRFSGSYPPAFDI 14 JH3b
38T.1 VH5 VHVCW/COS-24+ VPEGGDILTGTFDY 14 JH4b
VK1 L12a/PCRdil6-5 LHYNSYSPRYT 11 JK2
21.1 VH5 DP-73/V5-51…+ PAGAGYDAFDI 11 JH3b
21.2 VH5 DP-73/V5-51…+ GYSSGLDAFDI 11 JH3b
36.1 VH1 DP-25/VI-3b+ EEWVQSNWFDP 11 JH5b
36.2 VH3 V3-48/hv3d1…+ GPGMDV 6 JH6b
36.3 VH5 DP-73/V5-51…+ PAGAGYDAFDI 11
36.4 VH1 DP-25/VI-3b+ EEWVQSNWFDP 11
36.5 VH5 DP-73/V5-51…+ LPGLGGGPIVVVITASDI 18
36.6 VH1 DP-25/VI-3b+ EEWVQSNWFDP 11
36.7 VH1 DP-25/VI-3b+ EEWVQSNWFDP 11
36.10 VH5 DP-73/V5-51…+ MSGYSYGSRYYGMDV 15 JH6b
36II.1 VH5 DP-73/V5-51…+ AAAGTIDY 8 JH4b
36II.3 VH1 DP-75/VI-2…+ RFKFGNYNYGMDV 13 JH6b
36II.4 VH1 DP-8+ GDITAVQGLLRNDVFHF 17
36II.5 VH5 DP-73/V5-51…+ SYSWPSPNPYYFSH 14 JH1
40.2 VH5 DP-73/V5-51...+ PGNTGMAHFQY 11 JH4b
40.3 VH5 DP-73/V5-51...+ PGNTGMAHFQY 11 JH4b
40.4 VH5 DP-73/V5-51...+ PGNTGMAHFQY 11 JH4b
40.5 VH5 DP-73/V5-51...+ PGNTGMAHFQY 11 JH4b
40.6 VH5 DP-73/V5-51...+ PGNTGMAHFQY 11 JH4b
40.7 VH5 DP-73/V5-51...+ GSTGTAGDFCY 11 JH4b
46.2 VH5 DP-73/V5-51 PNFSGYDAFDI 11 JH3b
50.1 VH5 VHVCW/COS-24+ AGTNSDAFDI 10 JH3b
52.1 VH1 DP-14/V1-18+ GRYRYSSGWYSFNY 14 JH4b
Tab.7 Risultati delle sequenze dei scFvs anti-htTG delle mini-librerie intestinali e della libreria
totale orale. E’ indicato il nome del clone riferito alla libreria di appartenenza, la famiglia della
VH o della VL, il nome del gene della catena, la sequenza amminoacidica del CDR3
(Complementary Determining Region 3), il numero degli amminoacidi che formano il CDR3, e
il tipo di segmento J.
55

La maggior parte delle catene pesanti dei scFvs isolati dai soggetti celiaci sono VH5. Della
mini-libreria intestinale del paziente 38, sono stati sequenziati 5 cloni su 9: 4 (38.2-38.4-
38.6-38.7) hanno la VH5 di cui 2 (38.4 e 38.7) uguale cioè hanno lo stesso CDR3 e 1
(38.9) ha la VH1. Della libreria totale da mucosa orale l’unico clone isolato è dato dalla
combinazione di una VH5 con una VK1. Da osservare che il CDR3 di questo scFv è
uguale a quello del clone (38.2) della mini-libreria intestinale dello stesso paziente.
Nei diabetici c’è anche una prevalenza di VH5 (11) anche se compaiono diverse VH1 (5).
In particolare il paziente 40 ha 6 cloni VH5 di cui 5 uguali. Dei 10 cloni ottenuti dalla
selezione della libreria del paziente 36 al tempo 0 sono stati sequenziati 8 cloni che
risultano appartenere a famiglie diverse, precisamente: 3 diverse VH5, anche se hanno lo
stesso gene, il loro CDR3 è differente (36.3-36.5-36.10), 1 VH3 (36.2) e 4 uguali VH1
(36.1-36.4-36.6-36.7). Dei 5 cloni ottenuti dalla libreria dello stesso paziente dopo però 12
mesi di dieta senza glutine (36II) sono stati sequenziati 4 cloni: 2 sono VH1 diverse tra
loro (36II.3-36II.4) e 2 sono VH5 diverse tra loro (36II.1-36II.5). Inoltre entrambe le VH1
e le VH5 sono diverse da quelle precedenti.
LIBRERIE TOPO
I campioni bioptici murini analizzati per la ricerca svolta nell'ambito del Dottorato sono
stati gentilmente forniti dal professore Riccardo Troncone della Clinica Pediatrica
dell’Università degli Studi di Napoli “Federico II”.
I campioni provenivano da topi NOD e BALB/c femmine di 3-4 settimane di età.
Sono state costruite 2 librerie totali rispettivamente dall’intestino (IBL-n) e dalla milza
(PBL-n) di un topo NOD di 20 settimane posto a dieta standard, contenente glutine, e come
controllo 2 librerie sempre da intestino (IBL-c) e milza (PBL-c) da un topo BALB/c posto
a SD. Le librerie sono state costruite nella stessa maniera di quelle umane: estrazione del
RNA totale, retrotrascrizione in cDNA, PCR separate per amplificare rispettivamente tutte
le VH e tutte le VL con un set di oligonucleotidi opportuni [102], aggiunta del linker per
ogni tipo di catena, assemblaggio, digestione con gli enzimi di restrizione (BsshII e NheI),
clonaggio nel vettore pDAN5 anch’esso precedentemente digerito, trasformazione di
cellule di E.coli.
Le librerie ottenute hanno un ordine di grandezza compreso tra 10 6 -10 7 cloni. Tutte e 4 le
librerie hanno un rapporto di 100:1 rispetto i cloni ottenuti dalla ligazione del solo vettore
(vettore richiuso) garantendo così una buona rappresentatività.
56

Anche in questo caso si è valutata la variabilità delle librerie mediante fingerprinting. Sono
stati scelti a caso 20 cloni per ogni libreria. Le VH e le VL sono state amplificate
separatamente e digerite tramite BstNI. Il pattern di bande di ogni VH e di ogni VL è stato
confrontato tra i vari cloni di ciascuna libreria e con quello della catena VH e VL C5.22
per verificare che non si trattasse di un clone originale dato dalla richiusura del vettore. La
diversità anticorpale all'interno di ciascuna libreria è risultata buona.
Le librerie sono state selezionate su 2 antigeni: tTG murina (mtTG) e IA2 umano (hIA2-
630-976 aa). I geni codificanti queste due proteine sono stati amplificati con gli opportuni
primers e clonati nel vettore pTrcHisB. Le proteine sono state purificate mediante metallo-
cromatografia e analisi elettroforetica [98]. La loro immunoreattività è stata testata in
ELISA. Nel caso di mtTG sono stati usati come riferimento i sieri umani di soggetti
diagnosticati celiaci, CUB4702, un anticorpo monoclonale anti-tTG in commercio, e il
scFv 2.8, un clone anti-htTG precedentemente isolato [36] ma cross-reattivo con la tTG di
topo. Nel caso di hIA2 sono stati impiegati come riferimento sieri umani di soggetti
diabetici. La reattività delle due proteine è risultata buona e specifica (Tab.8).
Anticorpo/Antigene htTG mtTG hIA2
CUB4702 + + -
scFv 2.8 + + -
Sieri CD + + -
Sieri IDDM - - +
Tab.8 Risultati della reattività testata in ELISA degli antigeni ricombinanti (htTG, mtTG,
hIA2) con mAb, scFv e sieri.
I risultati delle selezioni delle librerie dei topi sono riportati in Tab.9 per l’antigene mtTG e
in Tab.10 per l’antigene hIA2.
mtTG
Topo Fonte libreria
Cicli
selezione
Cloni
testati
Cloni
positivi
Cloni
diversi
NOD IBL 2 96 6 3
NOD PBL 3 96 4 2
Balb/c IBL 3 96 0 -
Balb/c PBL 3 96 0 -
Tab.9 Risultati delle selezioni in ELISA su mtTG ricombinante delle librerie totali da intestino
(IBL) e da milza (PBL) dei topi NOD e BALB/c.
57

hIA2
Topo Fonte libreria
Cicli
selezione
Cloni
testati
Cloni
positivi
Cloni
diversi
NOD IBL 3 96 0 -
NOD PBL 2 96 2 2
Balb/c IBL 3 96 0 -
Balb/c PBL 3 96 0 -
Tab.10 Risultati delle selezioni in ELISA su hIA2 ricombinante delle librerie totali da intestino
(IBL) e da milza (PBL) dei topi NOD e BALB/c.
Per quanto riguarda il topo NOD si sono isolati cloni anti-mtTG in entrambe le librerie ma
maggiormente nell’intestino (6/96) dopo solo 2 cicli di selezione mentre dalla milza sono
stati trovati un numero minore (4/96) e sono stati necessari ben 3 cicli di selezione. Nelle
librerie del topo BALB/c anche dopo 3 cicli di selezione non sono stati isolati cloni anti-
mtTG.
Per quanto concerne l’altro antigene, si è stati in grado di isolare cloni anti-hIA2 solamente
dalla libreria di topo NOD ottenuta da organo periferico (2/96).
I cloni risultati positivi sono stati testati per la loro diversità mediante fingerprinting e
successivamente sequenziati. Le sequenze sono state confrontate con il database
internazionale IMGT (ImMunoGeneTics-http://imgt.cines.fr). Gli unici 2 cloni anti-hIA2
trovati sono risultati differenti tra loro. I cloni anti-mtTG della libreria PBL-n sono risultati
2 su 4 diversi (Tab.11).
Clone
H1
G6
Gene
VH
IGHV
1S61*01
IGHV
2S1*01
CDR3
ETKTG
TFDY
MVTWY
FDV
Lungh.
CDR3
9 7
8 15
Mutaz. Gene VL CDR3
IGKV
2-109*01
IGKV
6-13*01
AQMLKF
PRT
QQYGTS
PLT
Lungh.
CDR3
Mutaz.
9 10
9 9
Tab.11 Risultati delle sequenze dei 2 diversi scFvs anti-mtTG della libreria totale periferica
del topo NOD (PBL-n). E’ indicato il nome del clone, il nome del gene della catena VH o VL,
la sequenza aminoacidica del CDR3, il numero degli amminoacidi che formano il CDR3 e il
numero di mutazioni di basi della sequenza rispetto a quella del gene della linea germinale.
Si è riscontrata una situazione particolare per i cloni anti-mtTG della libreria IBL-n.
Risultano diversi solo 3 cloni su 6. Un clone (D9) è rappresentato ben 4 volte. La
ridondanza è intrinseca alla tecnica stessa per sovraamplificazione preferenziale. La
particolarità sta però nel fatto che questi 3 cloni sono dati dalla combinazione di 3 diverse
VH con 2 differenti VL. I risultati del sequenziamento sono visibili in Tab.12.
58

Clone
A11
D9
G6
Gene
VH
IGHV
14S2*01
IGHV
1S136*01
IGHV
14S1*01
CDR3
Lungh.
CDR3
Mutaz.
DYGRY 5 9
YGSSHA
GYFDVW
12 36
DYGSY 5 9
Gene
VL
IGKV
6-23*01
IGKV
3-10*01
IGKV
3-10*01
CDR3
EQYSSS
PLT
QQNNE
DPWT
QQNNE
DPWT
Lungh.
CDR3
Mutaz.
9 18
9 5
9 5
Tab.12 Risultati delle sequenze dei 3 diversi scFvs anti-mtTG della libreria totale intestinale
del topo NOD (IBL-n). E’ indicato il nome del clone, il nome del gene della catena VH o VL,
la sequenza aminoacidica del CDR3, il numero degli amminoacidi che formano il CDR3 e il
numero di mutazioni di basi della sequenza rispetto a quella del gene della linea germinale.
Precisamente la VH del clone A11 (IGHV 14S2*01) si lega a due VL diverse ovvero alla
VL del clone A11 (IGKV 6-23*01) e alla VL del clone G6 (IGKV 3-10*01). A sua volta la
VL del clone G6 (IGKV 3-10*01) è unita a due VH diverse ovvero alla VH del clone G6
(IGHV 14S1*01) e alla VH del clone D9 (IGHV 1S136*01).
Confrontando la sequenza nucleotidica dei geni delle catene pesanti e leggere dei cloni con
quella del gene della linea germinale si osservano numerose mutazioni somatiche
soprattutto nella regione del CDR3, data nel caso delle VH dalla giustapposizione dei
segmenti DH e JH e dall’attività di aggiunta/eliminazione di nucleotidi da parte di
esonucleasi.
Si è voluto allestire un esperimento per identificare le classi immunoglobuliniche espresse
dagli anticorpi anti-mtTG nel topo NOD. Infatti nella costruzione dei scFvs vanno perse le
regioni costanti degli anticorpi. Si è perciò preso come riferimento la VH del clone G6 in
quanto la sua sequenza contiene pochi nucleotidi AT, che possono influenzare
negativamente la specificità di riconoscimento sullo stampo di cDNA. I primers antisenso
sono stati disegnati sulla base delle sequenze dell’estremità C-terminale degli isotipi
murini IgA, IgG e IgM. Questi primers sono stati utilizzati per amplificare il cDNA
dell’intestino e della milza del topo NOD.
Fig.11 Amplificati delle diverse classi immunoglobuliniche (IgA, IgG IgM) del cDNA da
intestino (INTESTINE) e milza (SPLEEN) del topo NOD.
59

Nell’intestino si è ottenuta l’amplificazione di solo 2 classi isotipiche: IgA e IgM. Nella
milza risultano invece presenti tutte e tre le classi immunoglobuliniche. Quindi nella milza
compare anche la classe IgG, assente nell’intestino, e risulta più debole l’amplificato
corrispondente alla classe IgA.
Tutti i differenti cloni anti-mtTG (2 di PBL-n e 3 di IBL-n) sono stati prodotti in forma
solubile e testati in ELISA su mtTG, mtTG denaturata, htTG e BSA. Come controlli sono
stati usati gli anticorpi CUB4702 e scFv 2.8. Tutti i cloni selezionati riconoscono
specificatamente la mtTG, non la htTG e la BSA, e nemmeno la mtTG denaturata.
Fig.12 ELISA di 3 scFvs isolati da intestino (INT) del topo NOD (A11-D9-G6), 2 scFvs isolati
dalla milza (SPL) del topo NOD (G6-H1), del scFv 2.8 e dell’anticorpo monoclonale
CUB4702 su m-tTG, m-tTG denaturata (D m-tTG), h-tTG e BSA.
60

DISCUSSIONE
DISCUSSIONE TECNICA
I risultati ottenuti hanno messo in evidenza che l’impiego della costruzione di minilibrerie
anticorpali fagiche permette il rilevamento della sintesi di anticorpi anti-tTG nella mucosa
intestinale anche quando il livello nel siero di questi anticorpi è poco sotto la soglia o
addirittura non ancora rilevabile. Infatti 18 pazienti risultavano negativi al test sierologico
tTG. Ne sono stati analizzati tramite selezione 11: di questi ben 8, cioè il 73%, sono
risultati invece positivi per la presenza di anticorpi anti-tTG a livello intestinale. E’ un dato
significativo se si considera che la maggior parte dei celiaci sono asintomatici o la malattia
è in forma silente e quindi in base al solo test sierologico non verrebbero diagnosticati. La
spiegazione potrebbe risiedere nel fatto che la produzione di anticorpi anti-tTG avviene
solo a livello intestinale, dato confermato dall’isolamento di anticorpi anti-tTG solo da
libreria IBL e non PBL [34], e che questi successivamente fuoriescano nel circolo
sanguigno attraverso la mucosa danneggiata. Nei casi in cui però l’epitelio intestinale non
sia ancora danneggiato la risposta umorale potrebbe essere solo locale e perciò confinata
nell’intestino. La tecnica del phage display fornisce un’utile informazione nel caso di
biopsie normali che non mostrano alcun segno di alterazione. Questa tecnica potrebbe così
identificare quei pazienti ad uno stadio molto precoce di malattia, prevenendo le
complicazioni che potrebbero insorgere in un tempo successivo.
E’ stato ampiamente dimostrato da studi presenti in letteratura che la famiglia VH5 viene
usata da differenti soggetti celiaci per formare gli anticorpi anti-tTG. Si è sfruttata la
possibilità di semplificazione della complessa costruzione di librerie totali ad una
procedura di clonaggio a due soli passaggi [103]. La sequenza del primer VH5 è
considerevolmente diversa dalle corrispondenti regioni delle altre famiglie VH tranne per
la famiglia VH1 con cui ha solo 4 disaccoppiamenti. Ecco perché talvolta si ritrovano
anticorpi VH1 nelle selezioni.
La tecnica del phage display per costruire piccole librerie anticorpali basate sulla selettiva
amplificazione di famiglie V può essere quindi di considerevole interesse diagnostico e
terapeutico.
61

DISCUSSIONE TOPO NOD
Nel modello animale del diabete di tipo 1 sono stati isolati anticorpi anti-tTG. Dalla
libreria anticorpale ottenuta dalla milza del topo NOD dopo ben 3 cicli di selezione su tTG
purificata di topo si sono ottenuti 2 scFvs mentre da quella intestinale dopo solo 2 cicli di
selezione sono stati isolati 3 scFvs. Ciò indica una maggior presenza a livello intestinale di
linfociti B sintetizzanti anticorpi anti-tTG. Questi anticorpi sono presenti soprattutto
nell’intestino (6/96) piuttosto che a livello periferico (4/96). I valori però sono bassi: 6%
per l’intestino e 4% per la milza mentre nelle librerie da celiaco dopo solo 1 ciclo si trova
una media di positività del 30%. Inoltre tali valori sono inferiori anche a quelli trovati nel
gruppo dei diabetici dello studio.
Questi anticorpi sono specifici. Infatti in ELISA, sia espressi in forma fagica che in forma
solubile, riconoscono solo la tTG murina, non quella umana, nonostante l’omologia tra le
due proteine. Nessuno anticorpo isolato è risultato cross-reattivo.
Essi riconoscono un epitopo conformazionale. Infatti non sono in grado di riconoscere
l’antigene se denaturato. Probabilmente in seguito a denaturazione la mtTG perde la sua
struttura terziaria. La controprova è data dai risultati ottenuti dall’anticorpo monoclonale
CUB. Esso è capace di riconoscere, oltre ad entrambe le tTG, anche la mtTG, sebbene in
maniera leggermente minore della mtTG nativa. Infatti è noto che tale anticorpo riconosce
un epitopo lineare.
Inoltre è stato dimostrato che a livello intestinale, come ci si aspetta, la classe anticorpale
maggiormente presente è quella IgA, dato che tale classe è di tipo secretorio e quindi viene
espressa a livello delle mucose qual è l’epitelio secretorio intestinale. In più è stato
dimostrato che gli anticorpi anti-mtTG subiscono un cambiamento di classe (switching
isotipico). Infatti nell’intestino è presente solo la classe immunoglobulinica A ed M e
manca la G. In periferia è ancora presente la classe IgM, più debole la IgA ma forse
proprio perché compare anche la classe IgG.
Il particolare risultato messo in evidenza dal sequenziamento degli anticorpi anti-mtTG
della libreria intestinale di topo NOD potrebbe far pensare ad una situazione non reale
constatando che la tecnica si basa su accoppiamenti dei geni VH e VL in vitro a caso.
Invece proprio il numero limitato di cloni isolati e l’accoppiamento incrociato di alcune
delle catene V (3 VH e 2 VL) suggeriscono che tali scFvs derivino da una risposta
anticorpale oligoclonale. Inoltre sembra ragionevole pensare che riproducano i reali
62

accoppiamenti VH-VL che avvengono in vivo dato che tutti i scFvs hanno lo stesso pattern
di riconoscimento verso mtTG, htTG e mtTG denaturata.
Le estese mutazioni somatiche trovate nelle regioni V di tutti gli anticorpi anti-mtTG
isolati indicano la proliferazione clonale di una popolazione di linfociti B altamente
selettiva. Ciò è concorde con un processo guidato dall’antigene e avviato da una precoce
stimolazione antigenica da parte della tTG. La lunga “storia” di questi anticorpi viene
confermata dall’analisi della catena VH del clone IBL-n G6, preso da riferimento, il cui
cambiamento isotipico coinvolge 3 classi immunoglobuliniche (A, G, M). Le due
popolazioni linfocitarie sembrano sottostare però a differente regolazione dal momento che
è stato mostrato che la sintesi di IgG avviene solo nella milza.
Nell’intestino non sono stati isolati scFvs anti-IA2. Questo risultato negativo non può esser
imputato ad un’inefficienza della tecnica perché invece sono stati trovati nella milza. Ciò
conferma la funzionalità del sistema e della reattività dell’antigene. Il fatto di non aver
isolato anticorpi anti-IA2 dalla libreria intestinale è quindi dovuto alla loro reale assenza in
quest’organo. Da un topo NOD, quindi diabetico, ci si aspetterebbe la presenza di anticorpi
contro antigeni tipici del diabete. La loro mancanza nell’intestino suggerisce che l’intestino
non sia la sede di produzione di tali anticorpi. Questi anticorpi sembrano avere lo stesso
andamento degli AGA che vengono rilevati solo a livello periferico [34]. Ciò indica che il
sito di rottura della tolleranza nei confronti di questi due antigeni non avviene
nell’intestino.
Il topo NOD sintetizza anticorpi anti-tTG sia nella milza che nell’intestino. Questa risposta
condivide molte delle caratteristiche della malattia celiaca umana che è principalmente
caratterizzata dalla risposta autoimmune verso l’enzima tTG. I pazienti celiaci non trattati
sono ad alto rischio di sviluppare altre malattie autoimmuni come ad esempio proprio
l’IDDM [35] che è la principale caratteristica patogenetica del topo NOD. Inoltre il glutine
è stato dimostrato essere l’elemento scatenante di sviluppo del diabete nel topo NOD [80].
In un lavoro recentemente pubblicato è stato descritto che, in seguito ad induzione in vitro
con gliadina, la mucosa dell’intestino, normalmente strutturato, di soggetti con IDDM
mostra segni di infiammazione accompagnati da un aumento dell’espressione di molecole
HLA DR e DP nelle cripte e nell’epitelio dei villi e di attivazione di cellule T, situazione
del tutto simile a quella che si verifica dopo induzione di biopsia di un soggetto celiaco
[104]. Questo quadro è stato riscontrato anche nel topo NOD. Infatti sono stati trovati
63

linfociti infiltranti gli isolotti pancreatici esprimenti molecole di adesione mucosale [105].
Perciò una caratteristica dell’IDDM è probabilmente un’errata risposta immunitaria alla
gliadina, sebbene il concreto ruolo del glutine deve essere ancora chiarito.
Come nella celiachia, nel topo NOD il principale sito di produzione degli anticorpi anti-
tTG è la mucosa intestinale. Nel topo NOD la produzione di anticorpi anti-tTG potrebbe
essere correlata allo stato infiammatorio dell’intestino tenue. Se così fosse, nel topo NOD
potrebbero agire meccanismi simili a quelli ipotizzati per la celiachia, come ad esempio la
funzione di APC svolta da parte dei linfociti B. Le caratteristiche immunogenetiche del
topo NOD suggeriscono che ciò avvenga anche nel modello murino. Quindi nel topo NOD
i linfociti B giocano un ruolo centrale nella patogenesi dell’IDDM, essendo necessari per
l’attivazione di cellule T diabetogeniche attraverso la cattura Ig-mediata di antigeni tipici
del diabete.
DISCUSSIONE UOMO
Innanzitutto dalla mini-libreria VH5 della mucosa orale non sono stati isolati cloni anti-
tTG. Perciò sono state formulate due ipotesi: 1) i linfociti di questa zona non producono
anticorpi anti-tTG (dal momento che tali anticorpi sono stati isolati solo a livello intestinale
e non periferico [34]) o 2) gli anticorpi anti-tTG a livello della mucosa orale non sono
costituiti dalla famiglia VH5 ovvero i linfociti B associati alla mucosa orale utilizzano altre
famiglie per la formazione degli anticorpi contro questo antigene. Si è proceduti quindi alla
costruzione della libreria totale IgA dal campione bioptico. Dopo due cicli di selezione è
stato trovato un clone reattivo alla tTG. Di conseguenza la prima ipotesi è stata scartata.
Anche i tessuti linfoidi della mucosa orale reagiscono alla htTG producendo anticorpi. La
mucosa orale rappresenta quindi una prima barriera della risposta immune glutine-
dipendente. Inizialmente sembrava che i tessuti linfoidi associati alla mucosa orale agissero
però in maniera indipendente da quelli del tratto intestinale. In realtà anche la seconda
ipotesi è stata smentita dal successivo sequenziamento del clone. Infatti è risultato che la
VH dell’unico clone isolato dalla mucosa orale ha la stessa sequenza di uno isolato dalla
mucosa intestinale ed è una VH5. Concludendo i linfociti del sistema immunitario della
mucosa usano le stesse famiglie geniche per la sintesi degli anticorpi anti-tTG. Il sistema
immunitario della mucosa orale rappresenta comunque un argomento da approfondire
aumentando la casistica e reclutando un soggetto sano come controllo negativo.
64

Dato un po’ spiazzante è stato il risultato delle selezioni dei soggetti sani che dovevano
costituire il controllo interno negativo. Solo un soggetto è stato trovato veramente negativo
mentre negli altri 3 sono stati isolati anticorpi anti-tTG. Una spiegazione di questo risultato
può esser data constatando che questi soggetti non erano del tutto sani ovvero presentavano
al momento della biopsia varie infiammazioni del tratto gastro-intestinale (esofagite e
gastrite) che possono alterare la normale flora intestinale e provocare cambiamenti
nell’ambito delle citochine intestinali. Queste infiammazioni possono provocare alterazioni
della permeabilità intestinale scatenando una risposta immunitaria da parte dei linfociti
verso antigeni alimentari come il glutine.
Per quanto riguarda i soggetti con altre patologie autoimmuni o con quadro clinico non ben
definito, tutti tranne uno sono risultati positivi anche se in modo variabile. Il soggetto
negativo presentava un’enteropatia. Forse la causa di questa manifestazione
sintomatologica non è da imputare all’intolleranza al glutine ma piuttosto ad altri motivi
comuni nei bambini come altre forme di enteropatia come quella per sensibilità al latte,
sindrome post-enterite o infezione da Giardia. A conferma del dato noto in letteratura, è
stata riscontrata una positività anticorpale anti-tTG in due pazienti affetti da due malattie
autoimmuni associate o presunte tali alla celiachia, più precisamente la dermatite
erpetiforme e il Lupus eritematoso sistemico. L’altro paziente risultato positivo
effettivamente soffriva di dolori addominali ricorrenti e presentava lesioni allo smalto,
segni tipici della celiachia.
In un lavoro recentemente pubblicato [103] è stato osservato che la mucosa di una biopsia
intestinale in seguito ad induzione, cioè dopo coltura in vitro di 24 ore in presenza di
frammenti di gliadina, mostra segni di attivazione T-linfocitaria. In effetti dalle biopsie
intestinali indotte dei due soggetti celiaci in remissione si registra un aumento, anche se
lieve (dal 80% al 97% in un caso e dal 0% al 9% nell’altro), della produzione di anticorpi
anti-tTG. Va ricordato comunque che la forte positività del primo soggetto non contrasta
con la sua remissione in quanto la numerosità degli anticorpi è “fittizia” o meglio non
reale. Infatti si è visto, tramite fingerprinting, che metà dei cloni sono lo stesso anticorpo
che probabilmente è stato favorito, durante le amplificazioni della costruzione della
libreria, forse perché maggiormente espresso dai linfociti di questo paziente per la
formazione degli anticorpi anti-tTG. Inoltre lo stesso anticorpo è stato isolato dalla biopsia
non indotta dello stesso paziente.
65

Per quanto concerne il gruppo in esame cioè quello dei diabetici il dato rilevante è che per
la prima volta sono stati isolati anticorpi anti-tTG a livello intestinale. Infatti nei lavori
presenti in letteratura la positività anti-tTG di pazienti diabetici si basa su test sierologico.
All’interno del gruppo la positività è risultata variabile. Si nota comunque una concordanza
con la positività anti-transglutaminasica sierica. Infatti 5 pazienti tTG siero positivi (40-46-
47-48-49) sono anche tTG intestino positivi, mentre dei 4 pazienti tTG siero negativi 2
sono tTG intestino negativi (35-51) e 2 sono tTG intestino debolmente positivi (50-52).
Sembra esserci una correlazione tra la presenza di anticorpi anti-tTG sierici e la presenza di
anticorpi anti-tTG intestinali. I pazienti che sono sierologicamente negativi al test contro la
tTG non hanno o hanno pochi linfociti B esprimenti anticorpi anti-tTG.
Dalle sequenze di questi anticorpi isolati da soggetti affetti da IDDM si evince che non
sono solo VH5 anzi sembra che per la loro costituzione vengano utilizzate altre famiglie
come la VH3 ma forse ancor più privilegiata la VH1.
Molto interessante è il risultato ottenuto dai 2 pazienti diabetici, 4 e 36, rispettivamente un
adulto e un bambino. Entrambi sono risultati inizialmente fortemente positivi alla tTG.
Dopo un anno di regime alimentare privo di glutine si sono sottoposti nuovamente a
biopsia intestinale. Da questa seconda libreria si sono trovati ancora anticorpi anti-tTG ma
in numero minore nel bambino e la completa assenza nell’adulto.
I risultati ottenuti dal gruppo dei soggetti diabetici forniscono un ulteriore supporto che
rafforza l’esistenza di un legame tra queste due malattie autoimmuni. Inoltre è molto
importante sottolineare che è stata trovata una forte risposta immunologica glutine-
dipendente.
In conclusione è stato confermato il ruolo del glutine nell’attivare direttamente la risposta
anticorpale tTG. E’ stato dimostrato che innanzitutto c’è una risposta umorale anti-tTG nei
diabetici di tipo I e che essa avviene, come nei celiaci, soprattutto a livello intestinale.
L’iniziale sviluppo di cellule T diabetogeniche sembra perciò avvenire nell’intestino,
evento indicato da chiari segni di infiammazione che provocano alterazioni dell’epitelio
intestinale.
Il sistema immunitario dell’intestino gioca un ruolo importante nella patogenesi
dell’IDDM. L’ipotesi che viene formulata è che i linfociti B potrebbero funzionare da APC
di antigeni diabetici. La tTG potrebbe legare antigeni diabetogenici formando dei
complessi che vengono internalizzati e processati dalle cellule B, esprimenti anticorpi anti-
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cellule pancreatiche, che presentandoli ai linfociti T, nel contesto del MHC di classe II,
provocherebbero l’attivazione di linfociti T autoimmuni innescando la risposta cellulare.
Questa tesi ha rilevato l’evidenza una risposta infiammatoria glutine-dipendente della
mucosa intestinale sia nel modello animale del diabete, il topo NOD, che nei soggetti
umani affetti da diabete mellito insulino-dipendente.
Quindi si pensa che la dieta senza glutine possa essere un utile strumento di prevenzione
del diabete e che possa offrire almeno ad una parte dei soggetti una riduzione del rischio.
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MATERIALI E METODI
A) COSTRUZIONE DI MINI-LIBRERIA ANTICORPALE FAGICA
A1.PREPARAZIONE DEI FRAMMENTI VH5
A1.1) ESTRAZIONE DI RNA DA TESSUTO BIOPTICO TRAMITE TRIZOL
OMOGENEIZZAZIONE
• Omogeneizzare (con pestello) il campione scongelato in 1 ml di Trizol per 50-100 mg di tessuto.
Nel caso di campioni con un alto contenuto di proteine, grassi, polisaccaridi o materiale extracellulare come
muscoli, tessuto grasso o parti tuberose di piante per eliminare il particolato
• Centrifugare a 11000 rpm per 10' a 2°- 8°C.
SEPARAZIONE
• Prelevare il surnatante contenente l’RNA e porlo in Eppendorf da 1,5 ml.
• Incubare il campione per 5' a 15°- 30°C.
• Aggiungere 200 µl di Cloroformio per 1 ml di Trizol iniziale.
• Agitare vigorosamente per 15''.
• Incubare il campione per 2'-3' a 15°- 30°C.
• Centrifugare il campione a 11000 rpm per 15' a 2°- 8°C.
PRECIPITAZIONE
• Trasferire la fase acquosa superiore contenente l’RNA in un’Eppendorf pulita
(quantità teorica 60% di 1 ml di Trizol iniziale).
• Aggiungere 500 µl di Isopropanolo per 1 ml di Trizol iniziale.
• Incubare il campione per 10' a 15°- 30°C.
• Centrifugare a 11000 rpm per 10' a 2°- 8°C.
LAVAGGIO
• Rimuovere il surnatante.
• Lavare il fondello di RNA aggiungendo al massimo 1 ml di etanolo (EtOH) DEPC 75% per 1 ml di
Trizol iniziale.
• Mescolare il campione vortexando.
• Centrifugare a 9000 rpm per 5' a 2°- 8°C.
RISOSPENSIONE
• Eliminare l’alcool.
• Asciugare (all’aria o sottovuoto) il fondello di RNA non completamente per 5'-10'.
• A seconda della quantità del pellet risospendere l’RNA in H2O senza RNasi (o in 0.5% SDS).
• Incubare il campione per 10' a 55°- 60°C.
A1.2) TRATTAMENTO DI RNA CON DNasi
• Aggiungere in una provetta per PCR senza RNasi:
1 µg di RNA in 8 µl di H2O senza RNasi (Molecular Biology Grade)
1 µl di Buffer 10X
1 µl di Amplification Grade DNasiI (1 U/µl)
• Incubare il campione per 15' a temperatura (T) ambiente.
• Aggiungere 1 µl di Stop Solution.
• Scaldare per 10' a 70°C.
• Porre il campione subito in ghiaccio.
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A1.3) PRODUZIONE DI cDNA
• In una provetta mettere:
1 µl pd(N) 6 100 ng/µl
1 µg RNA
10 µl H2O
Nel caso l’RNA sia stato precedentemente trattato con DNasi aggiungere solo pd(N) 6 .
• Denaturare il campione per 10' a 70°C.
• Porre subito in ghiaccio.
• Aggiungere:
4 µl First Strand Buffer 5X
2 µl DTT 0.1 M
1 µl dNTP Mix (10 mM ognuno) 10 mM
• Incubare il campione per 10' a 25°C.
• Portare a 42°C e aggiungere 1 µl di enzima trascrittasi inversa.
• Incubare il campione per 50' a 42°C
15' a 70°C
A1.4) 1° PCR
− Buffer 1X
− MgCl2 1,5 mM
− dNTP 200 µM
− primer 0,5 µM
− cDNA
− Taq DNA polimerasi 0,03 U/µl
− H2O bidistillata sterile a 25 µl
Primer forward IgA: 5' GGG GCT GGT CGG GGA TGC 3'
Primer back VH5 FAM: 5' TTA TCC TCG AGC GGT ACC GAG GTG CAG CTG GTG CAG
TCT GGA GCA GAG GTG AAA 3'
Condizioni di amplificazione:
denaturazione lunga - 94°C per 3'
30 cicli: denaturazione breve - 94°C per 30''
appaiamento - 56°C per 30''
allungamento - 72°C per 45''
allungamento finale - 72°C per 5'
Controllare l'amplificato su gel di agarosio 2% in tampone TBE 1X.
A1.5) 2° PCR (aggiunta del linker)
− Buffer 1X
− MgCl2 1,5 mM
− dNTP 200 µM
− DMSO 5%
− primer 0,3 µM
− 1° PCR
− Taq DNA polimerasi 0,03 U/µl
− H2O bidistillata sterile a 50 µl
Primer forward VH MIX: 5' GAT TGG TTT GCC GCT AGC 3'+
VH1/2 for - TGA GGA GAC RGT GAC CAG GGT G
VH3 for - TGA AGA GAC GGT GAC CAT TGT
VH4/5 for - TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT T
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VH6 for - TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CC
Primer back VHPTL: 5' GGA GGG TCG ACC ATA ACT TCG TAT AAT GTA TAC TAT
ACG AAG TTA TCC TCG AGC GGT A 3'
Condizioni di amplificazione:
denaturazione lunga - 94°C per 3'
20 cicli: denaturazione breve - 94°C per 30''
appaiamento - 58°C per 30''
allungamento - 72°C per 45''
allungamento finale - 72°C per 10'
Fare 3 reazioni. Unire le 3 aliquote. Controllare la 2° PCR confrontandola con la 1° PCR su gel di agarosio
2% in tampone TBE 1X.
Caricare tutto il materiale su gel di agarosio 1% in tampone TAE 1X; tagliare la banda
corrispondente all’amplificato.
Purificare con QIAEX II gel extraction kit (Qiagen) come da protocollo.
Controllare il prodotto purificato su gel di agarosio 2% in tampone TBE 1X.
A1.6) DIGESTIONE DEL FRAMMENTO VH
− Buffer 2 1X
− BSA 1X
− 2° PCR
− enzima di restrizione
− H2O bidistillata sterile
La concentrazione degli enzimi di restrizione da usare dipende dalla concentrazione dell'amplificato.
Operare in modo sequenziale:
1° DIGESTIONE: con NheI 1h 30' a 37°C (Tenere 2 l per il controllo).
2° DIGESTIONE: con XhoI 2h 30' a 37°C (Dopo 1h 30' aggiungere 0,5-1 l di NheI).
Controllare: il campione non digerito, la 1° digestione e la 2° digestione su gel di agarosio 2% in TBE 1X.
Purificare con QIAquick PCR Purification kit (Qiagen) come da protocollo.
Controllare il prodotto purificato su gel di agarosio 1% in tampone TBE 1X confrontandolo con il vettore
digerito.
A2.PREPARAZIONE DEL VETTORE
A2.1) ESTRAZIONE DI DNA PLASMIDICO
Utilizzare un clone già trasformato con il plasmide di interesse. Eseguire una mini- o una midi-prep, a
seconda della quantità necessaria di vettore, con Qiagen Plasmid kit (Qiagen) come da protocollo.
Controllare il DNA su gel di agarosio 1% in tampone TBE 1X.
A2.2) DIGESTIONE DEL VETTORE
− Buffer 2 1X
− BSA 1X
− DNA plasmidico
− enzima di restrizione
− H2O bidistillata sterile
La concentrazione degli enzimi di restrizione da usare dipende dalla concentrazione del plasmide.
Operare in modo sequenziale:
1° DIGESTIONE: con NheI 2h a 37°C (Tenere 2 l per il controllo).
2° DIGESTIONE: con XhoI 2h a 37°C (Dopo 1h aggiungere 0,5-1 l di NheI).
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Controllare: il campione non digerito, la 1° digestione e la 2° digestione su gel di agarosio 1% in TBE 1X.
Caricare tutto il materiale su gel di agarosio 1% in tampone TAE 1X; tagliare la banda
corrispondente al vettore digerito.
Purificare con QIAEX II gel extraction kit (Qiagen) come da protocollo.
Controllare il vettore purificato su gel di agarosio 1% in tampone TBE 1X confrontandolo con la
VH digerita.
A3.PREPARAZIONE DEL LIGATO
A3.1) LIGAZIONE
− Buffer 1X
− DTT 10 mM
− 2° PCR digerita
− vettore digerito
− T4 DNA ligasi
− H2O bidistillata sterile
Calcolare le quantità di vettore e inserto da ligare in base al rapporto vettore:inserto 1:3 (in modo da favorire
la trasformazione di tutto il vettore) e alle loro dimensioni.
Programma:
16h a 16°C
10' a 70°C (inattivazione enzima)
Controllare 3 µl della ligazione confrontandola con l'inserto e il vettore digeriti su gel di agarosio 1% in TBE
1X.
A3.2) PRECIPITAZIONE DEL LIGATO
• Portare la ligazione ad un Volf = 100 l con sodioacetato (NaAc) 0,2 M pH=7. Se il Vol è già pari o
superiore a 100 l, aumentare un po’ con H2O o NaAc.
• Aggiungere un pari Vol di Fenolo pH=8 e mescolare bene anche vortexando.
• Centrifugare a 12000 rpm per 5'.
• Recuperare il surnatante.
• Se l’interfaccia risulta pulito procedere con le operazioni successive, altrimenti ripetere il passaggio con
il Fenolo.
• Aggiungere metà Vol di Fenolo pH=8 + metà Vol di Cloroformio:alcool Isoamilico 24:1.
• Centrifugare a 12000 rpm per 5'.
• Recuperare il surnatante.
• Aggiungere un pari Vol di Cloroformio:alcool Isoamilico 24:1 e mescolare bene anche vortexando.
• Centrifugare a 12000 rpm per 5'.
• Recuperare il surnatante.
• Aggiungere sodiocloruro (NaCl) Mf = 0,25 M.
• Aggiungere 2-2 e ½ Vol di EtOH 100%.
• Far precipitare per almeno 2h a –20°C.
• Centrifugare a 13000 rpm per 20' a 4°C.
• Eliminare l’alcool.
• Aggiungere al pellet 100 l di EtOH 80%.
• Centrifugare a 13000 rpm per 10' a 4°C.
• Eliminare l’alcool. Spinnare per togliere le tracce di alcool.
• Far asciugare il pellet a T ambiente.
• Aggiungere 5-10 l di H2O mQ calda (60°C).
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A4.ELETTROPORAZIONE
A4.1) PREPARAZIONE DI CELLULE ELETTRO-COMPETENTI
In 1 Falcon versare 5 ml di terreno 2xYT. Inoculare con ansa sterile 1 colonia di cellule batteriche DH5F' da
piastra fresca o una grattata da glicerolato. Far crescere in agitazione O/N a 37°C.
Preparare il TAMPONE GLICEROLO (t.g.): Versare 50 ml di glicerolo sterilizzato in autoclave in una
bottiglia con 450 ml di H2O mQ anch’essa autoclavata. Agitare. Tenere in ghiaccio in camera fredda a 4°C.
• Inoculare 200 l della precoltura di cellule in 200 ml di 2xYT (non freddo) in una beuta autoclavata. Far
crescere in agitazione a 37°C finchè la coltura non raggiunge alla lunghezza d’onda di 600 nm una
densità ottica (DO) pari a 0.8-1.0.
• Raggiunta la DO corretta, fermare la crescita ponendo la beuta in un contenitore con ghiaccio e porla in
cella a 4°C per almeno 20'.
• Suddividere la coltura in 4 Falcon da 50 ml precedentemente raffreddate.
• Centrifugare a 3800 rpm per 8' a 4°C.
• Eliminare il surnatante.
• Aggiungere un po’ di t.g. per risospendere il pellet aiutandosi con una pipetta sierologica fredda.
• Una volta risospeso aggiungere il t.g. fino a 50 ml.
• Tenere in ghiaccio per 8' (max 15').
• Centrifugare a 3800 rpm per 10' a 4°C.
• Eliminare il surnatante.
• Aggiungere circa 5 ml di t.g. per risospendere il pellet.
• Riunire in 2 Falcon e portare a Vol = 50 ml.
• Lasciare in ghiaccio per 8'.
• Centrifugare a 3800 rpm per 10' a 4°C.
• Eliminare il surnatante.
• Aggiungere un po’ di t.g. per risospendere il pellet.
• Aggiungere t.g. fino a 50 ml.
• Lasciare in ghiaccio per 8'.
• Centrifugare a 3800 rpm per 10' a 4°C.
• Eliminare il surnatante.
• Risospendere il pellet con un po’ di t.g.
• Riunire in 1 sola Falcon e portare con t.g. ad un Vol = 30 ml.
• Centrifugare a 3800 rpm per 12' a 4°C.
• Eliminare il surnatante.
• Aggiungere 125 l di t.g ogni 100 ml di coltura. (In questo caso: per 200 ml di coltura occorrono 250 l
di t.g.)
• Suddividere le cellule in aliquote e conservarle a –80°C.
NB: Tutte le operazioni vanno condotte mantenendo le massime condizioni di sterilità, lavorare tenendo le
provette sempre in ghiaccio e flambare al Bunsen il più possibile.
Verificare che le cellule competenti non si siano contaminate durante la loro preparazione e che abbiano un
buon valore di efficienza di trasformazione (minimo 10 8 colonie/g di plasmide).
A4.2) TRASFORMAZIONE DI CELLULE COMPETENTI MEDIANTE
ELETTROPORAZIONE
• Scongelare 1 aliquota di cellule competenti tenendola in ghiaccio.
• Pipettare 2,5-5 l di ligato precipitato in 1 aliquota rispettivamente da 30-90 l di cellule competenti.
• Tenere in ghiaccio per 30"-1'.
• Porre le cellule con il ligato nella cuvette da 1-2 mm fredda.
• Elettroporare a 180 Volts per le cuvette da 1 mm/ 220 Volts per le cuvette da 2 mm.
• Aggiungere rapidamente 500 l-1 ml di SOC (per far riprendere le cellule dallo shock elettrico).
• Incubare 30'-1h in agitazione a 37°C.
72

• Piastrare.
• Far crescere O/N a 30°- 37°C.
A5.RACCOLTA
Raccogliere la mini-libreria in terreno liquido 2xYT. Aggiungere glicerolo sterile fino alla concentrazione
massima 20%. Dividere in aliquote e conservare a -80°C.
A6.SELEZIONE
1° Giorno
• Inoculare 10-20 l della mini-libreria raccolta in 10 ml di 2xYT + Ampicillina (Amp) 1% + glucosio 1%
in modo da partire da una DO600 iniziale = 0.05 (= 5x10 7 batteri/ml; con una libreria il cui titolo è pari a
10 5 -10 6 , la rappresentatività della diversità è garantita).
• Far crescere in agitazione a 37°C fino a DO600 = 0.5.
• Infettare con fago helper in modo che il rapporto MOI fago:batteri sia 100:1 e lasciare fermo per 45' a
37°C.
• Centrifugare a 3000 rpm per 15' a T ambiente.
• Eliminare il sopranatante e risospendere il pellet in 50 ml di 2xYT + Amp 1% + Kanamicina (Kan) 1%.
• Far crescere in agitazione O/N a 28°- 30°C.
COATING: saturare un immunotubo con l’antigene (htTG) 10 g/ml diluito in 500 l - 1 ml di PBS 1X e
lasciare O/N a 4°C.
2° Giorno
• Centrifugare a 7000-8000 rpm per 20' a 10°C.
• Aggiungere a 40 ml del sopranatante 10 ml di PEG-NaCl sterile.
• Lasciar precipitare in ghiaccio per 45', agitando ogni tanto.
• Centrifugare a 5000 rpm per 20'.
• Eliminare il sopranatante e risospendere il pellet in 1 ml di PBS 1X; trasferire in un'Eppendorf da 1,5 ml.
• Centrifugare a 13000 rpm per 5' e recuperare 900 l di fagi presenti nel sopranatante.
• Saturare i fagi 1:1 in latte 4% per 45'-1h a T ambiente; contemporaneamente svuotare l’immunotubo e
saturarlo completamente con latte 2%.
• Inoculare 1 colonia di DH5F' da piastra fresca in 5 ml di 2xYT (DO600 iniziale = 0.05). Far crescere in
agitazione a 37°C fino a DO600 = 0.5.
• Al termine della saturazione svuotare l'immunotubo e aggiungere 500 µl - 1 ml (pari al volume usato per
il coating) dei fagi saturati in latte.
• Incubare in rotazione per 30' e fermo 1h 30' a T ambiente.
• Svuotare l’immunotubo e fare 5 lavaggi con PBS 1X - Tween 0.1% e 5 con PBS 1X.
• Svuotare l’immunotubo e mettere 500 µl - 1 ml di DH5F' a DO600 = 0.5.
• Lasciare infettare per 45' a 37°C.
• Piastrare su piastre 2xYT + Amp 1% + glucosio 1%: 200 l di DH5F' per controllare l’assenza di
contaminazioni; 500 µl - 1 ml delle cellule DH5F' infettate coi fagi (1° output); una diluizione per
calcolare la titolazione della 1° selezione.
• Far crescere le piastre O/N a 37°C.
3° Giorno
• Raccogliere il 1° output in 1 ml di 2xYT. Aggiungere glicerolo sterile fino alla concentrazione max 20%.
Conservare a -80°C.
• Ripetere i passaggi del 1° Giorno partendo da un inoculo del 1° output.
COATING: saturare un immunotubo con l’antigene (htTG) 10 µg/ml diluito in 500 l - 1 ml di PBS 1X e
lasciare O/N a 4°C.
4° Giorno
Procedere come il 2° Giorno ma aumentando la stringenza:
• Incubare in rotazione per 30' e fermo 1h 30' a T ambiente.
• Svuotare l’immunotubo e fare 10 lavaggi con PBS 1X - Tween 0.1% e 10 con PBS 1X.
• Aggiungere 2 ml di PBS 1X - Tween 0.1% e lasciare in rotazione per 30' a T ambiente.
• Svuotare l’immunotubo e fare 5 lavaggi con PBS 1X - Tween 0.1% e 5 con PBS 1X.
• Svuotare l’immunotubo e mettere 500 µl - 1 ml di DH5F' a DO600 = 0.5.
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• Lasciare infettare per 45' a 37°C.
• Piastrare su piastre 2xYT + Amp 1% + glucosio 1%: 200 l di DH5F' per controllare l’assenza di
contaminazioni; 500 µl - 1 ml delle cellule DH5F' infettate coi fagi (2° output); una diluizione per
calcolare la titolazione della 2° selezione.
• Far crescere le piastre O/N a 37°C.
A7.ELISA
5° Giorno
• Preparare una master plate in una piastra da microtitolazione da 96 pozzetti mettendo in ciascuno 120 µl
di 2xYT + Amp 1% + glucosio 1% + 1 colonia piccata dalla piastra della 2° selezione.
• Far crescere in agitazione a 37°C.
• Duplicare la master plate in una seconda piastra da microtitolazione da 96 pozzetti mettendo in ogni
pozzetto 100–110 µl di 2xYT + Amp 1% + glucosio 1% e rispettivamente 20-10 µl del corrispondente
pozzetto della master plate.
• Far crescere in agitazione a 37°C fino a DO600 = 0.5.
• Infettare con fago helper in modo che il rapporto MOI fago:batteri sia 100:1 e lasciare fermo per 45' a
37°C.
• Centrifugare a 1500 rpm per 20'.
• Eliminare il sopranatante.
• Risospendere il pellet in 140 µl di 2xYT + Amp 1% + Kan 1 %.
• Far crescere in agitazione O/N a 28°- 30°C.
COATING: saturare i pozzetti di una piastra per ELISA con l’antigene (htTG) 10 µg/ml diluito in 100 l di
PBS 1X e lasciare O/N a 4°C.
6° Giorno
• Svuotare il coating della piastra per ELISA e saturare la piastra con 120 µl per pozzetto di latte 2% per
45' a T ambiente.
• Centrifugare la seconda piastra da microtitolazione (con la coltura O/N) a 1500 rpm per 15'.
• Svuotare il latte dalla piastra per ELISA.
• Incubare con 100 µl per pozzetto di anticorpo primario (fagi) dato dal surnatante diluito 1:1 in latte 4%
per 1h 30' a T ambiente.
• Svuotare e fare 3 lavaggi con PBS 1X - Tween 0.1% e 3 con PBS 1X.
• Incubare con 100 µl per pozzetto di anticorpo secondario (anti M13-HRP) diluito 1:2000 in latte 2% per
1h-1h 30' a T ambiente.
• Svuotare e fare 3 lavaggi con PBS 1X - Tween 0.1% e 3 con PBS 1X.
• Sviluppare con 65 µl per pozzetto di TMB (3',3',5',5' tetrametilbenzidina diidrocloruro) - tampone di
sviluppo per la perossidasi.
• Bloccare la reazione con 35 µl per pozzetto di acido solforico (H2SO4) 1M.
• Eseguire la lettura a 450 nm.
I cloni risultati positivi vanno riconfermati. La master plate e i singoli cloni vanno conservati a -80°C
aggiungendo glicerolo sterile fino alla concentrazione massima 20%.
A8.FINGERPRINTING
A8.1) PCR
− Buffer 1X
− MgCl2 1,5 mM
− dNTP 200 µM
− primer 0,5 µM
− DNA (1 µl da 50 µl di 2xYT in cui è stata risospesa 1 colonia)
− Taq DNA polimerasi 0,03 U/µl
− H2O bidistillata sterile a 20 µl
74

Primer forward VHPT2: 5' TGG TGA TGG TGA GTA CTA TCC AGG CCC AGC AGT GGG
TTT G 3'
Primer back VHPTL: 5' GGA GGG TCG ACC ATA ACT TCG TAT AAT GTA TAC TAT
ACG AAG TTA TCC TCG AGC GGT A 3'
Condizioni di amplificazione:
denaturazione lunga - 94° per 5'
30 cicli: denaturazione breve - 94°C per 30''
appaiamento - 60°C per 30''
allungamento - 72°C per 45''
allungamento finale - 72°C per 10'
Controllare l'amplificato su gel di agarosio 2% in tampone TBE 1X.
A8.2) DIGESTIONE
− Buffer 2 1X
− BSA 1X
− PCR
− BstNI
− H2O bidistillata sterile
La concentrazione dell’enzima di restrizione da usare dipende dalla concentrazione dell’amplificato.
Digestione: 3h a 60°C.
Controllare il campione digerito su gel di agarosio 3% in TBE 1X.
A9.SEQUENZIAMENTO
A9.1) PRE-PCR DI SEQUENZA
− Buffer 1X
− MgCl2 1,5 mM
− dNTP 200 µM
− primer 0,5 µM
− DNA (1 µl da 50 µl di 2xYT in cui è stata risospesa 1 colonia del clone da analizzare)
− Taq DNA polimerasi 0,025 U/µl
− H2O bidistillata sterile a 20 µl
Primer forward VHseq: 5' CAA CTT TCA ACA GTA GCG GC 3'
Primer back VHPTL: 5' GGA GGG TCG ACC ATA ACT TCG TAT AAT GTA TAC TAT
ACG AAG TTA TCC TCG AGC GGT A 3'
Condizioni di amplificazione:
denaturazione lunga - 94°C per 5'
30 cicli: denaturazione breve - 94°C per 30''
appaiamento - 60°C per 30''
allungamento - 72°C per 45''
allungamento finale - 72°C per 10'
Controllare l’amplificato su gel di agarosio 2% in tampone TBE 1X.
75

A9.2) PURIFICAZIONE DELLA PRE-PCR DI SEQUENZA
− pre-PCR di sequenza (80-100 ng di DNA)
− mix di purificazione 2,5 µl
− H2O bidistillata sterile a 5 µl
Mix di purificazione:
♦ 0,05 l di ExoI (20 U/l)
♦ 0,2 l SAP (1 U/l)
♦ 0,4 l Buffer PCR 10X (con MgCl2)
♦ 1 l MgCl2 25 mM
Programma:
1h a 37°C
20' a 80°C (inattivazione enzima)
A9.3) PCR DI SEQUENZA
− BIG DYE TERMINATOR Buffer 1X
− primer 0,32 µM
− BIG DYE TERMINATOR RR PREMIX
− pre-PCR di sequenza purificata
− Taq DNA polimerasi 0,025 U/µl
− H2O bidistillata sterile a 10 µl
Condizioni di amplificazione:
denaturazione lunga - 96°C per 1'
25 cicli: denaturazione breve - 96°C per 30''
appaiamento - 50°C per 15''
allungamento - 60°C per 4’
A9.4) PRECIPITAZIONE DELLA PCR DI SEQUENZA
• Aggiungere 3 l di NaAc 3M pH=5 + 57 l di EtOH 100% e agitare.
• Tenere in ghiaccio per 15'.
• Centrifugare a 13000 rpm per 15' a 4°C.
• Eliminare il surnatante.
• Aggiungere 200 l di EtOH 70% freddo.
• Tenere in ghiaccio per 5'.
• Centrifugare a 13000 rpm per 15' a 4°C.
• Eliminare il surnatante.
• Asciugare per 10' in stufa a 60°C.
• Risospendere in 10 l di H2O mQ calda (60°C).
A10.PRODUZIONE DELLA htTG
A10.1) PRODUZIONE
• Inoculare 10 µl di cellule batteriche DH5F' trasformate, contenenti il plasmide con il gene codificante
per la htTG, in 10 ml di 2xYT + Amp 1%.
• Far crescere in agitazione O/N a 37°C.
• Inoculare 4 ml della precoltura in 400 ml di 2xYT + Amp 1%.
• Far crescere in agitazione a 37°C fino a DO600 = 0.5.
• Indurre la coltura con 0,2 mM IPTG O/N a 28°- 30°C.
• Centrifugare a 5000 rpm per 20' a 4°C.
• Eliminare il sopranatante e pesare il fondello.
76

• Risospendere il pellet con 10 ml/g di tampone di lisi (20 mM Tris pH=8, 500 mM NaCl, 5 mM
imidazolo, 0,1% Triton X 100).
• Incubare in agitazione in ghiaccio finchè i batteri non si sono lisati completamente.
• Aggiungere 20-50 µg/ml di DNasi e incubare in agitazione per 20'.
• Centrifugare a 5000 rpm per 30'.
• Recuperare il surnatante. Filtrare con filtro 0,45 m.
A10.2) SEPARAZIONE MEDIANTE CROMATOGRAFIA D'AFFINITA'
• Risospendere la resina NiNTA superflow (Qiagen). Diluire la resina (1 ml/l di coltura batterica iniziale)
in 8 ml di tampone di lavaggio (20 mM Tris pH=8, 500 mM NaCl, 5 mM imidazolo).
• Depositare la resina nella colonna di purificazione.
• Lavare la colonna con 2 volumi di tampone di lavaggio.
• Depositare il surnatante proteico recuperato. (La proteina si lega alla resina grazie ad una sequenza di 6
istidine presenti in coda).
• Lavare la resina con 1 volume di tampone di lavaggio.
• Lavare la resina con 2 volumi di tampone di lavaggio (20 mM imidazolo) + 0,1% Triton X 100.
• Lavare la resina con 1 volume di tampone di lavaggio per eliminare l’eccesso di Triton.
• Eluire con 5 ml di tampone di eluizione (20 mM Tris pH=8, 500 mM NaCl, 300 mM imidazolo).
• Raccogliere il campione eluito in 3 frazioni in Eppendorf da 1,5 ml.
• Dializzare il campione contro un tampone PBS 1X in continua ma moderata agitazione O/N a 4°C.
• Conservare la proteina così purificata a -20°C.
A10.3) ANALISI DELLA PROTEINA MEDIANTE SDS-PAGE
PREPARAZIONE CAMPIONE
• Aggiungere a 50 µl del campione dializzato un ugual volume di SBc 2X.
• Bollire il campione in H2O per 2'-3'.
• Spinnare.
ELETTROFORESI
• Effettuare una corsa elettroforetica come descritto da Laemmli [106]: SDS-PAGE 12% in tampone Tris-
Glicina 1X (25 mM Tris, 250 mM Glicina pH=8.3, 0,1% SDS) a 150 Volts costanti.
• Per fissare ed evidenziare le proteine, colorare il gel con una soluzione di Blue-Coomassie Brillant.
A10.4) WESTERN BLOTTING
• Trasferire le proteine, separate su gel, su una membrana di nitrato di cellulosa.
• Colorare la membrana di nitrocellulosa con il colorante per proteine reversibile (la colorazione scompare
sciacquando con H2O) Rosso Ponceau (0,1% Ponceau S (w/v), 5% acido acetico (v/v)).
A10.5) IMMUNO BLOTTING
• Saturare la membrana incubandola in latte 2% in agitazione per 1h a T ambiente.
• Svuotare il latte.
• Incubare con l’anticorpo primario (in parallelo monoclonale CUB7402 e monoclonale anti-His) diluito
1:2000 in latte 2% in agitazione per 1h a T ambiente.
• Svuotare e lavare la membrana in agitazione 2 volte con PBS 1X - Tween 0.1% per 5' e 1 volta con PBS
1X per 5'.
• Incubare con l’anticorpo secondario (anti mouse-AP) diluito 1:2000 in latte 2% in agitazione per 1h a T
ambiente.
• Svuotare e lavare la membrana in agitazione 2 volte con PBS 1X - Tween 0.1% per 5' e 1 volta con PBS
1X per 5'.
• Sviluppare immergendo la membrana in una soluzione contenente 10 ml di tampone per la fosfatasi
alcalina (1 M Tris pH=9.5, 5 M NaCl, 0,05 M MgCl2) + 2 substrati per la fosfatasi alcalina: 50 l di
BCIP e 37,5 l di NBT.
• Bloccare la reazione con H2O bidistillata.
77

A11.REAGENTI
A11.1) SOLUZIONI
-ACIDO SOLFORICO 1M (Volf = 100 ml)
Diluire 5,55 ml di H2SO4 (18 M) in 100 ml di H2O bidistillata.
-BCIP (5-Bromo-4-Cloro-3-Indolil fosfato)
Sciogliere 0,5 g di BCIP in 10 ml di dimetilformamide 100%.
-CLOROFORMIO:alcool ISOAMILICO 24:1 (Vf = 100 ml)
Mescolare 96 ml di Cloroformio e 4 ml di alcool Isoamilico. Conservare a 4°C.
-DTT (ditiotritolo) 0,1 M (Volf = 100 ml)
Sciogliere 1,5425 g in 100 ml di H2O bidistillata. Conservare a -20°C.
-ETANOLO 80% (Vf = 100 ml)
Mescolare 80 ml di EtOH 100% e 20 ml di H2O bidistillata.
-ETANOLO 70% (Vf = 100 ml)
Mescolare 70 ml di EtOH 100% e 30 ml di H2O bidistillata.
-ETANOLO DEPC (dietilpirocarbonato) 75% (Vf = 100 ml)
Mescolare 75 ml di EtOH 100% e 25 ml di H2O DEPC.
-GLUCOSIO 20X = 0,4 M = 0,2 g/ml (Volf = 1 l)
Sciogliere 200 g di glucosio in 1 l di H2O mQ. Filtrare con filtro 0,2 m. Aliquotare e conservare a -20°C.
--IPTG (isopropil-β-D-tiogalattoside) (Vf = 10 ml)
Sciogliere 200 g/l di IPTG in H2O bidistillata. Filtrare con filtro 0,2 m. Aliquotare e conservare a -20°C.
-LATTE 4% (w/v) (Vf = 100 ml)
Sciogliere 4 g di latte in polvere granulare istantaneo scremato in 100 ml di PBS 1X.
-LATTE 2% (w/v) (Vf = 100 ml)
Sciogliere 2 g di latte in polvere granulare istantaneo scremato in 100 ml di PBS 1X.
-NBT (nitro blu tetrazolio)
Sciogliere 0,5 g di NBT in 70% dimetilformamide.
-PBS 10X pH=7 (Volf = 1 l) - tampone fosfato salino
Sciogliere 80 g/l di NaCl + 2 g/l di KCl + 14,4 g di Na2HPO4 + 2g/l di KH2PO4. Regolare il pH con HCl.
Portare a Vol con H2O bidistillata. Autoclavare.
-PBST 0,1X = PBS 1X + TWEEN 0,1% (Volf = 1 l)
Aggiungere a 999 ml di PBS 1X 1 ml di Tween 20.
-PEG-NaCl (Volf = 1 l) - soluzione di precipitazione dei fagmidi
Sciogliere 200 g/l (20%) di PEG (polietilenglicole) 8000 + 146 g/l NaCl (Mf = 2,5 M) in 1 l di H2O
bidistillata. Filtrare con filtro 0,2 m. Conservare a 4°C.
-SBc 2X - tampone denaturante di caricamento
20% glicerolo v/v, 100 mM Tris-HCl pH=6.8, 2% SDS v/v, 2% β-mercaptoetanolo, 0,001% p/v Blu di
BrFenolo.
-SOB pH=7 (Volf = 1 l)
Sciogliere 20 g/l di Bacto-trypton (peptone) + 5 g/l Bacto-yeast extract + 0,5 g/l NaCl + KCl Mf = 2,5 mM in
1 l di H2O mQ. Autoclavare. Raffreddare e aggiungere MgCl2 Mf = 10 mM + MgSO4 Mf = 10 mM.
Conservare a 4°C.
-SOC (Volf = 1 l)
Mescolare 950 ml di SOB e 50 ml di glucosio 20X (Mf = 1X). Aliquotare e conservare a -20°C.
-SODIOACETATO 0,2 M pH=7 (Volf = 1 l)
Sciogliere 16,41 g/l di NaAc in 1 l di H2O bidistillata. Regolare il pH con acido acetico diluito 1:1 in H2O
bidistillata.
-SODIOACETATO 3 M pH=5 (Volf = 1 l)
Sciogliere 246,1 g/l di NaAc in 1 l di H2O bidistillata. Regolare il pH con acido acetico glaciale.
-TAE 50X pH=8,3 (Volf = 1 l) - tampone per elettroforesi su gel di agarosio
Sciogliere 242,2 g/l di Tris (Mf = 0,04 M) + 57,1 ml/l di acido Acetico glaciale + 37,224 g/l di EDTA (Mf = 2
mM pH=8,3) in 1 l di H2O bidistillata.
-TBE 10X ICI pH=8,8 (Volf = 1 l) - tampone per elettroforesi su gel di agarosio
Sciogliere 162 g/l di Tris (Mf = 1,34 M) + 46,3 g/l di acido Borico (Mf = 0,749 M) + 9,5 g/l EDTA (Mf =
0,0255 M) in 1 l di H2O bidistillata.
78

-TERRENO LIQUIDO PER COLTURA (2xYT) (Volf = 1 l)
Sciogliere 16 g/l di Bacto-trypton (peptone) + 10 g/l di Bacto-yeast extract + 5 g/l di NaCl in 1 ml di H2O
mQ. Autoclavare.
-TERRENO SOLIDO PER PIASTRE (2xYT agar) (Volf = 1 l)
Sciogliere 16 g/l di Bacto-trypton (peptone) + 10 g/l di Bacto-yeast extract + 5 g/l di NaCl + 15 g/l di Bactoagar
in 1 ml di H2O mQ. Autoclavare. Raffreddare finchè raggiunge circa 50°- 60°C (altrimenti l'antibiotico,
eventualmente aggiunto dopo, si inattiva). Aggiungere 50 ml di glucosio 20X (Mf = 1X) + antibiotico (Mf =
1X).
A11.2) ANTIBIOTICI
-AMPICILLINA M = 10 2 mg/ml = 1000X
Sciogliere 1 g in 10 ml di H2O mQ. Filtrare con filtro da 0,20 m. Aliquotare e conservare a -20°C.
-KANAMICINA M = 25 mg/ml = 1000X
Sciogliere 500 mg in 20 ml di H2O mQ. Filtrare con filtro da 0,20 m. Aliquotare e conservare a -20°C.
B) COSTRUZIONE DI LIBRERIA TOTALE ANTICORPALE
FAGICA
B1.PREPARAZIONE DEL scFv
Il materiale di partenza per la costruzione della libreria totale di classe anticorpale IgA fagica, cioè il cDNA,
viene preparato come già descritto nel paragrafo A1 punti A1.1-A1.2-A1.3 per la produzione della minilibreria.
B1.4) 1° PCR
− Buffer 1X
− MgCl2 1,5 mM
− dNTP 200 M
− primer 0,5 M
− cDNA
− Taq DNA polimerasi 0,03 U/l
− H2O bidistillata sterile a 25 l
Primer
forward
Primer
back
VH
4,6
VH
5
VH
10
IgA
VH
12
VH
14
VH
22
Primer forward IgA
Primer back VH: 5' TTA TCC TCG AGC GGT ACC 3'+
VH4 back - CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCS G
VH6 back - CAG GTG CAG CTA CAG CAG TGG G
VH5 back - CAG GTA CAG CTG CAG CAG TCA
VH10 back - GAG GTG CAG CTG KTG GAG WCY
VH12 back - CAG GTC CAG CTK GTR CAG TCT GG
VH14 back - CAG RTC ACC TTG AAG GAG TCT G
VH22 back - CAG GTG CAG CTG GTG SAR TCT GG
VK MIX
(VK1,2/4,3,5)
VK VK VK
1 2,12 9
Primer forward VK MIX: 5' GAA GTT ATG GTC GAC CCT CCG GA 3'+
VK1 for - TTT GAT TTC CAC CTT GGT CC
VK2/4 for - TTT GAT CTC CAS CTT GGT CC
VK3 for - TTT GAT ATC CAC TTT GGT CC
VK5 for - TTT AAT CTC CAG TCG TGT CC
Primer back VK: 5' AGC AAG CGG CGC GCA TGC C 3'+
3,11,38
MIX
(1/2,7)
13 7/8,15
1,4,9
79

VK1 back - GAC ATC CRG DTG ACC CAG TCT CC
VK2 back - GAA ATT GTR WTG ACR CAG TCT CC
VK12 back - GAA ACG ACA CTC ACG CAG TCT C
VK9 back - GAT ATT GTG MTG ACB CAG WCT CC
Primer forward Vλ MIX: 5' GAA GTT ATG GTC GAC CCT CCG GA 3'+
Vλ1/2 for - TAG GAC GGT SAS CTT GGT CC
Vλ7 for - GAG GAC GGT CAG CTG GGT GC
Primer back Vλ: 5' AGC AAG CGG CGC GCA TGC C 3'+
Vλ3 back - TCC TAT GWG CTG ACW CAG CCA C
Vλ11 back - TCC TCT GAG CTG AST CAG GAS CC
Vλ38 back - TCC TAT GAG CTG AYR CAG CYA CC
Vλ13 back - CAG TCT GYY CTG AYT CAG CCT
Vλ7/8 back - CAG DCT GTG GTG ACY CAG GAG CC
Vλ15 back - AAT TTT ATG CTG ACT CAG CCC C
Vλ1 back - CAG TCT GTS BTG ACG CAG CCG CC
Vλ4 back - CAG CCT GTG CTG ACT CAR YC
Vλ9 back - CAG CCW GKG CTG ACT CAG CCM CC
Condizioni di amplificazione:
denaturazione lunga - 94°C per 3'
30 cicli: denaturazione breve - 94°C per 30''
appaiamento - 56°C per 30''
allungamento - 72°C per 45''
allungamento finale - 72°C per 5'
Controllare l’amplificato su gel di agarosio 2% in tampone TBE 1X.
Preparare una mix per ogni famiglia anticorpale (VH mix, VK mix, V mix) unendo 10 l delle rispettive
amplificazioni.
Controllare 1-3 l di ciascuna delle 3 mix su gel di agarosio 2% in tampone TBE 1X.
B1.5) 2° PCR (aggiunta del linker)
− Buffer 1X
− MgCl2 1,5 mM
− dNTP 200 M
− DMSO 5%
− primer 0,3 M
− 1° PCR VH mix/VK mix/Vλ mix
− Taq DNA polimerasi 0,03 U/l
− H2O bidistillata sterile a 50 l
Per la VH mix usare:
Primer forward VH MIX
Primer back VHPTL
Per la VK mix e la Vλ mix usare:
Primer forward VLPTL: 5' ACC GCT CGA GGA TAA CTT CGT ATA GTA TAC ATT ATA
CGA AGT TAT GGT CGA CCC TCC 3'
Primer back VLPT1: 5' CGC TGG ATT GTT ATT ACT CGC AGC AAG CGG CGC GCA
TGC C 3'
80

Condizioni di amplificazione:
denaturazione lunga - 94°C per 3'
20 cicli: denaturazione breve - 94°C per 30''
appaiamento - 58°C per 30''
allungamento - 72°C per 45''
allungamento finale - 72°C per 10'
Fare 2 reazioni per ogni mix. Unire le 2 aliquote. Controllare le 3 PCR confrontandole con le rispettive VH
mix, VK mix, V mix su gel di agarosio 2% in tampone TBE 1X.
Caricare tutto il materiale su gel di agarosio 1% in tampone TAE 1X; tagliare la banda
corrispondente all’amplificato.
Purificare con QIAEX II gel extraction kit (Qiagen) come da protocollo.
Controllare il prodotto purificato su gel di agarosio 2% in tampone TBE 1X.
B1.6) ASSEMBLING (VH+linker+VL)
− Buffer 1X
− MgCl2 1,5 mM
− dNTP 200 M
− DMSO 5%
− primer 0,25 M (dopo 8 cicli)
− 2° PCR VH mix+linker
− 2° PCR VK mix+linker/2° PCR Vλ mix+linker
− Taq DNA polimerasi 0,03 U/l
− H2O bidistillata sterile a 50 l
Primer forward VHPT1: 5' CCA GGC CCA GCA GTG GGT TTG GGA TTG GTT TGC CGC TA
3'
Primer back VLPT2: 5' TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA
CTC 3'
Condizioni di amplificazione:
denaturazione lunga - 94°C per 3'
33 cicli: denaturazione breve - 94°C per 30''
appaiamento - 65°C per 30''
allungamento - 72°C per 45''
allungamento finale - 72°C per 10'
Fare 3 reazioni per ogni assembling. Unire le 3 aliquote. Controllare l’amplificato su gel di agarosio 2% in
tampone TBE 1X.
Caricare tutto il materiale su gel di agarosio 1% in tampone TAE 1X; tagliare la banda
corrispondente all’amplificato.
Purificare con QIAEX II gel extraction kit (Qiagen) come da protocollo.
Controllare il prodotto purificato su gel di agarosio 2% in tampone TBE 1X.
B1.7) DIGESTIONE DEL scFv
− Buffer 2 1X
− BSA 1X
− assembling VH+VK/VH+Vλ
− enzima di restrizione
− H2O bidistillata sterile
La concentrazione degli enzimi di restrizione da usare dipende dalla concentrazione dell’amplificato.
81

Operare in modo sequenziale:
1° DIGESTIONE: con BsshII 1h a 50°C (Tenere 2 l per il controllo).
2° DIGESTIONE: con NheI 2h 30' a 37°C (Dopo 1h 30' aggiungere 0,5-1 l di NheI).
Controllare: il campione non digerito, la 1° digestione e la 2° digestione su gel di agarosio 2% in TBE 1X.
Caricare tutto il materiale su gel di agarosio 1% in tampone TAE 1X; tagliare la banda
corrispondente all’amplificato.
Purificare con QIAEX II gel extraction kit (Qiagen) come da protocollo.
Controllare il prodotto purificato su gel di agarosio 2% in tampone TBE 1X confrontandolo con il vettore
digerito.
B2.PREPARAZIONE DEL VETTORE
B2.1) ESTRAZIONE DI DNA PLASMIDICO
Il plasmide va preparato come indicato al punto A2.1
B2.2) DIGESTIONE DEL VETTORE
− Buffer 2 1X
− BSA 1X
− DNA plasmidico
− enzima di restrizione
− H2O bidistillata sterile
La concentrazione degli enzimi di restrizione da usare dipende dalla concentrazione del plasmide.
Operare in modo sequenziale:
1° DIGESTIONE: con BsshII 2h a 50°C (Tenere 2 l per il controllo).
2° DIGESTIONE: con NheI 2h a 37°C (Tenere 2 l per il controllo).
3° DIGESTIONE: con XhoI 2h a 37°C (Dopo 1h aggiungere 0,5-1 l di NheI).
Controllare: il campione non digerito, la 1° digestione, la 2° digestione e la 3° digestione su gel di agarosio
1% in TBE 1X.
Caricare tutto il materiale su gel di agarosio 1% in tampone TAE 1X; tagliare la banda
corrispondente al vettore digerito.
Purificare con QIAEX II gel extraction kit (Qiagen) come da protocollo.
Controllare il vettore purificato su gel di agarosio 2% in tampone TBE 1X confrontandolo con il scFv
digerito.
I passaggi successivi coincidono con quelli precedentemente descritti nei paragrafi da A3 ad A9 per la
costruzione della mini-libreria anticorpale fagica.
B8.FINGERPRINTING
B8.1) PCR
Per la VH usare i primers indicati al paragrafo A8.1.
Per la VL usare:
Primer forward VLPTL
Primer back VLPT2
Per l’assembling usare:
Primer forward VHPT2
Primer back VLPT2
Per la digestione seguire le indicazioni descritte al punto A8.2.
82

B9.SEQUENZIAMENTO
B9.1) PRE-PCR DI SEQUENZA
Per la VH usare i primers indicati al punto A9.1.
Per la VL usare:
Primer forward VLPTL
Primer back M13revseq: 5' AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA 3'
Per l’assembling usare:
Primer forward VHseq
Primer back M13revseq
Proseguire come indicato nei punti A9.2-A9.3-A9.4.
CEPPO BATTERICO - DH5F': F’/endA1 hsdR17 (rK - mK + ) supE44 thi1 recA1 gyrA
(Nal r ) relA1 (lacZYA-argF) U169 deoR (F80dlac(lacZ)M15).
FAGO HELPER: M13 K07
VETTORE: pDAN5 C5.22
83

GLOSSARIO
AGA: anticorpi anti-gliadina
APC: antigen presenting cell = cellula presentante l’antigene
AtTGA: anticorpi anti-tTG
BSA: bovine serum albumin = siero-albumina bovina
CD: coeliac disease = malattia celiaca
CDn°: cell differentiation = differenziazione cellulare
CDR: complementary determining region = regione determinante la complementarietà
CTLA: cytotoxic T lymphocite associated protein = proteina associata a linfocita T
citotossico
DH: dermatitis herpetifomis = dermatite erpetiforme
ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay = analisi enzima-collegata
dell’immunosorbente
EMA: anticorpi anti-endomisio
Fab: fragment antibody = frammento anticorpale
GABA: gamma aminobutyric acid = acido aminobutirrico
GAD: glutamic acid decarboxylase = acido glutammico decarbossilasi
GFD: gluten free diet = dieta senza glutine
GTP: guanosine triphosphate = guanosin trifosfato
HLA: human leucocyte antigen = antigene leucocitario umano
IA-2: anti-insula
IAA: anticorpi anti-insulina
IBL: intestinal biopsy lymphocite = linfocita da biopsia intestinale
ICA: islet cell antibody = anticorpo delle cellule degli isolotti
ICAM: intracellular adhesion molecule = molecola di adesione intracellulare
ICOS: inducile T-cell co-stimulator = co-stimolatore inducibile delle cellule T
Idd: insulin dependent diabetes susceptibility = locus di suscettibilità al diabete insulino
dipendente
IDDM: insulin dependent diabetes mellitus = diabete mellito insulino dipendente
IELs: intraepithelial lymphocites = linfociti intraepiteliali
IFN: interferone gamma
Ig: immunoglobulina
84

IL: interleuchina
JM: juxta membrane = giustapposto alla membrana
MAP: mitogen activated protein = proteina mitogena attivata
MHC: major histocompatibility complex = complesso maggiore di istocompatibilità
NF-kB: nuclear factor of kappa light chain gene enhancer in B cells = fattore nucleare del
gene promotore della catena leggera k nelle cellule B
NK: natural killer
NKG2: natural killer group 2 = recettore delle cellule natural killer gruppo2
NOD: Non Obese Diabetic
PBL: peripheral blood lymphocite = linfocita da sangue periferico
PCR: polymerase chain reaction = reazione a catena della polimerasi
PTP: phosphotyrosine phosphatase = fosfotirosin fosfatasi
scFv: single chain fragment variable = frammento variabile a singola catena
SD: standard diet = dieta normale
SLE: systemic lupus erytematosus = lupus eritematoso sistemico (LES)
T1DM: type 1 diabetes mellitus = diabete mellito di tipo 1
TCR: T cell receptor = recettore delle cellule T
TG: transglutaminase = transglutaminasi
TGF: transforming growth factor = fattore di crescita trasformante
Th: T helper
TLR: toll-like receptor = recettore toll
TNF: tumor necrosis factor = fattore di necrosi tumorale
TNFR: tumor necrosis factor receptor = recettore del fattore di necrosi tumorale
ABBREVIAZIONI
aa = amminoacidi
bp: base pair = paia di basi (pb)
DO = densità ottica
DO600 = densità ottica alla lunghezza d’onda di 600 nm
ds: double strand = doppio filamento
kDa = chilo Dalton
MOI = indice di molteplicità di infezione
nm = manometri
85

PM: peso molecolare
t.g. = tampone glicerolo
Vol = Volume
Volf = Volume finale
86

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RINGRAZIAMENTI
Inizio ringraziando il professor Marzari da cui è partito tutto il mio iter post-laurea. Lo
ringrazio per avermi permesso di continuare a svolgere e approfondire le conoscenze nel
campo della biologia.
Ringrazio il professor Daniele Sblattero per avermi fornito utili consigli e per avermi
mostrato alcuni “trucchi del mestiere”.
Ringrazio tutto il gruppo del laboratorio di biologia dell’Università, in particolare la
Dottoressa Federica Ziller che con tanta pazienza mi ha seguito nei primi passi nel mondo
delle selezioni.
Ringrazio la Dottoressa Fiorella Florian per avermi ospitato in questi anni nel suo
laboratorio, per aver messo a mia disposizione le sue conoscenze e grazie a Lei ho appreso
il metodo di lavoro.
Ringrazio le compagne nonché amiche di sventura del laboratorio di biologia di Valmaura,
in particolare le Dottoresse Silvia e Monica per avermi consolato nei momenti di “buio”
lavorativo (ah, i misteri della biologia!). Con le loro parole hanno saputo farmi superare le
fasi di sconforto.
Ringrazio l’allegra “banda” del mitico Ospedaletto, come qualcuno scherzosamente
soprannomina il Burlo Garofolo. In primis ringrazio il Dottor Tarcisio Not che credendo
nelle mie potenzialità mi ha voluto nel suo gruppo. Mi ha così permesso di crescere
scientificamente inserendomi in un ambiente ricco di persone con esperienze diverse con
cui poter scambiare idee.
Ringrazio il Dottor Alberto Tommasini, “tutto fare”, per la sua disponibilità a risolvere
qualsiasi tipo di problema, da quello pratico a quello burocratico, e per aver fatto sentire il
mio bagaglio di esperienza “bibliotecaria” molto aprrezzato. Kiitos!
Ringrazio il gruppo festaiolo del laboratorio della Clinica Pediatrica del Burlo (i Dottori
Andrea, Elisa, Erica, Fortunato, Laura, Marilena, Sara e Valentina) per avermi accolto con
grande simpatia facendomi sentire a mio agio nel nuovo laboratorio.
~·~
93

Ringrazio immensamente i miei genitori che mi hanno dato l’opportunità di iniziare e
proseguire questa lunga strada sostenendomi nelle mie decisioni e sopportandomi nei
momenti di “crisi”. Spero che possano essere orgogliosi del traguardo raggiunto dalla loro
“figlioletta”.
Ringrazio mio fratello Fabrizio per essersi gentilmente occupato della stampa di questo
“mattone”.
Ringrazio il mio “fratellino” Federico per il suo aiuto informatico e per avermi risollevato
lo spirito nei momenti difficili con il sorriso.
Ringrazio gli amici e i parenti (Daniela, Antonella, Michela) che mi sono stati vicino in
questo lungo percorso, in particolare un grazie alle Yersinie, le Dottoresse Daniela e Fleur,
con cui ho condiviso le fatiche di questo impervio cammino che abbiamo intrapreso
insieme fin dall’inizio, quando eravamo matricole.
E infine, ma assolutamente non ultimo per importanza, per la sua enorme comprensione e
per avermi veramente dato forza in quest’ultimo periodo stressante, Ringrazio col cuore
l’uomo della mia vita…
…mio futuro marito Marco!
94