Anti TRANSGLUTAMINASI IgG EIA WELL R REF - Radim S.p.A.

Anti TRANSGLUTAMINASI IgG
R REF K10TG
EIA WELL
Italiano p. 3
English p. 12
96
M412 – Rev.1 – 04/2008 – Pag. 1/24

REAGENTI DEL KIT - KIT REAGENTS
Reag. Quant. Stato fisico,
Physical state
MTP 1 x 96
Pronti per l'uso
Ready for use
WASH 1 x 50 mL Conc.
DIL 1 x 100 mL
CAL 5 x 2 mL
CONJ 1 x 14 mL
CTR 2 x 2 mL
TMB 2 x 15 mL
STOP 1 x 14 mL
Pronto per l'uso
Ready for use
Pronti per l'uso
Ready for use
Pronto per l'uso
Ready for use
Pronti per l'uso
Ready for use
Pronto per l'uso
Ready for use
Pronto per l'uso
Ready for use
"Le Istruzioni per l'uso tradotte nelle altre lingue di interesse sono consultabili sul sito
Internet all'indirizzo www.radim.com".
“The instructions for use available in the other languages of interest can be viewed on our
website www.radim.com".
“Οι οδηγίες χρήσης μεταφρασμένες στις άλλες ενδιαφερόμενες γλώσσες όπως επίσης στην
ηλεκτρονική διεύθυνση www.radim.com".
“In den anderen Sprachen von Interesse ist die Bedienungsanleitung kann auf der Website
unter der Adresse www.radim.com konsultiertwerden”.
"Le mode d’emploi dans les autres langues intéressées est consultable sur le site Internet à
l'adresse www.radim.com”.
“Las instrucciones de uso traducidas en los otros idiomas de interés se pueden consultar en
nuestro sitio Internet www.radim.com”.
"As instruções de uso traduzidas nos outros idiomas de interesse podem ser consultadas
no nosso site Internet, ao endereço www.radim.com."
K10TG - Anti-Transglutaminasi IgG EIA WELL
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DOSAGGIO IMMUNOENZIMATICO PER LA DETERMINAZIONE
QUANTITATIVA DEGLI ANTICORPI IgG ANTI-TRANSGLUTAMINASI
TISSUTALE NEL SIERO O PLASMA UMANO.
PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO
1. APPLICAZIONI CLINICHE
La malattia celiaca è un’affezione cronica caratterizzata sul piano clinico da una
gamma estremamente variabile di disturbi digestivi (malassorbimento intestinale,
diarrea), da ritardo della crescita e a volte da dermatite erpetiforme.
A livello anatomo-patologico, la malattia è accompagnata da atrofia dei villi della
mucosa dell’intestino tenue, ipertrofia delle cripte ed ipercellularità della mucosa.
Come conseguenza del malassorbimento intestinale possono manifestarsi stati di
deplezione di fattori nutritivi, causa ad esempio di anemia, dovuta a carenza di
acido folico e vitamina B12. Inoltre individui con celiachia da lungo tempo,
presentano un rischio elevato di sviluppare il linfoma delle cellule T.
La frequenza delle malattia celiaca in Italia ed in Europa è stata stimata essere
pari a 1/200-1/300 su un’ampia casistica di popolazione pediatrica. Tale incidenza
risulta essere più elevata nella sindrome di Down e nel diabete giovanile insulinodipendente.
La malattia celiaca si instaura a seguito di una intolleranza, mediata
da meccanismi immunologici, nei confronti di proteine di alcuni cereali. In
particolare la gliadina, frazione proteica solubile in alcool del glutine, è
considerata la principale responsabile della tossicità della farina di grano nei
confronti della mucosa intestinale dei pazienti celiaci. Finora la determinazione di
anticorpi IgG e IgA anti-gliadina (ELISA) e la determinazione delle IgA antiendomisio
(IFA) sono state considerate i principali parametri sierologici per la
diagnosi della malattia celiaca. Nel 1977, è stato descritto da DIETERICH
l’enzima Transglutaminasi tissutale (TGA) come il principale auto-antigene
endomisiale, utilizzante la gliadina come substrato, verso cui sono diretti gli
anticorpi IgA anti-endomisio. Numerosi studi effettuati successivamente hanno
confermato l’elevata coincidenza nei celiaci di anticorpi anti-transglutaminasi di
classe IgA e IgG, determinate mediante tecniche ELISA e le IgA anti-endomisio
determinate in immunofluorescenza.
Il dosaggio degli anticorpi di classe IgG assume particolare rilevanza nei casi di
ridotta presenza di IgA, come nei bambini al di sotto dei 4 anni e nei pazienti con
deficit di IgA.
2. PRINCIPIO DEL METODO
Il presente kit è basato sul metodo immunoenzimatico (ELISA) ed utilizza come
marcatore enzimatico la perossidasi. Durante la prima incubazione, gli
autoanticorpi anti-Transglutaminasi della classe IgG, eventualmente presenti nel
siero in esame, si legano alla Transglutaminasi (ricombinante umana da
Baculovirus) adesa alla superficie dei pozzetti. Tramite lavaggio viene eliminato il
materiale non legato; in una successiva incubazione gli anticorpi anti-IgG umane,
coniugati alla perossidasi, reagiscono con il complesso precedentemente
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formatosi tra antigene ed anticorpo anti-Transglutaminasi. Dopo ulteriore
lavaggio, viene aggiunta tetrametilbenzidina (TMB) incolore che, reagendo con la
perossidasi presente, produce un composto colorato. La reazione di sviluppo del
colore è bloccata con l'aggiunta di H2SO4 e l'intensità del colore, misurata
mediante spettrofotometro a 450 nm, è direttamente proporzionale alla
concentrazione di anticorpi IgG anti-Transglutaminasi presenti nei calibratori, nei
controlli e nei campioni in esame.
3. REAGENTI CONTENUTI NEL KIT: PREPARAZIONE E STABILITA'
− I reagenti sono sufficienti per 96 pozzetti.
− Il kit deve essere conservato a 2-8°C.
− La data di scadenza di ciascun reagente è indicata sulla rispettiva etichetta.
− Una volta aperto il kit è stabile 1 mese a 2-8°C.
3.1 Reagenti Specifici
• MTP Micropiastra Sensibilizzata: 1 micropiastra da 96 pozzetti, separabili
singolarmente, sensibilizzati con Transglutaminasi ricombinante umana da
Baculovirus. I pozzetti non utilizzati devono essere conservati a 2°-8°C nella
custodia di alluminio accuratamente sigillata.
• CAL Calibratori: 5 flaconi contenenti IgG anti-Transglutaminasi in matrice
sierica, alle seguenti concentrazioni: 0, 7, 25, 50 e 100 U/mL. Conservante:
NaN3 (

4.1 Dosaggio Manuale
− Micropipette automatiche a puntali intercambiabili a volume variabile.
− Agitatore per micropiastre, regolabile a 1200 rpm.
− Cilindri graduati per la diluizione dei reattivi.
− Pompa aspirante oppure apparecchiatura automatica per il lavaggio delle
micropiastre.
− Spettrofotometro di precisione per micropiastre, con possibilità di misura in
assorbanza nell'intervallo 0-3.0 A ad una lunghezza d'onda di 450 e 405 nm.
− Carta millimetrata.
− H2O distillata.
4.2 Dosaggio Automatico
− Il dispositivo può essere utilizzato con strumentazione automatica di kit ELISA
su micropiastra.
− Si garantisce l’applicabilità su strumentazione RADIM e/o SEAC
− Qualora si utilizzi strumentazione automatica di altri fornitori, è responsabilità
dell’utilizzatore assicurarsi che il kit sia stato opportunamente validato.
5. AVVERTENZE E PRECAUZIONI
Per ottenere risultati corretti e riproducibili, è necessario osservare le
seguenti norme:
− Non mescolare i reagenti specifici (vedi 3.1) di lotti differenti.
− E’ possibile utilizzare reagenti comuni (vedi 3.2) di lotti differenti.
− Non usare i reagenti dopo la data di scadenza.
− Non esporre i reattivi e i campioni a calore intenso o a forti sorgenti di
inquinamento.
− Usare vetreria perfettamente pulita ed esente da contaminazioni di ioni
metallici o sostanze ossidanti.
− Usare acqua distillata o deionizzata, conservata in recipienti perfettamente
puliti.
− Evitare accuratamente contaminazioni tra campioni; a tal fine è consigliabile
usare pipette con puntali monouso per ogni campione e per ogni reattivo.
− Non modificare in alcun modo il Procedimento Operativo di esecuzione del
test. Eventuale non rispetto di:
• sequenza e quantità nell’aggiunta dei reattivi
• tempi e temperatura di incubazione
può dare luogo a risultati clinici errati.
− Ricostituire gli eventuali reagenti liofili secondo le modalità descritte sulle
etichette. Eventuale utilizzo di reattivi o volumi non idonei, può provocare
l’ottenimento di dati clinici non attendibili.
− In caso di procedura manuale è importante l’utilizzo di pipette calibrate e
possedere un’adeguata manualità tecnica. In particolare è essenziale una
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uona precisione nella preparazione e dispensazione dei reattivi. E’
necessario un adeguato piano di manutenzione (pulizia e calibrazione) di tale
strumentazione.
− Assicurarsi che la pompa di aspirazione oppure l’apparecchiatura automatica
per il lavaggio delle micropiastre sia perfettamente funzionante. Un lavaggio
non accurato delle micropiastre può dare luogo a misclassificazione dei
campioni. E’ necessario un adeguato piano di manutenzione di tale
strumentazione.
− Assicurarsi che lo spettrofotometro per micropiastre sia perfettamente
funzionante. L’utilizzo di uno spettrofotometro non calibrato o con filtri non
puliti, può comportare un errore nella lettura dei campioni, con conseguente
possibile misclassificazione degli stessi. E’ necessario un adeguato piano di
manutenzione (pulizia e calibrazione) di tale strumentazione.
− Assicurarsi che la stufa termostatata (se necessaria) sia perfettamente
funzionante. L’incubazione a temperature diverse da 37±2°C può dare luogo a
perdita di sensibilità e/o a denaturazione biologica dei materiali (reattivi e/o
campioni). E’ necessario un adeguato piano di manutenzione di tale
strumentazione e un controllo periodico della temperatura registrata.
− Assicurarsi che l’agitatore per micropiastre (se necessario) sia perfettamente
funzionante. L’agitazione in condizione diverse dall’atteso può dare luogo a
misclassificazione dei campioni . E’ necessario un adeguato piano di
manutenzione di tale strumentazione.
− Assicurarsi che la strumentazione utilizzata per la conservazione dei campioni
e/o del dispositivo sia perfettamente funzionante. La conservazione a
temperature diverse dall’atteso, può dare luogo a denaturazione biologica dei
materiali (reattivi e/o campioni). E’ necessario un adeguato piano di
manutenzione di tale strumentazione e un controllo periodico della
temperatura registrata.
− Utilizzare un adeguato metodo per la corretta identificazione dei campioni.
Possibili conseguenze possono essere sia la perdita di specificità del
dispositivo che risultati analitici errati.
Per evitare contaminazioni personali ed ambientali, è necessario osservare
le seguenti norme di sicurezza:
− Utilizzare guanti monouso durante la manipolazione di materiale
potenzialmente infetto e durante il dosaggio.
− Non pipettare i reagenti con la bocca.
− Non fumare, mangiare, bere o applicare cosmetici durante l'esecuzione del
dosaggio.
− Le soluzioni di Cromogeno e Reagente Bloccante vanno manipolate con
cautela. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi e le mucose. In caso di
incidente lavare abbondantemente con acqua.
− I materiali di origine umana utilizzati nella preparazione del presente kit sono
stati saggiati per la presenza di HBsAg, anti-HIV e anti-HCV e sono risultati
ripetutamente negativi. Comunque nessun test attualmente disponibile
garantisce l'assenza degli agenti virali responsabili della sindrome da
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immunodeficienza acquisita, dell'epatite B ed epatite C. Tutti i reagenti
contenenti materiale biologico e tutti i campioni di siero umano devono essere
considerati potenzialmente infettivi.
− Evitare la produzione di schizzi e la formazione di aerosol; qualora ciò si
verificasse ripulire accuratamente con ipoclorito di sodio ad una
concentrazione del 3%. Il mezzo adoperato per la pulizia deve essere trattato
come residuo potenzialmente infetto ed eliminato secondo le modalità
opportune.
− La sodio azide contenuta come conservante in alcuni reagenti, può reagire con
il piombo ed il rame delle tubature formando azidi di metallo altamente
esplosive. Per evitare l formazione e l'accumulo di tali composti far scorrere
abbondante acqua sui reagenti eliminati.
− Ai sensi del D.L. italiano n. 22 del 05.02.97, che fa riferimento alle direttive
CEE (91/156/CEE, 91/689/CEE, 94/62/CEE) tutti i rifiuti provenienti da
lavorazioni manuali e/o in automatico sono classificati rifiuti speciali pericolosi
con codice di classificazione CER 180103; devono quindi essere eliminati
affidandoli a ditte autorizzate al ritiro ed allo smaltimento.
6. RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Il dosaggio è effettuato su siero e plasma umano. Campioni fortemente lipemici o
emolizzati possono alterare i risultati. La presenza di filamenti di fibrina può
interferire nel dosaggio; assicurarsi pertanto che i campioni siano perfettamente
limpidi prima di dosarli. I campioni possono essere conservati per un periodo non
superiore ad una settimana se correttamente mantenuti a 2-8°C, a - 20°C per
tempi più lunghi. Si consiglia di non congelare e scongelare ripetutamente i
campioni.
Prima dell'uso, diluire i campioni 1:100 con il Diluente dei Campioni (es. 10 µL di
campione + 990 µL di diluente).
7. PROCEDIMENTO OPERATIVO *
− Attendere che i reagenti ed i campioni raggiungano la temperatura ambiente.
− Agitare i campioni per inversione prima dell'uso.
7.1 Preparare i pozzetti per: Bianco, Calibratori, Sieri di Controllo e Campioni.
7.2 Dispensare 100 µL di Calibratori, Sieri di Controllo e Campioni
precedentemente diluiti, nei rispettivi pozzetti.
N.B.: i Calibratori ed i Sieri di Controllo non devono essere diluiti.
7.3 Dispensare 100 µL di Diluente Campioni diluito nel pozzetto del Bianco.
7.4 Incubare per 60±5 minuti in agitazione a 1200 rpm a temperatura
ambiente (18-25°C), coprendo la micropiastra con il copripiastra adesivo
fornito nel kit.
7.5 Effettuare 4 lavaggi con un volume di 350 µL per pozzetto, impiegando la
Soluzione di Lavaggio diluita. Aspirare accuratamente il liquido da tutti i
pozzetti.
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7.6 Dispensare 100 µL di Coniugato Enzimatico in tutti i pozzetti.
7.7 Incubare per 30±2 minuti in agitazione a 1200 rpm a temperatura
ambiente (18-25°C), coprendo la micropiastra con il copripiastra adesivo
fornito nel kit.
7.8 Lavare i pozzetti come al punto 7.5.
7.9 Dispensare 100 µL di Cromogeno in tutti i pozzetti.
7.10 Incubare per 10 minuti in agitazione a 1200 rpm a temperatura ambiente
(18-25°C), al riparo dalla luce.
7.11 Dispensare 100 µL di Reagente Bloccante in tutti i pozzetti.
7.12 Leggere la densità ottica delle soluzioni a 450 nm in uno spettrofotometro
preferibilmente bicromatico con lunghezza d'onda di riferimento a 620 nm
(azzerando lo strumento con il Bianco). Nel caso di estinzione in overflow,
utilizzare la lettura spettrofotometrica a 405 nm. La lettura deve essere
effettuata entro 15 minuti dal termine del dosaggio.
* Qualora si utilizzasse nel procedimento operativo uno strumento automatico per
micropiastre RADIM e/o SEAC, far riferimento al relativo manuale.
8. SCHEMA DEL DOSAGGIO: vedi p. 22
9. CALCOLO DEI RISULTATI *
Disegnare la curva su carta millimetrata, riportando sull'asse delle ascisse le
concentrazioni dei calibratori e su quello delle ordinate l'assorbanza ottenuta per
ciascun calibratore. Interpolando sulla curva di calibrazione le assorbanze relative
ai sieri di controllo e a ciascun campione, si otterranno le corrispondenti
concentrazioni di IgG anti-Transglutaminasi, espresse in U/mL.
* Nel caso si utilizzi uno strumento automatico per micropiastre RADIM e/o SEAC,
la lettura spettrofotometrica è eseguita automaticamente a 3 lunghezze d'onda:
450, 405 e 620 nm, permettendo l'ampliamento del range di lettura.
9.1 Esempio di Calcolo
I valori sotto riportati debbono essere considerati unicamente un esempio e non
devono essere utilizzati in luogo dei dati sperimentali.
Descrizione Assorbanza 450 nm IgG
anti-
Transglutaminasi
Calibratore 0 U/mL 0.003
Calibratore 7 U/mL 0.565
Calibratore 25 U/mL 1.640
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Calibratore 50 U/mL 3.150
Calibratore 100 U/ml 5.350
Siero Controllo Negativo 0.250 3.1 U/ml
Siero Controllo Positivo 1.900 29.3 U/ml
Campione 1 0.151 1.8 U/mL
Campione 2 2.800 44.2 U/mL
Interpolando sulla curva di calibrazione, i campioni dosati risultano avere
rispettivamente un titolo di IgG anti-Tranglutaminasi di 1.80 e 44.2 U/mL.
9.2 Criteri di Accettazione
Prima di procedere al calcolo dei risultati verificare che le dosi dei controlli
rientrino nei range riportati sul Certificato di Controllo Qualità allegato al kit.
Se i valori ottenuti non rispecchiano quelli attesi, è necessario ripetere il dosaggio.
9.3 Interpretazione dei Risultati
I sieri di soggetti non celiaci presentano valori di IgG anti-Transglutaminasi
inferiori a 7 U/ml. I campioni con valori di IgG compresi tra 5-7 U/ml sono da
considerare di dubbia interpretazione e devono essere dosati nuovamente per
conferma.
Valori normali: ≤ 5 U/ml
Zona grigia: 5-7 U/ml
Valori patologici: ≥ 7 U/ml
10. CARATTERISTICHE METODOLOGICHE
10.1 Specificità Clinica
La specificità clinica del metodo è stata valutata su un campione rappresentativo
di soggetti non celiaci, risultando pari a 100%.
10.2 Sensibilità Clinica
La sensibilità clinica del metodo è stata valutata su un campione rappresentativo
di soggetti positivi agli anticorpi IgG anti-transglutaminasi, risultando pari a 95%.
10.3 Specificità Analitica
Il presente metodo analitico non ha mostrato interferenze con sieri positivi a
patologie autoimmuni sistemiche .
10.4 Sensibilità Analitica
La sensibilità analitica del metodo è definita come minima dose significativamente
distinguibile dal calibratore zero. E’ stata valutata dispensando 10 replicati del
calibratore zero e leggendo la media delle D.O.+2 D.S. sulla curva di calibrazione.
La sensibilità analitica è risultata pari a 0.24 U/ml.
10.5 Precisione
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La precisione é stata valutata misurando la variabilità intra-saggio ed inter-saggio
su 3 sieri a differenti concentrazioni di IgG anti-Tranglutaminasi.
Intra-saggio
Inter-saggio
Sieri Media
(U/ml)
D.S. C.V. Replicati
A1 14.7 1.1 7.5% 10
A2 33.2 1.7 5.0% 10
A3 39.2 2.3 5.9% 10
Sieri Media
(U/ml)
D.S. C.V. Dosaggio
A1 7.2 0.6 7.9% 12
A2 12 0.9 7.8% 12
A3 31.3 1.9 6.2% 12
10.6 Accuratezza
L’accuratezza è stata valutata effettuando prove di Parallelismo e Recupero.
Si è ritenuto indispensabile effettuare le prove su un numero vasto di campioni
considerando sia la variabilità che l’eterogeneità degli anticorpi di classe G
presente nei sieri come fattori che influenzano la risposta e la concordanza tra
atteso e misurato.
Test di Parallelismo
La prova di parallelismo è stata effettuata considerando due sieri a
concentrazione nota di anticorpi IgG anti-transglutaminasi diluiti nello Zero
standard.
Atteso Misurato %
S1 78.0
1:2 39.0 43.7 112
1:4 19.5 24.2 124
1:8 9.8 13.1 133
Atteso Misurato %
S2 44.1
1:2 22.0 28.4 129
1:4 11.0 14.9 135
1:8 5.5 6.3 114
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Test di Recupero
Il test di Recupero è stato allestito considerando due sieri a concentrazione nota
diluiti secondo un rapporto 1:2 con i punti della curva standard.
Atteso Misurato %
S1 25.0
‘+7U (1/2) 16.0 18.0 112
‘+25U (1/2) 25 24.8 99
‘+50U (1/2) 37.5 41.1 109
Atteso Misurato %
S2 7.0
‘+7U (1/2) 7.0 7.5 106
‘+25U (1/2) 16 21.1 132
‘+50U (1/2) 28.5 37.5 131
11. LIMITI DEL DOSAGGIO
Come per qualsiasi procedura analitica la diagnosi di un paziente non può essere
fatta in base al risultato di un singolo dosaggio.
I risultati ottenuti da questo metodo immunoenzimatico contribuiscono alla
diagnosi ma non ne costituiscono l’unico elemento nella pratica clinica.
12. LEGENDA SIMBOLI: vedi p. 20
ENZYME IMMUNOASSAY FOR QUANTITATIVE DETECTION OF TISSUE
TRANSGLUTAMINASE IgA ANTIBODIES IN HUMAN SERUM OR PLASMA.
1. CLINICAL APPLICATIONS
FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE ONLY
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The celiac disease is a chronic pathology, characterized by several
gastroenterological disorders (intestinal malabsorption, diarrhea), as well as
growth retardation and dermatitis herpetiformis.
Anatomically speaking, celiac disease is accompanied by villous atrophy of the
small bowel mucosa, hypertrophic crypts and also excessive amounts of mucosal
cells. The intestinal malabsorption can lead to depauperation of nutrient factors,
as anemia caused by deficiency of folic acid and vitamin B12. Moroever subjects
with celiac disease for long time have a high risk to develop the cell T lymphoma.
In Italy and in Europe the celiac disease frequency is 1/200-1/300, estimated on
wide casuistry of paediatric population. This incidence is higher in the Down
syndrome and in the juvenile-onset diabetes. The celiac disease is an intolerance
to some cereal proteins, mediated by immunological mechanisms. Particularly the
gliadin, which is an alcohol soluble proteic fraction of gluten, is the main
responsable for the wheatmeal toxicity in gluten/sensitive subjects. Up to now the
main diagnosis of celiac disease was obteined by quantitative testing of both antigliadin
IgG and IgA antibodies (ELISA) and of anti-endomysium IgA antibodies
(IFA). In 1977, DIETERICH described the tissue Transglutaminase enzyme (TGA)
as the main endomysial auto-antigen. As substrate this enzyme uses the gliadin,
which represents the target of anti-endomysium IgA antibodies. Subsequent
several studies have confirmed the high correlation between the antitransglutaminase
IgA antibodies, performed by ELISA methods, and the antiendomysium
IgA antibodies, performed by IFA methods.
Anti-Transglutaminase IgG antibodies test has significance in case of a reduce
presence of IgA such as in children under 4 years old and IgA deficit desease
2. PRINCIPLE OF THE ASSAY
This kit is based upon an enzyme immunoassay method (ELISA), where
horseradish peroxidase is used as enzyme tracer. During the first incubation, the
sample anti-Transglutaminase IgG antibodies, if any, are bound to the
Transglutaminase (human recombinant from Baculovirus) coated wells. A wash
cycle eliminates unbound material. In the incubation that follows, a second
antibody (conjugated with horseradish peroxidase) will bind to the
Transglutaminase-antigen-antibody complex. After a further wash cycle the
colorless tetramethylbenzidine (TMB) is added to the wells, where it yields a
colored compound, by reacting with the peroxidase enzyme. Color development
will be stopped by adding H2SO4.The color intensity, measured in a
spectrophotemeter at 450 nm, will thus be directly proportional to the antitransglutaminase
IgG antibody concentration in calibrators, control sera and
samples.
3. REAGENTS PROVIDED WITH THE KIT> PREPARATION AND STABILITY
− The reagents are sufficient for 96 wells.
− Store the kit at 2-8°C.
− The expiry date of each reagent is shown on the vial label.
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− Once opened the kit is stable at 2-8°C for 1 month.
3.1 Specific Reagents
• MTP Coated Microplate: 1 microplate for 96 breakable wells, coated with
human recombinant Transglutaminase from Baculovirus. Keep unused wells at
2-8°C in the provided plastic bag and accurately sealed.
• CAL Calibrators: 5 vials containing anti-Transglutaminase IgG in serum
matrix, at the following concentrations: 0, 7, 25, 50 and 100 U/mL.
Preservative: NaN3 (

− This test can be used with automatic instrument for ELISA kits on microplate.
− We guarantee its applications on RADIM and/or SEAC automatic instruments.
− While using a non RADIM or SEAC automatic instrument for microplate, it is
under end user responsibility, to make sure that it was appropriately tested for
ELISA kits.
5. WARNINGS AND PRECAUTIONS
In order to obtain correct and reproducible results, the following rules must
be observed:
− Do not mix specific reagents (see 3.1) from different lots.
− It is possible to mix common reagents (see 3.2) from different lots.
− Do not use reagents beyond their expiry date.
− Do not store or leave reagents and samples at high temperatures or areas of
possible contamination.
− Use thoroughly clean glassware, free from metal ion contamination or oxidizing
substances.
− Use distilled or deionized water, stored in perfectly clean containers.
− Carefully avoid any contamination among samples; for this purpose,
disposable tips should be used for each sample and reagent.
− Do not modify in any way the "Assay Procedure". If you not respect:
• exact incubation times and quantities adding the reagents
• incubation times and temperature
may cause incorrect clinical results.
− Reconstitute lyophilized reagents, if present, as described on the relative
labels. Any deviation in reagent use or wrong volumes, may affect the reliability
of results obtained.
− In case of manual procedure, it is important to use calibrated pipettes and
have appropriate technical manuals. Primary importance is a good precision
preparing and dispensing the reagents. Ensure that all the equipment used is
in perfect working order, has been correctly calibrated and is regularly
maintained.
− Ensure that the aspiration pump or automated well washing device is in perfect
working order. Inadequate rinsing of wells may cause an incorrect samples
classifications. Ensure that all the equipment used is in perfect working order.
− Ensure that the microplate spectrophotometer is in perfect working order. The
use of a not calibrated spectrophotometer or not clean filters may cause a
wrong reading samples with consequent incorrect samples classifications.
Ensure that all the equipment used is in perfect working order.
− Ensure that the dry heater (if necessary) is in perfect working order. The
incubation temperature different from 37±2°C may cause a sensitivity losses
and/or biological denaturation (samples and/or reagents). Ensure that the
equipment used is in perfect working order and periodically check the recorded
temperature.
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− Ensure that the microplate shaker (if necessary) is in perfect working order.
Incorrect agitation may cause wrong samples classifications. Ensure that the
equipment used is in perfect working order.
− Ensure that all the equipment used for samples storage and/or the system is in
perfect working order. The storage at different suggested temperature may
cause biological material denaturation (samples and/or reagents). Ensure that
the equipment used is in perfect working order and periodically check the
recorded temperature.
− Utilise a suitable method for the correct identification of patient samples.
Incorrect identification may cause a specificity losses of the system and wrong
clinical results.
In order to avoid personal and environmental contamination, the following
precautions must be observed:
− Use disposable gloves while handling potentially infectious material and while
performing the assay.
− Do not pipette reagents by mouth.
− Do not smoke, eat, drink or apply cosmetics during the assay.
− Chromogen and Blocking Reagent should be handled with care. Avoid contact
with skin, eyes and mucous membranes. In case of accident rinse thoroughly
with running water.
− All material of human origin used for the preparation of this kit tested negative
for HBsAg, anti-HIV and anti-HCV. Since no test at present can guarantee
complete absence of these viruses, all samples and reagents containing
biological material used for the assay must be considered potentially
infectious.
− Avoid splashing and aerosol formation; in such cases, carefully wash with a
3% sodium hypochlorite solution. Any such cleaning material must be treated
as potentially infectious and disposed of accordingly.
− Some reagents contain sodium azide as preservative; to prevent build-up of
explosive metal azides in lead and copper plumbing, reagents should be
discarded by flushing the drain with large amounts of water.
− According to Italian decree D.L. no. 22 dated 05.02.97, in compliance with
EEC directives (91/156/EEC, 91/689/EEC, 94/62/EEC), all waste products
originating from either manual and/or automated processing are classified as
hazardous special waste material (European classification code180103). As
such, they must be eliminated by delegating to special enterprises, qualified for
waste collection and disposal.
6. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION
The assay can be performed in serum or plasma samples. Highly lipemic or
hemolyzed samples may affect the results. The presence of fibrin filaments could
interfere with the assay; make sure that samples are always perfectly clear before
testing. Keep samples properly stored at 2-8°C for 1 week; for longer periods it is
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advisable to freeze samples at -20°C. Repeated freezing and thawing of samples
should be avoided.
Before use, dilute samples 1:100 with Sample Diluent (example: 10 µL sample +
990 µL Sample Diluent).
7. ASSAY PROCEDURE *
− Allow reagents and samples to warm up at room temperature.
− Mix samples by inversion before use.
7.1 Prepare the wells for: Blank, Calibrators, Controls and Samples.
7.2 Pipette 100 µL of Calibrators, Controls and diluted Samples into the
corresponding wells.
Note: Calibrators and Controls must not be diluted.
7.3 Pipette 100 µL of Sample Diluent into the Blank well.
7.4 Cover the microplate with adhesive sheet (supplied with the kit) and
incubate for 60±5 minutes at 1200 rpm at room temperature (18-25°C).
7.5 Wash the wells 4 times with 350 µL of diluted Washing Solution. Aspirate all
liquid from the wells.
7.6 Add 100 µL of Enzyme Conjugate into all wells.
7.7 Cover the microplate with adhesive sheet (supplied with the kit) and
incubate for 30±2 minutes at 1200 rpm at room temperature (18-25°C).
7.8 Wash the wells as described in point 7.5.
7.9 Pipette 100 µL of Chromogen into all wells.
7.10 Incubate the wells for 10 minutes at 1200 rpm at room temperature (18-
25°C). Avoid direct light exposure.
7.11 Pipette 100 µL of Blocking Reagent into all wells.
7.12 Read the absorbance of the wells with a preferably bichromatic
spectrophotometer at 450 nm, with reference wavelength at 620 nm (setting
the instrument at zero with the Blank well). In case of overflow absorbance
values, read at 405 nm. Reading must be completed within 15 minutes from
the end of the assay.
* While using for the procedure a RADIM and/or SEAC automatic instrument for
microplates, refer to its relative manual.
8. ASSAY SCHEME: see p. 22
9. CALCULATION OF RESULTS *
Draw a calibration curve on millimetric graph-paper, by plotting the calibrator
concentrations (x-axis) against their relative absorbances (y-axis). Corresponding
anti-Transglutaminase IgG concentrations in U/mL are obtained by interpolating
the absorbances of each sample on the calibration curve.
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* While using a RADIM and/or SEAC automatic instrument for microplates, the
spectrophotometric reading will be performed automatically at 3 different
wavelengths: 450, 405 and 620 nm, thereby allowing a wider curve range.
9.1 Calculation Example
The following values must be considered as an example and should not be used
in place of experimental data.
Description Absorbance 450 nm Anti-
Transglutaminase
IgG
Calibrator 0 U/mL 0.003
Calibrator 7 U/mL 0.565
Calibrator 25 U/mL 1.640
Calibrator 50 U/mL 3.150
Calibrator 100 U/ml 5.350
Negative Control Serum 0.250 3.1 U/ml
Positive Control Serum 1.900 29.3 U/ml
Sample 1 0.151 1.8 U/mL
Sample 2 2.800 44.2 U/mL
By interpolation, the tested sample will have an anti-Transglutaminase IgG titer of
1.80 and 44.2 U/mL.
9.2 Validation Criteria
Before proceeding in calculating the results, make sure the control concentrations
are included within the values described on the Quality Control sheet.
If the values obtained are not as expected, it will be necessary to repeat the
assay.
9.3 Interpretation of Results
Subjects samples without celiac disease show anti-Transglutaminase IgG levels
below 7 U/ml. The samples with IgG levels included in the range 5-7 U/ml should
be considered border line and should be repeated to confirm the results.
Normal values: ≤ 5 U/ml
Border line: 5-7 U/ml
Pathological
values:
≥ 7 U/ml
10. PERFORMANCES OF THE ASSAY
10.1 Clinical Specificity
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The clinical specificity of the method was evaluated on a representative group of
patients diagnosed as free from coelic disease. The result is 100%.
10.2 Clinical Sensitivity
The clinical sensitivity of the method was evaluated on a representative group of
individuals suffering from coelic disease. The result is 95%.
10.3 Analytical Specificity
This analitycal method shows no interferences with patients positive for
autoimmune disease.
10.4 Analytical Sensitivity
The analytical sensitivity is expressed as the minimal dose showing a significant
difference from the zero calibrator. It has been checked by pipetting 10 replicates
of zero calibrator and reading O.D. mean value + 2 S.D. upon the calibration
curve. This dose is 0.24 U/mL.
10.5 Precision
Precision has been evaluated determining the repeatability and the reproducibility
of the assay (intra- and inter-assay variability), on 3 sera at different anti-
Transglutaminase IgG concentrations.
Repeability (Intra-assay)
Serum Mean
(U/ml)
S.D. C.V. Replicates
A1 14.7 1.1 7.5% 10
A2 33.2 1.7 5.0% 10
A3 39.2 2.3 5.9% 10
Reproducibility (Inter-assay)
Serum Mean
(U/ml)
S.D. C.V. Assay
A1 7.2 0.6 7.9% 12
A2 12 0.9 7.8% 12
A3 31.3 1.9 6.2% 12
10.6 Accuracy
Accuracy of the method has been checked by the recovery and parallelism tests.
Recovery test
Two sera at known concentration of IgG were diluted 1:2 with the calibrators and
tested
Expected Measured %
S1 25.0
‘+7U(1/2) 16.0 18.0 112
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‘+25(1/2) 25 24.8 99
‘+50(1/2) 37.5 41.1 109
Expected Measured %
S2 7.0
‘+7U(1/2) 7.0 7.5 106
‘+25(1/2) 16 21.1 132
‘+50(1/2) 28.5 37.5 131
Parallelism test
Two sera with high IgG content were tested at different dilutions with the Zero
standard:
Expected Measured %
S1 78.0
1:2 39.0 43.7 112
1:4 19.5 24.2 124
1:8 9.8 13.1 133
Expected Measured %
S2 44.1
1:2 22.0 28.4 129
1:4 11.0 14.9 135
1:8 5.5 6.3 114
11. LIMITATION OF THE PROCEDURE
As with all diagnostic tests, a definite clinical diagnosis should not be based
on the results of a single test, but should only be made by the physician after
all clinical and laboratory findings have been evaluated
12. SYMBOLS LEGEND: see p. 20
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SIMBOLI, SYMBOLS, SYMBOLES, SÍMBOLOS, SÍMBOLOS, SYMBOLE,
ΣΥΜΒΟΛΑ, SYMBOLIT, SYMBOLER
EN 980 - EDMA
REF Codice di riferimento o di ordine / reference or order code / Référence
ou numéro de commande / referencia o número de pedido / referência
ou número da encomenda / Referenz oder Bestellnummer / κωδικός
προϊόντος ή παραγγελίας / Refarans veye sipariş numarsı / referenční
nebo objednací číslo
LOT Lotto / lot / Lot / lote / lote / charge / παρτίδα / parti / šarže
IVD
Data di scadenza / expiry date / date d’expiration / Fecha de
caducidad / Data de vencimento / Verfallsdatum / Ηµεροµηνία λήξης /
Son kullanma targhi / datum expirace
Per uso diagnostico in-vitro / For in-vitro diagnostic use / Pour
diagnostic in-vitro / Para uso diagnóstico In-vitro / aplicação do
diagnóstico In-vitro / Für den Gebrauch in der IN-VITRO-DIAGNOSTIK
/ για in vitro διαγνωστική χρήση / in –vitro diagnostik kullanım / pro
použití in-vitro
Marcatura CE secondo le direttive IVD 98/79/CE / CE marking
according to IVD guidelines 98/79/EC / marquage CE conforme aux
directives IVD 98/79/EC / marcado CE según directiva de IVD
98/79/CE / marcação-CE segundo a directriz-IVD 98/79/CE / CE-
Markierung bei Erfüllung der IVD Richtlinie 98/79/EG / Σηµανση CE
βάσει κοινοτικής οδηγίας IVD 98/79/EC / 98/79/EC IVD tüzüğüne göre
CE işareti / CE označení dle IVD 98/79/EU
Conservare a 2-8°C / keep at 2-8°C / conserver à 2-8°C / Conservar a
2-8°C / conservar a 2-8°C / Lagerung bei 2-8°C / φύλαξη στους 2-8°C
/ 2-8°C da saklayınız / skladovat při 2-8°C
Fabbricante / Manufacturer / Fabriquant / produzido por / Fabricante /
produkt der / κατασκευάζεται από / tarafından üretilmiştir / výrobce
Rischio biologico / Biohazard / Risque Biologique / Riesgo Biológico /
Risco Biológico / Bιολογικός κίνδυνος / Riziko tehlike biyolojik/
Biologicky nebezpečné
Consultare la metodica operativa / consult instructions for use /
consulter le mode opératoire / consultar las instrucciones de uso /
consultar as instruções de uso / Schauen Sie die Arbeitsanleitung an /
συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης / kullanımda başvurulacak bilgiler /
Sledujte návod k použití
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96
RDATE
RCNS
H2O
Sufficiente per 96 test / sufficient for 96 tests / suffisant pour 96
déterminations / suficiente para 96 determinaciones / Componentes
para 96 testes / genügend für 96 Tests / επαρκεί για 96 τεστ / 96 test
için yeterli / dostačující pro 96 testů
Data di Riferimento / Reference date / Date de référence / Fecha de
referencia / Data de refêrencia / Referenzdatum / ημερομηνία
βαθμονόμησης / Referans Targhi / referenční datum
Ricostituire con / reconstitute with / reconstituer avec / reconstituir con
/ reconstituir com / rekonstituiren mit / ανασυστάται με / ile karıştırma /
rekonstituovat
Acqua distillata o deionizzata / deionized or distilled water / eau
deionisée ou distillée / agua destilada o desionizada / água destilada
ou deionizada / Deionisiertes oder Destilliertes Wasser / απιονισμένο -
απεσταγμένο νερό / deiyonize veya distile su / deionizovaná nebo
destilovaná voda
SCHEMA DEL DOSAGGIO-ASSAY SCHEME
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Prediluizione del campione, Sample predilution: 1/100.
Pozzetti
Wells
Bianco,
Blank
CAL
(1-5)
CTR Campioni,
Samples
Reag
CAL --- 100 µL --- ---
CTR --- --- 100 µL ---
Campioni, Samples --- --- --- 100 µL
DIL 100 µL --- --- ---
− Incubare, Incubate: T.A./R.T. 60±5 min. 1200 rpm
− Aspirare e lavare, Aspirate and wash: 4 x 350 µL.
CONJ 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL
− Incubare, Incubate: T.A./R.T. 30±2 min. 1200 rpm
− Aspirare e lavare, Aspirate and wash: 4 x 350 µL.
TMB 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL
− Incubare, Incubate: T.A./R.T. 10 min. 1200 rpm
STOP 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL
− Leggere, Read: 450-405 nm.
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