Tossine da cianobatteri - Istituto Superiore di SanitÃ

Laura Achene
Istituto Superiore di Sanità
Reparto Igiene delle acque interne
Cianobatteri nelle acque destinate al consumo umano: Analisi dei dati, gestione del rischio,
principi, criteri e metodi di comunicazione del rischio
BARI, 6-7/12/2011

Le cianotossine
Neurotossine Citotossine Epatotossine
Saxitossin
e
Anatossin
e
Cilindrospermopsin
a
Microcistin
e
Nodularine
Alcaloidi
Peptidi ciclici
tossine gastrointestinali e con effetti cutanei acuti quali aplisiatossina,
debromoapsiatossina e lingbiatossina prodotte da cianobatteri di origine marina
e le endotossine lipopolisaccaridiche (LPS), potenzialmente irritanti

Vie di esposizione
Orale
Acqua
potabile
Mezzo
Acque ad uso ricreazionale
Cibo (prodotti ittici, latte, carne,
verdure, supplementi alimentari)
Polmonare
Attività ricreazionali, lavoro,
doccia
Cutanea
Emodialisi
Attività ricreazionali, lavoro,
doccia
Acqua usata per emodialisi

Le microcistine sono tra le
cianotossine quelle più diffuse
Eptapetidi monociclici con
peso molecolare variabile tra
500 e 4000 Da
Almeno 80 congeneri
I generi che producono le
microcistine comprendono
Microcystis, Anabaena,
Nodularia, Nostoc e
Oscillatoria
(5) Adda
H
C H 3
C H 3
O
H
H
C H 3
H
H 3
HC
H
(6) D-Glu (iso) (7) N-metildeidroalanina
(Mdha)
HN
H
NH
O
R 2
COOH
O
H
O
H 3 C O
N
NH
CH 2
H
H 3 C
CH 3
COOH
H
NH
R 1
(3) D-eritro-b-metilAsp
O
(1) D-Ala
I due amminoacidi variabili, indicati con R 1 e R 2 , che si trovano in posizione 2 e 4
nella struttura ciclica e le più frequenti variazioni nella struttura chimica dovute
all’assenza del gruppo metile nelle posizioni 3 e/o 7, danno luogo ad un numero
elevato di altri congeneri.
L’insolito amminoacido Adda è alla base della tossicità di questi composti.

Tabella 1. Denominazione e descrizione strutturale di Microcistine selezionate
MICROCISTINA R1 R2
dem-MC- RR Arginina Arginina
MC-RR Arginina Arginina
MC-YR Tirosina Arginina
dem-MC- LR Leucina Arginina
MC-LR Leucina Arginina
MC-LA Leucina Alanina
MC-LY Leucina Tirosina
MC-LF Leucina Fenilalanina
MC-LW Leucina Triptofano

Caratteristiche chimiche
‣ Le MCs devono le loro caratteristiche idrofobiche alla
presenza del residuo Adda e all’eventuale presenza di altri
amminoacidi a carattere idrofobico.
‣ Sono tossine estremamente stabili e difficilmente
subiscono idrolisi chimica e ossidazione a pH neutro; sono
resistenti alla temperatura di ebollizione dell’acqua.
‣ Il tempo di emivita nelle acque naturali varia in funzione
della temperatura e dell’entità delle popolazioni
microbiche presenti (biodegradazione ad opera di batteri
piuttosto che da fenomeni chimico-fisici)
‣ Una lenta degradazione di tipo fotochimico può avvenire
quando vi è l’esposizione diretta alla luce solare

MC: Farmacocinetica
La distribuzione delle MCs è limitata dalla scarsa capacità
di queste tossine di attraversare le membrane cellulari
In primo luogo sono accumulate nel fegato da sistemi di
trasporto attivi multispecifici per gli acidi biliari
Il fegato è l’organo bersaglio sia per l’accumulo che per
l’escrezione delle MCs
A seguito di somministrazione ip e iv, 50-70% di MC-LR è
nel fegato, 7-10% nell’intestino, 1-5% nei reni.
L’escrezione dal fegato avviene attraverso la bile
enteroepatico
Il fegato ha un ruolo importante nella detossificazione
delle MCs
ricircolo

MC: Meccanismo di azione
Le MC agiscono a livello epatico come inibitori delle
fosfatasi proteiche 1 e 2° (PP1 e PP2A)
Ad alte dosi (tox acuta)
eventi a cascata
(cambiamenti nel citoscheletro, stress ossidativo,
apoptosi, aumento della trascrizione di alcuni geni)
tossicità epatica centro lobulare, zone altamente
emorragiche per danneggiamento dei sinusoidi epatici
A basse dosi (tox ripetuta) induzione di
proliferazione cellulare ed ipertrofia epatica

Tossicità acuta delle MC
Le MC sono potenti epatotossine
‣La MC-LR è considerata il congenere con la più elevata
tossicità acuta
‣MC-LR: DL 50 ip – topo: 50-150 µg/Kg pc
‣MC-RR: DL 50 ip – topo: 600 µg/Kg pc
‣MC-LR: DL 50 orale – topo: 5000 µg/Kg pc
La morte si verifica entro breve tempo dalla
somministrazione (1-2 ore)

Tossicità
La differenza di tossicità acuta di 30-100 volte nelle due diverse
vie di somministrazione (ip/orale) è dovuta a differenze
tossicocinetiche
I sistemi di trasporto attivo per l’assorbimento intestinale
vengono by-passati dal trattamento i.p. La MC-LR diventa
direttamente disponibile per il trasporto all’interno della
cellula epatica
La somministrazione i.p. poco rappresentativa delle
reali condizioni di esposizione umana per via orale
(cibi e/o acqua potabile)

MC: Tossicità ripetuta
‣13 settimane- topo-gavaggio: NOAEL 40 µg MC-
LR/Kg/pc/giorno su danni epatici ed alterazioni dei
parametri enzimatici
• 45 giorni-topo-via orale (dieta): NOAEL di 333 µg MC-
LR/Kg/pc/giorno
Le differenze possono essere attribuite alla
tossicocinetica delle due vie di somministrazione
• Gavaggio: alte concentrazioni circolanti immediate
• Dieta: la somministrazione è graduale nel tempo;
possono intervenire sistemi di detossificazione

Altri effetti tossici
‣Estratti di MC-LR testati con 3 saggi di mutagenesi a
breve termine (Ara test, Ames test, SOS/umu test) non
hanno evidenziato effetti genotossici
‣Sono state dimostrate proprietà di promotore
tumorale correlate all’azione di fosforilazione delle
proteine
Lo IARC ha classificato la MC-LR come
possibile cancerogeno per l’uomo (gruppo 2B)

Tossicità delle MC
Tabella 2. Fattori di conversione definiti per 21 congeneri di MCs basati sulla IC50
definita mediante saggi di inibizione della PP2a (prove in triplicato). Fonte Ikehara et. al.*
* Ikehara et al. (2009) The effect of structural variation in 21 microcystins on their inhibition of PP2A
and the effect of replacing cys269 with glycine. Toxicon 54:539.

Considerazioni generali: potenziale rischio per
l’uomo
• L’uomo può essere esposto soprattutto per via orale attraverso l’acqua
potabile, alimenti (pesce soprattutto) e vegetali od il consumo di
integratori a base di alghe, in misura minore per via cutanea e via
respiratoria
• Non sono stati condotti studi in vivo sulla farmacocinetica delle MCs
• I dati di tossicità acuta suggeriscono uno scarso assorbimento delle
MCs a seguito di esposizione per via orale
• L’accumulo preferenziale delle MCs avviene negli epatociti grazie al
sistema di trasporto degli acidi biliari
• I dati sull’esposizione umana hanno mostrato effetti gastrointestinali
acuti (nausea, diarrea e vomito, morte per insufficienza respiratoria -
sindrome di Haff) e cutanei
• L’esposizione umana accidentale attraverso l’acqua di dialisi ha
dimostrato danni epatici gravi e in alcuni casi morte
• L’esposizione attraverso la via respiratoria ha identificato come organo
target la parte superiore dell’apparato respiratorio

Nodularina
• Pentapeptide monociclico con struttura simile alla
microcistine
Prodotta da
Nodularia
spumigena
Sono conosciute poche varianti (sette)
Chemical structure of nodularin (from Duy et al.

Tossicità acuta
‣Il meccanismo di tossicità è molto simile a quello delle
MC
‣Sono potenti epatotossine
‣Agiscono a livello epatico come inibitori delle fosfatasi
proteiche 1 e 2A (PP1 e PP2A)
‣Determinano un quadro di tossicità epatica
centrolobulare, con distruzione delle cellule
parenchimali e dei sinusoidi del fegato con morte o
gravi danni al fegato
‣DL 50 ip –topo: 30-50 µg/kg pc (la morte sopraggiunge
in 2-3h)

Altri effetti tossici a dosi ripetute
• Somministrazione ip a ratti maschi di due dosi per 2
settimane di 25 µg nodularina/kg pc notevole
decremento del livello nel siero di testosterone
accompagnato da un innalzamento del colesterolo
LDL
• Non è stata dimostrata attività mutagena
• Non è stato calcolato un NOAEL
• Può promuovere la crescita di tumori epatici od altri
tumori a seguito di esposizione ripetuta a basse dosi
(ratti femmine)

Cilindrospermopsina
‣Appartiene alla classe degli alcaloidi guanidici
‣La molecola è costituita da un gruppo guanidico
triciclico combinato con idrossimetil-uracile
Otto specie di cianobatteri produttori di cilindrospermopsina: Cylindrospermopsis
raciborskii, Aphanizomenon ovalisporum, Aphanizomenon flos-aquae, Umezakia
natans, Rhaphdiopsis curvata and Anabaena bergii, Anabaena lapponica, and Lygnbya
wollei .Tra questi Cylindrospermopsis raciborskii è la specie che rappresenta il
problema maggiore su scala mondiale

Farmacocinetica
• Ha elevata idrofilicità
• Necessita di trasporto attivo – trasportatori degli acidi
biliari per gli epatociti
• Per le ridotte dimensioni può attraversare
parzialmente le membrane biologiche per diffusione
passiva
• L’accumulo nei tessuti avviene principalmente nel
fegato e in misura ridotta nei reni
• Nel topo viene escreta per via renale (> 50% in 6h)
• Viene bioattivata dal P450 e probabilmente coniugata
col glutatione

Meccanismo di azione
Attivazione del citocromo P-450
• Agisce direttamente inibendo la sintesi proteica con
meccanismo non reversibile
• I metaboliti formati dal P450 agiscono con meccanismo non
noto
• Il fegato è l’organo target, il meccanismo di tossicità non è
chiaro, probabilmente dovuto alla inibizione delle proteine
grave necrosi epatica
• Nei reni si manifestano necrosi ed aumento della sezione dei
tubuli prossimali ed alterazione dei glomeruli.
• Come interferente endocrino è stato ipotizzato alterazione
del rapporto progesterone/estrogeni nelle donne a seguito di
assunzione della cilindrospermopsina
• Studi su animali da laboratorio sono a favore di un possibile
effetto genotossico e cancerogeno.

Tossicità acuta
‣Ha effetti epatotossici e nefrotossici. Altri organi
bersaglio sono timo e polmone.
‣La tossicità acuta è ritardata e progressiva: la morte si
verifica a 24-120 h (1-2 h per le MC)
‣LD 50 – topo - ip : 2,1 mg/kg a 24h
0,2 mg/kg a 5-6gg(120-144h)
‣LD 50 - topo – orale: 4,4-6,9 mg/kg a 2-6 gg

Tossicità ripetuta
• 11 settimane-topo-gavaggio dosi di 0, 30, 60, 120 or
240 μg/kg-giorno NOAEL e LOAEL of 30 e 60
μg/kg-giorno (incremento del peso del rene)
• Non sono disponibili dati sugli effetti
immunotossici, sebbene il sistema immunitario
sembra un bersaglio delle esposizioni a breve
termine e ad alte dosi
• Dati preliminari in vivo sono a favore di un
potenziale cancerogeno (tumori epatici)
• CYN purificata può causare inibizione crescita
cellulare, alterazione della morfologia cellulare

Anatossine
L’anatossina ATX-a è un alcaloide amminico biciclico con peso
molecolare di 165 Da, un’ammina secondaria 2-acetyl-9-azabicyclo(4-2-
1)non-2-ene) ed è un analogo strutturale della cocaina.
L’omoanatossina-a è un analogo dell’anatossina-a da cui differisce per la
presenza di un gruppo propionilico in posizione C-2 invece del gruppo
acetilico presente nell’anatossina-a. La anatossina-a(s) ha una struttura
chimica diversa essendo un estere fosforico della N-idrossi guanidina.
Struttura chimica della anatossina-a, dell’omoanatossina-a e dell’anatossina-a(S)
L’ATX-a è prodotta da alcuni ceppi di Anabaena (in particolare Anabaena flos-aquae ed almeno da altri 4
generi di cianobatteri Aphanizomenon, Microcystis, Oscillatoria (Planktothrix), Cylindrospermun.
L’omoanatossina-a è prodotta da Planktothrix formosa e O. formosum (Phormidium formosum). L’ATXa(S)
è prodotta da Anabaena sp.: A. flos-aquae e A. lemmermannii

Meccanismo di azione
‣L’anatossina-a è un agonista colinergico che si lega ai
recettori dell’acetilcolina nel sistema nervoso centrale e
periferico e nelle giunzioni neuromuscolari causando
stimolazione continua con blocco della trasmissione
elettrica. La morte sopraggiunge per paralisi muscolare
ed asfissia. Gli effetti acuti sembrano rappresentare il
rischio principale per la salute umana.
‣L’omoanatossina-a è un potente agente bloccante
neuromuscolare.
‣L’anatossina-a(s) inibisce l’attività
dell’acetilcolinesterasi ma solo nel sistema nervoso
periferico.

Tossicocinetica
Studi di tossicità orale acuta indicano che ATX-a è
rapidamente assorbita dal tratto gastrointestinale
con successivi segni di neurotossicità (perdita di
coordinazione, spasmi muscolari e morte per
paralisi respiratoria)
L’ATX-a causa la morte nel tempo di pochi minuti
ad alcune ore (a seconda della specie e dalla dose
di tossina ingerita
Non si hanno dati sulla distribuzione,
metabolismo ed escrezione

Tossicità acuta
‣ LD 50 orale: varia da 1 a 10 mg/Kg pc a seconda della specie
‣ LD 50 - topo-ip: 250 µg/kg pc (dose più bassa che causa la morte)
‣ 375 µg/kg pc
‣

Le endotossine LPS
Componenti delle membrane cellulari dei cianobatteri e dei batteri gram-negativi. Le
differenze nella subunità esterna (Antigene O) nei batteri causano la specificità
serologica; anche il lipide A è variabile. Le LPS dei cianobatteri differiscono
leggermente da quelle batteriche e contengono fosfati nelle catene esterne

Le endotossine LPS
• Associazione tossine LPS con effetti topici (irritazione di pelle, occhi,
mucose, e gastroenteriti) o reazioni allergiche/ infiammatorie mai
dimostrata sperimentalmente, solo ipotizzata in analogia agli effetti
dovuti alle LPS dei batteri Gram-negativi
• Il lipide A è responsabile della tossicità e la sua variabilità
determina il livello di tossicità (da nullo ad alto)
• La struttura del Lipide A dei cianobatteri non nota perciò non è
possibile trarre conclusioni sul grado di tossicità. Possibile
presenza e/o sinergia di fattori eziologici diversi e concorrenti.
Risultati test sensibilizzazione cutanea indicano che estratti
inducono gradi indipendentemente dalla produzione altre
cianotossine Torokne et al., 2001)
• Risultati di test di sensibilizzazione cutanea indicano che estratti di
cianobatteri inducono diversi gradi di sensibilizzazione
indipendentemente dalla produzione di altre cianotossine (Torokne et
al., 2001)
• Durante bloom di cianobatteri si formano molti altri composti organici
(aldeidi, chetoni e terpenoidi) che si dissolvono in acqua, hanno una
certa volatilità e spesso sono dotati di attività irritante e sensibilizzante.

• Indicate come responsabili di dermatiti da contatto
(swimmer’s itch), gastriti, ulcerazioni della mucosa
buccale e della lingua, irritazione e danni gravi alla
mucosa g.i., diarrea, mal di testa e febbre)

Le cianotossine nell’acqua
potabile
Le cianotossine possono contaminare l’acqua potabile
quando siano utilizzate come fonti di
approvvigionamento acque contenenti cianobatteri. I
livelli dipendono strettamente dall’entità della loro
presenza nelle acque grezze e dall’efficienza dei
metodi utilizzati per il trattamento e dalla loro
efficacia

MC-LR e acqua potabile
Si stima che l’80% della ingestione totale di MC-LR
avvenga attraverso il consumo di acqua potabile: AF=0,8
Consumo giornaliero: si assume che sia 2L al giorno per
un adulto di 60Kg di peso
Il per l’acqua potabile
* TDI- tolerable daily intake