Istruzioni per l'uso ImmunoCAP ISAC Assay Kit IgG4 - Phadia

Istruzioni per l'usoImmunoCAP ISAC ® Assay Kit IgG420-01-04-1-IT

Trademarks/Marques/Varemerker/Warenzeichen/Varemaerker/Marchi depositati/Marchas registradas/Varumärken/Marcas registradasI seguenti marchi sono registrati ed appartengono a Phadia AB:ImmunoCAPI seguenti marchi sono registrati ed appartengono aPhadia Multiplexing Diagnostics GmbH:ISACI seguenti marchi sono registrati ed appartengono a CapitalBio Corporation:LuxScanRiferimenti bibliograficiConsultare pag. 12Sviluppato da:Phadia Multiplexing Diagnostics GmbH, Vienna, Austria ePhadia AB, Uppsala, SveziaPubblicato nel Febbraio 2009© Phadia AB, Uppsala, SveziaPagina 2

APPLICAZIONE CLINICAImmunoCAP ISAC IgG4 è un test in vitro per la determinazione semi-quantitativa degli anticorpiIgG4 specifici nel plasma o nel siero umano. ImmunoCAP ISAC IgG4 è destinato all'usodiagnostico in vitro in combinazione con altri dati clinici ed il suo utilizzo è rivolto ai medici ed ailaboratori clinici.SPIEGAZIONE DEL TESTLa misura degli anticorpi IgG4 specifici è stata utilizzata negli studi clinici di diverse malattieallergiche (1-13). Inoltre, gli anticorpi IgG4 specifici possono essere biomarker di esposizione agliantigeni anche in individui non allergici (14). Nel monitoraggio dell'immunoterapia con inalanti econ veleni d'imenottero, si osservano generalmente elevati livelli di anticorpi IgG4 specifici, ma nonè ancora stata dimostrata una correlazione certa con l'esito clinico (1-7). Gli anticorpi IgG4allergene specifici possono avere un ruolo nella disregolazione immunologica e nello sviluppo dellatolleranza (1-3, 9-13); tuttavia, il ruolo esatto della misura degli anticorpi IgG4 specifici nelleindagini cliniche di routine non è ancora stato stabilito.PRINCIPI DELLA PROCEDURAImmunoCAP ISAC IgG4 è un test immunologico in fase solida. Le componenti allergenicheimmobilizzate in formato di microarray su un substrato solido, vengono incubate con campioni diplasma o siero umano al fine di rilevare gli anticorpi IgG4 specifici. Il legame tra gli anticorpi IgG4specifici e le componenti allergeniche legate alla fase solida, viene rilevato grazie ad un anticorposecondario anti-IgG4 umane marcato con un composto fluorescente. Una scansione con unappropriato scanner per microarray permetterà l’acquisizione dell’immagine. Il programma MIA(Microarray Image Analysis Software) consentirà poi l’analisi dei risultati e la determinazione delleISU (ISAC Standardized Units) per IgG4 specifiche (ISU-G4).Figura 1.Sinistra in alto: Disposizione inmicroarray delle componenti allergeniche.Destra in alto: Principio del test. Lecomponenti allergeniche sonocovalentemente legate alla fase solida. Glianticorpi IgG4 allergene specifici sonorilevati grazie ad anti-IgG4 marcati influorescenza.Sinistra in basso: Immagine acquisitacon uno scanner laser per fluorescenza.Le differenti intesità si distribuiscono suuna scala di pseudo colori che va dal nero(negativo) al bianco (positivo intenso).Desta in basso: Esempio di report del kitImmunoCAP ISAC IgG4.Pagina 3

REAGENTIImmunoCAP ISAC Assay Kit IgG4 contiene i reagenti necessari per l’esecuzione del test. Ildiluente per la diluizione del campione viene fornito in un kit separato. La data di scadenza e latemperatura di conservazione sono riportate sull'etichetta esterna. Ogni componente comunque èstabile fino alla data indicata sull'etichetta specifica.Si raccomanda di non fare pool di reagenti.ImmunoCAP ISAC Assay Kit IgG4 (Cod. 81-1008-01)(per 20 determinazioni)ImmunoCAP ISAC IgG44 siti di reazione ciascunoComponent A(Tampone 20x)Tappo colore rosso; 200 mlIgG4 Detection Antibody(Anticorpo Anti IgG4 umaneconiugato con fluoroforo)Tappo colore blu; 0,5 mlIgG4 Control Serum(siero umano)Sodio azide

Altri materialiMateriali richiesti e forniti nel kit ImmunoCAP ISAC Starter Kit IgE (Cod. 81-1001-01)• Camere di lavaggio• Barrette magnetiche• Camera umidaMateriale necessario non fornito da Phadia AB:• Cilindro da 1000 ml• Acqua purificata• Agitatore magneticoY PRECAUZIONI• Per uso diagnostico in vitro. Non per uso interno o esterno su persone o animali.• Non usare i reagenti dopo la loro data di scadenza.• E’ raccomandato l’utilizzo di guanti e occhiali protettivi e l’applicazione della buona pratica dilaboratorio quando si preparano o si maneggiano reagenti e campioni.• Il kit contiene reagenti ottenuti da componenti di sangue umano. I materiali di origine biologicasono stati analizzati mediante immunoassay e sono risultati negativi per l’Antigene diSuperficie dell'epatite B e per gli anticorpi ai virus HIV1, HIV2 e al virus dell'epatite C. Siconsiglia ugualmente di osservare tutte le norme cautelari previste per la manipolazione deiderivati ematici. Fare riferimento alla pubblicazione n. (CDC) 93-8395 del HHS (Human HealthService) o ad altre linee guida locali/nazionali sulle procedure di sicurezza nei laboratori.• Attenzione! I reagenti che contengono sodio azide come conservante devono esseremaneggiati con cura. Le Schede di Sicurezza dei prodotti sono richiedibili presso Phadia.Precauzioni per l’utilizzo di ImmunoCAP ISACNon utilizzare pennarelli con inchiostro solubile in acqua o solventi organici per scrivere su bottiglie,provette o vetrini. L’inchiostro può interferire nell’analisi della fluorescenza di ImmunoCAP ISAC.Se necessario utilizzare una matita per contrassegnare i reagenti. Evitare di toccare la superficie diImmunoCAP ISAC durante tutte le fasi della reazione: prendere sempre i vetrini dai bordi.Pagina 5

PREPARAZIONE DI CAMPIONI, REAGENTI ED EQUIPAGGIAMENTOCampioniPossono essere usati campioni di siero o plasma da sangue venoso o capillare prelevato conprocedure standard. I campioni sono conservabili a 2-8° C fino a 1 settimana o a -20° C per periodipiù lunghi. Evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti. I campioni possono essere spediti atemperatura ambiente.Preparazione dei campioniPrima del dosaggio, tutti i campioni devono essere diluiti 1:50 con ImmunoCAP Specific IgA/IgGSample Diluent. Esempio di diluizione: 10 μl di campione + 490 μl di diluente per campioni. Ilcampione così diluito è stabile per una settimana se conservato a 2-8°C. Se la concentrazione dianticorpi IgG4 specifici contenuti nel campione è superiore a 12 ISU-G4, il campione può esserediluito ulteriormente.Soluzione APreparare 700 ml di Soluzione A aggiungendo 665 ml di Acqua deionizzata a 35 ml di ComponentA. Si ottiene così una diluzione 1:20 di Component A. Il volume preparato è sufficiente per 3lavaggi con 220 ml ciascuno da effettuarsi all’interno delle camere di lavaggio fornite con lo StarterKit.IgG4 Detection AntibodyLa soluzione di Detection Antibody IgG4 è pronta all'uso. Proteggere dalla luce ed evitare ilcongelamento.Camera umidaRicoprire il fondo della camera umida con tovaglioli di carta e inumidire con acqua distillata. Se nonutilizzata, rimettere sempre il coperchio per evitare l’evaporazione.Vetrini ImmunoCAP ISAC IgG4Posizionare i vetrini ImmunoCAP ISAC IgG4 nel rack rimuovibile della camera di lavaggio (fino a10 vetrini), aggiungere approssimativamente 220 ml di Soluzione A e collocare la barrettamagnetica sul fondo. Agitare per 60 minuti su un agitatore magnetico. Spostare il rack con i vetrininell’altra camera di lavaggio preventivamente riempita con circa 220 ml di acqua distillata.Agitare con un agitatore magnetico per 5 minuti. Rimuovere il rack e posizionarlo su un tovagliolodi carta per lasciarlo asciugare. Attendere finché i vetrini siano completamente asciutti. Procederecon il passaggio seguente nella preparazione del test. Eliminare tutte le soluzioni di lavaggioutilizzate fin’ora.Pagina 6

PROCEDURA DEL TEST• Posizionare i vetrini ImmunoCAP ISAC IgG4 nella camera umida con i siti di reazione rivoltiverso l'alto.• Prediluire il siero del paziente 1:50 con ImmunoCAP Specific IgA/IgG Sample Diluent. Siraccomanda di diluire almeno 10 µl di siero con 490 µl ImmunoCAP Specific IgA/IgG SampleDiluent per garantire l'accuratezza della diluizione.• Dispensare 20 μl di campione diluito in ciascun sito di reazione (ogni vetrino contiene 4 siti direazione). Posizionare delicatamente il coperchio sulla camera umida facendo attenzione anon mischiare i campioni. Si raccomanda di effettuare una calibrazione con IgG4 ControlSerum per ogni kit. L’esecuzione di una calibrazione è necessaria se sono state fatte modifichealla procedura di preparazione del test o ai parametri di scansione dei vetrini. Evitare di toccarela superficie dei vetrini con il puntale mentre si dispensano i campioni.• Incubare a temperatura ambiente per 120 minuti.• Togliere i vetrini ImmunoCAP ISAC IgG4 dalla camera umida prestando attenzione a nonmescolare i campioni. Rimuovere i sieri picchiettando il lato lungo del vetrino su un pezzo dicarta pulita e utilizzando la giusta angolatura affinché i campioni non contaminino i siti direazione adiacenti.• Lavare i vetrini ImmunoCAP ISAC IgG4 con 220 ml circa di Soluzione A per 10 minuti(utilizzare la camera di lavaggio e l’agitatore magnetico come descritto precedentemente).• Spostare il rack con i vetrini nell’altra camera di lavaggio contenente circa 220 ml di acquadistillata. Lavare per 5 minuti.• Rimuovere il rack e lasciare asciugare i vetrini ImmunoCAP ISAC IgG4 all’aria finché non sianocompletamente asciutti.• I vetrini ImmunoCAP ISAC IgG4 sono ora pronti per l’incubazione con la soluzione di IgG4Detection Antibody. Posizionare i vetrini completamente asciutti nella camera umida con i siti direazione rivolti verso l’alto.• Eliminare tutte le soluzioni di lavaggio utilizzate precedentemente.• Dispensare 20 μl della soluzione di IgG4 Detection Antibody in ogni sito di reazione del vetrino.Chiudere quindi la camera umida col suo coperchio.• Incubare a temperatura ambiente per 60 minuti, proteggendo i vetrini dalla luce.• Rimuovere delicatamente i vetrini ImmunoCAP ISAC IgG4 dalla camera umida. Rimuovere lasoluzione IgG4 Detection Antibody picchiettando il lato lungo del vetrino su un tovagliolo dicarta pulita oppure risciacquare delicatamente con acqua distillata.• Lavare i vetrini ImmunoCAP ISAC IgG4 con circa 220 ml di Soluzione A per 10 minuti(utilizzare la camera di lavaggio e l’agitatore magnetico come descritto precedentemente).• Spostare il rack con i vetrini ImmunoCAP ISAC IgG4 nell’altra camera di lavaggio contenentecirca 220 ml di acqua distillata. Lavare per 5 minuti.Pagina 7

• Eliminare tutte le soluzioni di lavaggio utilizzate precedentemente.• Lasciare asciugare i vetrini all’aria finché non siano completamente asciutti.• I vetrini ImmunoCAP ISAC IgG4 sono ora pronti per la lettura. Utilizzare uno scanner dimicroarray per l’acquisizione delle immagini o conservarli in luogo asciutto e al riparo dalla luceper successiva lettura.Parametri della proceduraVolumi per singola determinazione:Campione diluito 20 µlIgG4 Detection Antibody 20 µlSoluzione A660 mlTempo totale per un dosaggio: 5 ore.Le incubazioni vengono effettuate a temperatura ambiente.RiferimentoLa calibrazione interna di ImmunoCAP ISAC IgG4 Assay Kit viene effettuata rispetto ad una curvacalcolata tramite diluizioni seriali di un siero di riferimento e le concentrazioni di anticorpi IgG4misurate sono riportate come unità arbitrarie: ISAC Standardized Units per IgG4 (ISU-G4).Range di misura0,1 - 12 ISU-G4Controllo di QualitàRegistrazione di ogni analisi: è buona pratica di laboratorio registrare i numeri di lotto deicomponenti usati, le date in cui sono stati aperti e i volumi residui.Campioni di controllo: la buona pratica di laboratorio richiede che un controllo di qualità siaeffettuato almeno in un dosaggio per kit. Il siero di controllo per IgG4 fornito dovrebbe esseretestato ad intervalli definiti in modo da garantire una misura accurata delle ISU-G4.Pagina 8

ANALISI DEI RISULTATIAcquisizione delle immaginiPer l'analisi di ImmunoCAP ISAC IgG4 è consigliato l'uso di uno scanner laser confocale, inparticolare è raccomandato lo scanner per microarray CapitalBio LuxScan 10K.Specifiche dello scanner per microarrayDimensione vetrino26 mm × 76 mmRisoluzione di scansione 10 µmSensibilità0,1 molecole fluorescenti/μm2Range dinamico16 bitMassima area di scansione22×72 mmLunghezza d'onda laser635 nm (laser rosso)FluoroforoAlexa Fluor 647 nmFormato fileTIFF 16 bit in scala di grigiIl protocollo di scansione per i vetrini ImmunoCAP ISAC IgG4 viene approntato durantel'installazione del sistema da parte di nostro personale qualificato. In generale, le immaginidovrebbero essere acquisite utilizzando la potenza laser consigliata dal produttore dello strumento,mentre gli altri valori andranno regolati in modo da evitare segnali a saturazione (fuori range)sull’immagine acquisita.Analisi delle immaginiPer l’analisi di ImmunoCAP ISAC IgG4, si raccomanda l’uso del programma MIA (MicroarrayImage Analyzer) che viene attivato da nostro personale qualificato al momento dell’installazionedel sistema. MIA consente l’analisi automatica dei vetrini ImmunoCAP ISAC IgG4. Le immaginidigitalizzate dei vetrini vengono analizzate e i risultati ottenuti sono memorizzati in un database ostampati per la refertazione. MIA inoltre dispone di un’interfaccia che permette l’esportazione deidati al programma ImmunoCAP Information Data Manager (IDM).RisultatiImmunoCAP ISAC IgG4 è un metodo semi-quantitativo in cui gli anticorpi IgG4 allergene specificivengono misurati in unità arbitrarie, ISU-G4 (ISAC Standardized Units per IgG4).Pagina 9

Figura 2a.Esempio di scansione diun’immagine diImmunoCAP ISACOgni allergene è riportatoverticalmente in triplicato.L’immagine è visualizzatain pseudo colori perapprezzare meglio ledifferenze di intensità. Unascala lineare di pseudocolori è riportata sottol’immagine0 65.535Figura 2b.Schema di ImmunoCAPISAC.Lo schema indica leposizioni e le sigle dei 103allergeni.La disposizione e ilpannello degli allergeniposso subire modifiche.Pagina 10

LIMITI DELLA PROCEDURAUna diagnosi clinica definitiva non deve basarsi sui risultati di un solo test, ma deve essereformulata dal medico curante dopo la valutazione di tutti i parametri clinici e di laboratorio.VALORI ATTESINon è possibile interpretare dogmaticamente i risultati dei test sugli anticorpi IgG4 specifici.Nell'immunoterapia specifica (SIT) si riscontrano generalmente livelli elevati degli anticorpi IgG4specifici ma non è ancora stata dimostrata una correlazione certa con l'esito clinico (1-7). Esistonoindicazioni secondo cui l'induzione di anticorpi IgG4 può avere un ruolo nella disregolazioneimmunologica e nello sviluppo della tolleranza (13, 9-13); tuttavia, il ruolo esatto della misura deglianticorpi IgG4 specifici nelle indagini cliniche di routine non è ancora stato stabilito.CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONILimite di rilevabilità: il limite di rilevabilità (LoD) è stato determinato in accordo alle Linee GuidaCLSI EP17-A (15) per alcune componenti allergeniche rappresentative. Il limite di rilevamentogenerale è stato stimato a 0,1 ISU-G4.Precisione: la precisione è stata determinata in accordo alle Linee Guida CLSI EP5-A2 (16) peralcune componenti allergeniche rappresentative. Il CV intradosaggio ha mostrato valori fino al 15%e il CV totale fino al 25%.Specificità analitica: IgG4 Detection Antibody non reagisce con altre immunoglobuline nel sieroumano.Le prestazioni indicate sono parametri generali che possono deviare per singole componentiallergeniche. Le prestazioni sono state determinate soltanto per alcune componenti allergenicherappresentative e non possono essere applicabili a tutte le componenti allergeniche.GARANZIALe prestazioni qui riportate sono state ottenute utilizzando le procedure indicate. Ognicambiamento o modifica del procedimento operativo non raccomandato da Phadia AB può inficiareil risultato finale. In tal caso Phadia AB declina ogni responsabilità, implicita od esplicita, inclusaquella implicita di commerciabilità ed idoneità all’uso. In tale evenienza, Phadia AB ed i suoidistributori autorizzati non saranno responsabili per danni indiretti o consequenziali.Pagina 11

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AUSTRIA Phadia Austria GmbHFloridsdorfer Hauptstraße 1, AT-1210 VIENNATelefono: +43 1 270 20 20, Fax: +43 1 270 20 20 20BELGIO Phadia NV/SARaketstraat, 64 (2° piano), BE-1130 BRUXELLESTelefono: +32 2 749 55 15, Fax: +32 2 749 55 23BRASILE Phadia Diagnósticos Ltda.Rua Luigi Galvani, 70 -10° andar - conj. 101Cidade Monções - São Paulo - SP Cep: 04575-020Telefono: +55 11 3345 5050, Fax: +55 11 3345 5060DANIMARCA Phadia ApSGydevang 33, DK-3450 ALLERØDTelefono: +45 7023 3306, Fax: +45 7023 3307FINLANDIA Phadia OyRajatorpantie 41 C, FIN-01640 VANTAATelefono: +358 9 8520 2560, Fax: +358 9 8520 2565FRANCIA Phadia SASBP 610, FR-78056 ST QUENTIN YVELINES CEDEXTelefono: +33 1 6137 3430, Fax: +33 1 3064 6237GERMANIA Phadia GmbHPostfach 1050, DE-79010 FRIBURGOTelefono: +49 761 47805 0, Fax: +49 761 47805 338IRLANDA Phadia Ltd (filiale irlandese)Beaghbeg, Carrigallen, LEITRIMTelefono: +44 1908 84 70 34, Fax: +44 1908 84 75 54ITALIA Phadia S.r.l.Via Libero Temolo, 4, IT-20126 MILANOTelefono: +39 02 64 163 411, Fax: +39 02 64 163 415GIAPPONE Phadia K.K.Tokyo Opera City Tower, 3-20-2, Nishi-shinjuku Shinjuku-ku, TOKYO 163-1431Telefono: +81 3 5365 8332, Fax: +81 3 5365 8336COREA Phadia Korea Co. LTD.20 Fl, IT Mirea Tower, 60-21, Gasan-dong Geumcheon-gu, Seul 153-801Telefono: +82 2 2027 5400, Fax: +82 2 2027 5404PAESI BASSI Phadia B.V.Postbus 696, NL-3430 AR NIEUWEGEINTelefono: +31 30 602 37 00, Fax: +31 30 602 37 09NORVEGIA Phadia ASPostboks 4814, Nydalen, NO-0422 OSLOTelefono: +47 21 67 32 80, Fax: +47 21 67 32 81PORTOGALLO Phadia Sociedade Unipessoal Lda.Lagoas Park - Edifício No. 11 - Piso 0, PT-2740-270 PORTO SALVOTelefono: +351 21 423 53 50, Fax: +351 21 421 60 36SUDAFRICA Laboratory Specialities (PTY)P.O. Box 1513, Randburg 2125Telefono: +27 11 793 5337, Fax: +27 11 793 1064SPAGNA Phadia Spain SLCtra. Rubí 72-74 (Edificio Horizon), ES-08173 Sant Cugat del Vallès, BarcellonaTelefono: +34 935 765 800, Fax: +34 935 765 820SVEZIA Phadia ABMarknadsbolag Sverige, Box 6460, SE-751 37 UPPSALATelefono: +46 18 16 50 00, Fax: +46 18 16 63 24SVIZZERA Phadia AGSennweidstrasse 46, CH-6312 STEINHAUSENTelefono: +41 43 343 40 50, Fax: +41 43 343 40 51TAIWAN Phadia Taiwan Inc.8F.-1, No. 147, Sec. 2, Jianguo N. Rd., Taipei 104 Taiwan R.O.C.Telefono: +886 2 2516 0925, Fax: +886 2 2509 9756REGNO UNITO Phadia Ltd.Media House, Presley Way, Crownhill, Milton Keynes, MK8 0ESTelefono: +44 1908 769 110, Fax: +44 1908 555 561STATI UNITI Phadia US Inc.4169 Commercial Avenue, Portage, Michigan 49002Telefono: +1 800 346 4364, Fax: +1 269 492 7541ALTRI PAESI Phadia ABDistributor SalesP O Box 6460, SE-751 37 UPPSALAPagina 13

Symbols/Symboles/Symbole/Symboler/Simboli/Simbolos/Symboler/Símbolos/SimboligEhYiXDVMlHNumero di lottoRischio biologicoNumero di codiceAttenzioneConsultare le Istruzioni per l'usoContiene materiale sufficiente per testNon riutilizzareDispositivo medico diagnostico In VitroProduttoreLimite di temperaturaUtilizzato daMPhadia AB, P.O. Box 6460SE-751 37 Uppsala, SveziaTelefono: +46 18 16 50 00Fax: +46 18 14 03 58CPagina 14