METINIS PRANEŠIMAS 2011 - Biotechnologijos institutas

© Biotechnologijos institutas 53
Metinis pranešimas – 2011
grybo Lactarius rufus genų banko tyrimai turėtų parodyti ar PGR amplikonas, gautas pagal
išskirtos ir sekvenuotos lakazės amino rūgčių seką, yra „netradicinę“ lakazę koduojanti seka.
Rugsėjo mėn. 1 d. buvo pradėtas Pramoninės Biotechnologijos programos projektas, kurio esmė
yra lipolitinių fermentų tyrimai, siekiant juos efektyviai pritaikyti pramoninei 2-etilheksil oleato
sintezei. Per tris projekto mėnesius, pradiniame etape buvo bandyta gryninimui naudoti klasikinę
baltymų gryninimo schemą. Tačiau gautos labai mažos tikslinių baltymų (fermentų su lipolitiniu
aktyvumu) koncentracijos ir reikalinga atlikti daug gryninimo stadijų. Tai labai apsunkina tolesnį
projekto vystymą. Todėl buvo nuspręsta sukurti vienstadijinę gryninimo schemą, atsižvelgiant į
lipolitinių fermentų savybes. Šiuo metu yra atrenkamos sąlygos šiam gryninimo metodui. Iš
šešių atiduotų sekvenuoti baltymų, buvo sekvenuoti penki. Peptidų de novo sekvenavimas
parodė, kad pagal vieną sekvenuotą seką atrinktose sekose yra atrandami kitų sekvenuotų sekų
atitikmenys. Pagal sekvenuotų peptidų sekas duomenų bazėse buvo identifikuoti lipazių analogai.
Be to, atliktas sekvenuotų peptidų iš Enterobacter aerogenes (Xenorhabdus nematophilus) E13
kamieno ir komercinės lipazės Lyposyme TL IM sekų palyginimas parodė „santūrų“ sekų dalių
atitikimą. Pagal šią patikslintą informaciją bus sukurti DNR pradmenys, kuriais bus nuskenuota
Enterobacter aerogenes E13 genominės DNR biblioteka.
Taip pat buvo galutinai suformuota gryninimo schema lakazei iš Lactarius rufus ir fermentas
išgrynintas su 2,29 % išeiga, tačiau aukštu išgryninimo laipsniu 268 ir aukštu specifiniu
aktyvumu 133 U/mg. Nustatyta, kad fermento Mw 66 kDa, tačiau baltymo gauti pavyko labai
mažai, tik 200 μl su baltymo koncentracija 0,13 mg/ml. Gautas baltymas buvo sekvenuotas de
novo Proteomikos centre. Atlikus peptidų sekos analize, duomenys patvirtino anksčiau pastebėtus
skirtumus, kad mūsų tiriamas baltymas turi netradicinę seką. Toliau tyrimai bus nukreipti į
fermento kristalinės struktūros nustatymą, kadangi ši lakazė gali būti priskiriama geltonosios arba
baltosioms lakazėms.
Antrinės alkoholoksidazės išskirtos iš Pseudomonas putida 4 kamieno gryninimas buvo
optimizuotas. Atlikus 16 S RNR testą surasta, kad tiriamojo darbo metu naudotos bakterijos
priklauso Pseudomonas putida rūšiai. Nustatytos laukinio tipo P. putida 4 kamieno bakterijų
ląstelių kultivacijos sąlygos: ląstelių augimui palanki terpė, kurioje PVA koncentracija yra 5 g/L
ir 7,5 g/L; stipriausiai bakterijų ląstelių augimą indukuoja – glicerolis ir gliukozė; ląstelių
populiacijos kitimui palankiausia auginimo terpės pH vertė – 7,5; aeracija – ląstelių populiacijos
kitimui įtakos neturi; papildomas Fe (III) kiekis terpėje ląstelių prolifercijai įtakos neturi;
sintetinė terpė bakterijų kultivacijai netinkama. Surastos katalitiškai aktyvios antrinių alkoholių
oksidazės (2-AO) ekspresijos sąlygos P. putida 4 bakterijų kamiene: katalitiškai aktyviausia 2-
AO ekspresuojama, kai terpėje nėra PVA; 2-AO gaunama katalitiškai aktyvesnė, kai terpės pH
8,5; deguonies kiekis nelemia fermento aktyvumo; papildomas Fe (III) kiekis terpėje ląstelių
prolifercijai įtakos neturi; sintetinėje terpėje aktyvaus fermento nerasta. 2-AO išgryninta su 99,05
% išeiga naudojant du jonų mainų chromatografijos etapus (Q-Sepharose ir SP-Sepharose
kolonėles). Nustatyta, kad 2-AO yra monomeras ir fermento molekulinė masė – 52 kDa.
Numanoma, jog fermento katalitiniame centre yra Fe (II). Substratų savitumo tyrimas parodė, kad
fermentas ekspresuojamas Pseudomonas putida 4 genties bakterijose, išskirtose iš dirvožemio,
yra savita tik antriniams linijinės grandinės alkoholiams.
2011 m. sektoriuje buvo pradėti ir poliolių sintezės katalizuojamos fermentais tyrimai. Pradiniai
rezultatai naudojant komercinius fermentus parodė daug žadančių rezultatų. Šią tema pradėtas
doktorantūros darbas.
Imobilizacijos tyrimai buvo nukreipti į papildomos grandinės prikabinimą („linker“) tarp nešėjo
ir fermento. Buvo ištirtos temperatūros, buferio, pH ir laiko trukmės įtaka.
Taip pat 2011 m. TBS buvo sudaryta eilė metodikų bioplastikų savybių nustatymams, kurios
buvo panaudotos atliekant tiriamuosius darbus pagal tris Inovacinius čekius susijusius su
bioplastikų tyrimais.