Vollono Cecilia, Guarino Fabio Maria – Analisi scheletrocronologica ...

I Vertebrati ectotermidel Parco Regionale del Matese, 2002A cura di Odierna G. e Guarino F.M., pp. 163-171Analisi scheletrocronologica in alcune speciedi Anfibi e Rettili del Parco Regionale del MateseVOLLONO CECILIA, GUARINO FABIO MARIADipartimento di Biologia Evolutiva e ComparataUniversità degli Studi di Napoli Federico IIAbstractIndividual age in two species of amphibians (Rana italica, R. synklepton esculenta) andthree species of reptiles (Lacerta bilineata, Podarcis muralis, P. sicula) from the MateseRegional Park was assessed by skeletochronology. Age of the collected adults ranged fromtwo to six ys, in L. bilineata, from two to five both in P. muralis and P. sicula, from two toseven in R. italica. As far as R. synklepton esculenta concerns almost all individuals showedtwo LAGs and only two showed three LAGs, so we concluded they were 2 and 3 ys old.The skeletochronological results are correlated to the reproductive condition of eachspecimen.IntroduzioneNei vertebrati ectotermi la scheletrocronologia rappresenta uno dei metodi piùattendibili per stimare l’età degli individui e studiarne i ritmi di crescita mediantel’interpretazione delle marche che si osservano nell’osso (Castanet et al., 1993;Guarino et al., 1995; Guarino et al., 1998).Infatti, nei vertebrati ectotermi, l’alternanza di periodi di crescita e di periodi dirallentamento o di arresto di crescita si manifesta nel tessuto osseo come alternanzadi strati concentrici di differente ampiezza, diverso grado di mineralizzazione eproprietà cromofile.Di importanza fondamentale negli gli studi scheletrocronologici è l’individuazionedelle linee di arresto di crescita o LAG (lines of arrested growth). Esse rientranonella categoria delle linee ossee cementanti, sono ipermineralizzate e con unospessore molto piccolo (circa 10-15µm), appaiono intensamente cromofile rispettoalla matrice ossea circostante e con andamento generalmente concentrico. LeLAG corrispondono ad un temporaneo ma completo arresto dell’osteogenesi.Poiché nei vertebrati ectotermi terrestri di norma si ha un arresto di crescita peranno, in corrispondenza dei mesi più freddi (periodo di ibernazione), per stimarel’età di un individuo può essere sufficiente contare le LAG. Analogamente, peravere informazioni sui tassi di crescita è sufficiente calcolare la distanza che inter-

164 VOLLONO & GUARINOcorre tra due LAG successive. Tuttavia alcuni fenomeni, come la scomparsa totaledi una o più LAG in seguito a rimodellamento osseo, scarsa visualizzazione delleLAG, possono creare problemi nell’applicazione del metodo scheletrocronologico,cosicchè la scheletrocronologia deve fondarsi su una accurata conoscenza del tessutoosseo delle specie indagate e non può essere considerata un metodo di routine(Castanet & Smirina, 1990).Nel presente contributo vengono forniti i risultati di un’analisi scheletrocronologicacondotta sulle specie di Anfibi e Rettili del Parco del Matese più frequentementecampionate (vedi Guarino et al., presente volume).Materiali e metodiSono stati usati femori e falangi di individui sacrificati per le altre indagini dilaboratorio. Nel caso di esemplari catturati e liberati nuovamente in natura, lo studioscheletrocronologico è stato condotto esclusivamente sulle falangi, prelevatemediante toe-clipping (Donnelly et al., 1994) cercando di arrecare il minino disturboall’individuo. È opportuno ricordare che il prelievo della falange di norma noncausa un sensibile danno all’individuo poiché le dita, in molti Anfibi e Rettili, sonoscarsamente vascolarizzate e ricrescono dopo un tempo relativamente breve e variabilea seconda della specie. Sono stati studiati campioni ossei di due specie di Anfibi,Rana italica (5 maschi e 3 femmine) e Rana synklepton esculenta (7 maschi e 1 femmina),e tre specie di Rettili, Lacerta bilineata (6 maschi e 5 femmine), Podarcismuralis (7 maschi e 9 femmine), Podarcis sicula (5 maschi e 5 femmine).Tutti gli individui esaminati sono stati misurati con un calibro di precisione e diognuno di essi è stato determinato il sesso e la condizione riproduttiva. Femori efalangi sono stati preparati secondo un protocollo standardizzato (Guarino et al.,1998) che, in sintesi, prevedeva la fissazione degli elementi scheletrici in alcool 70°,la decalcificazione degli stessi con acido nitrico al 5%, per un tempo variabile aseconda delle dimensioni dell’osso, e l’ affettatura al criostato. Le sezioni, dello spessoredi 12µm, sono state quindi colorate con ematossilina di Herlich ed osservate almicroscopio a luce trasmessa con annesso sistema di analisi di immagine. L’osservazionedei preparati e la conta delle LAG periosteali è stata effettuata indipendentementedai due autori.La relazione esistente tra la dimensione corporea dell’individuo e il numero diLAG è stata valutata mediante analisi di regressione lineare e si è scelto un livellodi significatività P

Struttura di età negli Anfibi e Rettili del Matese 165RisultatiIn tutte le specie esaminate l’organizzazione istologica del femore e della falangesono risultate molto simili. In entrambi i tipi di osso, infatti, sono stati osservatidue strati concentrici, di cui quello più esterno (osso periosteale) scarsamentevascolarizzato e prevalentemente costituito da osso a fibre intrecciate e/opseudolamellare, talvolta (in particolare nelle aree periosteali periferiche dell’ossodegli individui di maggiori dimensioni) anche da osso lamellare. Lo strato piùinterno (osso endosteale), di norma, è apparso molto più sottile rispetto alla componenteperiosteale; in taluni casi (ad esempio nel femore di individui giovani diRana italica e di Rana synklepton esculenta) esso è risultato del tutto assente.In tutte le specie sono state osservate evidenti LAG, anche se di aspetto variabilein quanto a spessore, intensità di colorazione e decorso nella matrice ossea (Fig.1). In ogni caso, il numero e l’andamento spaziale delle LAG sono risultate coincidentinel femore e nella falange di uno stesso individuo. Nella Fig. 2 è mostratala relazione esistente tra dimensione dell’individuo e numero di LAG osservatenella falange nelle tre specie di lacertiliani: solo in L. bilineata è emersa una significativacorrelazione positiva tra le due variabili considerate. In Lacerta bilineata,il numero delle LAG è risultato compreso fra 2 e 6; in Podarcis muralis e in Podarcissicula tra 2 e 5.Per quanto riguarda gli Anfibi, in R. Italica il numero di LAG è variato da 2 a 7 enon è risultato significativamente correlato alle dimensioni dell’individuo sebbenenella maggior parte dei casi gli individui di taglia maggiore avevano anche ilmaggior numero di LAG. (Fig. 3); relativamente a R. synklepton esculenta, i setteadulti esaminati, di dimensioni nettamente diverse tra loro (da 41 a 61 mm),presentavano tutti 2 o 3 LAG e non è emersa alcuna correlazione tra la tagliacorporea e il numero di LAG.DiscussioneI risultati ottenuti nel presente studio dimostrano che la scheletrocronologiapuò essere applicata con successo per tutte le specie di Anfibi e Rettili campionatenel comprensorio del Matese. È necessario, tuttavia, prestare particolare attenzionead alcuni fenomeni quali il rimodellamento osseo, la incompleta espressionedelle marche ossee di crescita e la non evidente distinzione fra osso endosteale eperiosteale che possono generare difficoltà nelle interpretazioni scheletrocronologiche.Fenomeni di rimodellamento dell’osso periosteale in prossimità dellacavità midollare, con eventuale distruzione delle LAG periosteali più interne, sonostati osservati in tutte le specie. Comunque, è stato possibile valutare l’entità deifenomeni di rimodellamento osseo utilizzando l’approccio osteometrico propostoda vari autori (Hemelaar, 1985; Bastien & Leclair, 1992; Guarino et al., 1999)

166 VOLLONO & GUARINOFig. 1. Sezioni trasverse rappresentative di falange. a) L. bilineata, maschio di 12.4 cm di lunghezzamuso-cloaca (MC). b) P. muralis, femmina di 5.9 cm di lunghezza MC. c) P. sicula, femmina di 7.1 cmdi lunghezza MC. d) R. italica, femmina di 4.96 cm di lunghezza muso-estremità caudale dell’urostilo(SVL). e) R. synklepton esculenta, maschio di 4.90 cm di lunghezza SVL. Le frecce indicano le LAG.Tutte le fotografie sono con il medesimo ingrandimento e la barra in basso a destra corrisponde a 155µm.

Struttura di età negli Anfibi e Rettili del Matese 16776numero di LAG54321y = 0,7019x - 3,8204R 2 = 0,7422066 8 10 12 14lunghezza muso-cloaca (mm)5numero di LAG43266%610y = 0,6923x - 0,3732R 2 = 0,22053 4 5 6 7 8lunghezza muso-cloaca (mm)5numero di LAG43210y = 0,4691x + 0,5693R 2 = 0,21613 4 5 6 7 8 9lunghezza muso-cloaca (mm)Fig. 2. Relazione tra la dimensione corporea e il numero di linee di arresto di crescita (LAG) in L.bilineata (in alto), P. muralis (in mezzo) e P. sicula (in basso). Per ogni specie è riportata, in basso, l’equazionedi regressione lineare. I cerchi pieni indicano i maschi, i cerchi vuoti le femmine.

168 VOLLONO & GUARINOnumero di LAG8765432104y = 0,2821x - 10,163R 2 = 0,447235 40 45 50 55lunghezza muso-urostilo (mm)numero di LAG321y = 0,0256x + 0,9442R 2 = 0,0732035 40 45 50 55 60 65lunghezza muso-urostilo (mm)Fig. 3. Relazione tra la dimensione corporea e il numero di linee di arresto di crescita (LAG) in R. italica(in alto) e R. synklepton esculenta (in basso). Per ogni specie è riportata, in basso, l’equazione di regressionelineare. I cerchi pieni indicano i maschi, i cerchi vuoti le femmine.che consiste nella comparazione delle dimensioni delle cavità midollari e dellelinee di arresto di crescita fra gli individui giovani e adulti. Nel caso delle falangidi P. muralis e P. sicula, invece, le piccole dimensioni dell’osso e la non semprefacile distinzione fra osso endosteale e periosteale hanno creato talvolta probleminell’applicazione del metodo scheletrocronologico. In tutte le specie, raramentesono state osservate LAG supplementari o false (sensu Castanet & Smirina, 1990).In accordo con gli studi condotti su altre specie di Anfibi e Rettili delle regionitemperate (Castanet et al., 1993) possiamo ritenere che anche per le specie delParco del Matese le linee di arresto di crescita o LAG abbiano periodicità annuale

Struttura di età negli Anfibi e Rettili del Matese 169e molto probabilmente si formino in corrispondenza dei mesi invernali, durantei quali tutte le specie qui studiate vanno incontro ad un periodo di ibernazione.Conseguentemente, la conta delle LAGs ci consente di avere dati sulla longevitàmedia di alcune specie di Anfibi e Rettili del Parco del Matese. In particolare, perL. bilineata e P. muralis l’età massima riscontrata (rispettivamente 6 e 5 anni)coincide con quella emersa in altri studi scheletrocronologici (Castanet & Roche,1981; Castanet, 1994). Anche P. sicula vive in natura almeno 5 anni ed il nostrostudio fornisce i primi dati sulla longevità di questa specie. Per quanto riguardagli Anfibi, i dati ottenuti su R. italica rientrano nella longevità tipica di questoanuro (Guarino et al., 1995 a; 1995b), mentre per Rana synklepton esculenta ilnumero di LAG osservate, e quindi l’età media, è risultato basso se confrontatocon i dati noti per questa specie (Smirina, 1994). È probabile, tuttavia, che acausa delle le piccole dimensioni del campione studiato l’età massima da noi riscontrataper R. synklepton esculenta non corrisponda a quella raggiunta in naturadalla specie.Gli studi scheletrocronologici finora condotti hanno mostrato che negli Anfibi enei Rettili non sempre è possibile stabilire l’età dell’individuo in base alla suataglia corporea (Platz & Lathrop, 1993; Wake & Castanet, 1995). Infatti, nellenumerose specie in cui è stata osservata una correlazione positiva tra la dimensionee l’età dell’individuo è anche emerso che individui di dimensioni simili possonoavere età molto diverse. Nel nostro studio, solo L. bilineata, ha evidenziatouna correlazione significativa tra dimensione ed età sicchè è ragionevole concludereche per questa specie gli individui di taglie maggiori sono, di norma, anche ipiù vecchi. Nel caso delle altre specie esaminate, invece, individui con dimensioninettamente diverse hanno mostrato la medesima età. In altri Anfibi dove è statoosservato un fenomeno analogo, è stato ipotizzato che la dimensione al momentodella metamorfosi (Ryser, 1988) e tassi di crescita differenti prima delraggiungimento della maturità sessuale possono influenzare fortemente la tagliacorporea dell’adulto.L’esame istologico delle gonadi ha evidenziato che nelle tre specie di lacertilianitutti gli individui con fenotipo da adulto campionati durante la stagione degliaccoppiamenti (maggio-luglio), mostravano gameti maturi. Poiché dall’analisischeletrocronologica è emerso che i più giovani di tali individui avevano 3 LAG ècerto che sia i maschi che le femmine di L. bilineata, di P. muralis e di P. siculasono in grado di riprodursi a 3 anni. Seguendo il criterio proposto da alcuniautori (Kleineberg & Smirina, 1969), in base al quale le prime due LAG periostealipiù vicine sono in relazione con il raggiungimento della maturità sessuale, è probabilecomunque che nel caso di P. muralis e P. sicula gli individui siano sessualmentematuri già al secondo anno di vita. Per quanto concerne R. italica e R. synklepton

170 VOLLONO & GUARINOesculenta, infine, i nostri dati sull’età di raggiungimento della maturità sessualesono in accordo con quelli bibliografici (Neveu, 1992; Guarino et al., 1995a):R. italica è sessualmente matura ed in grado di accoppiarsi al secondo annodopo la metamorfosi, mentre per R. synklepton esculenta, soprattutto nel casodei maschi, la maturità sessuale è probabilmente raggiunta l’anno seguente lametamorfosi.RingraziamentiLavoro finanziato dalla Regione Campania. Esemplari catturati con autorizzazionedel 1/06/2000 n. SCN/2D/2000/9213 del Ministero dell’Ambiente.RiassuntoAttraverso il metodo scheletrocronologico è stata stimata l’età degli individui di due speciedi Anfibi (Rana italica, R. synklepton esculenta ) e tre di Rettili (Lacerta bilineata, Podarcismuralis, P. sicula), campionati in differenti siti del Parco Regionale del Matese. L’età degliadulti campionati è risultata compresa fra 2 e 6 anni in L. bilineata; 2 e 5 anni sia in P.muralis che in P. sicula; tra 2 e 7 anni in R. italica. Nel caso di Rana synklepton esculenta,quasi tutti gli individui adulti studiati, sebbene di taglia corporea nettamente diversa, hannomostrato 2 e 3 anni di età. Infine, in tutte le specie, l’età degli individui è stata messa inrelazione con la loro taglia corporea e con la loro condizione riproduttiva.BibliografiaBastien H., Leclair R., 1992 - Aging wood frogs (Rana sylvatica) by scheletochronology.J. Herpetol., 2: 222-225.Castanet J., 1994 – Age estimation and longevity in reptiles. Gerontology, 40: 174-192.Castanet J., Roche E., 1981 – Determination de l’age chez le lézard des murailles, Lacertamuralis (Laurenti, 1768) au moyen de la squelettochronologie. Rev. Suisse Zool., 1:215-226.Castanet J., Smirina E., 1990 - Introduction to the skeletocronological method inamphibians and reptiles. Ann. Sci. Nat. Zool. (Paris) serie XIII, 11: 191-196.Castanet J., Francillon-Vieillot H., Meunier F. J., de Ricqlès A., 1993 - Bone and individualaging. In B. K. Hall (ed.), Bone, Vol 7. CRC Press, Boca Raton, London, pp. 245-283.Donnelly M. A., Guyer C., Juterbock J. E., Alford R. A., 1994 - Techniques for markingamphibians. In: Measuring and Monitoring Biological Diversity. Standards Methodsfor Amphibians. Heyer R. W., Donnelly M. A., Mc Diarmind R. W., Hayek L. A.,Foster M. S. (eds). Smithsonian Institution Press, USA, pp. 277-284.Guarino F. M., Angelini F., Cammarota M., 1995a - A skeletochronological analysis ofthree syntopic amphibian species from southern Italy. Amphibia-Reptilia, 16: 297-302.Guarino F. M., Angelini F., Giacoma C., Cavallotto L., 1995b - Age determination byskeletochronology in low- and high-elevation populations of Rana italica. ScientiaHerpetologica. Llorente et al (eds.), pp. 187-191.

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