Gebrauchsinformation ImmunoCAP ISAC Assay Kit IgE ... - Phadia

20-01-02-3-CH
Gebrauchsinformation
ImmunoCAP ISAC ® Assay Kit IgE
ImmunoCAP ISAC ® Starter Kit IgE

Trademarks/Marques/Varemerker/Warenzeichen/Varemaerker/
Marchi despositati/Marchas registradas/Varumärken/Marcas registradas
Die folgenden Bezeichnungen sind registrierte Warenzeichen der Phadia AB: ImmunoCAP ® ,
ImmunoCAP ISAC ®
Die folgenden Bezeichnungen sind registrierte Warenzeichen der Phadia Multiplexing Diagnostics
GmbH:
ISAC
Die folgenden Bezeichnungen sind registrierte Warenzeichen der CapitalBio Corporation: LuxScan
Referenzen
Siehe Seite 12
Entwickelt von:
Phadia Multiplexing Diagnostics GmbH, Donau-City-Strasse 1, A-1220 Wien, Österreich
Ausgabe April 2008
Überarbeitet September 2009
© Phadia AB, Uppsala, Schweden
Seite 2

ANWENDUNGSGEBIET
ImmunoCAP ISAC ® ist ein In-vitro-Test zur quantitativen Bestimmung von spezifischen IgE-
Antikörpern im menschlichen Serum oder Plasma. ImmunoCAP ISAC ® ist für die In-vitro-
Diagnostik in Verbindung mit anderen klinischen Befunden bestimmt und wurde für den Einsatz
durch medizinisches Fachpersonal in klinischen Laboratorien entwickelt.
TESTPRINZIP
ImmunoCAP ISAC ® ist ein Festphasen-Immunoassay. Für den Nachweis spezifischer IgE-
Antikörper werden Allergenkomponenten, die im Mikroarray-Format auf einem festen Träger
immobilisiert wurden, mit humanen Serum- oder Plasmaproben inkubiert. Durch Zugabe eines
Fluoreszenz-markierten anti-humanen IgE-Antikörpers werden die, an die immobilisierten Allergenkomponenten
gebundenen spezifischen IgE-Antikörper, nachgewiesen. Die Fluoreszenz wird
mittels eines geeigneten Mikroarray-Scanners gemessen. Die ISAC-Standardeinheiten (ISAC
Standardized Units, ISU) werden ermittelt und die Testergebnisse mit einer speziellen Software
(MIA - Microarray Image Analysis Software) analysiert.
Abb. 1.
Oben links: Schematische
Darstellung der Mikroarray-
Anordnung der Allergenkomponenten.
Oben rechts: Schematische
Darstellung des Testprinzips.
Allergenkomponenten werden
kovalent an die feste Phase
gebunden. Allergenspezifische
IgE-Antikörper werden durch
Fluoreszenz-markierte antihumane
IgE-Antikörper nachgewiesen.
Unten links: Scan des
Fluoreszenz-Laser-Scanners,
der die unterschiedlichen
Fluoreszenzintensitäten auf einer
Falschfarbenskala farblich von
schwarz (negativ) bis weiss (stark
positiv) darstellt.
Unten rechts: Schematische
Darstellung des ImmunoCAP ISAC ®
Patientenberichts.
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REAGENZIEN
Die ImmunoCAP ISAC ® Assay Kits oder Starter Kits enthalten 5 Glasträger und alle für die
Testausführung notwendigen Reagenzien. Das Verfallsdatum, die Charge und die
Lagertemperatur des jeweiligen Kits sind auf dem äußeren Etikett verzeichnet. Jeder Bestandteil
der Packung ist so lange haltbar, wie es auf dem jeweiligen Etikett angegeben ist.
Das Vermischen von Reagenzien wird nicht empfohlen.
ImmunoCAP ISAC ® Starter Kit IgE (Art.-Nr. 81-1001-01)
(für 20 Bestimmungen)
ImmunoCAP ISAC ®
Komponente A
(20fach konzentrierter Puffer)
200 ml
IgE-Detektionsantikörper
(fluoreszierendes anti-humanes IgE-
Konjugat) 0,5 ml
IgE-Kontrollserum
(humanes Serum)
Natriumazid < 0,1%, 50 µl
5 Glasträger
mit je 4
Analysenfeldern
Waschschale 2 Schalen für 10
Glasträger
Gebrauchsfertig
Lagerung bei 2 – 8°C bis zum
Verfallsdatum
Bitte den Kit auf Zimmertemperatur
bringen, bevor das Vakuumsiegel
geöffnet wird.
Nach dem Öffnen des Vakuumsiegels
können die Chips für 6 Wochen
aufbewahrt werden, wenn sie trocken,
dunkel und bei 18 – 32°C gelagert
werden.
1 Flasche Lagerung bei 2 – 8°C bis zum
Verfallsdatum
1 Fläschchen Gebrauchsfertig.
Lagerung bei 2 – 8°C bis zum
Verfallsdatum.
Vor Licht geschützt lagern!
1 Fläschchen Gebrauchsfertig.
Lagerung bei 2 – 8°C bis zum
Verfallsdatum.
Kontrollserum nicht verdünnen!
Gebrauchsfertig
Magnetrührstab 2 Gebrauchsfertig
Feuchtkammer 1 Kammer für 26
Glasträger
Gebrauchsfertig
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ImmunoCAP ISAC ® Test Kit IgE (Art.-Nr. 81-1000-01)
(für 20 Bestimmungen)
ImmunoCAP ISAC ®
5 Glasträger
mit je 4
Analysenfeldern
Komponente A
(20fach konzentrierter Puffer)
200 ml
IgE-Detektionsantikörper
(fluoreszierendes anti-humanes IgE-
Konjugat) 0,5 ml
IgE-Kontrollserum
(humanes Serum)
Natriumazid < 0,1%, 50 µl
Gebrauchsfertig
Lagerung bei 2 – 8°C bis zum
Verfallsdatum
Bitte den Kit auf Zimmertemperatur
bringen, bevor das Vakuumsiegel
geöffnet wird.
Nach dem Öffnen des Vakuumsiegels
können die Chips für
6 Wochen aufbewahrt werden, wenn
sie trocken, dunkel und bei 18 – 32°C
gelagert werden.
1 Flasche Lagerung bei 2 – 8°C bis zum
Verfallsdatum
1 Fläschchen Gebrauchsfertig.
Lagerung bei 2 – 8°C bis zum
Verfallsdatum.
Vor Licht geschützt lagern!
1 Fläschchen Gebrauchsfertig.
Lagerung bei 2 – 8°C bis zum
Verfallsdatum.
Kontrollserum nicht verdünnen!
Sonstige Materialien
Erforderliche Materialien, die nicht von Phadia AB mitgeliefert werden:
• Messzylinder (1000 ml, 100 ml)
• Destilliertes Wasser
• Magnetrührer
• Pipetten
Y VORSICHTSMASSNAHMEN
• Nur zur In-vitro-Diagnostik. Nicht zur inneren und äußeren Anwendung bei Mensch und
Tier.
• Reagenzien nicht nach dem Verfallsdatum benutzen.
• Bei der Vorbereitung der Reagenzien und Proben sowie bei der Arbeit mit den Reagenzien
und Proben sollten Schutzhandschuhe und eine Schutzbrille getragen sowie die
Grundsätze guter Laborpraxis befolgt werden.
• Diese Kits enthalten Reagenzien, die aus Komponenten menschlichen Blutes hergestellt
wurden. Die Ausgangsbestandteile wurden mittels Immuno-Assay negativ auf das
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•
Hepatitis-B-Oberflächenantigen sowie negativ auf Antikörper gegen HIV1, HIV2 und
Hepatis-C-Virus getestet. Dennoch sind alle empfohlenen Vorsichtsmassnahmen zum
Umgang mit Blutderivaten zu befolgen. Bitte beachten Sie die Richtlinien der Publikation
Nr. (CDC) 93-8395 des Human Health Service (HHS) oder die lokalen/nationalen
Richtlinien zu den Sicherheitsverfahren für Laboratorien.
Achtung! Die Reagenzien enthalten zum Teil Natriumazid als Konservierungsmittel und
müssen mit besonderer Vorsicht behandelt werden. Auf Anfrage ist ein
Sicherheitsdatenblatt von Phadia AB erhältlich.
Umgang mit dem ImmunoCAP ISAC ®
Verzichten Sie auf eine Kennzeichnung mit wasserlöslichen oder mit lösungsmittelhaltigen Stiften
oder Markern. Andernfalls könnten Rückstände der Kennzeichnung die fluoreszenzbasierte
Analyse des ImmunoCAP ISAC ® beeinträchtigen. Zur Kennzeichnung ggf. einen Bleistift
verwenden. Vermeiden Sie während der einzelnen Reaktionsschritte den direkten Kontakt mit der
Oberfläche des ImmunoCAP ISAC ® . Achten Sie darauf, dass Sie den ImmunoCAP ISAC ®
grundsätzlich nur am Rand des Glasträgers berühren.
VORBEREITUNG DER PROBEN, REAGENZIEN UND DES ZUBEHÖRS
Proben
Für diesen Test können Serum- oder Plasmaproben von venösem Blut oder Kapillarblut verwendet
werden. Die Entnahme der Blutproben erfolgt unter Anwendung des Standardverfahrens. Die
Proben dürfen nur für Transportzwecke bei Raumtemperatur (RT) aufbewahrt werden. Die
Lagerung sollte für einen Zeitraum von bis zu einer Woche bei 2 – 8°C erfolgen, im Falle einer
längerfristigen Aufbewahrung bei –20°C. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen.
Lösung A
Für die Lösung A werden 700 ml einer frischen Lösung (Mischungsverhältnis: 1:20) aus der
Komponente A und destilliertem Wasser zubereitet (665 ml destilliertes Wasser werden zu 35 ml
der Komponente A gegeben). Die Kalkulation der Menge basiert auf 3 Waschschritten mit jeweils
220 ml unter Verwendung der im Starter Kit enthaltenen Waschschalen. Die Menge der Lösung
muss an die verwendeten Behälter angepasst werden.
Detektionsantikörperlösung
Der IgE-Detektionsantikörper ist gebrauchsfertig. Vor Licht schützen und Einfrieren vermeiden.
Feuchtkammer
Legen Sie ein frisches Papiertuch auf den Boden der Feuchtkammer und tränken Sie es mit
destilliertem Wasser. Vermeiden Sie ein Verdunsten der Feuchtigkeit, indem Sie die
Feuchtkammer bis zur weiteren Nutzung geschlossen halten.
ImmunoCAP ISAC ®
Geben Sie den ImmunoCAP ISAC ® in dem herausnehmbaren Halter für Glasträger (bis zu 10
Glasträger) in die Waschschale, geben Sie zirka 220 ml der Lösung A in die Schale und
positionieren Sie einen Magnetrührstab am Boden der Schale. Stellen Sie die Schale auf einen
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Magnetrührer und sorgen Sie dafür, dass die Lösung 60 Minuten lang bei 600 U/Min gerührt wird.
Geben Sie den Glashalter mit dem ImmunoCAP ISAC ® in eine separate Waschschale mit zirka
220 ml destilliertem Wasser. Geben Sie einen Magnetrührstab hinzu und sorgen Sie dafür, dass
die Schale auf einem Magnetrührer 5 Minuten lang 600 U/Min gerührt wird. Nehmen Sie den
Glashalter mit dem ImmunoCAP ISAC ® aus der Schale und stellen Sie ihn zum Trocknen an der
Luft auf ein Papiertuch. Warten Sie, bis die Glasträger vollständig trocken sind. Setzen Sie das
ImmunoCAP ISAC ® Testverfahren direkt nach dem Trocknen der Glasträger fort. Entsorgen Sie
alle verwendeten Waschlösungen.
TESTVERFAHREN
• Geben Sie den vorbereiteten ImmunoCAP ISAC ® in die Feuchtkammer und achten Sie darauf,
dass sich die Analysenfelder an der nach oben gerichteten Seite befinden.
• Pipettieren Sie 20 µl Probe auf ein Analysenfeld (auf jedem Glasträger befinden sich 4
Analysenfelder für 4 Proben). Achten Sie darauf, dass die Pipettenspitze beim Dispensieren
der Probe keinen direkten Kontakt mit der Oberfläche des ImmunoCAP ISAC ® hat. Jedes
Analysenfeld muss vollständig bedeckt sein. Schliessen Sie die Feuchtkammer vorsichtig und
achten Sie darauf, dass die Proben dabei nicht vermischt werden. Pro ImmunoCAP ISAC ® Kit
sollte ein Kontrollserum eingesetzt werden. Wenn Änderungen des Tests oder des Scanning-
Verfahrens eingeführt werden, ist der Einsatz des Kontrollserums obligatorisch.
• Lassen Sie den ImmunoCAP ISAC ® 120 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
• Nehmen Sie den ImmunoCAP ISAC ® vorsichtig aus der Feuchtkammer und achten Sie darauf,
dass die Proben dabei nicht vermischt werden. Entfernen Sie das überschüssige
Probenmaterial, indem Sie die Glasträger unter schwach fließendem Wasser abspülen (halten
Sie dabei den Glasträger waagerecht, um eine Probenkontamination zu vermeiden).
• Waschen Sie den ImmunoCAP ISAC ® 10 Minuten lang mit zirka 220 ml der Lösung A (unter
Verwendung der Waschschale und des Magnetrührers in der zuvor beschriebenen Form).
• Geben Sie den Halter für Glasträger mit dem ImmunoCAP ISAC ® in eine Waschschale mit
zirka 220 ml destilliertem Wasser. 5 Minuten lang waschen.
• Entsorgen Sie alle verwendeten Waschlösungen.
• Lassen Sie den gewaschenen ImmunoCAP ISAC ® an der Luft vollständig trocknen.
• Der ImmunoCAP ISAC ® kann jetzt mit der Detektionsantikörperlösung inkubiert werden. Geben
Sie den trockenen ImmunoCAP ISAC ® in die Feuchtkammer und achten Sie darauf, dass sich
die Analysenfelder an der nach oben gerichteten Seite befinden.
• Pipettieren Sie 20 µl der Detektionsantikörperlösung auf jede der verwendeten Analysenfelder
des ImmunoCAP ISAC ® . Überzeugen Sie sich davon, dass der ImmunoCAP ISAC ®
•
ordnungsgemäss in die Feuchtkammer gegeben wurde und schließen Sie dann die
Feuchtkammer.
Lassen Sie bei Raumtemperatur 60 Minuten inkubieren, vor Licht schützen.
• Nehmen Sie den ImmunoCAP ISAC ® vorsichtig aus der Feuchtkammer. Entfernen Sie die
überschüssige Detektionsantikörperlösung, indem Sie die Glasträger unter schwach
fließendem Wasser abspülen (halten Sie dabei den Glasträger waagerecht, um eine
Kontamination zu vermeiden).
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• Waschen Sie den ImmunoCAP ISAC ® 10 Minuten lang mit zirka 220 ml der Lösung A (unter
Verwendung der Waschschale und des Magnetrührers in der zuvor beschriebenen Form).
• Geben Sie den Halter für die Glasträger mit dem ImmunoCAP ISAC ® in eine Waschschale mit
zirka 220 ml destilliertem Wasser. 5 Minuten lang waschen.
• Entsorgen Sie alle verwendeten Waschlösungen.
• Lassen Sie den gewaschenen ImmunoCAP ISAC ® an der Luft vollständig trocknen.
• Der ImmunoCAP ISAC ® kann jetzt gescannt werden. Geben Sie den ImmunoCAP ISAC ® für
die Datengewinnung direkt in einen geeigneten Mikroarray-Scanner oder bewahren Sie den
ImmunoCAP ISAC ® für eine spätere Messung trocken und lichtgeschützt auf. Die Messung
sollte innerhalb von sieben Tagen erfolgen.
PARAMETER FÜR DAS VERFAHREN
Volumen je Bestimmung:
Probe 20 µl
Detektionsantikörper 20 µl
Lösung A 660 ml
Die Gesamtdauer für einen Test beträgt 5 Stunden.
Die Inkubationen erfolgen bei Raumtemperatur.
Referenzmaterial
Die interne Kalibrierung von ImmunoCAP ISAC ® erfolgt gegen ein In-house-Referenzserum. Die
gemessenen Konzentrationen an IgE-Antikörpern werden als arbiträre Einheiten – ISAC
Standardized Units (ISU) – ausgedrückt. Das ImmunoCAP ISAC ® In-house-Referenzserum wird
gegen ImmunoCAP ® Specific IgE standardisiert. ImmunoCAP ® Specific IgE Kalibratoren sind
(durch eine ununterbrochene Kette von Kalibrierungen) gegen die 2. Internationale Referenzpräparation
(IRP) 75/502 für Immunglobulin E im Humanserum der Weltgesundheitsorganisation
(WHO) kalibriert. Folglich stehen Ergebnisse für IgE-Antikörper (ISU), die
mit dem ImmunoCAP ISAC ® ermittelt wurden, indirekt mit der WHO IRP 75/502 IgE in Verbindung.
Messbereich
Die ImmunoCAP ISAC ®
Bereiche 0 – 3 entsprechen ungefähr dem Messbereich
0 – 100 kUA/l der spezifischen IgE-Bestimmung mit dem ImmunoCAP ® Specific IgE-Test.
Qualitätskontrolle
Dokumentation für jeden Test: Gemäß den Grundsätzen guter Laborpraxis werden die
Chargennummern der eingesetzten Komponenten sowie das Datum der ersten Öffnung und das
Restvolumen notiert.
Kontrollproben: Die Grundsätze guter Laborpraxis erfordern, dass in einem Durchlauf pro Kit
Kontrollproben zur Qualitätskontrolle entnommen werden müssen.
Das mitgelieferte IgE-Kontrollserum muss in festgelegten Intervallen eingesetzt werden, damit das
System genaue ISU-Messungen liefert.
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ImmunoCAP ISAC ® DATENANALYSE
Scanning-Verfahren
Für die Analyse des Biochips ImmunoCAP ISAC ® empfehlen wir den Einsatz eines konfokalen
Laser-Scanners, speziell des Mikroarray-Scanners CapitalBio LuxScan 10K.
Spezifikationen für den Mikroarray-Scanner
Chipformat 26 mm × 76 mm
Scanauflösung 10 µm
Sensitivität 0,1 fluoreszierende Moleküle /μm 2
Dynamischer Messbereich 16 Bit
Maximaler Scanbereich 22 × 72 mm
Exzitationswellenlänge 532 nm und/oder 635 nm (Grün- und Rotlaser)
Fluoreszierende Farbstoffe Alexa Fluor 546 nm, Alexa Fluor 647 nm
Bilddateiformat 16 Bit Grauskala TIFF
Während der Installation des Systems wird von dem Systemtechniker ein Scanprotokoll für
ImmunoCAP ISAC ® eingerichtet. Damit auf dem Scan keine gesättigten (außerhalb des
Messbereichs liegenden) Signale erscheinen, sollten die Darstellungen im Allgemeinen bei
maximaler Laserstärke (laut Herstellerempfehlungen) und den entsprechend gewählten
Einstellungen erstellt werden. Falls der ImmunoCAP ISAC ® mehr als zweimal gescannt wird,
können infolge der Bleichung des Fluoreszenz Farbstoffes durch den Laser eine Abnahme des
Fluoreszenzsignals beobachtet werden.
Verfahren zur Bildanalyse
Für die Analyse des ImmunoCAP ISAC ® raten wird zum Einsatz der MIA-Software (Microarray
Image Analyzer), die während des Setups für das Gerät von unserem Servicemitarbeiter installiert
wird. Die MIA-Software ermöglicht eine automatische Analyse des ImmunoCAP ISAC ® . Die
gescannten Bilder werden analysiert. Die Ergebnisse werden in einer Datenbank gespeichert und
dem Anwender direkt mitgeteilt. Die MIA-Software verfügt über eine Schnittstelle, über die
ImmunoCAP ISAC ® -Daten an den ImmunoCAP ® Information Data Manager (IDM) weitergeleitet
werden.
Ergebnisse
ImmunoCAP ISAC ® ist eine quantitative Testmethode, bei der allergen-komponentenspezifische
IgE-Antikörper in ISU (ISAC Standardized Units) gemessen werden. Die Ergebnisse werden auch
in semi-quantitativer Form in 4 Bereichen ausgedrückt (0 = unter der Nachweisgrenze oder sehr
niedrig, 1 = niedrig, 2 = erhöht bis hoch, 3 = sehr hoch). Die Berechnung wird von der MIA-
Software automatisch ausgeführt.
ImmunoCAP ISAC Bereiche Beurteilung: Konzentration der IgE-Antikörper Entspricht ISU
0 unter der Nachweisgrenze oder sehr niedrig

0 65.535
Abb. 2A. Beispiel für ein
ImmunoCAP ISAC® Scan.
Alle Allergene sind als
vertikale Triplikate
angeordnet. Die bildliche
Darstellung der Fluoreszenz
erfolgt in einer
Falschfarbenskala. Die lineare
Skala der Falschfarben ist
unter dem Bild dargestellt.
Abb. 2B. ImmunoCAP ISAC ®
Anordnung.
Die Anordnung zeigt die
Positionen und
Bezeichnungen von den 103
Allergenkomponenten. Die
Anordnung und das Allergen-
Panel können Veränderungen
unterliegen.
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GRENZEN DES VERFAHRENS
Eine endgültige klinische Diagnose sollte nicht auf die Ergebnisse einer einzigen diagnostischen
Methode gestützt, sondern vom Arzt erst nach Auswertung aller klinischen und labortechnischen
Befunde gestellt werden.
Bei Nahrungsmittelallergien könnten zirkulierende IgE-Antikörper unentdeckt bleiben, obwohl eine
überzeugende Anamnese vorliegt; denn diese Antikörper können gegen Allergene gerichtet sein,
die erst während der industriellen Verarbeitung, während des Kochens oder der Verdauung
entstehen oder verändert werden und deshalb nicht in dem Lebensmittel vorkommen, auf das der
Patient getestet wird.
Insektengift-Ergebnisse innerhalb des Bereichs 0 deuten auf keine zirkulierenden Insektengiftspezifischen
IgE-Antikörper oder eine Konzentration der spezifischen IgE-Antikörper unter der
Nachweisgrenze hin. Diese Ergebnisse schließen das Vorliegen einer gegenwärtigen oder
zukünftigen Überempfindlichkeit gegen Insektenstiche aber nicht aus.
Die Charakteristika des Tests wurden basierend auf repräsentativen Allergenkomponenten
bestimmt und gelten möglicherweise nicht für alle Allergenkomponenten in gleicher Weise.
CHARAKTERISTKA DES TESTS
Nachweisgrenze: Die Nachweisgrenze wurde in Übereinstimmung mit der CLSI-Richtlinie EP17-A
für repräsentative Allergenkomponenten bestimmt. Die allgemeine Nachweisgrenze wurde mit 0,3
ISU veranschlagt, was ungefähr 0,3 kUA/l entspricht.
Präzision: Die Präzision wurde in Übereinstimmung mit der CLSI-Richtlinie EP5-A2 für
repräsentative Allergenkomponenten bestimmt. Während eines Durchlaufs ergaben sich ein
Variationskoeffizient von 15 % und ein Gesamt-Variationskoeffizient von 25 %.
Analytische Spezifität: Der IgE-Detektionsantikörper reagiert nicht mit anderen Immunglobulinen
im humanen Serum.
GARANTIE
Die hier angegebenen Testdaten wurden mit der beschriebenen Testdurchführung ermittelt. Jede
von Phadia AB nicht empfohlene Änderung oder Modifikation des Verfahrens kann die Resultate
beeinträchtigen. Phadia AB lehnt in diesem Falle jede explizite, implizite oder gesetzliche Garantie
ab, die implizite Marktfähigkeit und Anwendbarkeit inbegriffen. Phadia AB und deren Vertreter
können in diesem Fall weder indirekt noch konsekutiv für Schäden haftbar gemacht werden.
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REFERENZEN
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clinical practice. Wohrl S, Vigl K, Zehetmayer S, Hiller R, Jarisch R, Prinz M, Stingl G, Kopp T.
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Nitulescu G, Jensen-Jarolim E.
Expert Rev Mol Diagn. 2004 Jul;4(4):539-48. Protein microarrays in diagnosing IgE-mediated
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gatekeepers for allergy treatment. Hiller R, Laffer S, Harwanegg C et al.
Seite 12

AUSTRIA Phadia Austria GmbH
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OTHER COUNTRIES Phadia AB
Distributor Sales
P O Box 6460, SE-751 37 UPPSALA
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Symbols/Symboles/Symbole/Symboler/Simboli/Simbolos/Symboler/Símbolos/ Symbolen
g Chargennummer
E Biologische Risiken
h Katalognummer
Y Warnhinweis
i Siehe Gebrauchsanweisung
X Enthält ausreichende Menge für Tests
D Nicht noch einmal verwenden
V Medizingerät für In Vitro-Diagnostik
M Hersteller
l Temperaturvorgaben
H Verfallsdatum
M
Phadia AB, P.O. Box 6460
SE-751 37 Uppsala, Sweden
Tel: +46 18 16 50 00
Fax: +46 18 14 03 58
C
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Mode d’emploi
ImmunoCAP ISAC ® Assay Kit IgE
ImmunoCAP ISAC ® Starter Kit IgE

Trademarks/Marques/Varemerker/Warenzeichen/Varemaerker/
Marchi despositati/Marchas registradas/Varumärken/Marcas registradas
Les désignations suivantes sont des marques de fabrique enregistrées appartenant à Phadia AB :
ImmunoCAP
Les désignations suivantes sont des marques de fabrique enregistrées appartenant à Phadia
Multiplexing Diagnostics GmbH :
ISAC
Les désignations suivantes sont des marques de fabrique appartenant à CapitalBio Corporation :
LuxScan
Bibliographie
Voir page 26
Développé par :
Phadia Multiplexing Diagnostics GmbH, Donaucitystrasse 1, A-1220 Vienna, Austria
Publication Avril 2008
Mise à jour Septembre 2009
© Phadia AB, Uppsala, Sweden
Page 16

BUT DU DOSAGE
ImmunoCAP ISAC est un test in vitro qui permet la détermination quantitative d’IgE spécifiques
dans le sérum ou le plasma humain. ImmunoCAP ISAC est destiné à une utilisation diagnostique
in vitro en parallèle avec les investigations cliniques. Il est conçu pour une utilisation en laboratoire
d’analyse médicale.
PRINCIPE DE LA METHODE
ImmunoCAP ISAC est un immuno-dosage sur phase solide. Les composants allergéniques
immobilisés sur un substrat solide en format biopuce sont incubés avec des échantillons sériques
ou de plasma d’origine humaine pour détecter les IgE spécifiques. La liaison des IgE spécifiques
aux composants allergéniques est révélée par l’ajout d’un anticorps anti-IgE humaine sur lequel
est fixé un marqueur de fluorescence secondaire. La procédure est suivie de l’acquisition d’une
image avec un scanner de biopuce adapté. Les unités standardisées (ISAC Standardized Units -
ISU) sont déterminées et les résultats des tests sont analysés avec le logiciel MIA (Microarray
Image Analysis Software).
Figure 1.
En haut, à gauche : Schéma
d’organisation de la biopuce à
composants allergéniques.
En haut, à droite : Schéma
du principe du dosage. Les
composants allergéniques
sont couplés de façon
covalente à la phase solide.
Les IgE spécifiques
d’allergènes sont détectées
par des anti-IgE fluorescents.
En bas, à gauche : Image
acquise par le microscope à
balayage laser à fluorescence,
montrant les différentes
intensités sur une échelle de
fausse couleur, du noir
(négatif) au blanc (fortement
positif).
En bas, à droite : Schéma du
compte rendu du dosage
ImmunoCAP ISAC
Page 17

REACTIFS
ImmunoCAP ISAC est un élément de l’Assay kit (trousse de dosage) ou du Starter kit (trousse de
démarrage) contenant les réactifs requis pour réaliser un dosage. La date de péremption et la
température de stockage de chaque trousse sont indiquées sur l’étiquette extérieure. Cependant,
chaque composant est stable jusqu’à la date indiquée sur son étiquette individuelle. Il est
recommandé de ne mélanger aucun des réactifs.
ImmunoCAP ISAC Starter Kit IgE (Art. No. 81-1001-01)
(pour 20 déterminations)
ImmunoCAP ISAC
incluant 4 sites réactionnels
Composant A
(tampon concentré 20 fois)
200 ml
Anticorps de détection des IgE
(Anti-IgE humaine conjugué à
un fluorophore)
0,5 ml
Sérum de contrôle IgE
(Sérum humain)
Azide de Sodium

ImmunoCAP ISAC Assay Kit IgE (Art. No. 81-1000-01)
(pour 20 déterminations)
ImmunoCAP ISAC
incluant 4 sites réactionnels
Composant A
(tampon concentré 20 fois)
200 ml
Anticorps de détection des IgE
(Anti-IgE humaine conjugué à
un fluorophore)
0,5 ml
Sérum de contrôle IgE
(Sérum humain)
Azide de Sodium

• Attention ! Les réactifs qui contiennent comme conservateur de l’azide de sodium doivent
être manipulés avec précaution. La fiche de sécurité est disponible sur demande auprès de
Phadia AB.
Manipulation des ImmunoCAP ISAC
Ne pas écrire sur les ImmunoCAP ISAC avec des stylos ou des marqueurs solubles dans l’eau ou
des solvants organiques. Des résidus de marquage peuvent interférer sur l’analyse de
fluorescence. Si nécessaire, utiliser un crayon. Eviter tout contact direct avec la surface de
l’ImmunoCAP ISAC à toutes les étapes de la réaction. Saisir toujours ImmunoCAP ISAC par le
bord de la lame.
PREPARATION DES ECHANTILLONS, DES REACTIFS ET DU MATERIEL
Echantillons
Il est possible d’utiliser des échantillons de sérum ou de plasma provenant d’un prélèvement de
sang veineux ou capillaire. Prélever les échantillons sanguins selon les procédures habituelles. Ne
conserver les échantillons à température ambiante que pour le transport. Sinon, les conserver
entre 2 et 8 °C jusqu’à une semaine ou à –20 °C pour une conservation plus longue. Eviter les
congélations et décongélations répétées.
Solution A
Préparer au moment de la manipulation 700 ml d’une dilution au 1/20 du Composant A dans de
l’eau purifiée pour obtenir la Solution A (ajouter 665 ml d’eau purifiée à 35 ml du composant A). Ce
volume est calculé pour 3 lavages de 220 ml à l’aide du récipient de lavage fourni dans la trousse
de démarrage (Starter kit). Le volume de dilution doit être ajusté au récipient utilisé.
Solution d’anticorps de détection
La solution de détection d'Anticorps de détection d’IgE est prête à l'emploi.
Elle doit être conservée à l'abri de la lumière et du gel.
Chambre Humide
Placer une serviette en papier propre au fond de la chambre humide et l’imbiber d’eau distillée.
Fermer le couvercle de la chambre humide pour éviter une évaporation avant son usage.
ImmunoCAP ISAC
Mettre les ImmunoCAP ISAC dans le récipient de lavage contenant le support de lames amovible
(jusqu’à 10 lames) et approximativement 220 ml de Solution A. Ajouter un barreau magnétique au
fond du récipient. Le placer sur un agitateur magnétique et agiter fortement pendant 60 minutes à
600 T/min. Déplacer le support de lames contenant les ImmunoCAP ISAC dans un autre récipient
de lavage contenant approximativement 220 ml d’eau distillée. Ajouter un barreau magnétique et
agiter fortement sur un agitateur magnétique pendant 5 minutes à 600 T/min. Retirer le support de
lames contenant les ImmunoCAP ISAC, placer les lames sur une serviette en papier et laisser
sécher à l’air. Attendre que les lames soient complètement sèches. Poursuivre la procédure de
test des ImmunoCAP ISAC immédiatement après. Jeter toutes les solutions de lavage utilisées.
Page 20

PROCEDURE DE DOSAGE
• Placer les ImmunoCAP ISAC préparés dans la chambre humide en orientant les sites
réactionnels vers le haut.
• Pipeter 20 µl de chaque échantillon sur un site réactionnel (il y a 4 sites par lame). Eviter le
contact direct de l’embout de la pipette avec la surface de l’ImmunoCAP ISAC pendant la
distribution des échantillons. Fermer la chambre humide avec précaution, pour ne pas
mélanger les échantillons. Il est recommandé d’utiliser un sérum de contrôle par trousse
ImmunoCAP ISAC. Le dosage du sérum de contrôle est obligatoire si des changements sont
introduits dans la procédure de dosage ou de mesure. Incuber à température ambiante
pendant 120 minutes.
• Retirer les ImmunoCAP ISAC de la chambre humide avec précaution, sans mélanger les
échantillons. Eliminer le reste d’échantillon en rinçant les lames délicatement à l’eau courante.
Tenir la lame inclinée mais en longueur afin d’éviter toute contamination.
• Laver les ImmunoCAP ISAC avec environ 220 ml de Solution A pendant 10 minutes (en
utilisant le récipient de lavage et le barreau magnétique comme décrit précédemment).
• Déplacer le portoir de lames contenant les ImmunoCAP ISAC dans un autre récipient de
lavage contenant environ 220 ml d’eau distillée. Laver pendant 5 minutes.
• Laisser sécher les ImmunoCAP ISAC à l’air jusqu’à séchage complet.
• Les ImmunoCAP ISAC sont maintenant prêts pour l’incubation avec la Solution d’anticorps de
détection. Placer les ImmunoCAP ISAC secs dans la chambre humide en orientant les sites
réactionnels vers le haut.
• Jeter toutes les solutions de lavage utilisées.
• Pipeter 20 µl de Solution d’anticorps de détection sur chaque site réactionnel des ImmunoCAP
ISAC. S’assurer que les ImmunoCAP ISAC sont correctement placés dans la chambre humide
et fermer le couvercle.
• Incuber à température ambiante pendant 60 minutes, à l’abri de la lumière.
• Retirer les ImmunoCAP ISAC de la chambre humide avec précaution. Eliminer le reste de
solution d’anticorps de détection en rinçant les lames délicatement à l’eau courante. Tenir la
lame inclinée mais en longueur afin d’éviter toute contamination.
• Laver les ImmunoCAP ISAC avec environ 220 ml de Solution A pendant 10 minutes (en
utilisant le récipient de lavage et le barreau magnétique comme décrit précédemment).
• Déplacer le portoir de lames contenant les ImmunoCAP ISAC dans un autre récipient de
lavage contenant environ 220 ml d’eau distillée. Laver pendant 5 minutes.
• Laisser sécher les ImmunoCAP ISAC à l’air jusqu’à séchage complet.
Page 21

• Les ImmunoCAP ISAC sont maintenant prêts pour la lecture. Les utiliser tout de suite pour
l’acquisition des données avec un scanner de biopuce approprié ou les conserver au sec en
les protégeant de la lumière pour une lecture ultérieure.
PARAMETRES DE LA PROCEDURE
Volumes par détermination :
Echantillons 20 µl
Anticorps de détection 20 µl
Solution A 660 ml
Le temps total pour un dosage est de 5 heures.
Les incubations sont réalisées à température ambiante.
MATERIEL DE REFERENCE
La calibration d’ImmunoCAP ISAC est réalisée par rapport à un sérum de référence interne et les
concentrations d’IgE mesurées sont exprimées en unités arbitraires, ISAC Standardized Units
(ISU). Le sérum de référence interne ImmunoCAP ISAC est standardisé par rapport à la méthode
ImmunoCAP Specific IgE. Les calibrateurs ImmunoCAP Specific IgE sont calibrés (via une chaine
ininterrompue d’étalonnage) par rapport à la 2 ème Préparation Internationale de Référence (IRP)
75/502 d’Immunoglobulines E sériques de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS). En
conséquence, les résultats d’IgE (ISU) obtenus avec ImmunoCAP ISAC sont indirectement liés à
l’IRP 75/502 IgE de l’OMS.
Gamme de mesure
Les classes 0 – 3 d’ImmunoCAP ISAC correspondent approximativement à 0 – 100 kUA/l d’IgE
mesurées avec ImmunoCAP Specific IgE.
Contrôle de la Qualité
Enregistrements pour chaque dosage : une bonne pratique de laboratoire consiste à conserver
les numéros de lot des composants utilisés, ainsi que les dates de première ouverture et les
volumes restants.
Sérums de contrôle : une bonne pratique de laboratoire requiert l’ajout de contrôles de qualité
dans une série par trousse. Pour obtenir des mesures ISU précises, le sérum de contrôle fourni
doit être dosé à des intervalles définis pour le système.
Page 22

ANALYSE DES DONNEES ImmunoCAP ISAC
Procédure de mesure
Pour l’analyse des ImmunoCAP ISAC, nous recommandons l’utilisation d’un système à balayage
laser confocal, tel que le scanner de biopuce CapitalBio LuxScan 10K.
Spécifications du scanner
Format de la lame 26mm × 76mm
Précision de balayage 10 µm
Sensibilité 0,1 molécule fluorescente /μm2
Plage dynamique 16 bits
Aire maximum de balayage 22×72 mm
Longueur d’onde d’excitation 532 nm et/ou 635 nm (laser vert et rouge)
Marqueurs fluorescents Alexa Fluor 546 nm, Alexa Fluor 647 nm
Format du fichier image TIFF échelle de gris 16 bits
Un protocole de balayage de l’ImmunoCAP ISAC est paramétré par un spécialiste produit au
moment de l’installation du système. En général, les images doivent être acquises avec la
puissance laser maximum recommandée par le fabricant de l’instrument, et tous les autres
paramètres choisis pour éviter une saturation (hors limite) des images. Si les ImmunoCAP ISAC
sont scannés plus de deux fois, on observe une décroissance des signaux de fluorescence due au
photoblanchiment du marqueur de fluorescence par le laser.
Procédure d’analyse de l’image
Pour analyser les ImmunoCAP ISAC, nous recommandons d’utiliser le logiciel MIA – Microarray
Image Analyzer software, qui a été installé par notre spécialiste produit lors du paramétrage de
l’instrument. MIA facilite l’analyse automatique d’ImmunoCAP ISAC. Les images de balayage des
puces sont analysées et les résultats sont à la fois enregistrés dans une base de données et
directement fournis à l’utilisateur. MIA a une interface d’export des données d’ImmunoCAP ISAC
vers ImmunoCAP Information Data Manager (IDM).
Résultats
ImmunoCAP ISAC est une méthode quantitative qui mesure les IgE spécifiques de composants
allergéniques en unités ISU (ISAC Standardized Units). Les résultats sont également présentés
semi-quantitativement en 4 classes (0 = indétectable ou très faible, 1 = faible, 2 = modéré à élevé,
3 = très élevé). Le logiciel MIA réalise automatiquement les calculs.
Scores ImmunoCAP ISAC (Taux d’IgE) Correspondance avec les ISU
0 (Indétectable ou très faible)

0 65.535
Fig. 2A.
Exemple d’image
d’ImmunoCAP ISAC
acquise. Tous les
allergènes sont mesurés en
triplets verticaux. Pour
visualiser la fluorescence,
l’image est affichée en mode
fausse couleur.
L’échelle linéaire d’affichage
en fausse couleur est
indiquée en dessous de
l’image.
Fig. 2B.
Matrice du test
ImmunoCAP ISAC. Ce
schéma montre les positions
et les noms des 103
composants allergéniques.
La répartition et le contenu
en allergènes peuvent être
soumis à des changements.
Page 24

LIMITES DE LA PROCEDURE
Un diagnostic clinique ne peut être fondé uniquement sur les résultats d’une seule méthode
diagnostique mais doit être établi par le praticien après évaluation de tous les résultats cliniques et
de laboratoire.
En allergie alimentaire, les IgE circulantes peuvent être indétectables en dépit d’une histoire
clinique convaincante parce que ces anticorps peuvent être dirigés vers des allergènes révélés ou
altérés au cours d’un traitement industriel, de la cuisson ou de la digestion, de sorte qu’ils
n’existent pas dans l’aliment d’origine pour lequel le patient est testé.
Des résultats de classe 0 pour les venins indiquent l’absence ou un taux indétectable d’IgE
spécifiques circulantes de venin. De tels résultats ne préjugent pas d’une hypersensibilité clinique
actuelle ou future aux piqûres d’insectes.
Les performances indiquées sont des données générales qui peuvent varier pour un composant
allergénique individuel. Les performances ont été déterminées pour des composants allergéniques
représentatifs et ne peuvent pas être appliquées à tous les composants allergéniques.
PERFORMANCES CARACTERISTIQUES
Limite de détection : La limite de détection a été déterminée en accord avec les
recommandations CLSI EP17-A pour les composants allergéniques représentatifs. La limite de
détection générale est estimée à 0,3 ISU ce qui correspond à 0,3 kUA/L approximativement.
Précision : La précision a été déterminée en accord avec les recommandations CLSI EP5-A2
pour les composants allergéniques représentatifs. Le CV intra-série a été estimé à 15 % et le CV
total à 25 %.
Spécificité Analytique : L’anticorps de détection des IgE ne réagit pas avec les autres
immunoglobulines du sérum humain.
GARANTIE
Les performances décrites ici ont été obtenues en suivant la procédure indiquée. Toute
modification de la procédure non recommandée par Phadia AB peut affecter ces résultats. Dans
ce cas, Phadia AB rejette toute garantie explicite, implicite ou prévue par la loi, et notamment toute
garantie implicite concernant l’aptitude à la vente ou à l’utilisation. Dans cette éventualité, Phadia
AB rejette toute responsabilité en cas de dommages indirects ou liés pouvant en résulter.
Page 25

BIBLIOGRAPHIE
Allergy. 2006 May;61(5):633-9. The performance of a component-based allergen-microarray in clinical
practice. Wohrl S, Vigl K, Zehetmayer S, Hiller R, Jarisch R, Prinz M, Stingl G, Kopp T.
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atopy. Ott H, Schroeder CM, Stanzel S, Merk HF, Baron JM.
Clin Chem Lab Med. 2005;43(12):1321-6. Protein microarrays for the diagnosis of allergic diseases: stateof-the-art
and future development. Harwanegg C, Hiller R.
Immunol Lett. 2005 Feb 15;97(1):81-9. Affinity determinations of purified IgE and IgG antibodies against the
major pollen allergens Phl p 5a and Bet v 1a: discrepancy between IgE and IgG binding strength. Hantusch
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Expert Rev Mol Diagn. 2004 Jul;4(4):539-48. Protein microarrays in diagnosing IgE-mediated diseases:
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Methods. 2004 Mar;32(3):249-54. Microarrayed allergens for IgE profiling. Deinhofer K, Sevcik H, Balic N,
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FASEB J. 2002 Mar;16(3):414-6. Epub 2002 Jan 14. Microarrayed allergen molecules: diagnostic
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Page 26

AUSTRIA Phadia Austria GmbH
Floridsdorfer Hauptstraße 1, AT-1210 VIENNA
Tel: +43 1 270 20 20, Fax: +43 1 270 20 20 20
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ITALY Phadia S.r.l.
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OTHER COUNTRIES Phadia AB
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Page 27

Symbols/Symboles/Symbole/Symboler/Simboli/Simbolos/Symboler/Símbolos/
Symbolen
g Code de lot
E Risques biologiques
h Numéro de catalogue
Y Avertissement
i Consulter le mode d'emploi
X Contenu suffisant pour tests
D Ne pas réutiliser
V Appareils médicaux pour diagnostic In Vitro
M Fabricant
l Limite de température
H A utiliser avant
M
Phadia AB, P.O. Box 6460
SE-751 37 Uppsala, Sweden
Tel: +46 18 16 50 00
Fax: +46 18 14 03 58
C
Page 28

Istruzioni per l’uso
ImmunoCAP ISAC ® Assay Kit IgE
ImmunoCAP ISAC ® Starter Kit IgE

Trademarks/Marques/Varemerker/Warenzeichen/Varemaerker/
Marchi depositati/Marchas registradas/Varumärken/Marcas registradas
I seguenti marchi sono registrati ed appartengono a Phadia AB:
ImmunoCAP
I seguenti marchi sono registrati ed appartengono a Phadia Multiplexing Diagnostics GmbH:
ISAC
I seguenti marchi sono registrati ed appartengono a CapitalBio Corporation:
LuxScan
Riferimenti bibliografici
Vedere a pag. 40
Sviluppato da:
Phadia Multiplexing Diagnostics GmbH, Donau-City-Strasse 1, A-1220 Vienna, Austria
Preparato Aprile 2008
Revisione Settembre 2009
© Phadia AB, Uppsala, Svezia
Pagina 30

APPLICAZIONE CLINICA
ImmunoCAP ISAC è un test in vitro per la determinazione quantitativa degli anticorpi IgE specifici
nel plasma o siero umano. ImmunoCAP ISAC è destinato all’uso diagnostico in vitro in
combinazione con altri dati clinici ed il suo utilizzo è rivolto ai medici ed ai laboratori clinici.
PRINCIPIO DELLA PROCEDURA
ImmunoCAP ISAC è un test immunologico in fase-solida. Le componenti allergeniche,
immobilizzate in formato di microarray su un substrato solido, sono incubate con siero o plasma
umano al fine di identificare gli anticorpi IgE specifici. Il legame tra gli anticorpi IgE Specifici e le
componenti allergeniche legate alla fase solida, è rilevato grazie ad un anticorpo secondario anti-
IgE umane marcato con un composto fluorescente. Una scansione con un appropriato scanner per
microarray permetterà l’acquisizione dell’immagine. Il programma MIA (Microarray Image Analysis
Software) consentirà poi l’analisi dei risultati e alla determinazione delle ISU (ISAC Standardized
Units).
Figura 1.
Sinistra in alto: Disposizione in
microarray delle componenti
allergeniche.
Destra in alto: Principio del test.
Le componenti allergeniche sono
covalentemente legate alla fase
solida. Gli anticorpi IgE specifici
sono rilevati grazie ad anti-IgE
marcati in fluorescenza.
Sinistra in basso: Immagine
acquisita con uno scanner laser
per fluorescenza. Le differenti
intesità si distribuiscono su una
scala di pseudo colori che va dal
nero (negativo) al bianco
(positivo intenso).
Desta in basso: Esempio di
report.
Pagina 31

REAGENTI
ImmunoCAP ISAC fa parte dell’Assay Kit o dello Starter Kit in cui si trovano tutti i reagenti richiesti
per l’esecuzione del test. La data di scadenza e la temperatura di conservazione sono indicate
sull’etichetta esterna. Ogni componente comunque è stabile fino alla data riportata sulla specifica
etichetta.
Si raccomanda di non fare pool di reagenti.
ImmunoCAP ISAC Starter Kit IgE (Cod. 81-1001-01)
(per 20 determinazioni)
ImmunoCAP ISAC
4 siti di reazione ciascuno
Component A
(Tampone 20x)
200 ml
IgE Detection Antibody
(Anticorpo monoclonale di topo
anti-IgE umano coniugato con
fluoroforo) 0,5 ml
IgE Control Serum
(siero umano)
Sodio azide

ImmunoCAP ISAC Assay Kit IgE (Cod. 81-1000-01)
(per 20 determinazioni)
ImmunoCAP ISAC
4 siti di reazione ciascuno
Component A
(Tampone 20x)
200 ml
IgE Detection Antibody
(Anticorpo monoclonale di topo
anti-IgE umano coniugato con
fluoroforo) 0,5 ml
IgE Control Serum
(siero umano)
Sodio azide

• Attenzione! I reagenti che contengono sodio azide come conservante devono essere
maneggiati con cura. Le Schede di Sicurezza dei prodotti sono richiedibili presso Phadia.
Precauzioni per l’utilizzo di ImmunoCAP ISAC
Non utilizzare pennarelli con inchiostro solubile in acqua o solventi organici per scrivere su
bottiglie, provette o vetrini. L’inchiostro può interferire nell’analisi della fluorescenza di ImmunoCAP
ISAC. Se necessario utilizzare una matita per contrassegnare i reagenti. Evitare di toccare la
superficie di ImmunoCAP ISAC durante tutte le fasi della reazione: prendere sempre i vetrini dai
bordi.
PREPARAZIONE DI CALMPIONI, REAGENTI ED EQUIPAGGIAMENTO
Campioni
Possono essere usati campioni di siero o plasma da sangue venoso o capillare prelevato con
procedure standard. I campioni sono conservabili a 2-8° C fino a 1 settimana o a -20° C per periodi
più lunghi. Evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti. I campioni possono essere spediti a
temperatura ambiente.
Soluzione A
Preparare 700 ml di Soluzione A aggiungendo 665 ml di Acqua deionizzata a 35 ml di Component
A. Si ottiene così una diluzione 1:20 di Component A. Il volume preparato è sufficiente per 3
lavaggi con 220 ml ciascuno da effettuarsi all’interno delle camere di lavaggio fornite con lo Starter
Kit.
Detection Antibody Solution
La Detection Antibody Solution é pronta per l’uso.
Conservare al riparo dalla luce ed evitare di congelarla.
Camera umida
Ricoprire il fondo della camera umida con tovaglioli di carta e inumidire con acqua distillata. Se non
utilizzata, rimettere sempre il coperchio per evitare l’evaporazione.
ImmunoCAP ISAC
Posizionare i vetrini ImmunoCAP ISAC nel rack rimuovibile della camera di lavaggio (fino a 10
vetrini), aggiungere approssimativamente 220 ml di Soluzione A e collocare la barretta magnetica
sul fondo. Agitare per 60 minuti a 600 giri/min su un agitatore magnetico. Spostare il rack con i
vetrini nell’altra camera di lavaggio preventivamente riempita con circa 220 ml di acqua distillata.
Agitare con un agitatore magnetico per 5 minuti a 600 giri/min. Rimuovere il rack e posizionarlo su
un tovagliolo di carta per lasciarlo asciugare. Attendere finché i vetrini siano completamente
asciutti. Procedere con il passaggio seguente nella preparazione del test. Eliminare tutte le
soluzioni di lavaggio utilizzate fin’ora.
Pagina 34

PROCEDURA DEL TEST
� Posizionare i vetrini ImmunoCAP ISAC nella camera umida con i siti di reazione verso l’alto.
� Dispensare 20 μl di campione in ciascun sito di reazione (ogni vetrino contiene 4 siti di
reazione), evitando di toccare la superficie dei vetrini con il puntale mentre si dispensano i
campioni. Posizionare delicatamente il coperchio sulla camera umida facendo attenzione a
non mischiare i campioni. Si raccomanda di effettuare una calibrazione con Control Serum
per ogni kit. L’esecuzione di una calibrazione è necessaria se sono state fatte modifiche alla
procedura di preparazione del test o ai parametri di scansione dei vetrini.
� Incubare a temperatura ambiente per 120 minuti.
� Togliere i vetrini ImmunoCAP ISAC dalla camera umida prestando attenzione a non
mescolare i campioni. Rimuovere i sieri sciacquando i vetrini sotto un debole getto d’acqua.
(Tenerli orizzontalmente per evitare una contaminazione dei campioni)
� Lavare i vetrini con 220 ml circa di Soluzione A per 10 minuti (utilizzare la camera di lavaggio
e l’agitatore magnetico come descritto precedentemente).
� Spostare il rack con i vetrini nell’altra camera di lavaggio contenente circa 220 ml di acqua
distillata. Lavare per 5 minuti.
� Rimuovere il rack e lasciare asciugare i vetrini all’aria finché non siano completamente
asciutti.
� I vetrini ImmunoCAP ISAC sono ora pronti per l’incubazione con la Detection Antibody
Solution. Posizionare i vetrini completamente asciutti nella camera umida con i siti di reazione
rivolti verso l’alto.
� Eliminare tutte le soluzioni di lavaggio utilizzate precedentemente.
� Dispensare 20 μl della Detection Antibody Solution in ogni sito di reazione ImmunoCAP
ISAC. Chiudere quindi la camera umida col suo coperchio.
� Incubare a temperatura ambiente per 60 minuti, proteggendo i vetrini dalla luce.
� Rimuovere delicatamente i vetrini ImmunoCAP ISAC dalla camera umida. Rimuovere la
Detection Antibody Solution sciacquando i vetrini sotto un debole getto d’acqua. (Tenerli
orizzontalmente per evitare una contaminazione)
� Lavare i vetrini ImmunoCAP ISAC con circa 220 ml di Soluzione A per 10 minuti (utilizzare la
camera di lavaggio e l’agitatore magnetico come descritto precedentemente).
� Spostare il rack con i vetrini ImmunoCAP ISAC nell’altra camera di lavaggio contenente circa
220 ml di acqua distillata. Lavare per 5 minuti.
� Eliminare tutte le soluzioni di lavaggio utilizzate precedentemente.
� Lasciare asciugare i vetrini all’aria finché non siano completamente asciutti.
� I vetrini ImmunoCAP ISAC sono ora pronti per la lettura. Utilizzare uno scanner di microarray
per l’acquisizione delle immagini o conservarli in luogo asciutto e al riparo dalla luce per
successiva lettura.
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PARAMETRI DELLA PROCEDURA
Volumi per singola determinazione:
Campione 20μl
Detection Antibody 20μl
Solution A 660ml
Tempo totale per un dosaggio: 5 ore.
Le incubazioni vengono effettuate a temperatura ambiente.
Riferimento
La calibrazione di ImmunoCAP ISAC è effettuata con un siero di riferimento interno e le
concentrazioni di anticorpi IgE sono espresse in unità arbitrarie, ISAC Standardized Units, (ISU). Il
siero di riferimento interno ImmunoCAP ISAC è standardizzato verso ImmunoCAP Specific IgE. I
calibratori di ImmunoCAP Specific IgE sono riferiti (tramite un’ininterrotta catena di calibrazioni)
alla 2 a Preparazione di Riferimento Internazionale (IRP) 75/502 di Immunoglobuline E di Siero
Umano del WHO (World Health Organization). Conseguentemente i risultati degli anticorpi IgE
ottenuti con ImmunoCAP ISAC sono indirettamente riferiti allo standard WHO IRP 75/502 delle
IgE.
Range di misura
Le classi 0-3 di ImmunoCAP ISAC, corrispondono approssimativamente a 0 – 100 kUA/l di
anticorpi IgE misurati col metodo ImmunoCAP Specific IgE.
Controllo di qualità
Registrazione di ogni analisi: è buona pratica di laboratorio registrare i numeri di lotti dei
componenti utilizzati, le date in cui sono stati aperti e i volumi residui.
Campioni di controllo: la buona pratica di laboratorio richiede che un controllo di qualità sia
effettuato almeno in un dosaggio per kit. Il siero di controllo per IgE fornito dovrebbe essere testato
ad intervalli definiti in modo da garantire una misura accurata delle ISU.
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ANALISI DEI RISULTATI ImmunoCAP ISAC
Acquisizione delle immagini
Per l’analisi di ImmunoCAP ISAC è consigliato utilizzare uno scanner laser confocale, in
particolare è raccomandato lo scanner per microarray CapitalBio LuxScan 10K.
Specifiche dello scanner per microarray
Dimensioni vetrino 26mm × 76mm
Risoluzione di scansione 10 µm
Sensibilità 0.1 molecole fluorescenti/μm2
Range Dinamico 16 bit
Massima area di
scansione
22×72 mm
Lunghezza d’onda laser 532 nm e/o 635 nm (Laser Verde e Rosso)
Fluorofori Alexa Fluor 546 nm, Alexa Fluor 647 nm
Formato file TIFF 16 bit in scala di grigi
Il protocollo di scansione per i vetrini ImmunoCAP ISAC viene approntato durante l’installazione
del sistema da parte di nostro personale qualificato. In generale, le immagini dovrebbero essere
acquisite utilizzando la massima potenza laser consigliata dal produttore dello strumento, mentre
gli altri valori andranno regolati in modo da evitare segnali a saturazione (fuori range)
sull’’immagine acquisita. Se si scansiona un vetrino ImmunoCAP ISAC per più di due volte è
possibile notare una diminuzione del segnale fluorescente dovuto al fenomeno di photo-bleaching
del fluoroforo.
Analisi delle immagini
Per l’analisi di ImmunoCAP ISAC, si raccomanda l’uso del programma MIA – Microarray Image
Analyzer che viene attivato da nostro personale qualificato al momento dell’installazione del
sistema. MIA consente l’analisi automatica dei vetrini ImmunoCAP ISAC. Le immagini dei vetrini
vengono analizzate e i risultati ottenuti sono memorizzati in un database o stampati per la
refertazione. MIA inoltre ha un’interfaccia che permette l’esportazione dei dati al programma
ImmunoCAP Information Data Manager (IDM).
Risultati
ImmunoCAP ISAC è un metodo quantitativo in cui gli anticorpi IgE specifici alle componenti
allergeniche sono misurati in ISU (ISAC Standardized Units). I risultati vengono presentati anche in
modo semiquantitativo divisi in 4 classi (0 = Non misurabile o molto basso, 1 = Basso, 2 =
Moderato o Alto, 3 = Molto alto). Il programma MIA effettua tale misurazione in modo automatico.
Range ImmunoCAP ISAC (Livello di anticorpi IgE) Equivalenti a ISU
0 (Non misurabile o molto basso)

0 65.535
Fig. 2A.
Esempio di scansione di
un’immagine di
ImmunoCAP ISAC
Ogni allergene è riportato
verticalmente in triplicato.
L’immagine è visualizzata in
pseudo colori per
apprezzare meglio le
differenze di intensità. Una
scala lineare di pseudo colori
è indicata sotto l’immagine.
Fig. 2B.
Schema di ImmunoCAP
ISAC.
Lo schema indica le
posizioni e le sigle dei 103
allergeni.
La disposizione e il pannello
degli allergeni posso subire
modifiche.
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LIMITI DELLA PROCEDURA
Una diagnosi clinica definitiva non deve basarsi sui risultati di un solo test, ma deve essere
formulata dal medico curante dopo la sua valutazione di tutti i referti clinici e di laboratorio.
Nelle allergie alimentari, è possibile che gli anticorpi IgE specifici circolanti non siano rilevabili
nonostante un’anamnesi chiara. Questi anticorpi possono essere infatti diretti contro allergeni che
vengono evidenziati o alterati durante i processi di preparazione industriale, di cottura o di
digestione, e che pertanto non sono presenti nell’alimento allo stato naturale per il quale viene
eseguito il test.
Risultati di classe 0 per i veleni indicano assenza o livelli non rilevabili di anticorpi IgE specifici per i
veleni. Tali risultati, tuttavia, non precludono l’esistenza di ipersensibilità clinica attuale o futura alle
punture di insetti.
Le caratteristiche riportate devono essere considerate parametri generali che possono variare per
componenti allergeniche singole. Queste caratteristiche sono state determinate solo per
componenti allergeniche rappresentative e potrebbero non essere applicabili per tutte le
componenti allergeniche.
CARATTERISTICHE DEL TEST
Limite rilevabilità: Il limite di rilevabilità (LoD) è stata determinato in accordo alle Linee Guida
EP5-A2 del CLSI per alcune componenti allergeniche rappresentative. Il limite di rilevabilità
generale è stato stimato essere al massimo 0.3 ISU che corrispondono approssimativamente a 0.3
kUA/L
Precisione: La precisione è stata determinata in accordo alle Linee Guida EP5-A2 del CLSI per
alcune componenti allergeniche rappresentative. Il CV intradosaggio ha mostrato valori fino al 15%
e il CV totale fino al 25 %.
Specificità analitica: IgE Detection Antibody non reagisce con altre immunoglobuline nel siero
umano.
GARANZIA
Le prestazioni qui riportate sono state ottenute utilizzando le procedure indicate. Ogni
cambiamento o modifica del procedimento operativo non raccomandato da Phadia AB può inficiare
il risultato finale. In tal caso Phadia AB declina ogni responsabilità, implicita od esplicita, inclusa
quella implicita di commerciabilità ed idoneità all’uso. In tale evenienza, Phadia AB ed i suoi
distributori autorizzati non saranno responsabili per danni indiretti o consequenziali.
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RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI
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clinical practice. Wohrl S, Vigl K, Zehetmayer S, Hiller R, Jarisch R, Prinz M, Stingl G, Kopp T.
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AUSTRIA Phadia Austria GmbH
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