Significato tossicologico degli indicatori biologici - Giornale Italiano ...

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G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4 273 www.gimle.fsm.it l’esposizione ad un determinato fattore di rischio e a seconda dell’entità, indica un danno effettivo o potenziale alla salute o una vera e propria malattia”. Gli IBR rappresentano la categoria più vicina alla clinica (ma non ancora clinicamente rilevante) nella sequenza dall’esposizione alla malattia e sono quindi particolarmente utili per la valutazione del rischio nei lavoratori, sia a livello individuale che di gruppo. Essi inoltre, se utilizzati in studi epidemiologici ad hoc, permettono di individuare i cosiddetti “livelli di non effetto avverso osservabile” o no observed adverse effect level (NOAEL) utili alla definizione dei valori limite di esposizione occupazionali ed ambientali. Per una trattazione del ruolo del MB nella valutazione del rischio si veda la relazione di Lotti et al. in questo volume. Mentre per l’uso del MB nella sorveglianza sanitaria ed epidemiologica si rimanda a quelle di Consonni e Bertazzi e di Assennato e Bisceglia, sempre in questo volume. Indicatori biologici di suscettibilità (IBS) Gli IBS per il NRC indicano una “intrinseca o acquisita diminuzione della capacità di un organismo di rispondere ai possibili effetti conseguenti l’esposizione ad un determinato xenobiotico”. L’utilità pratica di un test di suscettibilità, come peraltro di qualsiasi tipo di test, dipende essenzialmente da due fattori: a) il suo valore predittivo, ovvero la sua validità (sensibilità e specificità) nel predire una determinata suscettibilità ad una data patologia, e b) l’effettiva prevalenza di quella patologia nella popolazione studiata. L’esclusione dall’esposizione di soggetti ritenuti suscettibili in base ad un test predittivo di suscettibilità porterebbe all’allontanamento dal lavoro anche di un certo numero, talora elevato e quindi non accettabile, di soggetti non suscettibili. Ammettiamo, ad esempio, che una patologia abbia una prevalenza del 10% nella popolazione esaminata e che un test genetico (o di altro tipo) abbia una sensibilità ed una specificità, diciamo, del 90%. Il test è cioè in grado di individuare correttamente come positivi il 90% dei soggetti “suscettibili” (sensibilità) e correttamente come negativi il 90% dei soggetti “non suscettibili”. In questo caso l’uso del test con l’obiettivo di escludere tutti i soggetti positivi, in quanto ritenuti appunto suscettibili, porterebbe anche all’esclusione di un numero elevato di soggetti risultati falsamente positivi al test. In questo specifico caso, su 100 soggetti testati, ne risulterebbero positivi al test ben 18 ma i veri positivi sarebbero solo 9, così che 9 lavoratori, ovvero il 50% dei soggetti risultati positivi, sarebbero esclusi dall’esposizione senza motivo. Tale percentuale di soggetti inutilmente allontanati dal lavoro, nel caso di un test di pari sensibilità e specificità ma applicato ad una patologia che avesse una prevalenza nella popolazione pari all’1% (valore, questo, non infrequente nel caso, ad esempio, di polimorfismi genetici degli enzimi metabolici, come discusso nella relazione di Pavanello e Clonfero, 2004), salirebbe ad oltre il 90% dei soggetti positivi al test! Una percentuale ovviamente non accettabile. Indicatori biologici di dose interna (IDI) Rappresentano una particolare categoria di IBE in quanto sono in grado di misurare direttamente, o indirettamente attraverso la misura dei metaboliti, la quantità/con- centrazione di xenobiotico presente o accumulata in un determinato compartimento od organo, come ad es. il piombo urinario dopo chelazione (PbU). Gli IDI sono spesso più informativi dei corrispondenti IBE in quanto forniscono un’informazione più mirata e che si presta ad una valutazione del rischio più precisa, soprattutto nei casi in cui la dose venga misurata a livello dell’organo bersaglio. Indicatori di dose biologicamente efficace (IDBE) Anche gli IDBE appartengono alla categoria degli indicatori di esposizione e rispetto agli indicatori tradizionali rappresentano una misura dell’esposizione più vicina al bersaglio, in quanto sono in grado di fornire indicazioni altamente sensibili e specifiche della piccola o minima frazione di xenobiotico che, generalmente dopo attivazione metabolica, ha legato un determinato bersaglio. Il bersaglio può essere critico, ovvero strettamente connesso con l’eziopatogenesi della patologia (es. addotti al DNA nell’organo bersaglio per i cancerogeni genotossici), o non-critico, ovvero indipendente dall’organo bersaglio (es. addotti all’emoglobina per composti epato- o nefrotossici). È forse inutile ricordare che l’effetto tossico dipende dalla piccola o piccolissima frazione di composto, o di suoi metaboliti, che interagisce col bersaglio critico, e non già dalla quota preponderante di essi che viene eliminata dagli organi emuntori e che costituisce gli IBE tradizionali. Per una più ampia trattazione deli IDBE vedi Miraglia et al., 2004. Indicatori precoci di malattia (IPM) Ai tipi di biomarcatori già citati se ne è aggiunto un altro che, nella sequenza di eventi che vanno dall’esposizione alla patologia conclamata, si colloca in una fase subito precedente quella dei test clinico-diagnostici di malattia usati nella sorveglianza sanitaria. Il termine indicatori precoci di malattia indica appunto quelle alterazioni dei parametri biochimici, funzionali o biomolecolari di base di un individuo che, pur non essendo il risultato di un quadro di malattia clinicamente conclamata, dimostrano tuttavia che tale processo è in corso. Vi è quindi un’elevata probabilità che, qualora si verifichino o persistano determinate condizioni, ad esempio l’esposizione al fattore di rischio (professionale o non-professionale che sia), la malattia si svilupperà effettivamente. La rivista Biomarkers ha recentemente aggiunto agli indicatori tradizionali anche questo tipo di indicatore con il nome di biomarker of disease. Appare evidente che la classificazione di un test come appartenente alla categoria degli indicatori biologici piuttosto che a quella dei test propriamente clinici, come pure la distinzione tra i diversi tipi di IB, non è facile né ovvia e richiede un’attenta valutazione sia del significato fisiopatologico del test medesimo che del ruolo eziopatogenetico (causale o concausale) del fattore di rischio nello sviluppo e nell’evoluzione della patologia. Per una discussione più approfondita del significato diagnostico dei test di monitoraggio biologico ed in particolare dei criteri da adottare per distinguere gli IBR dagli IPM, si veda anche la relazione di De Palma et al. in questo volume. Riassumendo, la corretta individuazione di un IB come IBE, IBR o IBS e a quale sottocategoria esso appartenga all’interno di ciascuna categoria, come già detto, non è
274 G Ital Med Lav Erg 2004; 26:4 www.gimle.fsm.it sempre facile ma è necessaria al medico del lavoro per poter attribuire al test il suo vero significato, sia in termini di valutazione del rischio (interpretazione del test, diagnosi, ecc.) che di gestione del rischio (giudizio d’idoneità, provvedimenti sul lavoratore, eventuale terapia, ecc.). Sarà utile quindi considerare ora con alcuni esempi quali sono i problemi interpretativi relativi ad un nuovo IB, ovvero la caratterizzazione fenotipica in vivo nell’uomo di alcune isoforme del citocromo P450 (CYP), in particolare il CYP-2E1. Tale test, tuttora in corso di validazione, è potenzialmente assai specifico e sensibile, come dimostra il crescente interesse negli ultimi anni di molti gruppi di ricerca in questo settore. Citocromo P450 e monitoraggio biologico È noto che gli effetti sulla salute, sia deterministici che stocastici, di molti inquinanti ambientali e occupazionali sono il risultato della loro biotrasformazione (attivazione e detossificazione) nel fegato e in altri organi (Manno & Saia, 1994). Il principale sistema enzimatico responsabile dell’attivazione degli xenobiotici è il citocromo P-450, una superfamiglia di circa 1000 proteine presenti in quasi tutti gli organismi viventi e situate nel reticolo endoplasmatico degli epatociti e di altre cellule/organi. Solo nell’uomo sono state isolate e caratterizzate alcune decine di isoforme costitutive di cui però solo alcune sono quantitativamente e cataliticamente importanti. Individui diversi hanno diverse quantità di ciascuna isoforma. Inoltre, alcuni CYP sono geneticamente polimorfici ed altri sono inducibili, ovvero la loro sintesi (e quindi la loro attività metabolica) è stimolata da vari fattori, quali la dieta, l’alcol, il digiuno, i farmaci ed altri ancora. Ne consegue che individui diversi presentano capacità di metabolizzare gli xenobiotici anche molto diverse tra loro (Puga et al., 1997). Tali differenze individuali nel contenuto e attività del CYP si ritiene possano spiegare, almeno in parte, la variabilità umana nella risposta tossicologica agli agenti chimici (Perera F.P., 1996, 1997; Meyer & Zanger, 1997; Caporaso & Landi 1995). Vari studi di epidemiologia molecolare che cercavano di stabilire una correlazione tra genotipo di questi enzimi e risposta tossica o cancerogena in soggetti esposti ad un dato composto non hanno potuto, eccetto che per alcune eccezioni (D’Errico et al, 1996), confermare l’ipotesi di partenza. E ciò solo in parte a causa delle piccole dimensioni dello studio o di altre limitazioni metodologiche (Boffetta, 1995). Il motivo principale di queste scarse correlazioni sta invece nel fatto che l’individuazione di un singolo, anche se importante, passaggio metabolico di attivazione o di detossificazione non costituisce un indicatore sufficientemente sensibile e specifico in grado di predire se l’esposizione a (determinate concentrazioni di) quel composto determinerà tossicità o cancerogenesi (Hong & Yang, 1997). È necessario pertanto riflettere sulla necessità di un approccio più complesso, che permetta una valutazione integrata dei vari fattori in gioco, inclusi quelli di suscettibilità, sia genetica che acquisita. La possibilità di determinare in vivo, con metodiche relativamente semplici e poco o per nulla invasive, l’atti- vità metabolica individuale di specifiche isoforme del citocromo P450 ha ovvie implicazioni in tossicologia industriale. Questo è stato uno degli obiettivi di due progetti di ricerca interdisciplinari condotti in collaborazione tra gruppi europei e latinoamericani, che miravano a studiare il citocromo P450 come bioindicatore di suscettibilità nell’esposizione umana e sperimentale a diversi agenti, quali composti organici volatili (VOC), idrocarburi aromatici policiclici (IPA), e idrocarburi da benzine e diesel (Manno M. e Albores A., 2003). Lo studio prevedeva la determinazione nei lavoratori e in un gruppo di controllo del test di fenotipizzazione del CYP-2E1 mediante la metodica del clorzoxazone (CHZ), un farmaco miorilassante di largo uso in molti paesi. Questa consiste nella misurazione, mediante un semplice metodo isocratico HPLC, del rapporto metabolico tra il metabolita 6-idrossiclorzoxazone (6-OH-CHZ) e il CHZ stesso rilevato nel sangue del soggetto due ore dopo l’assunzione di una compressa di CHZ (500 mg). Poiché il CHZ è un substrato altamente specifico per il CYP-2E1, il rapporto metabolico 6-OH- CHZ/CHZ in vivo indica con buona precisione e accuratezza, purché effettuato a distanza dall’assunzione di alcol, la capacità metabolica, ovvero, il fenotipo CYP-2E1 in quel soggetto. Per una descrizione più dettagliata della metodica si veda altrove (Lucas et al., 2001). È stata pertanto utilizzata questa metodica per cercare di valutare la suscettibilità metabolica di soggetti esposti a solventi clorurati in un’industria calzaturiera, dopo l’approvazione dello studio da parte dei Comitati Etici dei laboratori partecipanti, sia europei (Italia, Francia) che messicano. Un’osservazione interessante fatta nel corso dello studio è stato il riscontro di una riduzione altamente significativa (di circa 40-50%) del fenotipo CYP-2E1, rispetto ai controlli, in soggetti messicani (lavoratori calzaturieri) esposti a vari VOC, tra cui toluene, xilene ed altri, presenti nell’aria a concentrazioni pari o addirittura inferiori al TLV- TWA e quindi prive di effetto tossico (Martinez-Hernandez et al. 2000, Lucas et al., 1999). Il dato, confermato dalla ripetizione delle analisi in tre laboratori diversi, in Messico, Francia e Italia, suggerisce che la determinazione del fenotipo CYP-2E1 usata per valutare la potenziale suscettibilità metabolica dei soggetti esaminati, può rappresentare invece un nuovo indicatore biologico di esposizione o di risposta/effetto. Tale nuovo IB mostra di essere estremamente più sensibile e specifico di molti IBE o IBR per il MB dei solventi oggi in uso (i soggetti non presentavano alterazioni dei principali test di citolisi e colestasi, né individualmente né come gruppo rispetto ai controlli non esposti). Il meccanismo di inibizione del CYP-2E1 osservato nei lavoratori messicani non è ancora chiaro e sarebbe pertanto difficile inserire il test tra gli IBE, gli IBR o gli ID- BE. Possiamo tuttavia fare delle ipotesi: 1. Le basse concentrazioni di solventi cui erano esposti i lavoratori non erano di per sé tossiche ma potrebbero essere state in grado di inibire funzionalmente e reversibilmente l’attività catalitica del CYP-2E1, diminuendo la disponibilità dell’enzima per il substrato CHZ (inibizione competitiva). 2. Il CYP-2E1 e/o il reticolo endoplasmatico (RE) dell’epatocita, in cui il CYP-2E1 si trova, potrebbero essere
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