Isolamento ed identificazione dei ceppi - Sezione di Microbiologia

Isolamento ed identificazione 

Isolamento ed 

identificazione dei 

ceppi 

Prima di poter procedere con 

l’identificazione della specie 

microbica responsabile di una 

determinata patologia è necessario 

ottenere una coltura pura della 

specie in questione, occorre cioè 

effettuarne l’isolamento. 

l 

Isolamento 


Lo studio microbiologico di un 

qualsiasi campione biologico è 

destinato al successo solo se le 

cellule batteriche vengono fatte 

sviluppare separatamente, isolate. 

Sul terreno solido i batteri sono 

immobilizzati, cosicchè le cellule derivate 

da ciascuna delle cellule madri 

originariamente presenti nel campione 

seminato non sono in grado di 

allontanarsene, ma rimangono in stretto 

contatto le une con le altre 

organizzandosi in una struttura visibile ad 

occhio nudo, la colonia batterica. 

1

Colonia batterica 

Una colonia batterica risulta 

costituita da milioni di cellule 

batteriche (10 6 -10 

7 ), derivate dalla 

medesima cellula progenitrice e 

dotate di identiche proprietà 

biologiche 

Isolamento primario 

Il fine dell’isolamento primario è quello di ottenere 

colonie ben separate tra loro diluendo il materiale 

biologico in modo tale da permettere che almeno 

alcune cellule batteriche risultino, sulla superficie 

dell’agar 

ben distanziate le une dalle altre e si 

originino quindi colonie ben isolate. 

Durante questi passaggi è necessario lavorare in 

condizioni di assoluta sterilità, , avendo riguardo di 

non contaminare il nostro campione, rischiando così 

di inficiare i risultati. 

Semina su terreno solido 

• Si utilizza un’ansa in nichel o platino sterilizzata 

su fiamma. 

• Il primo inoculo si può effettuare con un tampone 

o un ansa. 

• Poi si procede a distribuire il materiale con l’ansa l 

in 4 passaggi successivi ruotando la piastra di 90°, 

ad ogni passaggio si sterilizza l’ansa l 

sulla fiamma 

di un bunsen. 

• In questo modo l’inoculo l 

si diluisce sulla superficie 

dell’agar 

e si ottengono colonie ben isolate che si 

possono passare su terreni differenziali per 

ottenere colture pure e successiva 

identificazione. 

E.coli 


P.aeruginosa 

2

Identificazione 

Avviene in 2 fasi: 

‣esame microscopico (colorazione di 

Gram); 

‣esame colturale (semina su terreni 

selettivi o indicatori). 

Esame microscopico 

Una volta ottenuta la colonia pura si 

allestisce con questa un vetrino colorato 

secondo la colorazione di Gram. . Questa 

permetterà di determinare a quale 

categoria appartiene la specie in esame 

(Gram+ 

e Gram-). Inoltre permette di 

determinare le principali caratteristiche 

morfologiche del batterio, in part. la 

forma (cocco o bacillo). 

Esame colturale 

L’appartenenza al gruppo dei Gram+ 

o 

Gram- può essere verificato anche 

tramite semina su terreno solido 

indicatore McConkey Agar, che contiene 

un’alta concentrazione di sali biliari e 

cristalvioletto, , in grado di inibire la 

crescita dei Gram+ (parete cellulare) e 

permettere solo quella dei Gram-. 

Prove biochimiche 

Per identificare le varie specie si 

utilizzano delle prove biochimiche. 

‣Si ricerca nel ceppo in esame una ben 

definita attività metabolica che permette al 

microrganismo di utilizzare per i propri fini 

plastici ed energetici un ben definito 

substrato (zucchero, proteina, aminoacido, 

lipide, acido organico). 

3


In linea generale l’assenza l 

o presenza nel 

ceppo batterico di una determinata 

attività metabolica viene evidenziata 

mettendo in contatto una sospensione 

delle cellule con il substrato in esame. 

Dopo un idoneo periodo di incubazione a 

37°C, onde permettere agli enzimi 

batterici di attaccare il substrato, si 

esamina la miscela substrato-batteri. 

batteri. 


Lettura dei risultati 

Risultato negativo 

Se il microrganismo non possiede gli enzimi 

capaci di degradare il substrato, la molecola 

rimane integra e le condizioni chimico- 

fisiche della miscela al termine 

dell’incubazione rimangono identiche a quelle 

esistenti all’inizio del periodo di incubazione. 


Lettura dei risultati 

Risultato positivo 

Se il microrganismo è attivo nei confronti del 

substrato, la molecola viene scissa in composti 

semplici più acidi o più alcalini del substrato di 

partenza. Lo stato chimico-fisico della miscela 

dopo l’incubazione l 

differisce da quello iniziale. 

Un adatto indicatore di pH testimonia con la 

variazione del proprio colore il cambiamento 

della miscela. 


Nella maggior parte dei casi lo studio di 

una sola attività metabolica non permette 

di discriminare tutte le specie all’interno 

di una famiglia. Di solito sono necessarie 

più 

attività metaboliche. Il tutto 

ovviamente sarebbe molto laborioso, se 

non esistessero dei sistemi prodotti 

industrialmente. Si tratta dei sistemi 

API. 

4


Sistema API 

• E’ un sistema biochimico prodotto industrialmente dove 

le reazioni tra la miscela ed il substrato avvengono in 

delle piccole provette (microprovette). Questo 

permette di potere studiare più attività enzimatiche 

(fino a 20) in poco spazio. 

• I risultati vengono letti mediante un opportuno 

software. 

• Esistono diversi sistemi API, a seconda delle attività 

metaboliche ricercate, che a sua volta dipendono dalla 

famiglia di appartenenza del batterio che vogliamo 

studiare (API 20 E, API 20 NE, API Strep, , ecc...). 


Sistema API 


Bacilli Gram negativi 

E.coli: microscopio elettronico 

E.coli: microscopio ottico (colorazione di Gram) 

5


Bacilli Gram negativi 

Test della ossidasi 

Si impiegano come substrati monocloroidrato 

di 

paradimetillanilina o dicloroidrato 

di 

tetrametil 

parafenilendiamina. . Su carta da filtro viene 

depositata una goccia di substrato. L’eventuale 

L 

attività 

enzimatica viene evidenziata tramite la 

formazione di un prodotto di colore violaceo entro 

pochi secondi. 

I batteri che danno reazione positiva appartengono 

alla famiglia delle Non Enterobacteriaceae, , quelli che 

danno reazione negativa alle Enterobacteriaceae. 


Bacilli Gram negativi: Enterobacteriaceae 

‣ Bacilli Gram-negativi 

negativi; 

‣ asporigeni; 

‣ mobili per ciglia peritriche o immobili; 

‣ provvisti di pili; 

‣ aerobi o anaerobi facoltativi; 

‣ ossidasi-negativi. 



Crescono su qualsiasi tipo di terreno. Di 

solito si utilizza il terreno indicatore 

McConkey Agar, che permette di 

distinguere le specie che fermentano il 

lattosio 

( (E.coli)) da quelle che non lo 

fermentano (la maggior parte degli 

Enterobatteri patogeni). Vengono incubate a 

37°C C in atmosfera aerobia. 



Il terreno McConkey Agar contiene uno zucchero, 

il lattosio, che può essere fermentato da quei 

batteri che hanno gli enzimi idonei. La sua 

fermentazione produce acido lattico, che 

determinerà acidificazione del terreno. In 

presenza di un opportuno indicatore di pH (rosso 

neutro) si avrà il viraggio delle colonie produttrici 

dal colore bianco al rosso. 

6





Per identificare le varie specie all’interno 

della famiglia si ricorre al sistema API 20E. 

Questo sistema è dotato di 20 gallerie, per 

cui saggia 20 attività metaboliche. Dopo 18- 

24 ore di incubazione a 37°C è possibile 

leggere il risultato. 

E.coli su McConkey Agar 

API 20E 


Bacilli Gram negativi: non Enterobacteriaceae o 

batteri non fermentanti 

Vengono definiti anche non fermentanti perché non 

sono in grado di fermentare gli zuccheri. Sono: 

‣ bastoncelli diritti o incurvati, lunghi da 1.5 a 3 µm; 

‣ mobili (uno o più flagelli polari); 

‣ isolati o a coppie o in brevi catene; 


‣ catalasi-positivi 

positivi; 

‣ ossidasi-positivi o negativi; 

‣ aerobi. 


Bacilli Gram negativi: non Enterobacteriaceae 

o batteri non fermentanti 

Crescono su qualsiasi terreno. Vengono incubate 

a 37°C C in condizioni aerobie. . Per identificare le 

varie specie all’interno della famiglia si ricorre 

al sistema API 20NE. Anche questo sistema è 

dotato di 20 gallerie, per cui saggia 20 attività 

metaboliche. Dopo 18-24 ore di incubazione a 

37°C è possibile leggere il risultato. 

7


Bacilli Gram negativi: non Enterobacteriaceae 

o batteri non fermentanti 


Bacilli Gram negativi: non Enterobacteriaceae o 

batteri non fermentanti 

P.aeruginosa 

su Agar sangue 

A.baumannii 

API 20NE 


Bacilli Gram negativi: Haemophilus spp. 

Cresce su Agar Cioccolato (10% sangue di montone 

emolizzato). Viene incubato a 37°C C in presenza di 5% 

CO 2 

. Questo terreno è la sorgente di due fattori che 

questo gruppo di batteri non è in grado di 

sintetizzare: 

‣Fattore X, termostabile (gruppo eme necessario alla 

sintesi degli enzimi eminici); 

‣Fattore V, termolabile (NAD). 

Alternativamente può essere seminato su terreno 

TSA (Tryptic Soy Agar) addizionato dei fattori X +V. 



Caratteri differenziali degli emofili 

Ceppo 

H.influenzae 

H.parainfluenzae 

H.ducrey 

H.aegyptius 

H.haemolyticus 

Fattore 

X 

+ 

- 

+ 

+ 

+ 

Fattore 

V 

+ 

+ 

- 

+ 

+ 

Emolisi 

- 

- 

+ 

- 

+ 

8



Per identificare le varie specie all’interno 

del genere si ricorre al sistema API NH. 

Questo sistema è dotato di 10 gallerie, per 

il saggio di 13 attività metaboliche. Dopo 2 

ore di incubazione a 37°C è possibile 

leggere il risultato. 



H.influenzae 

API NH 


Cocchi Gram negativi: Neisseria spp. . e 

Moraxella spp. 

‣Cocchi 

Gram-negativi 

negativi; 

‣disposte in coppie; 

‣aerobi-anaerobi anaerobi facoltativi; 

‣immobili; 

‣asporigeni; 

‣spesso capsulati; 

‣catalasi-positivi; 

‣ossidasi-positivi. 


Cocchi Gram negativi: Neisseria spp.e 

Moraxella spp. 

Crescono su Agar Cioccolato (10% sangue di 

montone emolizzato) ) o su Agar ascite. Vengono 

incubata a 37°C C in presenza di 5% CO 2 . Per 

identificare le varie specie all’interno della 

famiglia si ricorre al sistema API NH. Questo 

sistema è dotato di 10 gallerie, per cui saggia 13 

attività metaboliche. Dopo 2 ore di incubazione a 

37°C è possibile leggere il risultato. 

9


Cocchi Gram negativi: Neisseria spp. 

A 

N.gonorrhoeae 

B 


Cocchi Gram positivi 

Test della catalasi 

Si sfrutta la capacità di alcuni batteri di 

metabolizzare il substrato H 2 

O 2 

, tramite questo 

enzima, che porta alla produzione di O 2 

. La reazione 

viene eseguita su vetrino, dove viene posta una goccia 

di H 2 

O 2 

3% e su questa viene stemperata una colonia. 

Una reazione positiva si osserva se viene prodotta 

effervescenza. I batteri che danno reazione positiva 

appartengono alla famiglia degli Stafilococchi, quelli 

che danno reazione negativa a quella degli 

Streptococchi. 

Microscopio elettronico (A) ed ottico (colorazione di Gram) (B) 


Cocchi Gram positivi catalasi-positivi 

S.aureus: microscopio ottico (colorazione di Gram) 


Cocchi Gram positivi: Staphylococcus spp. 

‣Cocchi 

Gram-positivi 

positivi; 

‣di forma sferica; 

‣riuniti in ammassi irregolari, dall’aspetto aspetto di 

grappoli, del diametro di 0.8-1 µm; 

‣immobili; 

‣privi di capsula evidente; 

‣asporigeni. 

S.aureus: microscopio elettronico 

10



Cocchi Gram positivi: Staphylococcus spp. 

Crescono su ogni tipo di terreno, escluso McConkey 

Agar. Su terreni di Agar sangue si nota un’evidente 

emolisi. Vengono incubati a 37°C C in ambiente aerobio. 

Per essere sicuri di essere in presenza di questa 

specie si può addizionare il normale terreno di 

coltura con NaCl 7.5%, che permette la crescita 

soltanto degli Stafilococchi, che tollerano una lieve 

salinità del mezzo. 

Cocchi Gram positivi: Staphylococcus aureus 

Si può riconoscere tramite semina su terreno 

contenente NaCl 7.5% (che è ben tollerato a questa 

concentrazione da S.aureus) ) o su terreno contenente 

mannite (Mannitol( 

Salt Agar), zucchero fermentato 

da S.aureus 

e non da S.epidermidis. 

Le colonie 

appaiono circondate da un alone giallo dovuto al 

viraggio di un indicatore di pH (rosso fenolo) dovuto 

alla produzione di acidi, che acidificano il terreno. Su 

terreni normali la maggior parte dei ceppi assume 

una colorazione gialla. 




Test della coagulasi 

Si tratta di un enzima in grado di catalizzare la 

trsformazione del fibrinogeno in fibrina. 

S.aureus produce 2 tipi di coagulasi: una legata 

alle cellule ed una solubile, espulsa nello spazio 

extracellulare. Gli altri stafilococchi invece non 

ne producono. 



Coagulasi legata alle cellule 

Su vetrino si stempera una colonia di 

stafilococco in esame su una goccia di sangue. 

L’eventuale reazione positiva si evidenzia 

mediante il fenomeno dell’agglutinazione: si 

formano piccoli fiocchi di plasma coagulato. 

11






Coagulasi solubile 

In una provetta si mescola una piccola 

quantità (0.5 ml) di una brodocoltura dello 

stafilococco in esame con 1 o 2 ml di plasma 

citratato e si incuba a 37°C C per 3 ore. Dopo 

tale periodo si produce un evidente coagulo, 

se si tratta di S.aureus. S.aureus 

S.aureus su Agar sangue 

S.aureus su Mannitol Salt Agar 


Cocchi Gram positivi: Staphylococcus 

spp. 

Per identificare le varie specie all’interno del 

genere si ricorre al sistema API Staph. . Questo 

sistema è dotato di 20 gallerie, per cui saggia 20 

attività metaboliche. Dopo 18-24 ore di 

incubazione a 37°C è possibile leggere il 

risultato. 


positivi: Staphylococcus spp 

Cocchi Gram positivi: 

spp. 

S.epidermidis su Mannitol Salt Agar 

S.epidermidis su Agar sangue 

S.haemolyticus su Agar sangue 

12



Cocchi Gram positivi: Micrococcus spp. 

Sono anche loro rotondeggianti riunite per lo 

più a grappolo. 

Si differenziano dagli stafilococchi per la 

loro incapacità do fermentare il glucosio in 

condizioni anaerobie. Per identificare le varie 

specie all’interno della famiglia si ricorre al 

sistema API Staph. 

Cocchi Gram positivi: Micrococcus spp. 

Micrococcus spp. 


Cocchi Gram positivi catalasi-negativi 

Streptococcus spp.: microscopio ottico 

(colorazione di Gram) 

Streptococcus spp.: microscopio elettronico 


Cocchi Gram positivi: Streptococcus spp. 

‣Cocchi 

Gram-positivi 

positivi; 

‣sferici, con diametro di 1-1.51 

1.5 µm, disposti in 

coppie o catenelle. 

‣capsulati; 

‣immobili; 

‣asporigeni; 

‣ossidasi-negativi; 

‣catalasi-negativi; 

‣aerobi-anaerobi anaerobi facoltativi. 

13


Cocchi Gram positivi: Streptococcus 

pneumoniae 

E’ agente 

eziologico di molte malattie 

dell’apparato respiratorio. Cresce su Agar 

Sangue (5% sangue di montone). Viene 

incubato a 37°C C in presenza di 5% CO 2 

preferibilmente, ma cresce anche in 

atmosfera aerobia. . Su questo terreno è 

possibile osservare un’emolisi parziale del 

sangue (di tipo α). 


Cocchi Gram positivi: Streptococcus pneumoniae 

Test della sensibilità all’optochina 

Permette di distinguerli dagli Streptococchi 

viridanti, , che presentano lo stesso tipo di emolisi. 

Si pone un disco impregnato di optochina su una 

piastra di Agar Sangue e si semina il ceppo in esame. 

Si incuba a 37°C C in 5% CO 2 

per 24 ore. Se si è in 

presenza di pneumococco si osserverà intorno al 

disco un alone di inibizione (>14( 

14 mm). 



pneumoniae 

Test della sensibilità all’optochina 


Cocchi Gram positivi: Streptococcus pneumoniae 

Test della solubilità in sali biliari 

Optochina 

S.pneumoniae 

In presenza di sali biliari i pneumococchi lisano 

rapidamente. 

Si prepara una sospensione dei batteri in questione 

in sodio desossicolato (0.05%) ed un’altra in 

soluzione fisiologica (come controllo). 

Si incubano a 37°C C in ambiente aerobio per 2 ore. Se 

si è in presenza di S.pneumoniae si osserverà che la 

sospensione in sali biliari è diventata limpida, mentre 

l’altra 

è rimasta torbida. 

14




pneumoniae 

Test sierologico 

Si fa l’agglutinazione l 

con Omniserum, , ossia un 

siero polivalente in grado di agglutinare tutti i 

tipi di pneumococchi. 


pyogenes 

E’ agente eziologico della faringite. Cresce su 

Agar Sangue (5% sangue di montone). Viene 

incubato a 37°C C in presenza di 5% CO 2 

preferibilmente, ma cresce anche in 

atmosfera aerobia. . Su questo terreno è 

possibile osservare un’emolisi totale (di tipo 

β). 



pyogenes 

Test della sensibilità alla bacitracina 


Cocchi Gram positivi: Streptococcus pyogenes 

Test della sensibilità alla bacitracina 

Si pone un disco impregnato di bacitracina su 

una piastra di Agar Sangue e si semina il 

ceppo in esame. Si incuba a 37°C C in 5% CO 2 

per 24 ore. Se si è in presenza di 

Streptococcus pyogenes si osserverà intorno 

al disco un alone di inibizione. 

Bacitracina 

S.pyogenes 

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Cocchi Gram positivi: Streptococcus pyogenes 

Test della identificazione dell’antigene 

polisaccaridico 

C 

Si esegue mediante la metodica di Lancefield. . Si 

utilizza una subcoltura cresciuta in terreno liquido o 

poche colonie. La positività della reazione è 

evidenziabile con la presenza di agglutinazione nei 

confronti di uno dei sieri utilizzati. Esistono 6 sieri 

(A, B, C, D, F, G) corrispondenti ai rispettivi gruppi. 

Streptococcus pyogenes reagisce con il siero A, per 

cui possiede l’antigene l 

polisaccaridico di gruppo A. 

Permette un’identificazione molto 

rapida (circa mezz’ora) rispetto ai 

metodi colturali (18-24 ore). 


Cocchi Gram positivi: Streptococchi di 

gruppo B 

Non presentano emolisi, solo raramente 

presentano emolisi β. . Sono caratterizzati 

dal possesso dell’antigene 


di gruppo B ( (Streptococcus 

agalactiae). 


Cocchi Gram positivi: Streptococchi di 

gruppo B 


Cocchi Gram positivi: Enterococchi 

S.agalactiae 

Enterococcus spp. 

S.pyogenes 

Appartengono al genere Streptococcus. 

Non presentano emolisi, solo raramente 

presentano emolisi β. . Sono caratterizzati 

dal possesso dell’antigene 


di gruppo D. Si ritrovano costantemente 

nel materiale fecale dei vertebrati. 

16



E’ possibile differenziare le 2 specie 

principali di enterococchi che infettano 

l’uomo: 

E.faecalis 

ed E.faecium, , tramite la 

semina su un terreno selettivo contenente 

tellurito di potassio 0.04%. Le colonie di 

E.faecalis 

appaiono di colore nero, quelle 

di E.faecium 

bianche. 



E.faecalis 


Cocchi Gram positivi: Streptococcus spp. 


genere si ricorre al sistema API 20 Strep. 

Questo sistema è dotato di 20 gallerie, per cui 

saggia 20 attività metaboliche. Dopo 18-24 ore 

di incubazione a 37°C è possibile leggere il 

risultato. Oppure si può utilizzare il sistema 

Rapid ID 32 Strep, , che è dotato di 32 gallerie. E’ E 

più rapido del precedente, perché necessita di 

una incubazione a 37°C C di solo 4 ore. 


Bacilli Gram positivi: Corynebacterium 

spp. 

‣ Bacilli Gram-positivi 

positivi; 

‣ di lunghezza variabile nelle varie specie (da 1 a 5 

µm); 

‣ spesso assumono forma di clava; 

‣ Gram-positivi o Gram- variabili; 

‣ presentano un aggruppamento a “lettere cinesi”; 

‣ sprovvisti di capsula; 


‣ immobili. 

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Bacilli Gram positivi: Corynebacterium spp. 


genere si ricorre al sistema API Coryne. . Questo 

sistema è dotato di 20 gallerie, per cui saggia 

20 attività metaboliche. Dopo 18-24 ore di 

incubazione a 37°C è 

possibile leggere il risultato. 


Bacilli Gram positivi: Corynebacterium spp. 

Corynebacterium spp.: 

microscopio ottico 

Corynebacterium spp.: 

microscopio elettronico 


Anaerobi 

Per identificare le varie specie si ricorre 

al sistema API 20 A. Questo sistema è 

dotato di 20 gallerie, per cui saggia 20 

attività metaboliche. Dopo 18-24 ore di 

incubazione a 37°C C in ambiente anaerobio è 

possibile leggere il risultato. 

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Isolamento ed identificazione dei ceppi - Sezione di Microbiologia

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